Aktivitätsbestimmung der Laktatdehydrogenase Für das Verständnis des Aufbaus von Enzymen und ihrer Wirkung sind Kenntnisse in der Biochemie der Proteine Voraussetzung. Folgende Begriffe sind von Bedeutung: Peptidbindung Primär-, Sekundär-, Tertiär-, Quartärstruktur von Proteinen Pufferwirkung von Proteinen Isoelektrischer Punkt pk-wert Katalyse Glucosestoffwechsel, Cori-Zyklus 1 Theoretischer Hintergrund Enzyme auch Biokatalysatoren genannt - sind in der Mehrzahl katalytische aktive Proteine (es gibt einige wenige katalytisch aktive RNA-Moleküle). Sie besitzen die Fähigkeit, Substrate an sich zu binden und deren Umwandlung in Produkte zu beschleunigen. Enzyme sind an jeder Stoffwechselreaktion in unserem Körper beteiligt, indem sie die Geschwindigkeit der biochemischen Reaktionen um das 10 8 - bis 10 12 -fache beschleunigen. Diese Reaktionsbeschleunigung wird durch die Bildung von Enzym-Substrat-Komplexen erreicht, welche eine Stabilisierung des Übergangszustandes bewirken und damit die Aktivierungsenergie einer Reaktion herabsetzen. Die Bindung der Substrate erfolgt im sogenannten aktiven Zentrum des Enzyms, welches nur einen kleinen Teil des Gesamtproteins darstellt. Die an der Katalyse beteiligten Aminosäurereste nennt man katalytische Gruppen. Enzyme können Reaktionsgleichgewichte nicht verschieben, d. h. sie verändern nicht die Gleichgewichtslage einer Reaktion sondern beschleunigen nur die Einstellung dieses Gleichgewichts; auch gehen sie aus einer Reaktion immer unverändert hervor. a) Kinetik enzymkatalysierter Reaktionen Die Enzymkinetik beschäftigt sich mit dem Reaktionsverhalten von enzymkatalysierten Stoffveränderungen. Die durch ein Enzym katalysierte Umwandlung eines Substrates S in ein Produkt P verläuft nach HENRI (1903) über die Bildung eines Enzym-Substrat- Komplexes ES. Zunächst bindet ein Enzym E ein Substratmolekül S unter Bildung eines Enzym-Substratkomplexes ES mit einer Geschwindigkeitskonstanten k+1. Dieser ES- Komplex kann nun entweder mit der Geschwindigkeitskonstanten k-1 wieder in E und S zerfallen oder er wird der Geschwindigkeitskonstanten k+2 in das Produkt P umgewandelt. Es gilt also: E+S k+1 ES k+2 E+P k-1 k-2 (1) 1
Zur MICHAELIS-MENTEN Kinetik. Auf der Grundlage von Gleichung (1) haben MICHAELIS und MENTEN 1913 eine Beziehung für die Abhängigkeit der Netto-Reaktionsgeschwindigkeit v von der Substratkonzentration [S] abgeleitet, die in sehr guter Näherung auf die meisten Enzymreaktionen angewendet werden kann. Der zentrale Gedanke der MICHAELIS-MENTEN-Theorie besteht darin, dass bei konstanter Enzymkonzentration die Geschwindigkeit v der Gesamtreaktion (1) letztlich von der Konzentration des ES-Komplexes [ES] abhängt, und zwar dieser direkt proportional ist. Diese Proportonalität findet ihren Ausdruck in der Gleichung (2): Unter der vereinfachenden Annahme einer exergonen Einsubstrat-Reaktion, wenn die Rückreaktion E+P ES wegen k 2 << k +2 vernachlässigbar ist, gilt nämlich: v = k +2 [ES]. (2) Was bestimmt nun die aktuelle Konzentration des ES-Komplexes? Steigert man bei festgelegter Enzymkonzentration die Substratkonzentration [S] kontinuierlich, so wird in zunehmendem Maße die Konzentration freier Enzymmoleküle sinken und dafür die ES- Konzentration [ES] steigen, bis schließlich unter Grenzbedingungen