Grundpraktikum Genetik 8. Kurstag 16.06.2005 Gentechnologie: Klonierung und Transformation von DNA Lerninhalte: Transformation, natürliche Kompetenz, Transformationseffizienz, Vektor, Plasmid, Resistenzgen, Replikationsursprung, Polylinker ( multiple cloning site ), Ligation, Markergen, Blau-Weiß-Test, Klonierung Genübertragung durch Transformation Die direkte Aufnahme von DNA-Molekülen und die stabile Weitergabe dieser Information wird Transformation genannt. Einige Bakterienstämme (insbesondere grampositive, wie z.b. Streptococcus pneumoniae) besitzen die Eigenschaft, DNA ohne besondere Vorbehandlung aufzunehmen. Diese Eigenschaft nennt man natürliche Kompetenz. In der molekularen Genetik findet allerdings hauptsächlich das gramnegative Bakterium Escherichia coli Verwendung. E. coli besitzt keine natürliche Kompetenz, kann aber durch verschiedene Methoden kompetent gemacht werden: Die Behandlung mit zweiwertigen Ionen (meist Ca 2+ ) macht Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase fähig zur Aufnahme von DNA. Werden so behandelte Zellen mit zirkulärer, superhelikaler Plasmid- DNA inkubiert, können ca. 10 6-10 8 Transformanden je µg DNA erzielt werden. Plasmide und Vektoren Plasmide sind zirkuläre, extrachromosomale DNA-Moleküle, die sich in der Zelle unabhängig vom Wirtsgenom vermehren können. Viele dieser natürlich vorkommenden Plasmide tragen Resistenzgene, welche die Bakterien gegen die Wirkung bestimmter Antibiotika schützen. Die schnelle Ausbreitung solcher (Multi-)Resistenzplasmide stellt im Krankenhausalltag eine beträchtliche Gefahr dar, denn viele pathogene Organismen sind inzwischen gegen eine Vielzahl therapeutisch wichtiger Antibiotika resistent. Ausgehend von den natürlich vorkommenden Plasmiden sind sogenannte Plasmidvektoren entwickelt worden, die sich durch folgende Eigenschaften auszeichnen: Sie sind klein, haben eine hohe Kopienzahl und besitzen im Allgemeinen nur noch das für die Selektion notwendige Resistenzgen sowie einen Replikationsursprung für ihre Vermehrung. Zur Erleichterung von Klonierungsexperimenten tragen Vektoren meist eine künstlich eingefügte Region (Polylinker oder multiple cloning site ), die eine Reihe sogenannter singulärer Restriktionsschnittstellen enthält. Dies bedeutet, 8-1
dass das Plasmid von den Restriktionsenzymen, die im Polylinker eine Erkennungssequenz besitzen, ausschließlich an dieser Stelle geschnitten werden. Abb. 1: Aufbau des Klonierungsvektors puc18 mit vergrößerter Darstellung des Polylinkers Ligation und Blau-Weiß-Test DNA-Fragmente mit einer Größe bis ca. 20 kb lassen sich mit Hilfe von Plasmidvektoren in Bakterienzellen einbringen. Dazu wird das zu klonierende DNA-Fragment mit einem Restriktionsenzym behandelt. Restriktionsenzyme sind aus Bakterien isolierte Enzyme, die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden. Auch der Vektor, in den ein DNA-Fragment eingebracht werden soll, muss mit einem Restriktionsenzym behandelt werden, welches passende Enden erzeugt. Das DNA-Fragment kann dann mit Hilfe der T4 DNA-Ligase in Gegenwart von Mg 2+ und ATP in den Vektor eingefügt werden (Ligation). Dabei katalysiert die Ligase die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen den offenen Enden des DNA-Fragments und dem Vektor. Zur Erkennung, ob ein Vektor ein DNA-Fragment aufgenommen hat, dient das