Diagnose angeborener Störungen der Thrombozytenfunktion

Leitlinie 201 Diagnose angeborener Störungen der Thrombozytenfunktion Interdisziplinäre S2K-Leitlinie* der Ständigen Kommission Pädiatrie der Gesellschaft für Thrombose- und Hämostaseforschung e. V. R. Knöfler 1# ; W. Eberl 2# ; H. Schulze 3# ; T. Bakchoul 4 ; F. Bergmann 5 ; S. Gehrisch 6 ; C. Geisen 7 ; S. Gottstein 8 ; S. Halimeh 9 ; U. Harbrecht 10 ; G. Kappert 9 ; C. Kirchmaier 11 ; B. Kehrel 12 ; W. Lösche 13 ; M. Krause 11 ; R. Mahnel 14 ; O. Meyer 15 ; A. K. Pilgrimm 11 ; D. Pillitteri 11 ; H. Rott 9 ; S. Santoso 4 ; A. Siegemund 16 ; C. Schambeck 17 ; M. Scheer 18 ; M. Schmugge 19 ; T. Scholl 11 ; G. Strauss 3 ; B. Zieger 20 ; R. Zotz 21 ; M. Hermann 22 ; W. Streif 22 1 Klinik u. Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin, Bereich Hämostaseologie, Universitätsklinikum Dresden; 2 Städtisches Klinikum Braunschweig; 3 Lehrstuhl für Experimentelle Biomedizin, Würzburg; 4 Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin, Gießen; 5 MVZ Wagner-Stibbe, Amedes-Gruppe, Hannover; 6 Medizinische Fakultät, Inst. f. Klinische u. Lab. Med., TU Dresden; 7 Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie, Frankfurt am Main; 8 Klin. f. Innere Medizin-Angiologie, Hämostaseologie; Vivantes-Klinikum im Friedrichshain, Berlin; 9 Gerinnungszentrum RheinRuhr, Duisburg; 10 Institut für Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin der Universität Bonn; 11 Deutsche Klinik für Diagnostik, Wiesbaden; 12 Klinik für Anästhesiologie, operative Intensivmedizin und Schmerztherapie, Experimentelle und klinische Hämostaseologie, Universitätsklinikum Münster; 13 IFB Sepsis, Center for Sepsis Control and Care, Uni-Klinikum Jena; 14 Hämostaseologische Praxis u. Labor zur Diagnostik und Therapie von Blutgerinnungsstörungen, Frankfurt am Main; 15 Institut für Transfusionsmedizin, Thrombozytenlabor Blutbank mit Immunhämatologie, Berlin; 16 MVZ Dr. Reising-Ackermann u. Kollegen, Leipzig; 17 Hämostasikum München; 18 Päd III, Universitätsklinikum Essen; 19 Hämatologie, Kinderspital Zürich, Schweiz; 20 Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Universitätsklinikum Freiburg; 21 Centrum für Blutgerinnungsstörungen und Transfusionsmedizin Düsseldorf ; 22 Univ.-Klinik für Pädiatrie I, Med. Uni. Innsbruck, Österreich Schlüsselwörter Thrombozyten, Thrombozytopathien, Leitlinie Korrespondenzadresse a.o. Univ. Prof. Dr. Werner Streif Innsbruck Medical University Univ.-Klinik für Pädiatrie I, Anichstrasse 35, 6020 Innsbruck, Österreich E-Mail: werner.streif@i-med.ac.at * AWMF # 086 003; S2K # Die Autoren RK, WE, HS haben zu gleichen Teilen bei getragen. Zusammenfassung Angeborene Störungen der Thrombozytenfunktion sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die oft erst bei Auftreten von Blutungen erkannt werden. Im klinischen Bereich haben sich nur wenige Methoden zur Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen bewährt. Für eine rationelle Diagnostik ist ein stufenweises Vorgehen empfehlenswert. Anamnese und klinische Untersuchung sind Grundvoraussetzungen. Das von-willebrand- Syndrom und andere plasmatische Gerinnungsstörungen sollten vor einer spezifischen Thrombozytenfunktionsdiagnostik immer ausgeschlossen werden. Die Bestimmung von Zahl, Größe, Volumen (MPV) und Morphologie der Thrombozyten erlauben Rückschlüsse auf die zu Grunde liegende Störung. Die PFA-100 -Verschlusszeit eignet sich als Screening zum Ausschluss schwerer Thrombozytenfunktionsstörungen. Die Aggrego metrie ermöglicht die Untersuchung zahlreicher Aspekte der Thrombozytenfunktion. Die Durchflusszytometrie ist zur Diagnose von Thrombasthenie Glanzmann, Bernard- Soulier- Syndrom und Freisetzungsstörungen geeignet. Molekulargenetische Untersuchungen können die Verdachtsdiagnose bestätigen oder zum Nachweis nicht beschriebener Defekte verwendet werden. Hier wird die ungekürzte Version der inter - disziplinären Leitlinie* präsentiert. Diagnosis of inherited diseases of platelet function Interdisciplinary S2K guideline* of the Permanent Paediatric Committee of the Society of Thrombosis and Haemostasis Research (GTH e. V.) Hämostaseologie 2014; 34: 201 212 http:dx.doi.org10.5482hamo-13-04-0024 received: April 22, 2013 accepted: May 21, 2014 epub ahead of print: June 6, 2014 Keywords Platelets, platelet disorders, guideline Summary Congenital disorders of platelet function are a heterogeneous group of disorders that are often not detected until bleeding occurs. In clinical settings only a few methods have proven to be useful for identification and classification of inherited platelet disorders. For a rational diagnostic approach, a stepwise algorithm is recommended. Patient history and clinical investigation are mandatory. Von Willebrand disease and other coagulation disorders should always be ruled out prior to specific platelet testing. Platelet count, size, volume (MPV) and morphology may guide further investigations. The PFA-100 CT is suited for screening for severe platelet defects. Platelet aggregometry allows assessment of multiple aspects of platelet function. Flow cytometry enables diagnosis of thrombasthenia Glanzmann, Bernard-Soulier syndrome and storage pool defects. Molecular genetics may confirm a putative diagnosis or pave the way for identifying new defects. We present an unabridged version of the interdisciplinary guideline. Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