alle Enzymmoleküle als ES-Komplexe vorliegen: das Enzym ist gesättigt und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit v max ist erreicht. Mit der Einbeziehung der Bildungs- und Zerfallsgeschwindigkeitskonstanten k +1 und k -1 in Gleichung (2), einigen Umformungen und der Zusammenfassung (k 1 + k +2 ) (k +1 ) -1 = K M gelangt man zur Michaelis-Menten-Gleichung: [S] v = v max MICHAELIS-MENTEN-Gleichung (3) [S] + K M Gleichung (3) besagt, dass die Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeiten v über den zugehörigen Substratkonzentrationen [S] eine rechtwinklige Hyperbel ergibt, bei der sich v asymptotisch dem Grenzwert v max nähert (Substratsättigungskurve). Abb. 1: Substratsättigungskurve Die Reaktionsgeschwindigkeit v wird gegen die Substratkonzentration [S] aufgetragen. 2
K M, die MICHAELIS-Konstante, hat gemäß Gleichung (3) die Dimension einer Konzentration (mol/l). Sie ist für jedes Enzym und jedes vom Enzym umgesetzte Substrat eine charakteristische Größe: sie repräsentiert die Substratkonzentration, bei der das Enzym die halb-maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht, und sie kann in grober Näherung als Maß für die Affinität des Enzyms zum Substrat aufgefasst werden. Ein niedriger KM-Wert bedeutet eine hohe Substrataffinität (es wird nur wenig Substrat benötigt, bis die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird), ein hoher hingegen eine sehr niedrige Substrataffinität (es wird sehr viel Substrat benötigt, bis endlich die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht ist). Die Reaktionsgeschwindigkeit und damit die Enzymaktivität wird üblicherweise in Units (U) angeben, wobei 1 U der Umsetzung von 1µmol Substrat pro Minute entspricht. Die Aktivität von Enzymen in Lösungen kann durch die sogenannte Volumenaktivität in U pro Milliliter (U/ml) angegeben werden. Weitere gängige Einheiten von Enzymaktivitäten sind die spezifische Aktivität, die sich auf die Aktivität pro Menge des Gesamtproteingehaltes einer Lösung bezieht und in Units pro mg (U/mg) angegeben wird und die Wechselzahl, welche angibt, wie viele Substratmoleküle pro Sekunde umgesetzt werden. Lineare Transformationen der Michaelis-Menten-Gleichung. Die exakte Bestimmung der kinetischen Parameter v max und K M aus einer experimentell erhaltenen Substratsättigungskurve ist wegen ihres hyperbolischen Verlaufs nicht möglich. Mit folgenden vier linearen Geradengleichungen aber, welche unterschiedliche Transformationen der M.-M.-Beziehung (Gl. 3) darstellen, können v max und K M graphisch oder rechnerisch aus den Meßdaten ermittelt werden: (1/v) = (K M /v max ) (1/[S]) + (1/v max ) LINEWEAVER-BURK (3a) ([S]/v) = (1/v max ) [S] + (K M /v max ) HANES (3b) v = -K M (v/[s]) + v max EADIE (-HOFSTEE) (3c) v max = (v/[s]) K M + v CORNISH-BOWDEN (3d) Obwohl alle vier Transformationen auf der M.-M.-Gleichung basieren, sind sie für die Abschätzung/Ermittlung von v max und K M nicht als gleichwertig zu betrachten. Denn die Messgröße v kann, insbesondere bei kleinen Werten - anders als die recht präzisen Substratkonzentrationen - mit erheblichen prozentualen Fehlern behaftet sein und damit bei Linearisierungen, welche mit dem Kehrwert von v arbeiten, zu einer übermäßigen Wichtung gerade der am meisten fehlerbehafteten Messwerte führen. Die Lineweaver-Burk-Auftragung erleichtert wie alle linearen Funktionen der M.-M.- Gleichung die Ermittlung von K M und v max. Hierzu werden die reziproken Werte 1/v und 1/[S] der Sättigungskurve gebildet und gegeneinander aufgetragen: 3
