Photometrie mit Pyridinnucleotiden Grundlagen der Photometrie Photometer-Arten Eppendorf-Photometer Struktur und Funktion des NADH Beispiele des optischen Tests Berechnungsverfahren Biochemie - "Photometrie mit NADH" 1
Farbaktive Gruppen Chromophore: Atomgruppen, die die selektive Absorption nennenswert beeinflussen Bathochromie: Verschiebung der Absorbtionsmaxima zu langwelligerem / sichtbaren Licht - Farbvertiefung durch Anhäufung solcher Gruppen Auxochrome: Bindeglieder zwischen Chromophoren und Fasern Doppelbindungen: -C=C- Ketogruppen: >C=O Nitrogruppen: O -N O Aminogruppen: -NH 2 Hydroxylgruppen: -OH Sulfonsäuregruppen: -SO 3 H Biochemie - "Photometrie mit NADH" 2
Licht-Absorption Energie definierter Größe (Quantengröße) einer Strahlung ändert den Energiezustand des Atoms / Moleküls Atom: Anhebung der Elektronen auf höhere Orbitale Moleküle: Anregung von Schwingungs- / Rotationsbewegungen Energie der absorbierten Strahlung E = h υ, mit υ := Wellenlänge h := 6,626 * 10-34 Js (Planck sches Wirkungsquantum) Beim Rückfall auf altes Energieniveau: Abgabe der Energie hauptsächlich als Wärme Fluoreszenz: Energieabgabe als Lichtstrahlung Absorbierbare Quantengrößen sind charakteristisch für den Stoff, da nur zu den Änderungen passende Quanten aufgenommen werden Absorptionsausmaß ist proportional der Konzentration des Stoffes (und der Schichtdicke) - s.u. Biochemie - "Photometrie mit NADH" 3
Absorption und Farbe bei organischen Stoffen Voraussetzung für die Lichtabsorption bei organischen Verbindung sind vorwiegend Doppelbindungen Je mehr konjugierte Doppelbindungen, desto langwelliger und höher ist das Absoptionsmaximum Farbige Stoffe = Stoffe, die sichtbares Licht aufnehmen. Stofffarbe ist die Komplementärfarbe des resorbierten Lichtes Biochemie - "Photometrie mit NADH" 4
Gesetz von Lambert-Beer mit: I I = I 0 e -k c d I = I 0 10 -ε c d := Intensität des Lichtes nach der Probe [cd = Candela] I 0 := Intensität vor der Probe [cd] k c d ε := Materialkonstante [l/(mol cm)] := Stoffkonzentration [mol/l] := Schichtdicke [cm] := molarer Extinktionskoeffizient [l/(mol cm)] Monochromatisches Licht jedes Molekül absorbiert den selben Intensitätsanteil Größe dieses Anteils abhängig von k bzw. ε Anzahl der absorbierten Anteile abhängig von der Anzahl der getroffenen Moleküle (c * d) Biochemie - "Photometrie mit NADH" 5
Transmission und Extinktion Transmission Extinktion Durchlässsigkeit des Mediums für das Licht Abhängig von der Wellenlänge Absorption durch das Medium ebenfalls abhängig von der Wellenlänge I T= --- = 10 - ε c d I 0 Einheitenlos, Angabe in % oder als Bruch T = 1 bedeutet keine Absorption Einheitenlos E = log 1 / T E = ε c d Optimaler Meßbereich: 0 < E < 1 Biochemie - "Photometrie mit NADH" 6
Absorptionsspektrum Messung der Extinktion einer Substanz bei verschiedenen Wellenlängen Berechnung der Extinktionskoeffizienten jeder Wellenlänge hieraus 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 Auftragung der ε (λ) gegen die Wellenlänge λ 6000 4000 Dieses Spektrum ist charakterisierend für die Substanz 2000 0 Extinktionskoeffizient / 1 220 NAD+ NADH 240 260 280 300 320 340 360 380 Wellenlänge / nm 400 Biochemie - "Photometrie mit NADH" 7
Allgemeines Photometer Fotozelle Filter Strahlungsquelle Parallelrichter Meßküvette Galvanometer Biochemie - "Photometrie mit NADH" 8
Qualitätskriterien der Photometrie Je monochromatischer das Licht ist, umso exakter ist die photometrische Messung, d.h. umso linearer ist die Abhängigkeit des Extinktionskoeffizienten von der Stoffkonzentration Biochemie - "Photometrie mit NADH" 9