202 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen Die Leitlinie soll die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozyto - pathien Thrombozytenfunktionsstörungen bei Kindern und Jugendlichen erleichtern. Zur rationalen und zielgerichteten Diagnostik wurden einzelne Kapitel erarbeitet. In einem Stufenalgorithmus wird zunächst die Diagnose einer Thrombozytopathie gestellt. Gegebenenfalls sind die diagnostischen Schritte individuell anzupassen, abhängig von einer positiven Familienanamnese, dem Lebensalter des Kindes, akuter und chronischer Blutungsneigung, verfügbarer Blutmenge und anderem. Für die häufigsten und am besten charakterisierten Thrombozytopathien werden weitere Informationen gegeben. Die wichtigsten allgemein anerkannten Methoden Aggregometrie einschließlich Varianten und Durchflusszytometrie, sind im Detail beschrieben. Zur Unterstützung einer Klassifizierung der Thrombozytopathie, insbesondere solcher mit Thrombozytopenie und assoziierten Symptomen () ist eine Liste beigefügt ( Tab. 3). Die Liste enthält detaillierte Informationen zu klinischer Präsentation, OMIM-Nummer ( www.ncbi.nlm.nih.govomim), Vererbungsmodus, genetischen Defekt und wichtigsten Diagnosekriterien. Für die weiterführende Diagnostik stehen die spezialisierten Zentren des Kompetenznetzes der Ständigen Kommission Pädiatrie der GTH zur Verfügung ( www.gth-online.org). Die Leitlinie ist nicht geeignet für die Beurteilung von Patienten, die plättchenaktive Substanzen erhalten, oder erworbene Störungen der Thrombozytenfunktion bzw. -zahl aufweisen. Stufendiagnostik einer hämorrhagischen Diathese Für eine rationale Diagnostik einer hämorrhagischen Diathese wird ein Stufen - schema ( Abb. 1) verwendet (3 9). Stufe 1 Stufe 2 Stufe 3 Hämorrhagische Diathese Syndromal 1 Medikamente, Nahrungsmittel, Nahrungsmittelergänzungsstoffe 2 Erhebung von internistischen Grund- und Begleiterkrankungen Ausschluss einer plasmatischen Gerinnungsstörung: PTT, PT, Fibrinogen, Faktor XIII 3 Faktor VIII 4, IX 4, von Willebrand Faktor 5 ; Inhibitoren 6, (Protein Z) 7 Thrombozytenzahl MorphologieGröße Normalab 1 Thrombozytopathie Ausschluss: Pseudothrombozytopenie 8 Immunthrombozytopenie (ITP) Thrombotische-Thrombozytopenische Purpura (TTP; ADAMTS 13) 9 Thrombozytenfunktionstests 10 Vasopathie Zuweisung an spezialisierte Zentren 11 Thrombozytenzahl MorphologieGröße Normalab 1 Abb. 1 Diagnostisches Stufenschema 1. Syndromal: Kinder mit komplexen Erkrankungen, Auffälligkeiten der Thrombozyten siehe Anhang Liste Molekulargenetik. 2. Siehe Anhang Medikamentenliste. 3. Faktor-XIII-Mangel wird nicht von den globalen Gerinnungstests (PT, PTT) erfasst. 4. Bei Jungen stets Faktor-VIII- und -IX-Mangel (Hämophilie AB) ausschließen. 5. Von-Willebrand-Faktor-Ag und Ristocetin-Kofaktor (alternativ Kollagenbindungsaktivität), evtl. Multimere; Faktor VIII bei ertem VWF : Ag bestimmen! 6. Inhibitoren: Lupus-Antikoagulans, Antiphospholipid-Antikörper, FVIIIIXVWF-Hemmkörper ausschließen. 7. Protein Z (Relevanz umstritten) 8. In-vitro-Phänomen bei Verwendung von EDTA als Antikoagulans 9. TTP häufig mit defekter VW-Protease (ADAMTS 13) assoziiert. TTP kann durch P2Y12 Inhibitoren ausgelöst werden. 10. Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) im PRP, Impedanzaggregometrie (IA) und Durchfluss - zytometrie im Zitratblut. 11. Siehe www.gth-online.org, Ständige Kommission Pädiatrie Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014

R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 203 Screening-Methoden In der klinischen Routine werden keine Tests der Thrombozytenfunktion durchgeführt (2). Durch Fortschritte in der Medizin und dem stark zunehmenden Einsatz von plättchenhemmenden Medikamenten gibt es ein steigendes Interesse an Thrombozytenfunktionstests. Die Bedeutung dieser Methoden für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen ist beschränkt. Für die Durchführung einer rationalen Thrombozytenfunktionsdiagnostik soll immer ein Stufenplan (Abklärungsalgorithmus; Abb. 1) verwendet werden, der auch die lokalen Gegebenheiten berücksichtigt. Als Vorinformation sollen zumindest Angaben zur Familien- und Individualanamnese vorliegen und eine körperliche Untersuchung durchgeführt werden. Beispiele für Fragebögen zur Blutungsneigung sind verfügbar unter www.gth-online.org, www.oegari.at und www.netzwerkvon-willebrand.de. Zumindest muss nach einer Neigung zu Epistaxis, Petechien, kutanen Hämatomen, Schleimhautblutungen, Menorrhagie, Weichteil- und Gelenkblutungen sowie, postinterventionellenpostoperativen Blutungen gefragt werden. Die Leitsymptome von Kindern mit klassifizierter Thrombozytenfunktionsstörung nach THROMKID (2) sind zusammengefasst ( Tab. 1). Als Basisuntersuchung soll eine Blutbildbestimmung einschließlich Retikulo - zytenzahl und Leukozytendifferenzierung erfolgen. Eine im Rahmen der Routineblutbildbestimmung an allen marktüblichen Großgeräten verfügbare Thrombozytengrößenverteilungskurve und das mittlere Thrombozytenvolumen sollen angefordert und evaluiert werden. Die Thrombozytengröße und Morphologie sind in der Lichtmikroskopie in Blutausstrichen mittels der Färbemethode von May-Grünwald-Giemsa zu beurteilen. Bei lokaler Verfügbarkeit hat sich die Thrombozytenaggregation (LTA, IA) mit mindestens drei verschiedenen Agonisten (ADP, Kollagen und Ristocetin) als Erstuntersuchung bewährt siehe Kapitel Aggregometrie. Folgende Methoden sind eingeschränkt zur Feststellung einer Thrombozytenfunktionsstörung geeignet: Tab. 1 Leitsymptome von 123 Kindern mit klassifizierter Thrombozytenfunktionsstörung nach THROMKID (2) Leitsymptom Epistaxis Hämatome Schleimhaut blutungen peri- postinterventionelle Blutungen Menorrhagie gastrointestinale Blutungen Hämarthros Häufigkeit (%) 54 20 11 7 5 2 1 In-vivo-Blutungszeit (10): Es sollen nur standardisierte Verfahren nach Ivy, Duke, Mielke, Borchgrevink oder Marx mit Surgicutt, Template, Precisette oder Hemostilette von erfahrenen Untersuchern angewendet werden. Die Patienten sollen über die Möglichkeit einer Narbenbildung aufgeklärt werden. Für Kleinkinder, Patienten mit Bindegewebs- und Hauterkrankungen ist die Methode nur eingeschränkt geeignet. Mangelnde Kooperation des Patienten, Anämie und Thrombozytopenie < 100000µl führen zu verfälschten Ergebnissen. PFA-100 -Verschlusszeit (In-vitro- Blutungszeit) (11 13) eignet sich insbesondere zur Diagnose von schweren Störungen der Thrombozytenfunktion. Das von-willebrand-syndrom und die Thrombasthenie Glanzmann führen zu einer Verlängerung der Verschlusszeit. Zu beachten ist, dass der von-willebrand-faktor beim Neugeborenen, Schwangeren und anderen Zuständen (Akutphaseprotein!) erhöht ist. Bei Kindern mit rezidivierenden Infekten ist mit einer en Variabilität der Verschlusszeiten zu rechnen. Grundvoraussetzung für die Testdurchführung ist eine Thrombozytenzahl über 100000µl und ein Hämatokrit (HKT) über 30 ll. Verkürzte Verschlusszeiten werden durch Hämolyse, HKT > 50 ll, Thrombozyten > 500000µl und verlängerte Verschlusszeiten durch Ikterus, Hämolyse, Anämie (HKT < 35 