Abb. 2: Lineweaver-Burk-Plot Die Verlängerung der Gerade ergibt zwei Schnittpunkte mit den Achsen, aus denen man K M und v max ablesen oder genauer - mit Hilfe der Geradengleichung (y = mx + b) - berechnen kann. Der Schnittpunkt der x-achse entspricht (1/K M ), der mit der y-achse 1/v max. Bildet man von den berechneten Schnittpunkten also den Kehrwert, hat man K M und v max. b) Die Laktatdehydrogenase () Die Laktatdehydrogenase spielt eine wichtige Rolle im Glucosestoffwechsel, indem sie die Umwandlung von Pyruvat in Laktat bzw. von Laktat in Pyruvat katalysiert. In Säugetieren existieren 4 verschiedene Isoformen der, welche in unterschiedlichen Geweben vorkommen und dort jeweils spezielle Aufgaben übernehmen. Das Enzym katalysiert unter anaeroben Bedingungen in der Skelettmuskulatur die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat und garantiert damit in der arbeitenden Muskulatur die Regeneration von NAD + zur Aufrechterhaltung der Glykolyse. Das unter diesen Bedingungen in der (Skelett-) Muskulatur entstehende Laktat wird über die Blutbahn zur Leber transportiert, in der nun ebenfalls durch die eine Rückumwandlung in Pyruvat erfolgt. Das durch die in der Leber generierte Pyruvat wird in der Gluconeogense wieder in Glucose umgewandelt und zur Versorgung der Muskulatur in die Blutbahn abgeben. Dieser Kreislauf von Glucose und deren Abbauprodukten zwischen Skelettmuskulatur und Leber wird Cori-Zyklus genannt. 2 Versuchsziel und experimentelles Vorgehen Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Laktatdehydrogenase () sollen bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen (das Substrat der ist in unserem Versuch Pyruvat) gemessen werden. Dazu wird zunächst eine Substrat (=Pyruvat)- Konzentrationsreihe hergestellt. Die gewonnenen Messdaten für die Reaktionsgeschwindigkeiten sollen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration als hyperbolische Substratsättigungskurve, sowie durch eine lineare Darstellung mit Datentransformation nach Lineweaver-Burk präsentiert werden. Es soll gezeigt werden, dass die enzymatische Katalyse der der MICHAELIS-MENTEN-Kinetik folgt. Die mit den 2 Auswertungen ermittelten kinetischen Parameter v max und K M sollen verglichen/diskutiert werden. 4
Die Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeiten erfolgt mit Hilfe des optischen Tests : Gemessen werden stets zeitliche Extinktionsänderungen, welche durch [NADH+H + ]- Konzentrationsänderungen verursacht sind, denn diese gehen ihrerseits stöchiometrisch mit Stoffumsätzen enzymatisch katalysierter Reaktionen einher. Der optische Test spielt in der Laboratoriumspraxis (z.b. klinische Diagnostik) die zentrale Rolle bei der Bestimmung der Aktivität von Enzymen. Materialbedarf Photometer (λ=340 nm); Halbmikroküvetten, d=1 cm, Plastik; Plastikspatel; Mikroliterpipetten (20, 50, 100, 200-1000 µl); gelbe und blaue Spitzen; Reaktionsgefäße 1,5 ml mit Ständer Lösungen: 67,2 mm Tris/HCl-Puffer, ph 7,0 112 mm Pyruvat-Lösung (py1) 4 mm reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (NADH + H + ) Laktatdehydrogenase (, from rabbit muscle), 2 U/ml Durchführung Zu diesem Versuch lernen Sie den optischen Test kennen. Das Meßprinzip dieser wichtigen photometrischen Methode zur Messung von Enzymaktivitäten wird zunächst kurz anhand der -Reaktion erläutert. Anschließend finden Sie eine Anleitung zur Herstellung einer Lösungsreihe mit unterschiedlichen Pyruvatkonzentrationen, die schließlich zur Ermittlung der kinetischen Basisparameter K M und v max der benötigt wird. Die -Reaktion in der Skelettmuskulatur Der letzte Schritt der anaeroben Glycolyse, die Reduktion von Pyruvat zu Laktat, wird durch das Enzym Laktatdehydrogenase () katalysiert: O O - O O - C C C O + NADH + H+ H C OH + NAD+ CH 3 CH 3 Pyruvat Lactat Entsprechend dem stark negativen ΔG -Wert von -25,1 kj mol -1 liegt das Gleichgewicht weit auf der Seite der Laktatbildung. Als Cosubstrat dient NADH+H +, die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid, in dem Nicotinsäureamid-Ribosid über eine Diphosphorsäurebrücke mit Adenosin verbunden ist. (4) 5
Das Prinzip der Nicotinamidnucleotid-Katalyse besteht in einer reversiblen Hydrid-Ion (H - )- Übertragung am Pyridinring des Cosubstrates; es ist in Gleichung 5 wiedergegeben: H H H H CONH 2 CONH 2 + N N +H+ R R (5) (In Gl. (5) entspricht das linke H von H-H dem Wasserstoff am C-2-Atom des Laktats aus Gl.(4); das jeweils bindende Elektronenpaar wird bei der Reduktion des Pyridinringes mit dem Wasserstoff als Hydrid-Ion übertragen.) Das Meßprinzip Aus dem Vergleich der Spektren (Abb. 3) geht hervor, dass 340 nm die optimale Wellenlänge für die Messungen ist, in denen Änderungen der NADH-Konzentration ohne Störung durch NAD + gemessen werden sollen. Abb. 3: Absorptionsspektren von NADH (gepunktet) und NAD+ (gestrichelt) ε NADH, λ =340 nm = 6,3 (L mmol-1 cm-1) Entsteht nun während der Enzymkatalyse NAD + aus NADH, so nimmt die Absorption bei 340 nm allmählich ab. Die Abnahme der Lichtabsorption kann im Photometer als Extinktionsabnahme leicht gemessen und damit der zeitliche Verlauf des Übergangs R + NADH + H + R-H 2 + NAD + optisch verfolgt werden. Allgemein werden im optischen Test Geschwindigkeiten von enzymatischen Reaktionen durch zeitliche Extinktionsänderungen gemessen, welche die Redox-Reaktionen des NAD(P)/NAD(P)H-Systems spiegeln. 6
10-stufige Pyruvat-Verdünnungsreihe Jede Gruppe bekommt eine 112 mm Pyruvat-Lösung. Setzen Sie die Verdünnungen laut Tabelle an. Jede Gruppe fertigt eine eigene Messreihe und die dazu gehörige Kurve an. Verfahren Sie dabei wie in der Vorbesprechung erläutert bzw. auf dem ausliegenden Vordruck am Arbeitsplatz dargestellt. Pyruvat-Lösungen py1 py2 py3 py4 py5 py6 py7 py8 py9 py10 (Py) erhalten, mm 112 78,4 52,3 29,04 14,52 7,26 3,63 1,82 0,91 0,45 *[Py] Küvette, mm 5 3,50 2,33 1,30 0,648 0,324 0,162 0,081 0,041 0,020 *Diese Konzentrationen ergeben sich aus dem Pipettierschema (s.u.) als Testkonzentrationen in der Küvette. Photometrische Messung der Reaktionsgeschwindigkeiten Mit jeder der erhaltenen Pyruvat-Verdünnungen werden die -Reaktionsgeschwindigkeiten wie folgt ermittelt: Mit Programm Testansatz die Messung mit dem EasySpec-Photometer starten Button Kinetik auswählen Bei Kinetik Parameter bei der 1. Messung Wellenlänge auf 340 nm stellen In die Küvette