Photometer-Typen Filterphotometer: Lichquelle weisses, kontinuierliches Licht (z.b. Wolframlampe) Monochromatisierung Filter aus gefärbtem Glas Vorteil einfach und robust Spektrallinienphotometer: Lichtquelle Gasentladungslampe (z.b. Quecksilberdampf) Monochromatisierung Farbfilter Vorteil strenger monochromatisches Licht Spektralphotometer: Lichtquelle weisses, kontinuierliches Licht Monochromatisierung Prisma + Spaltblende Vorteil beliebige Wellenlänge verfügbar Doppelstrahlphotometer: Spektralphotometer mit gleichzeitig zwei Strahlengängen Vorteil Parallelmessung der Probe und der Referenzprobe Biochemie - "Photometrie mit NADH" 10
Eppendorf-Photometer Spektrallinienphotometer Strahlungsquelle: Quecksilberdampflampe Anzeige durch Spiegelgalvanometer Anzeigenskala: oben Extinktion unten Transmission Energie /? 10000 1000 100 10 334 365 405 436 492 546 578 623 691 1 300 350 400 450 500 550 600 650 700 Wellenlänge / nm Biochemie - "Photometrie mit NADH" 11
Pyridin-Nucleotide Nicotinamid H N + OH O C NH2 HO NAD + Nicotinamid-adenin-dinucleotid Diphosphorsäure O O CH 2 -O-P-O-P-O-CH 2 HO OH O N N NH 2 N N Adenin Ribose O HO OH Ribose O-P = NADP + Biochemie - "Photometrie mit NADH" 12
NAD + NADH + H + R H R H H + H O H H O C NH2 C NH2 N + R NAD + _ N R NADH Biochemie - "Photometrie mit NADH" 13
Funktionen der Nicotinamidnucleotide Coenzyme zahlreicher Dehydrogenasen i.a. reversible Reaktionen H 2 -Transport intrazellulär NADH: Oxidation (H + -Abgabe) an Enzyme der Atmungskette z.b. Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Ethanol + NAD + Acetaldehyd + NADH + H + NADPH: Oxidation - Biosynthese Reduktion - Fettsäure-Biosynthese und CO 2 -Reduktion bei der Photosynthese Biochemie - "Photometrie mit NADH" 14
Spektrales Verhalten der NAD s Farbaktives Zentrum sind die Doppelbindungen im Pyridinring Reduktion des NAD + zum NADH Verändert den aromatischen Charakter des Rings NAD + zusätzliches Absorptionsmaximum bei 340 nm ε bei 340 nm: NADH / NADPH: 6.3 * 10 3 ε bei 365 nm (s. Hg-Spektrum): NADH: 3,4 * 10 3 NADPH: 3,5 * 10 3 Extinktionskoeffizient / 1 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 220 NAD+ 240 260 280 300 NADH 320 340 360 380 400 Wellenlänge / nm Biochemie - "Photometrie mit NADH" 15
Anwendungsbeispiele Lactat im Plasma: NAD + - Zugabe Messung der Ausgangsextinktion E 0 Zugabe von Lactatdehydrogenase (LDH) Umsetzung des Lactat zu Pyruvat Umbau des NAD + zu NADH Anstieg der Extinktion bei z.b. 365 nm Aktivität - Lactatdehydrogenase: Enzymaktivität Reaktionsgeschwindigkeit Pyruvat + NADH Zugabe des Serums mit dem LDH Pyruvat zu Lactat NADH zu NAD + Abnahme der Extinktion Messung der Abnahme pro Zeiteinheit Biochemie - "Photometrie mit NADH" 16
Berechnung der Substratkonzentration E E = ε c d c = ---- ε d E V c = ------ * --- * F ε * d v c := Konzentration in der Probe [mol / l] E := Extinktionsveränderung V := Endvolumen [ml] v := Ursprungsvolumen der Probe [ml] F := Verdünnungsfaktor vor Testbeginn Biochemie - "Photometrie mit NADH" 17
Berechnung der Enzymaktivität A = c / t E V A = ---------- * -- * F t * ε * d v A := Enzymaktivität [mol / (l * min)] c := Konzentration in der Probe [mol / l] E := Extinktionsveränderung V := Endvolumen [ml] v := Ursprungsvolumen der Probe [ml] F := Verdünnungsfaktor vor Testbeginn t := Zeit [min] Biochemie - "Photometrie mit NADH" 18