The Iceberg Concept of Infection Zelluläre Reaktion Zelltod Zytopathischer Effekt (CPE) Transformation Virusvermehrung ohne erkennbare Schäden oder unvollständige Virusreifung Exposition ohne Rezeptorbindung oder Penetration Reaktion des Wirtes Tod Schwere Erkrankung Moderate oder leichte Symptome Asymptomatische Infektion Exposition ohne Infektion
Infektion Ansteckung (lat. inficere = hineinbringen), Haften, Eindringen und Vermehrung von Erregern in einem Wirt Monoinfektion - Mischinfektion - Superinfektion z.b. Primärinfektion mit Influenzaviren (Virusgrippe), Sekundärinfektion mit Staphylokokken oder Streptokokken Reinfektion erneute Infektion nach Ausheilung bei geringer Ausprägung einer Immunreaktion
Allgemeine Eigenschaften von Krankheitserregern Infektion Anhaften, Eindringen und Vermehrung eines Krankheitserregers (Mischinfektion, Superinfektion, Reinfektion) Pathogenität Grundeigenschaft einer Erregerspezies nach Infektion des Wirtes Krankheitssymptome zu verursachen Virulenz Summe aller krankmachenden Eigenschaften stark variabel, LD 50 Attenuierung Virulenzminderung, Abschwächung: Erhalt von Immunogenität und Fähigkeit zur Vermehrung Organtropismus charakteristisch für Viren breite Wirtsspezifität, enge Organspezifität:Tollwutvirus enge Wirtsspezifität, breite Organspezifität: HSV
Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Erreger Wirt Spezies apathogen resistent Spezies pathogen nicht resistent (empfänglich) Stamm avirulent nicht anfällig Individuum virulent Infektion anfällig (Disposition) Infektionskrankheit
Infektionsverlauf Nicht jede Infektion führt zu einer Infektionskrankheit. Die meisten Infektionen verlaufen klinisch inapparent. Klinisch apparente Infektionen werden als Infektionskrankheit bezeichnet.
Formen der Infektion Akute Infektion Viruselimination; zeitlich begrenzt, lokal Antikörperbildung Vorkommen sowohl apparent als auch inapparent (subklinisch) Persistierende Infektion keine (vollständige) Viruselimination nach Primärinfektion Latente Infektion: keine Virusproduktion, lebenslange Infektion, Reaktivierung (Rezidiv, Exazerbation) Chronische Infektion: produktiver Replikationszyklus Transformation Immortalisierung, Tumorentstehung
Virus-Zell-Interaktion Infektionstyp Virusproduktion Reaktion der Zelle abortiv - keine lytisch ++ Zelltod persistierend temporäre Symbiose produktiv + variabel/alterung latent - keine Transformation -/+ Immortalisierung
Interaktion bei Virusinfektionen Virus Wirtsorganismus Immunsystem
Konsequenzen der Virusinfektion Direkter Effekt: Destruktion Funktionsverlust Indirekter Effekt: Immunpathologie Autoimmunität
Immunantwort MHC Glykoproteine T-Zell-Rezeptor (TCR) Proteine des TCR-Komplexes Präsentation viraler Peptide an Oberfläche infizierter Zellen & APC Erkennung von Fremdantigenen, die von MHC präsentiert werden nicht antigenspezifisch Immunglobuline humorale Immunität
Antivirale Immunantwort humoral zellulär B-Lymphozyten Antikörper Bindung Neutralisation T-Helfer-Zellen Bindung an MHC II auf APC Cytokine Immunologisch aktive Zellen Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Bindung an MHC I auf virusinfizierten Zellen Perf., Gran. Fas/ FasL Apoptose
Aktivierter T-Lymphozyt FasL - Gen Perforin/ Granzym TCR MHC / Viruspeptid Virusinfizierte Zelle Apoptose
Antigenerkennung durch T-Zellen
Verlaufsformen/Typen viraler Infektionen Akute Infektion * Immunität z.b. Masern Viruselimination Reinfektion z.b. Influenza * Latente Infektion * Chronische Infektion z.b. Hepatitis C * Slow Virus Infektion * z.b. Masern-SSPE Reaktivierung z.b. Herpesviren * * Virus kann isoliert werden * nur Nukleinsäure kann nachgewiesen werden
Kriterien für persistierende Virusinfektionen 1. Nicht-lytische Virus-Wirt-Interaktion 2. Versagen der Erkennung von viralen Proteinen durch das Immunsystem des Wirtes