β-galaktosidase-gen lacz als Markergen, dessen Ausprägung durch Insertion eines DNA-Fragmentes gestört wird. Die Aktivität der β-galaktosidase ist auf Platten durch den Indikator X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-Galaktosid) direkt nachweisbar, denn dieses Enzym spaltet den farblosen Indikator unter Freisetzung eines blauen Farbstoffes. Bakterien, die ein Plasmid ohne kloniertes DNA-Fragment aufgenommen haben, bilden daher auf X-Gal-Platten blaue Kolonien. Nach Insertion eines DNA- Stückes in das Plasmid kann keine funktionelle β-galaktosidase gebildet werden. Deshalb bleiben 8-2
Grundpraktikum Genetik 8. Kurstag 16.06.2005 diejenigen Kolonien, die ein rekombinantes Plasmid tragen, in der Regel auf X-Gal-Platten weiß (Blau-Weiß-Test). Klonierung Unter einer Klonierung versteht man die Vermehrung eines bestimmten DNA-Moleküls in Wirtszellen. Da alle Nachkommen einer Ausgangszelle genetisch identisch sind, spricht man von einem Klon (griech.: klõn, der abgebrochene Zweig, der für die vegetative Vermehrung von Rebstöcken oder Obstbäumen verwendet wird). Gleichzeitig findet durch das schnelle Wachstum der Bakterien (Teilungsrate: 20-30 min unter geeigneten Wachstumsbedingungen) eine enorme Vermehrung dieses DNA-Moleküls in der Bakterienpopulation statt, so dass bereits in einer Übernachtkultur eines transformierten Bakterienstammes genügend Vektor-DNA vorhanden ist, um die klonierte DNA in vitro zu untersuchen. Die Plasmid-DNA lässt sich durch einfache Methoden (Plasmid-Präparation) aus den Zellen isolieren. Dabei können aus 3 ml einer Kultur bis zu 50 µg Plasmid-DNA gewonnen werden. Experimentalteil Wir wollen in einem Transformationsexperiment mit nachfolgender Restriktionsanalyse die Klonierung eines DNA-Fragmentes durchführen und überprüfen. Ein 2140 bp großes Fragment ist durch Behandlung der DNA des Bakteriophagen λ mit der Restriktionsendonuklease PstI entstanden (s. Abb. 2). Dieses Fragment wurde in das Plasmid puc18 kloniert. Hierfür wurde der Vektor puc18 mit dem Restriktionsenzym PstI im Polylinker linearisiert und anschließend das PstI-Fragment des Bakteriophagen λ mit Hilfe der DNA-Ligase mit dem Vektor kovalent verknüpft. Da beide Enden des PstI-Fragmentes die gleichen Überhänge von 4 Nukleotiden aufweisen (vergl. S. 10 des Skriptes), kann das Fragment in beiden Richtungen - in der Molekulargenetik spricht man von beiden Orientierungen eines Fragmentes in puc18 ligiert werden. Weiterhin können natürlich auch puc18-moleküle auftreten, die kein fremdes DNA-Fragment (Insertion) besitzen, sondern bei denen die eigenen Enden verknüpft wurden (s. Abb. 2). Diese drei Molekültypen müssen nach einer Klonierung voneinander 8-3
unterschieden werden. Das insertionsfreie Plasmid lässt sich von den Plasmiden, welche eine Insertion tragen, mittels des Blau-Weiß-Tests unterscheiden (s. S. 2/3 des Skriptes). Bei den Plasmiden, die eine Insertion besitzen, lässt sich die Größe und die Orientierung des klonierten Fragmentes durch Restriktionsanalyse bestimmen (s. S. 3 des Skriptes). Zur Bestimmung der Größe des inserierten DNA- Fragments wird das Plasmid mit PstI geschnitten. Die Orientierung lässt sich durch Behandlung mit der Restriktionsendonuklease EcoRI feststellen. EcoRI schneidet das PstI-Fragment 945 bp vom Rand entfernt. Da EcoRI außerdem genau einmal im Polylinker schneidet, erhält man je nach Orientierung Fragmente mit einer Länge von 985 bp und 3880 bp (Orientierung A in Abb. 2) bzw. 1235 bp sowie 3631 bp (Orientierung B). Abb. 2: Klonierung des 2140 bp PstI-Fragmentes des Bakteriophagen λ in das Plasmid puc18. 8-4