ll), Thrombozytopenie verursacht 1 und aufgrund der angewendeten Scherkräfte ist diese Methode grundsätzlich sensitiv zum Nachweis des von-willebrand-syndroms, der Thrombasthenie Glanzmann und des Bernard-Soulier-Syndroms. Die PFA- 100 - Verschlusszeit eignet sich auch zum Nachweis einer durch ASS induzierten Thrombozytenfunktionsstörung. Eine P2Y-Messzelle wurde zum Nachweis einer medikamentösen Hemmung der Thrombozytenfunktion durch den ADP-Rezeptorinhibitor Clopidogrel entwickelt. Ein verdächtiger oder pathologischer Befund bedarf einer weiteren Abklärung. Ungeeignete Methoden zur Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen sind die native Thrombelastographie, der Prothrombinverbrauchstest, der Rumpel-Leede-Test und der Thrombusretraktionstest. Das für das Drug-Monitoring entwickelte halbautomatische System Verify- Now (Accumetrics) und das Impact-R (Matis Medical) sind für die Diagnose und Klassifizierung von angeborenen Thrombozytenfunktionsstörungen nicht evaluiert und daher nicht ge eignet. Von den individuell eingesetzten und seltenen Methoden sind das Elektronenmikroskop (ELMI) und die histochemische Färbung von Zellen als diagnostische Verfahren anerkannt. Beide Methoden erfordern viel Erfahrung und werden daher nur an wenigen Zentren durchgeführt. Methodik, Befundung und Befundinterpretation unterscheiden sich wesentlich von Labor zu Labor. Hinweise über diese Methoden überschreiten die Ziele des Leitlinienprojekts. Informationen zu hochspezialisierten Labors können der Liste des Kompetenznetzwerks auf www.gth-online.org, Ständige Kommission Pädiatrie, entnommen werden. Die Bedeutung der konfokalen Lasermikroskopie als Ersatz oder Ergänzung der ELMI ist in Erforschung. Über die klinische Anwendung der aus der Wissen- 1 Auf Grund des verwendeten Vollblutes kann eine HämolyseIkterus nicht detektiertausgeschlossen werden. Hämatokrit und Zellzahlen haben einen direkten Einfluss auf die Fließeigenschaften des Blutes. Eine Bestimmung und Beurteilung des Blutbildes wird empfohlen. Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

204 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen schaft bekannten Durchflusssysteme (Flow Chamber), die als standardisierte Systeme erworben werden können, kann zurzeit noch keine Aussage getroffen werden. Aggregometrie Die Aggregometrie ist als Standarduntersuchung der Thrombozytenfunktionsdiagnostik zu bezeichnen. Es lassen sich damit eine Vielzahl von funktionellen Eigenschaften der Thrombozyten charakterisieren. Die Durchführung der Untersuchung, die Interpretation der Befunde und die Zuordnung zu einem definierten Krankheitsbild stellen eine e Herausforderung dar. Lichttransmissionsaggregometrie Die Lichttransmissionsaggregometrie (LTA) ist auch nach über 40 Jahren seit der Erstbeschreibung durch Born der Goldstandard zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion (4, 6, 8, 14). Die eingeschränkte Standardisierbarkeit und eine e Auswahl an Agonisten und deren Konzentrationen haben diese Methode in der Vergangenheit auf die Verwendung in spezialisierten Laboren eingeschränkt. Verschiedene Fachgruppen und Organisationen haben sich in den letzten Jahren der Standardisierung dieser Methode gewidmet. Prinzip Kontinuierliche Registrierung der im Verlauf der Aggregation sich ändernden Transmission langwelligen Lichts. In einem in Bewegung gehaltenem plättchenreichen Zitratplasma oder in einer Suspension gewaschener Thrombozyten kommt es nach Zusatz von Agonisten zur Aggregation. Zunehmende Aggregation führt zum Auftreten von Aggregaten und damit zur Zunahme der Lichttransmission, welche fortlaufend photometrisch registriert und in Kurvenform aufgezeichnet wird. Präanalytik Patient Patient kurz ruhen lassen 2. Kein Fasten 3, aber auf Grund des potentiellen Störfaktors alimentäre Lipidämie vermeiden. Medikamentenanamnese laut Medikamentenliste ( Tabelle im Anhang). Medikamente registrieren und nach Möglichkeit absetzen, sofern nicht dringend medizinisch indiziert. Gegebenenfalls bekannte Auswirkungen der Medikation bei Befundung berücksichtigen. NSAR mind. 3 Tage (unterschiedliche HWZ beachten), irreversible Aggregationshemmer (ASS) mind. 10 Tage, P2Y12 Hemmer (z. B. Clopidogrel) mind. 7 Tage, GP-IIbIIIa-Inhibitor (z. B. Abciximab) mind. 3 Tage. Blutgewinnung Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen (DINISO 6710 Vacutainer möglich) Natriumzitrat 109 oder 129 mmoll resp. 3,2 oder 3,8% Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile bei schlechten Venenverhältnissen und kleinen Kindern ggfs. abtropfen lassen. Nadel mit 19 bis 21 Gauge nur leicht und nicht zu lange stauen bei problematischer Punktion erstes Röhrchen unbedingt verwerfen 3 bis 4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden Folgeabnahmeröhrchen für Thrombozytenanalyse verwenden, unbedingt Schaumbildung vermeiden über- unterfüllte Proben ablehnen, Füllung der Röhrchen wie vom Hersteller gefordert, Proben nicht kühlen, Transport bei Raumtemperatur, keine Rohrpost! Angabe der Uhrzeit der Blutentnahme auf der Probe (als auch Analysezeitpunkt) verzeichnen. Thrombozytenzahl unbedingt vor Zentrifugation bestimmen. 2 Der Einfluss von den Punktionsschmerz lindernden Lokalanästhetika (EMLA ) auf das Testergebnis ist ungeklärt. 3 Alimentäre Hyperlipidämie vermeiden inter - agiert mit Probenanalyse. Probenvorbereitung Zentrifugation bei Raumtemperatur bei Thrombozytenzahl in Ausgangsprobe < 100 000µl Probe spontan sedimentieren lassen oder schonende Zentrifugation nach Laborspezifikation PRP 150 x g für 10 min keine Bremse. Thrombozytenzahl im PRP messen. Keine Einstellung der Thrombozytenzahl erforderlich, wenn Thrombozytenzahl im PRP zwischen 150 000 und 500 000µl. Bei Thrombozytenzahl im PRP < 150 000µl Kontrolle mit angepasster Thrombozytenzahl mitmessen. Niedrige Thrombozytenzahl bei z. B. Bernard-Soulier-Syndrom, VWS Typ 2B, Platelet-type VWS! Bei hoher Thrombozytenzahl > 500 000µl mit autologem PPP korrigieren und auf 250 000 bis 300 000µl einstellen. für Riesenplättchen: Sedimentation für ca. 45 min, 45 Winkel für Sedimentation, nicht aufrichten und in 45 Winkel belassen für PRP-Entnahme. PPP 1500 x g für 10 min Qualität der Proben kontrollieren. Hämolytische Proben verwerfen. Lipidämie berichten. Methodik Normalkontrolle als Qualitätsstandard mindestens 1 xwoche mitführen. Eichung des Gerätes mit plättchenarmen autologen Plasma als Markierung der Lichttransmission von 100% Plättchenreiches Plasma bezeichnet den Nullwert der Lichttransmission. Rührgeschwindigkeit: 1000 Umin Temperatur: 37 C Kurve vor Induktorzugabe für mind. 1 min beobachten (stabile Grundlinie, Spontanaggregation registrieren) Agonistenmenge (wässrige Lösung) darf 10% des Probenvolumens nicht übersteigen. Beobachtung der Kurve für mind. 10 min bzw. bis zur maximalen Amplitude. Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014