pipettieren, mischen und in den Strahlengang des Photometers stellen o 1000 µl Tris/HCl-Puffer o 50 µl Pyruvat-Verdünnung (variable Konzentration) Start drücken Bei Kinetik starten nach Sicherheitsanpassung nochmals Start drücken In die Küvette pipettieren, gründlich mit dem Spatel mischen (Spatel zwischen den Messungen in H2O spülen und abtrocknen) o 50 µl NADH+H + anschließend 1 min Vorlauf registrieren (beobachten ob Absorption konstant bleibt, sonst evtl. nochmals mit Spatel mischen und weitere min beobachten) Skalierung anpassen In die Küvette pipettieren und rasch (!) aber gründliche mischen: o 20 µl Registrierung ca. 3 min Danach mit Stop Kinetik Messung beenden Bei Berechnung Linear Fit auswählen Rote Linien auf Start und Ende des Bereichs mit der höchsten Reaktionsgeschwindigkeit legen (dabei Im Fenster Lineare Regression den Wert von Corr. kontrollieren, dieser sollte bei 0,99... liegen) Im Fenster Lineare Regression den Wert ABS/min ablesen und in der Tabelle notieren Fenster schließen (nicht speichern) Neue Messung beginnen... 7
Vorbereitung zur Darstellung der Ergebnisse Werten Sie bitte bereits parallel zu den Messungen die ersten Aufzeichnungen aus und tragen Sie die ΔE/min-Werte im Ergebnisprotokoll ein. Berechnen Sie die Reaktionsgeschwindigkeiten v gemäß der Gleichung: v [U/mL] = F (ΔE/min), wobei sich der Konversionsfaktor F folgendermaßen berechnen lässt: 1 V Testvolumen F = ε d V Enzym Ermitteln Sie F durch Einsetzen der gültigen Zahlenwerte; tragen Sie den erhaltenen Faktor und die errechneten Reaktionsgeschwindigkeiten v im Ergebnisprotokoll ein. Auswertung und Darstellung der Ergebnisse Mit der vervollständigten Tabelle im Ergebnisprotokoll liegen die Daten in geeigneter Form zur graphischen Darstellung der Versuchsergebnisse vor. Fertigen Sie folgende Graphiken an: 1. Substratsättigungskurve 2. Lineweaver-Burk-Plot Aus den Graphiken sollen graphisch bzw. rechnerisch die v max - und K M -Werte ermittelt und diese Werte für die beiden Auswertemethoden vergleichen werden. Literatur-Informationen K M -Werte für die aus 2 Organen des Schweins Herzmuskel Skelettmuskel Leber repräsentative K M -Werte für Laktat 3,3 mm 8,3 mm (ph 7,5) für Pyruvat 0,15 mm 0,12 mm 0,24mM für NADH + H + 0,011 mm 0,012 mm zur Substratinhibition Pyruvatkonzentrationen > 2 mm inhibieren die Reduktionsreaktion in geringem Ausmaß... (Angaben aus: biochemica information; Boehringer Mannheim, 1987) 8
Ergebnis-Protokoll für den Versuch Aktivitätsbestimmung der Laktatdehydrogenase Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeiten v Berechnung des Konversionsfaktors F (Einheit?): 1 V Testvolumen F = ----------- ------------------- = ε d V Enzym Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit v (Einheit?): v [U/ml] = F ( E/min) Pyruvatkonzentration E/min Reaktionsgeschwindigkeit 1) 5,00 2) 3,50 3) 2,33 4) 1,30 5) 0,648 6) 0,324 7) 0,162 8) 0,081 9) 0,041 10) 0,020 [S] [S] -1 in mmol L -1 in mmol -1 L Abs/mn (4 Nachkommastellen) v v -1 in U ml -1 in U -1 ml Bestimmung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit v max und der Michaelis-Konstante K M anhand: v max (Einheit?) K M (Einheit?) Substratsättigungskurve Lineweaver-Burk-Plot Datum, Unterschrift des Dozenten 9
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