Grundpraktikum Genetik 8. Kurstag 16.06.2005 Vor Beginn des Praktikums durchgeführte Experimente: Restriktion der λ-dna mit PstI und Isolierung des 2140 bp Fragmentes Restriktion von puc18 mit PstI Ligation beider DNA-Moleküle -> Plasmidgemisch 1. Versuchstag (16.06.05): Herstellung kompetenter E. coli-zellen Transformation des Plasmidgemisches Weiterführung am 20.06.05 oder 21.06.05: Auswertung der Transformation Animpfen von zwei E. coli-kulturen (von je einer blauen und einer weißen Kolonie) 2. Versuchstag (23.06.05): Isolierung der Plasmid-DNA und Restriktionsanalyse Gelelektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente 1. Versuchstag Der Versuch umfasst folgende Teile: Herstellung CaCl 2 -kompetenter E. coli-zellen und Überprüfung der kompetenten Zellen und Transformation des Plasmidgemisches in die kompetenten Zellen Zur Vorbereitung des Experimentes gießen Sie 3 LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 µg/ml) und X- Gal (40 µg/ml) sowie eine LB-Agarplatte ohne Zusätze. Herstellung CaCl 2 -kompetenter E. coli-zellen Die Behandlung von E. coli-zellen mit Ca 2+ -Ionen bewirkt aufgrund eines bisher nicht verstandenen Mechanismus, dass die Zellen mit hoher Effizienz Plasmid-DNA aufnehmen können. 8-5
Folgender Ansatz wurde vorbereitet: Ein Vollmedium (dyt-medium) wurde mit einer frischen Übernachtkultur des Stammes E. coli DH5α (lacz M15) 1:50 angeimpft und schüttelnd bei 37 C ca. 2 Stunden inkubiert. Bei Erreichen einer Konzentration von ca. 1 x 10 9 Zellen pro ml (optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) 0,5-0,8) wurde die Kultur bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert. Der Versuch wird im Praktikum folgendermaßen fortgesetzt: In vier Reaktionsgefäßen werden jeweils 1,5 ml Kultur 2 min bei 5000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird in den Flüssigabfall verworfen, die Zellpellets werden in jeweils 200 µl eiskalter 50 mm CaCl 2 -Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis gestellt. Danach werden die Zellsuspensionen 2 min bei 5000 Upm zentrifugiert, der Überstand wird wiederum verworfen, und die Zellen werden in jeweils 20 µl eiskaltem 50 mm CaCl 2 aufgenommen und auf Eis aufbewahrt. Diese kompetenten Zellen können bei Lagerung auf Eis innerhalb von ca. 12 Stunden für die Transformation verwendet werden. Transformation Es werden vier verschiedene Transformationsexperimente durchgeführt: 1. Kompetente Zellen werden ohne Zugabe von DNA gemäß dem Transformationsprotokoll (s. unten) behandelt und anschließend auf einer antibiotikumfreien Agarplatte ausplattiert. Dieses Experiment zeigt Ihnen, ob die kompetenten Zellen nach Kompetenzinduktion und Transformation weiterhin lebensfähig sind. 2. Kompetente Zellen werden wie im Experiment 1 ohne Zugabe von DNA behandelt, jedoch auf einer Agarplatte ausplattiert, die Ampicillin und X-Gal enthält. Dieses Experiment dient der Überprüfung der Antibiotikumsensitivität der Zellen. 3. Kompetente Zellen werden mit einer definierten Menge Plasmid (2 µl puc18; 50 µg/µl) transformiert und auf einer Agarplatte ausplattiert, die sowohl Ampicillin als auch X-Gal enthält. Mit diesem Experiment wird die Transformationseffizienz der kompetenten Zellen 8-6