R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 205 Abschluss der Untersuchung möglichst nach 2 h spätestens 4 h nach Blutabnahme (Zeitpunkt dokumentieren!). Agonisten Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Herstellerangaben beachten. Prinzip: zunächst e Agonistenkonzentration wählen, da hohe Konzentrationen Defekte verdecken können. Keine sequenzielle Agonistenzugabe! Ausnahme: Ristocetin. Ristocetin: 1,2 1,5 mgml (0,5 0,6 mgml zur Erfassung des VWS Typ 2B). Bei Neugeborenen sind ere Endkonzentrationen der Agonisten erforderlich. Arachidonsäure: 1,0 1,5 mmoll ADP: 2 3 µmoll (Verdopplung der Konz. falls keine Reaktion mit er Konz.) Beurteilung der second wave. Eine Probe sollte bei einer Konzentration von 2 3 µmoll reagieren. Nach Standzeit benötigen Proben höhere Konzentrationen: Erhöhung auf 4 µmoll. Epinephrin: 5 µmoll (ggfs. höhere Dosis, z. B. 10 µmoll). Kollagen: 0,5 2 (bis 4) µgml je nach Art des Kollagens! TRAP: 10 µmoll Tab. 2 Erkrankung Typische Befundkonstellation (LTA) Thrombasthenie Glanzmann Bernard-Soulier-Syndrom Aspirin-like Defekt Storage-Pool-Defekt Aggregation mit ADP herabgesetzt fehlend Kollagen herabgesetzt herabgesetzt Beurteilung von Aggregationskurven Für jeden Agonisten und jede Konzentration sollen hauseigene Referenzwerte durch mindestens jeweils 20 Analysen erfolgen besonders wichtig bei Kollagen aufgrund der unterschiedlichen Kollagenarten mit erheblichem Einfluss auf die Testergebnisse. Normalbereiche definieren bei größeren Fallzahlen dafür auch Verwendung von Perzentilen möglich als pathologisch sind alle Werte anzusehen, die außerhalb eines Bereiches von ± 2 SD liegen (Normalverteilung vorausgesetzt). Visuelle Beurteilung der Kurven auf Plausibilität Obligatorischer Bericht: Latenzphase (Lag-time), maximale Aggregation, Beurteilung einer Desaggregation (vorhanden, bei >10% ->Angabe). Optionaler Bericht: Maximale Aggregationsgeschwindigkeit (Kurvenanstieg), Formenwandel (shape change), Bestimmung der Fläche unter der Aggregationskurve. ( Tab. 2) Impedanzaggregometrie im Vollblut Whole Blood Aggregometry (WBA) Die Impedanzaggregometrie (IA) ist eine Variante der Aggregometrie bei der mit isotoner Kochsalzlösung verdünnte und mit Zitrat antikoagulierte Vollblutproben analysiert werden (15). Diese Methode hat in letzter Zeit vermehrt Verwendung als Point-of-care in semi-automatischen Ge - räten gefunden. Die Standardisierung ist schwierig. Prinzip Eine Halterung mit zwei Elektroden wird in die mit einem Rührstäbchen versehene, auf 37 C erwärmte Probe eingetaucht. Mit Zugabe eines Agonisten (Induktors) kommt es zu einer Impedanzerhöhung infolge der Anlagerung von aggregierten Thrombozyten an den Elektroden, welche als zeitliche Funktion der Impedanzzunahme aufgezeichnet wird. Präanalytik Patient Analog zur LTA (siehe dort). Blutgewinnung Analog zur LTA (siehe dort). Ausnahme: Multiplate ist für Hirudinantikoagulierte Proben standardisiert. Empfohlenes Abnahmeröhrchen: Dynabite HIRUDIN 4,5 ml für Multiplate Analyse, REF : MP0620. Arachidonsäure herabgesetzt Ristocetin herabgesetzt fehlend Geräte Chronolog-Aggregometer (Chronolog Corporation, Havertown, USA). Multiplate (Dynabyte, München, Deutschland). Probenvorbereitung Vor dem Test Blut für mindestens 10 30 min bei Raumtemperatur ruhen lassen. Im Chronolog-Aggregometer Blut in die mit NaCl 0,9% vorgefüllten Küvetten im Verhältnis von 1 : 1 (Gesamtprobenmenge 1000 µl : 500 µl Vollblut und 500 µl NaCl 0,9%) überführen und bei 37 C für 15 bis 20 min im Gerät vorwärmen. Die Vollblutprobe für Multiplate laut Vorgabe (mit dem Gerät verbundene halbautomatische Pipette) mit NaCl 0,9% verdünnen. Agonisten (Chronolog-Aggregometer) Agonisten frisch am Tag der Messung zubereiten bzw. auftauen, Hersteller - angaben beachten. Gleiches Prinzip wie bei LTA: mit er Agonistenkonzentration beginnen. ADP: 10 µmoll (ggfs. steigern auf 20 µmoll) Kollagen: 1 µgml (ggfs. steigern auf 2 µgml) Arachidonsäure: 0,5 mmoll (ggfs. steigern auf 1,0 mmoll) Ristocetin: 1,25 mgml (0,2 0,6 mgml bei Verdacht auf VWS Typ 2B) Agonisten (Multiplate) ASPI-Test (Arachidonsäure) mit 1 ml aqua destillata auflösen, aliquotiert bei 20 C einfrieren, und unmittelbar vor Gebrauch auftauen. RISTO-Test (Ristocetin) mit 1 ml aqua destillata auflösen, aliquotiert bei 20 C Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

206 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen Tab. 3 Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter Thrombozytopathien Defekt bzgl. Adhäsion Aggregation Thrombopenie (Abkürzung) Bernard-Soulier-Syndrom (BSS) OMIM 231200 Ver - erbung Gen (Genort) GP1BA (17p13.2); GP1BB (22q11.21); GP9 (3q21.3) Thrombozytenzahl größe* DiGeorgeVelokardiofaziales Syndrom (DGS) Thrombozyten-Typ oder Pseudo-von-Willebrand-Syndrom (PTVWD) Glanzmann Thrombasthenie (GT) 188400 177820 273800 GP1BB (22q11.2) GP1BA (17p13.2) ITGA2B, ITGB3, (17q21.3132) Rezeptor Granula und Signal - transduktion Velokardiofaziales Syndrom (VCFS) ADP-Rezeptor-Defekte P2Y12 (purinerger Rezeptor P2Y; P2RY12) Kollagenrezeptor-Defekte (Glykoprotein VI, GP6) Thromboxane-A2-Rezeptor- Defekte (TBXA2R) Grey-Platelet-Syndrom (GPS) Arthrogrypose mit renaler Dysfunktion und Cholestase (ARCS1) Quebec-Platelet-Syndrom (QPD) Paris-Trousseau-Typ Thrombozytopenie (TCPT); Jacobsen-Syndrom (JBS) Hermansky-Pudlak-Syndrom (HPS) Chediak-Higashi-Syndrom (CHS1) Griscelli-Syndrom Typ 2 (GS2) 192430 600515 605546 188070 139090 208085 601709 188025 147791 214500 607624 CGS c -GP1BB (22q11) P2RY12 (3q24 25) GP6 (19q13.42) TBXA2R (19q13.3) NBEAL2 (3p21.31) VPS33B (15q26.1) PLAU Tandem-Duplikation (10q22.2) Deletion