Persistenz - Unterlaufen der Immunabwehr Antigenshift der Glykoproteine Neutralisierende Antikörper blockierende Antikörper ( Unwirksamkeit neutralisierender Antikörper) AK-vermittelte Zytotoxizität limitierte Genexpression (HSV) Verlust von Glykoproteinen (Masern) Antigenshift (Influenza) Zytotoxische T-Lymphozyten Infektion von Zellen ohne MHC (neurotrope Viren) Suppression MHC-I (Adenoviren) Delokalisation von MHC (HIVnef)
Faktoren, die an der Entstehung persistierender Virusinfektionen beteiligt sind Virale Eigenschaften Mutationen Integration der viralen Nukleinsäure Tropismus Regulation der MHC-Genexpression Zelluläre Eigenschaften Differenzierungsgrad Interferonsynthese Enzymdefekte Immunreaktionen Immundefekte Antigene Modulation Selektion von Virusvarianten
Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Chronische Infektionen produktiv Hepatitis B und C, HIV latent HSV, VZV, HIV langsam (slow virus) SSPE, PML Virusinduzierte Tumoren Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome
Virus-Wirt-Interaktion Akute Infektion Lytische Infektion Chronische Infektion Persistierende Infektion Produktiv Latent Reaktivierte Infektion Virämie Transformierende Infektion
Transformation z.b. HPV (Papillomiren) Slow Virus Disease z.b. SSPE Virale Pathogenese Zytopathogenität z.b. Poliovirus Immunpathogenese spezifisch Zerstörung virus- Infizierter Zielzellen durch CTL z.b. HBV unspezifisch Freisetzung von Zytokinen Fieber z.b. Adeno- & Masernvirus
Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Erreger Wirt Spezies apathogen resistent Spezies pathogen nicht resistent (empfänglich) Stamm avirulent nicht anfällig Individuum virulent Infektion anfällig (Disposition) Infektionskrankheit
Weitere Begriffsbestimmungen Infektiosität Fähigkeit von pathogenen Erregern, in einen Wirt einzudringen, sich dort zu vermehren und sich und weiter auszubreiten. Lebende und tote Vektoren (Träger), die derartige vermehrungsfähige Erreger mit sich tragen, bezeichnet man als infektiös. Kontagiosität Fähigkeit eines Erregers von einem infizierten Organismus direkter Kontakt auf nicht infizierte Organismen überzugehen und eine Infektion auszulösen.
Weitere Begriffsbestimmungen Kontagionsindex Richtgröße zur Quantifizierung einer Erkrankungswahrscheinlichkeit an einer Infektion. Epidemiologische Größe, die die Anzahl der tatsächlich Erkrankten angibt, bezogen auf 100 nichtimmune Exponierte. z.b. für Masern, Pocken, Varizellen 95-98 % für Poliomyelitis (und Diphtherie) 10-20 % Manifestationsindex Anzahl der manifest Erkrankten/Anzahl der Infizierten, Empirisch hoch >90% (z.b. Masern, Windpocken, MKS) mittel >1, <90% (z.b. Röteln, Mumps) niedrig <1% (z.b. Poliomyelitis)
Transmission von Viren Horizontal Blutkontakt (HCV, HIV) Speichel (EBV, Mumps) Organe (CMV, HBV) Aerosole ( Masern, Influenza) Arthropoden (FSME, Dengue) Nahrung (HAV, Hantaviren) fäkal-oral (Entero-, Rotaviren) Vertikal Schwangere - Fetus - pränatal (Röteln, CMV) - konnatal (VZV, HBV)
Eintrittspforten Respirationstrakt (Tröpfcheninfektion, aerogen) Intestinaltrakt (fäkal-oral) Blut, Blutprodukte (parenteral) Biss- und Stichwunden durch Tiere/Insekten
Möglichkeiten des Auftretens von Erregern durch infizierte Organismen in der Umwelt Wege Art der Ausscheidung direkter Weg Nasen- und Rachensekrete (Schleimhäute der Atemwege, des Verdauungstraktes, Speicheldrüsen, Tonsillen) Stuhl/Kot Urin Augensekret Muttermilch Genitalsekrete Haut- und Schleimhautveränderungen indirekter Weg Blut (während Virämie) Lebensmittel Abfälle, Kadaver
Koch-Henle sche Postulate Jacob Henle, 1840: Lehre vom lebenden Ansteckungsstoff Präzisierung durch Robert Virchow, 1890 1. Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Die Koch-Henle schen Postulate gelten nur für monokausale Infektionskrankheiten.