Grundpraktikum Genetik 8. Kurstag 16.06.2005 bestimmt. Die Transformationseffizienz ist ein Maß für die Kompetenz der Zellen und gibt an, wie viele Transformanden bei einem Transformationsexperiment mit 1 µg eines superhelikalen, ringförmigen Plasmids erzielt werden können. Transformationseffizienz = Anzahl der Transformanden µg eingesetzte DNA Da die Transformationseffinienz im Bereich von 10 5 bis 10 6 Transformanden/µg DNA liegt, werden in der Regel werden aber nur einige ng des Plasmids transformiert, damit die Zahl der Kolonien auf den Transformationsplatten nicht zu groß wird. 4. Die kompetenten Zellen werden mit 2 µl des Plasmidgemisches behandelt und auf einer Agarplatte ausplattiert, die sowohl Ampicillin als auch X-Gal enthält. Dieses Experiment gibt Ihnen das Verhältnis rekombinanter zu nicht rekombinanten Klonen an. Von dieser Platte werden Sie am zweiten Versuchstag von je einer blauen (ohne Insertion) und einer weißen Kolonie (mit Insertion) eine Kultur ansetzen, aus der am 3. Versuchstag die Plasmid-DNA isoliert und mittels Restriktionsanalyse charakterisiert wird. Durchführung der Transformation: Die Gefäße mit den CaCl 2 -kompetenten Zellen (je 20 µl) werden beschriftet (Nr. 1 4; Gruppennummer) und bei den Ansätzen 3 und 4 wird die oben angegebene DNA-Menge zugegeben. Die Ansätze werden 15 min auf Eis inkubiert, anschließend genau 2 min in einen auf 42 C warmen Heizblock gestellt. Danach werden jeweils 500 µl dyt-medium ohne Ampicillin zugegeben und 30 min bei 37 C inkubiert (Wasserbad). In dieser Zeit regenerieren sich die Zellen und es wird das Enzym gebildet, das für den Abbau von Ampicillin notwendig ist (Ausprägung der Ampicillinresistenz). 100 µl dieser Transformationsansätze werden jeweils auf einer dyt-platte ausplattiert, welche die oben für die einzelnen Versuchsteile jeweils angegebenen Zusätze enthält (Ampicillin, X-Gal). 8-7
Weiterführung des Versuchs am 20.06.05 oder 21.06.05 Versuchsauswertung und Vorbereitung des Experiments Isolierung und Charakterisierung von DNA Werten Sie die Platten des ersten Versuchstages aus. Zählen Sie hierfür die Kolonien auf Ihren Platten und unterscheiden Sie dabei zwischen weißen und blauen Kolonien. 1. Geben Sie für die Transformationsansätze 1 und 2 den Grund an, warum sie durchgeführt wurden und werten Sie ihre Ergebnisse aus. 2. Erklären Sie auch für den 3. Transformationsansatz, warum er durchgeführt wurde, zählen Sie die Kolonien und bestimmen Sie die Transformationseffizienz ihrer kompetenten Zellen. Falls Sie sehr viele Kolonien auf Ihrer Platte haben (> ca. 200), zählen Sie nur einen Teilbereich ( Tortenstück ) der Platte aus und berücksichtigen dies bei Ihren Berechnungen. 3. Beim 4. Transformationsansatz (Plasmidgemisch) zählen Sie die blauen und weißen Kolonien (evtl. nur bei einem Teilbereich der Platte) und bestimmen das Verhältnis rekombinanter zu nicht rekombinanten Klonen. Jede Gruppe überführt dann jeweils eine weiße und eine blaue Kolonie von der Platte mit dem Plasmidgemisch mit einem sterilen Zahnstocher in 3 ml dyt-medium mit Ampicillin (100 µg/ml). Diese Kulturen werden über Nacht bei 37 C schüttelnd inkubiert und am nächsten Versuchstag für die Isolierung der Plasmid-DNA eingesetzt. 8-8