von 11q23 24; hemizygote Deletion von FLI1 (11q24.1-q24.3) HPS1 8, HPS1, AP3B1, HPS3, HPS4, HPS5, HPS6, DTNBP1, BLOC1S3 CHS1 (1q42.3) RAB27A (15q21.3) RUNX1 151385 RUNX1 (21q22.12) GATA-Bindungsprotein 1 (GATA1) 305371 XL GATA1 (Xp11.23) Laborabität, klinische Manifestation bzw. Erscheinungsbild defektes GPIbIXV (CD42abcd) homozygot: erweise schwere Thrombozytopenie, Riesenthrombo zyten und defekte Ristocetin-induzierte Thrombozytenagglutination heterozygot: milde Thrombozytopenie, e Ristocetin-induzierte Thrombo - zytenagglutination. Durchflusszytometrie T-Zell-Defekt: kardiale, faziale und kognitive Abitäten, Hypoparathyreoidismus, Thymushypoplasie spontane Thrombozytenaggregation in vitro und erhöhte Thrombozytenagglutination nach Ristocetin; VWF-Multimere und VWF:AG ert wichtig: Unterscheidung zum von-willebrand-syndrom 2B! Defektes GPIIbIIIa (CD41a, CD41b, CD61); wichtig: Heterozygotennachweis mit Durchflusszytometrie; defekte Thrombozytenaggregation (auf alle Agonisten, aus - genommen Ristocetin) defektes GPIbIXV: Gaumenspalte, faziale Dysmorphie, kardiale Anomalien, Lernschwierigkeiten Thrombozytenaggregation: abe Reaktion auf ADP Thrombozytenaggregation: abe Reaktion auf Kollagen Thrombozytenaggregation: abe Reaktion auf Arachidonsäure graue Plättchen, keine α-granula. graue Plättchen, keine α-granula. variable Thrombozytopenie, abe Urokinase in Thrombozyten, Nachblutungstyp kardiale und faziale Anomalie, mentale Retardierung, Riesen-α-Granula Riesengranula, erte oder nicht vorhandene δ-granula; Luminometrie: erte oder gar nicht vorhandene ATP-Freisetzung; okulokutaner Albinismus Rieseneinschlüsse in Neutrophile, erte oder irreguläre δ-granula, Immundefizienz Ähnelt dem Chediak-Higashi Syndrom (CHS; 214500): partieller Albinismus, häufig pyogene Infektionen, akute Fieberschübe, Neutropenie, erte Thrombozytenaggregation RUNX1 reguliert MYL9-Expression in Megakaryozyten: erte Thrombozyten - aggregation und ATP-Sekretion, Neigung zur Leukämie dyserythropoetische Anämie, Makrothrombozytopenie, Neigung zur Myelodys plasie, wenig α-granula Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014

R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 207 Laborabität, klinische Manifestation bzw. Erscheinungsbild größe* Thrombozytenzahl Immundefekt (T-Zell), Infektionen und Ekzeme; erte Aggregation und Sekretion, ertes oder nicht vorhandenes WAS-Protein in der Durchflusszytometrie klein mögliche milde Immundefizienz, defektes WAS-Protein klein erte Thrombozyten-Gefäßwandinteratktion auf Scherkräfte; periventrikuläre noduläre Heterotopie, otopalatodigitales Syndrom Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Döhle-Körper in Leukozyten Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Einschlüsse in Leukozyten Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Döhle-Körper in Leukozyten, Nephritis, Schwerhörigkeit, Katarakt Thrombozytopenie, Riesenthrombozyten, Nephritis, Schwerhörigkeit schwere Thrombozytopenie, fehlende Megakaryozyten im Knochenmark proximale Fusion von Radius und Ulnar, Neigung zu Knochenmarksversagen bilateral fehlende Radii einfrieren, und unmittelbar vor Gebrauch auftauen. COL-Test (Kollagen) mit 1 ml aqua destillata auflösen, bei Kühlschranktemperatur (4 6 C) lagern! ADP-Test (ADP) mit 1 ml aqua destillata auflösen, aliquotiert bei 20 C einfrieren, und unmittelbar vor Gebrauch auftauen. TRAP Test (Thrombin Receptor Activating Peptide) mit 1 ml aqua destillata auflösen, aliquotiert bei 20 C einfrieren, und unmittelbar vor Gebrauch auftauen. Auswertungsmodus der Aggregations - kurven (Chronolog Aggregometer) Vor Beginn der Messung Kalibration mit einer mit isotonischer Kochsalz - lösung gefüllten Küvette. Charakterisierung der Aggregations - kurven durch folgende Parameter: obligatorisch: maximale Aggregation (in Ohm) und Latenzphase (lag-time in s). optional: Aggregationsrate (in %min) und Fläche unter der Kurve altersabhängige Referenzbereiche beachten (16, 17). Tab. 3 Fortsetzung Ver erbung Ver - erbung OMIM Thrombopenie (Abkürzung) Defekt bzgl. Zytoskelett Wiskott-Aldrich-Syndrom (WAS) 300392 XL WASP (Xp11.23-p11.22) WASP (XP11) XL 313900 X-chromosomale Thrombozyto - penie (XLT) FLNA (Xq28) XL 300017 Filaminopathie A (FLNA) MYH9 (22q12.3) MYH9 (22q12.3) MYH9 (22q12.3) 155100 605249 153640 May-Hegglin-Anomalie (MHA) Sebastian-Syndrom (SBS) Fechtner-Syndrom (FTNS) MYH9 (22q12.3) 153650 Epstein-Syndrom c-mpl (1p34) 604498 kongenitale amegakaryozytische Thrombozytopenie (CAMT) andere HOXA11 (17p15.2) 605432 amegakaryozytische Thrombozytopenie mit radio-ulnarer Synostose (CTRUS) RBM8A (1q21.1) (200 kb Deletion) digenetisch 274000 Thrombozytopenie mit fehlender Radii (TAR) : autosomal dominant; : autosomal rezessiv; XL: X-chromosomal; *lichtmikroskopisch Auswertungsmodus der Aggregations - kurven (Multiplate) Parameter: Fläche unter der Kurve (area under the curve in Units), maximale Aggregation (Aggregation Units), Aggregationsgeschwindigkeit (velocity in Umin) altersabhängige Referenzbereiche, siehe (12) Luminometrische Bestimmung der ATP-Freisetzung Mit dieser durch Lundin et al. erstmals vorgestellten Methode wird die thrombozytäre ATP-Freisetzung gemessen, wodurch Sekretionsdefekte der δ-granula (Storagepool-Defekt) identifiziert werden können (18). Prinzip Zitratantikoaguliertem Vollblut oder PRP wird das Luciferin-Luciferase- Reagenz (LLR) zugefügt, welches in Gegenwart von ATP luminesziert. Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