Koch-Henle sche Postulate 1. Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Gegenbeispiele: zu 1. - klinisch gesunde Träger, Dauerausscheider; - Normalflora mit fakultativ pathogenen Keimen zu 2. - Viren zu 3. - Gewebeschäden / Tumorbildung nicht immer experimentell reproduzierbar - latente und persistierende Virusinfektionen
Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Chronische Infektionen produktiv Hepatitis B und C, HIV latent HSV, VZV, HIV langsam (slow virus) SSPE, PML Virusinduzierte Tumoren Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome
Parameter von Virusinfektionen Epidemiologie und Durchseuchung Übertragungswege (Ausbreitung) Inkubationszeit und Manifestationsgrad Reaktionen des Immunsystem Rekonvaleszenz und Immunität bzw. Persistenz - Reaktivierung
Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Adsorption Penetration Uncoating Transkription Translation Assembly Maturation Freisetzung Wirt Viruseintritt in den Wirt Primäre Replikation Virämie Zell- und Gewebstropismus Zell- und Organschäden Immunreaktion Viruspersistenz Slow Virus Disease Infektionskrankheit Inkubationszeit Prodromalstadium Generalisation Organmanifestation Rekonvaleszenz
Pathogenese der Poliovirus-Infektion Tag 0 2 4 6 8 Infektion Darm Pharynx GALT GALT regionale Lymphknoten lymphogen hämatogen Blut-Liquor- Schranke Leber Milz Virusvermehrung in Organen Virämie Fieberhafter Infekt 10 12 14 16 18 Virusausscheidung im Stuhl Beginn der Antikörper- Synthese Kontrolle der Virusinfektion CSF Meningitis Ausbreitung ins ZNS Enzephalitis Paresen Blut-Hirn- Schranke Nervenzellen 20
Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Infektionskrankheit Adsorption Penetration Uncoating Transkription Translation Assembly Maturation Release Inkubationszeit Prodromalstadium Generalisation Organmanifestation Rekonvaleszenz
Schwerpunkte der Medizinischen Virologie Diagnostik und Prophylaxe sog. Kinderkrankheiten, Infektionen der Atemwege HIV, HCV, Viren mit onkogenem Potential Immunsupprimierte Patienten Schwangerschaft Therapie HIV, Hepatitis B und C, Herpesviren, Virusgrippe Viruslast-Bestimmung und Resistenz-Testung Emerging Viruses Filoviren, West-Nil-Virus, Virales Hämorrhagisches Fieber SARS-Coronavirus, H5N1- & H7-Influenzaviren Prion-Erkrankungen (TSE)
Aufgaben der Medizinische und der experimentellen Virologie Neue Nachweismethoden PCR, Resistenztestung, Rapid Viral Diagnosis Struktur-Funktions-Untersuchungen Reverse Genetics Enzyme (z.b. Protease-Inhibitoren, Caspase-Aktivierung) Fusion & Intergase Gentherapie und Impfstoffentwicklung Adenovirale, retrovirale, herpesvirale oder AAV-Vektoren DNA-Impfung (HCV, HIV, etc.) Zelluläre Immunität Epidemiologie und Übertragung Reservoir, Vektoren, Impfkampagnen
Erregerübertragung Art der Übertragung Medien, Wege, etc. Schmier-, Kontaktinfektionen über Mund, Nase, Auge (fäkal-oral) oder Haut Tröpfcheninfektion (Aerosole) Nasensekret, Speichel parenteral (iatrogen) Blut, Blutprodukte Verletzungen (Haut/Schleimhaut) Stechmücken, Zecken, Sandflöhe, Bisse sexuell Schleimhäute der Genitalien diaplazentar, intrauterin hämatogen - aszendierend Stillen Muttermilch - Kontakt germinativ, transovariell Eier bei Mücken, Zecken, Vögel
Virusdiagnostik Zellkultur (Virusisolation) - zytopathischer Effekt in vitro Antigennachweis - in Patientenmaterial - In Zellkultur (nach Isolation) Nukleinsäurenachweis - PCR, LCR, bdna - ISH, Sequenzierung Elektronenmikroskopie ----------------------------------------Bestimmung von Antikörpern - IgM, IgG, (IgA)
Diagnostisches Spektrum der Medizinischen Virologie Direkter Virusnachweis Indirekter Nachweis Virusisolation (CPE) Antigennachweis in Zellkultur in Patientenmaterial Nukleinsäurenachweis PCR, (LCR, bdna) ISH, Sequenzierung Elektronenmikroskopie Bestimmung von Antikörpern IgG, IgM, IgA
Antikörpernachweise Welche viralen Proteine induzieren Antikörper? Welche Klasse von Antikörper werden gebildet? Wann und wie lange sind diese Antikörper im Serum? Sind die Antikörper spezifisch für einen Erreger? Welche Antigenquelle ist geeignet - gereinigtes Virus aus Zellkultur - Isolierte Virusproteine (z.b. Hämagglutinin) - synthetisch hergestellte Peptide oder Proteine
Serologischer Verlauf einer EBV-Infektion Reaktivierung Heterophile Antikörper VCA-IgG VCA-IgM EA-Antikörper EBNA-IgG 2 Wochen 3-4 Monate Jahre
Nachweisverfahren für Antikörper Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA/EIA) Immunfluoreszenz Western - Blot Neutralisationstest (NT) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Agglutinationstests
Immunoassay Markierung FITC POD AP Isotope Biotin Antikörper im Patientenserum Konjugatantikörper Träger mit AG
Enzym-Immuno-Assay Patientenseren negative Kontrolle positive Kontrolle
ELISA Y Y Y Y Y AK-produzierende Zellen Antigen an der Festphase Test mit Fang-Ak
nativer Zustand des Antigens veränderter Zustand des Antigens Y Y
Substrat + Chromogen Y Capture-Assay
Immunfluoreszenz
FITC-markierte virale Proteine Oberfläche Zytoplasma Kern
Nachweis von Virusantigen durch Immunperoxidasereaktion
unsichtbare Banden Immunblot i.d.r.