208 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen Die bei der ATP-Freisetzung entstehende Lumineszens wird photometrisch von einem Photomultiplier erfasst. Mit Hilfe eines externen ATP-Standards erfolgt die Auswertung der ATP-Freisetzungskurve. Gerät Chronolog-Lumiaggregometer (Chronolog Corporation, Havertown, USA) Kommentar zur Leitlinie Thrombozytenfunktionsteste Agonisten Gesamtprobenmenge 1000 µl (450 µl Zitratblut, 450 µl NaCl 0,9% und 100 µl LLR) Ansätze nach Zugabe von LLR bei 37 C für 2 min vorwärmen. Kollagen: 2 µgml Thrombin: 1 Eml Auswertungsmodus der Freisetzungskurve Freisetzungskurve bis zum Erreichen des Peaks aufzeichnen. Das klassische Verfahren der gerinnungsphysiologischen Labordiagnostik ist die Messung der Fibrinbildung im Plasma. Diese Einschränkung auf die plasmatische Gerinnung führt zu dem lange bekannten und beklagten Mangel der Erfassung der primären Hämostase und der Thrombozytenfunktion. In der Routine- und Notfall - diagnostik ist immer noch nur die Thrombozytenzahl in der Patientenversorgung verfügbar. Die Thrombozytenfunktionstestung blieb lange auf wenige Speziallabore beschränkt, die mit aufwändigen händischen Methoden (z. B. Aggregometrie nach Born, Durchfluss - zytometrie) arbeiteten und arbeiten. Für Prä - analytik, Aktivatoren und Bewertung der Befunde sind zahlreiche Varianten im Gebrauch. Offensichtlich ist der Ruf nach standardisierter, vergleichbarer Analytik und Ergebnismitteilung nicht wirklich erfüllbar. Erst die weitgehend automatisierte Messung der Thrombozytenfunktion im Vollblut (PFA, Impendanzaggregometrie) ermöglicht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen Laboratorien. Diese wird auch für die aufwändigen klassischen Methoden mehr und mehr gefordert, nicht zuletzt weil sie noch als hochwertige Standardverfahren gelten. Leitlinie und technischer Report Die GTH gab den Anstoß zur Bildung einer interdisziplinären Gruppe aus der Kommission Pädiatrie, die eine Leitlinie zur Thrombozytenfunktionsdiagnostik erarbeitet hat. Dabei wurden sowohl die aufwändigen Standardmethoden als auch neuere automatisierte Messsysteme eingeschlossen. Diese Leitlinie Thrombozytopathien ist im AMWF-Leitlinienregister verfügbar (Nr. 086 003, Klasse: S2K) und wird auch in dieser Hämostaseologie-Ausgabe präsentiert. Automatisierte Methoden werden inzwischen vor allem zum Monitoring von Thrombozytenhemmern breit eingesetzt, komplexe Verfahren wie die Lumino - metrie bleiben dagegen nur ganz wenigen Laboratorien vorbehalten. Obwohl evtl. einzelne technische Details in der Leitlinie nicht ganz auf aktuellem Stand sind, so ist dieses Dokument dennoch unverändert wertvoll, weil es die unterschiedlichen Testsysteme systematisch nebeneinander stellt und wenn möglich eine Standardisierung verschlägt. Des Weiteren haben einige GTH-Mitglieder in der DIN-Kommission Haemostaseologie einen technischen Report (Technical Report Nr. DIN SPEC 58961: 2013 04) zur Thrombozytenfunktion fertig gestellt, der über das deutsche Institut für Normung (DIN-Beuth Verlag) bezogen werden kann. M. Spannagl, München R. Knöfler, Dresden Parameter zur Charakterisierung der ATP-Freisetzungskurve: obligatorisch: maximale ATP-Freisetzung (Berechnung erfolgt unter Verwendung eines ATP-Standards mit definierter ATP-Menge, die einer separaten Probe zugegeben wird.) optional: Reaktionszeit bis zum Erreichen des Peaks. Altersabhängige Referenzwerte beachten (analog zur Literatur unter IA für das Chronolog Aggregometer)! Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie ist als fixer Bestandteil der Zelldiagnostik etabliert. Die Beurteilung von Thrombozyten zur Diagnose von angeborenen Störungen der Thrombozytenfunktion ist relativ neu und unzureichend standardisiert (20). Die Durchflusszytometrie eignet sich sehr gut zur Diagnose der Thrombasthenie Glanzmann, des Bernard-Soulier-Syndroms und der Storage-pool-Erkrankung (α-δ- Gra nu la defekte). Die besonderen Vorteile liegen in geringen benötigten Blutmengen und in der einstufigen Diagnostik mit der Möglichkeit der Identifizierung heterozygoter Träger (21). Prinzip Quantifizierung konstitutiver Oberflächenrezeptoren und Messung von Granula - inhaltsstoffen vor und nach Aktivierung. Präanalytik Patient Blutbild einschließlich Thrombozytenzahl bestimmen! Kein Fasten Koffeinabstinenz mind. 2 Stunden Nikotinabstinenz mind. 60 min Patient kurz ruhen lassen. Medikamentenanamnese: vgl. Tabelle im Anhang. Blutgewinnung bei Indexpatient und gesundem Kontrollprobanden Nur leicht und nicht zu lange stauen. 3 bis 4 ml Blut abnehmen und für andere Analysen verwenden Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014

R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 209 Unterdruck-Abnahmesysteme vermeiden (Vacutainer). Nadel mit 19 bis 21 Gauge. Plastikröhrchen (Polypropylen) oder silikonisierte Glasröhrchen Natriumzitrat 109 oder 129 mmoll resp. 3,2 oder 3,8%. Zitrat : Blut = 1 Teil : 9 Teile. Probenverarbeitung 30 90 min nach Abnahme ausschließlich Analyse von Zitrat-antikoaguliertem Vollblut ohne Fixans oder Konservierung bis 3 Stunden nach erfolgter Färbung Keine Lyse der Erythrozyten durchführen; cave ATP- und ADP-Freisetzung. Proben bei Raumtemperatur transportieren und lagern, nie kühlen! Schütteln und mechanischen Stress (auch Rohrpost) für Thrombozyten vermeiden. Inkubation ca. 15 Minuten im Dunkeln, dann mit Puffer (1%BSA auf PBS) verdünnen und messen. Apparative Voraussetzung Durchflusszytometer; allgemeine Qualitätskontrollen werden vorausgesetzt. Thrombozytenzahl: Vollblutprobe benötigt im Regelfall keine Einstellung der Thrombozytenzahl. Cave: Gesamtzellzahl darf nicht über der Auflösung des Gerätes liegen (am FACS-Canto II z. B. 10000 Eventss). Ansatz in Polypropylenröhrchen Direkt Fluorochrom-markierte AK verwenden. Schwach exprimierte Antigene mit stark fluoreszierenden Farben markieren (z. B. PE) stark exprimierte Antigene mit schwächeren Farben markieren (z. B. FITC). Positive immunologische Erkennung der Thrombozyten durch Färbung eines konstitutiv hochexprimierten Rezeptors mit einem PE-oder PE-Cy5-markierten AK gegen CD41 oder CD42 oder CD61. Sichere Erkennung von schwach exprimierten Rezeptoren oder aktivierungsabhängig exprimierten Rezeptoren durch Messung einer adäquaten Isotyp- Kontrolle vor der jeweiligen Rezeptormessung (IgG oder IgM beachten!). Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie Negativkontrolle: IgG1 FITC IgG1-PE: Gleiche Ig-Subklasse, oder AK gegen AG, das nicht auf Thrombozyten exprimiert ist, z. B. gegen Neutrophile (CD16). Positivkontrolle: CD41a- FITC CD42b-PE (zur Auffindung z. B. CD31 CD36) Thrombasthenie Glanzmann IgG1 FITC IgG1-PE CD41a-FITC oder CD41b- FITC CD61-PE + FSCSSC e Oberflächenpräsentation von und nach Stimulation Empfohlen werden Antikörper gegen folgende Antigene: CD41a Fibrinogenrezeptor (GPIIbIIIa) gesamter Komplex (stöchiometrisch) CD41b Fibrinogenrezeptor (GPIIb) CD42ab (Fluorescence-minus-one)- Kontrolle verwendet werden. Darstellung der FSC- und SSC-Signale in logarithmischer Skalierung Stop-Kriterium der Messung: ca. 10 000 Thrombozyten im Gate. Es wird empfohlen alle Zellen aufzunehmen um Makro thrombozyten und Thrombozytenaggregate identifizieren zu können. Falls Zähl-Beads verwendet werden nicht mit Thrombozyten zusammen ansetzen. von-willebrand-faktor-rezeptor (GPIbαIX) CD61 Fibrinogenrezeptor (GPIIIa) CD49b Kollagenrezeptor (GPIaIIa) Empfohlen werden folgende Antikörper gegen aktivierungsabhängig exprimierte Antigene: Messung nach Stimulation der Thrombozyten mit ADP und TRAP CD62 P P-Selectin (α-granula) GP-53 (lysosomale und δ-granula) CD107ab LAMP-12 (lysosomale Granula) PAC1 aktivierter GPIIbIIIa-Komplex- Fibrinogenrezeptor (Inside-out-Signaling) gemessen durch den spezifischen IgM Antikörper PAC-1. keine (erhöhte) Bindung von Fibrinogen oder dem Fibrinogen-simulierenden Anti- GPIIbIIIa-Antikörper PAC1 nach Stimulation mit ADP, Kollagen, Thrombinrezeptor PAR-1 Aktivator (TRAP) Bernard-Soulier-Syndrom IgG1 FITC IgG1 PE oder korrekte Isotypkontrolle CD42a-FITC CD42b-PE CD42c + FSCSSC (Shift wegen Größe) Zur Untersuchung der δ-granula eignet sich der Mepacrine-Assay (22). Glanzmann-Diagnostik 4 Thrombozyten-Zahl, Größe (Forward Scatter) CD41a (gesamten Rezeptorkomplex stöchiometrisch erkennend)-klon P2 CD41b (GPIIb) CD61 (GPIIIa) Aktivierungsmarker PAC-1, + CD42b (als Alternative FITC-markiertes Fibrinogen statt PAC1) Glanzmann-Typ I: CD41a < 10% (Fib.rez. homozygot verändert) Glanzmann-Typ II: CD41a > 10% Bernard-Soulier-Diagnostik Thrombozyten-Zahl vermindert, Größe (Forward Scatter) erhöht CD42a (GPIX) vermindert CD42b (GPIbα) vermindert CD42c (GPIbβ) vermindert. Es können selektiv einzelne Komponenten, oder mehrere Untereinheiten durch stöchiometrische Bindungseffekte reduziert sein ( Kasten). Aktivierungsmarker Fragestellungen: 1. ADP-Rezeptor-Stimulierbarkeit 2. Thrombinrezeptor-Stimulierbarkeit 4 Vereinfachte Klassifizierung in Typ I und Typ II. Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

210 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen Vorschlag zum rationalen Einsatz der Durchflusszytometrie mit Aktivierung Beispiel aus der Arbeitsgruppe Harald Schulze (4 Farben): Tab. Tube Antikörper FITC PE PE-Cy5 PerCP APC Agonist FITC IgG1 PE IgG1 PE-Cy5 PE-Cy7 K1 K2 CD61 CD49b CD29 CD49e CD42a CD49f CD42b CD41a --- --- unstimuliert CD41 K3 PAC-1 CD41a --- 2 µmoll ADP CD41 K4 --- --- CD41a 2 µmoll ADP 1 µmoll TRAP-6 CD41 K5 PAC-1 CD41a FMO* 5 µmoll ADP 10 µmoll TRAP-6 CD41 K6 PAC-1 FMO* CD41a 1 µmoll TRAP-6 5 µmoll ADP PAC-1 CD41 K7 FMO* CD41a 5 µmoll TRAP-6 *Bei Mehrfarbenmessung kann eine FMO (Fluorescence-minus-one)- Kontrolle verwendet werden. 3. Vorhandensein von Granula 4. regelrechte Ausschüttung der Granula Granuläre Aktivierungsmarker α-granula: lysosomale Granula: Dense-Granula: Mepacrine-Beladung oder Serotonin-Reuptake-Test Rezeptorassoziierter Aktivierungsmarker PAC-1: aktivierter Fibrinogenrezeptor Storage-Pool-Disease Diagnostik Aktivatoren: Standard: ADP und TRAP-6 (SFLLRN) - humaner Protease Activated Receptor-1 (PAR1-Peptid für basale Aktivierungsuntersuchungen) weiterführend: Kollagen und Tx-A2- Agonisten (U-46619) Agonistenkonzentrationen: ADP: 2 10 µmoll TRAP-6: (1 ) 10 100 µmoll (Konzentration Produkt-abhängig!) Inkubation mit Aktivator für 5 Minuten, anschließend für weitere 15 Minuten AK dazu (im Dunkeln inkubieren!), dann Abstoppen mit Puffer (1% BSA oder Albumin auf PBS) und innerhalb 30 bis max. 60 Minuten messen ( Kasten). Beurteilung Nach mittlerer Fluoreszenzintensität und Vergleich gegenüber Normalkollektiv nach MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) im Vergleich zur adäquaten Isotypoder FMO-Kontrolle Aktivierung auch als % positive Zellen (% over threshold) deskriptive Angabe des Befundes (keine Zahlen). Molekulargenetische Methoden Obwohl molekulargenetische Untersuchungen eine immer wichtigere Rolle spielen, sind deren Methoden aufgrund der en Heterogenität der angeborenen und erworbenen Thrombozytendefekte in der klinischen Praxis von geringem Nutzen. Sie können dazu dienen eine vermutete Diagnose zu bestätigen (23). Bis auf wenige gut definierte Erkrankungen (24, 25) kann mittels Molekulargenetik kaum eine Diagnose gestellt werden. Große Bedeutung hat die Molekulargenetik zur Familiendiagnostik und Bestimmung eines heterozygoten Status. Diagnose, klinische Präsentation, Laborauffälligkeit und Genetik definierter Thrombozytopathien sind zur Unterstützung der Identifikation von angeborener Erkrankungen mit assoziierten Thrombozytenfunktionsstörungen-penien aufgelistet ( Tab. 3). Die Einteilung erfolgt nach Adhäsions-, Aggregations-, Rezeptor- und Signaltransduktions-, Granula-, zyto - skelettalen Defekten und anderen. Literatur 1. Cox K, Price V, Kahr WH. Inherited platelet disorders: a clinical approach to diagnosis and management. Expert Rev Hematol 2011; 4: 455 472. 2. Streif W, Olivieri M, Weickardt S et al. Testing for inherited platelet defects in clinical laboratories in Germany, Austria and Switzerland. Platelets 2010; 21: 470 478. 3. Guidelines on platelet function testing. The British Society for Haematology BCSH Haemostasis and Thrombosis Task Force. J Clin Pathol 1988; 41: 1322 1330. 4. Christie JD, Avari T, Carrington RL et al. H58-A Platelet Function Testing by Aggregometry; Approved Guideline. Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008. 5. Schambeck CM. Blutungsneigung: Diagnostische Strategie zur Abklärung einer Thrombozytendysfunktion. Consensus-Papier der DGKL-Arbeitsgruppe Hämostaseologische Labordiagnostik. J Lab Med 2004; 28: 453 462. 6. Cattaneo M, Hayward CP, Moffat KA et al. Results of a worldwide survey on the assessment of platelet function by light transmission aggregometry: a report from the platelet physiology subcommittee of the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 2009; 7: 1029. 7. Duncan EM, Bonar R, Rodgers SE et al. Methodology and outcomes of platelet aggregation testing in Australia, New Zealand and the Asia-Pacific region. Int J Lab Hematol 2009; 31: 398 406. 8. Harrison P, Mackie I, Mumford A et al. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function. Br J Haematol 2011; 155: 30 44. 9. Hayward CP, Moffat KA, Plumhoff E, Van Cott EM. Approaches to investigating common bleeding disorders: an evaluation of North American coagulation laboratory practices. Am J Hematol 2012; 87 (Suppl 1): S45-S50. 10. Rodgers RP. Bleeding time tables. A tabular summary of pertinent literature. Semin Thromb Hemost 1990; 16: 21 138. Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014