Westernblot Verlauf einer HIV-Infektion gp160 gp120 p66 p51/55 gp41 p31 p24 p18 frühe Serokonversion reaktiv späte Infektionsphase
Exemplarischer Verlauf der Serokonversion nach Infektion mit HIV-1 1 2 3 4 5 43 J., männl. Untersuchungszeitpunkte 1 keine Symptome, 6 Tage nach Infektionsereignis 2 Fieber, Abgeschlagenheit, Lymphknotenschwellung, 23. Tag 3 keine Symptome, 42. Tag 4 keine Symptome, 3 Monate (106. Tag) 5 keine Symptome, 7 Monate (223. Tag)
Virusnachweis mittels EM Norovirus Astrovirus Calicivirus Adenovirus
Virusnachweis mittels CPE Humane Lungenfibroblasten Affen-Nierenzellen CMV mock infiziert Rötelnvirus mock infiziert
Antikörperdiagnostik Vorteile Nachteile lange Erfahrung standardisierbar automatisierbar relativ schnell relativ preiswert quantifizierbar Serumpaar notwendig aussageschwach bei Immunsuppression und persistierenden Infektionen und bei Infektionen mit sehr kurzer Inkubationszeit Kreuzreaktivität (Spezifität) Ig-Gabe verfälscht Befunde begrenzt auf Serum und Liquor Leihimmunität bei Neugeborenen
Nachweisverfahren für virale Antigene Ag-ELISA Rota- & Adenoviren im Stuhl Direkte Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörper - RSV in Aspiraten, CMV in BAL, etc. Indirekte Immunperoxidase-Assays - CMV (pp65) in PBL Kurzzeitkulturen (Shell Vial) und Nachweis viraler Proteine - IE-Proteine der Herpesviren - Strukturproteine respiratorischer Viren
In Situ Hybridisierung Chromogen Farbstoff Streptavidin biotinyliertes Enzym (AP) HPV-Gensonde biotinyliert HPV-DNA
Genomnachweis in klinischen Proben HPV EBV
Genomnachweise PCR (Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) n-pcr LCR (Ligase Chain Reaction) NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (b-dna Technik)
PCR Reagenzien Target - DNA aus Untersuchungsmaterial 2 für den Erreger spezifische Primer Nukleotidmix - dntp's thermostabile DNA-Polymerase (Taq) Puffer für Polymerase mit MgCl 2
PCR Protokoll Denaturierung bei 95 C, linear - ss ca 30 Zyklen Annealing bei T m der Primer Extension bei 72 C ss ---> ds Denaturierung bei 95 C ds ---> ss final extension 72 C 4 C bis zur weiteren Verarbeitung
Denaturierung bei 95 C Annealing der Primer Extension bei 72 C Denaturierung bei 95 C 35-40 Zyklen final extension 72 C
2. Zyklus 1. Zyklus Auffüllen des Stranges 5 3 Primer doppelstr. (Oligo s) DNA DNA/RNA Annealing der Primer Denaturierung bei 95 C
Nachweis des PCR-Produktes M 19 20 21 22 23 24 25 26 Fluoreszenz 1000 Kopien 10 Kopien 10 19 25 30 40 Zyklen
Diagnostische Parameter einer CMV-Infektion nach Nierentranspantation IgG IgM pp65 Fieber Ganciclovir Geq/ml x 10 4 80 20 DNA 20 15 5 10 1,25 5 0,3 0 60 67 74 76 77 81 88 95 98 Tage nach NTX