R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 211 11. Hayward CP, Harrison P, Cattaneo M et al. Platelet function analyzer (PFA)-100 closure time in the evaluation of platelet disorders and platelet function. J Thromb Haemost 2006; 4: 312 319. 12. Halimeh S, Angelis G, Sander A et al. Multiplate whole blood impedance point of care aggregometry: preliminary reference values in healthy infants, children and adolescents. Klin Pädiatr 2010; 222: 158 163. 13. Favaloro EJ. Clinical utility of the PFA-100. Semin Thromb Hemost 2008; 34: 709 733. 14. Born GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature 1962; 194: 927 929. 15. Cardinal DC, Flower RJ. The electronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood. J Pharmacol Methods 1980; 3: 135 158. 16. Bonduel M, Frontroth JP, Hepner M et al. Platelet aggregation and adenosine triphosphate release values in children and adults. J Thromb Haemost 2007; 5: 1782 1783. 17. Knöfler R, Weissbach G, Kuhlisch E. Platelet function tests in childhood. Measuring aggregation and release reaction in whole blood. Semin Thromb Hemost 1998; 24: 513 521. 18. Lundin A, Richardsson A, Thore A. Continuous monitoring of ATP-converting reactions by purified firefly luciferase. Anal Biochem 1976; 75: 611 620. 19. George JN, Shattil SJ. The clinical importance of acquired abities of platelet function. N Engl J Med 1991; 324: 27 39. Anhang Medikamente, Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine mit Einfluss auf die Thrombozytenfunktion; modifiziert nach (19) Agens Abität Agens Abität Antiphlogistika Phenylbutazone Antiepileptika ValproinsäureValproat a.t.a Piroxicam Antidepressiva Duloxetin klin. Blutungen Naproxen a.b.z. Chemotherapeutika Asparaginase Acetylsalicylsäure Diclofenac a.b.z.; klin. Blutungen a.b.z.; klin. Blutungen kombinierte Chemotherapie Cisplatin, Cyclophosphamid Carmustein oder Melphalan, Vincristin Ibuprofen a.b.z. Carmustin, Daunorubicin β-lactam- Antibiotika Penicilline Mezlocillin, Piperacillin a.b.z.; klin. Blutungen Plicamycin a.b.z.; klin. Blutungen Ampicillin, Penicillin G Benzylpenicillin a.b.z. Antihistaminika Chlorpheniramin, Diphenhydramin, Pyrilamin in vitro Cephalo - sporine Cefotaxim Cefamandol a.b.z.; klin. Blutungen klin. Blutungen radiographische Kontrastmittel Iopamidol DiatrizoatAmidotrizoesäure kardiovaskuläre Medikamente Antikoagulanzien und fibrinolytische Medikamente Dipyridamole Diltiazem Isosorbidmononitrat Nimodipin Propranolol Verapamil Nifedipin NitroglycerinGlyceroltrinitrat Heparin Alteplase Nitrofurantoin a.b.z.; klin. Blutungen a.b.z. a.b.z. a.b.z.; klin. Blutungen andere Medikamente G-CSF Prostaglandine Nahrungsmittel, Gewürze und Vitamine Meglumin-Diatrizoat und Natrium-Diatrizoat Guaifenesin Montelukast (FilgrastimLenograstim) Alprostadil Epoprostenol Iloprost Ingwer Vitamin C Ascorbinsäure Kreuzkümmel, Gelbwurz (Kurkuma), Nelken Anästhetika und Narkotika Benzocain Kokain Hydroxychloroquin Alkohol,, n-3-fettsäuren Omega-3-Fischöl, Gingko, Ginseng Mu-Err Pilz, Knoblauch a.b.z. a.b.z.; klin. Blutungen Lidocain Procain Tetracain G-CSF: Granulocyte colony stimulating factor : abe Thrombozytenaggregation; a.b.z.: abe In-vivo-Blutungszeit Halothan Morphin NO Schattauer 2014 Hämostaseologie 32014

212 R. Knöfler et al.: Diagnose angeborener Thrombozytenfunktionsstörungen 20. Schmitz G, Rothe G, Ruf A et al. European Working Group on Clinical Cell Analysis: Consensus protocol for the flow cytometric characterisation of platelet function. Thromb Haemost 1998; 79: 885 896. 21. Michelson AD. Evaluation of platelet function by flow cytometry. Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35: 67 82. 22. Wall JE, Buijs-Wilts M, Arnold JT et al. A flow cytometric assay using mepacrine for study of uptake and release of platelet dense granule contents. Br J Haematol 1995; 89: 380 385. 23. Israels SJ, Kahr WH, Blanchette VS et al. Platelet disorders in children: A diagnostic approach. Pediatr Blood Cancer 2011; 56: 975 983. 24. Balduini CL, Cattaneo M, Fabris F et al. Inherited thrombocytopenias: a proposed diagnostic algorithm from the Italian Gruppo di Studio delle Piastrine. Haematologica 2003; 88: 582 592. 25. Nurden A, Nurden P. Advances in our understanding of the molecular basis of disorders of platelet function. J Thromb Haemost 2011; 9 (Suppl 1): 76 91. In eigener Sache Neuerungen CME 2014 Nutzen Sie die Möglichkeit, unter cme.schattauer.de bis Mitte 2014 noch fehlende CME-Punkte für Ihr laufendes Fortbildungszertifikat zu sammeln! Die Landesärztekammern haben hinsichtlich der einheitlichen Punktevergabe ärztlicher Fortbildungsaktivitäten zu einer gemeinsamen Linie gefunden. Nach Vorgabe der Bundesärztekammer werden ab jetzt die CME-Fortbildungen einheitlich bepunktet. Konkret hat die Bayerische Landesärztekammer seit 1. Januar 2014 eine neue Fortbildungsordnung beschlossen, sodass auch zukünftig CME-Punkte durch Online-Fortbildung (Kategorie I) gesammelt werden können: Zwei Fortbildungspunkte erreichen Sie ab jetzt, wenn Sie mindestens 70% der Fragen eines CME-Moduls richtig beantworten. Unter cme.schattauer.de haben Sie weiterhin die Option, zu jeder Zeit und von jedem beliebigen Ort aus eine Vielzahl von sorgfältig ausgewählten Fortbildungsmodulen zu bearbeiten und Punkte zu sammeln. Wenn Sie bei der Registrierung Ihre Einheitliche Fortbildungsnummer (EFN) angeben, werden Ihre erworbenen CME-Punkte auf elektronischem Wege an Ihre Ärztekammer übermittelt und auf persönlichen Fortbildungskonten der Landesärztekammern gutgeschrieben. Dies geschieht indirekt über den Elektronischen Informationsverteiler (EIV) der Bundesärztekammer. An diesen sind wiederum die Landesärztekammern angeschlossen. Umfassende Informationen zu CME finden Sie unter cme.schattauer.de. Weiterhin viel Spaß und Erfolg beim Beantworten der CME-Fragen wünscht Ihnen Dr. med. Jan Hueber Redaktion CME Hämostaseologie im Internet www.haemostaseologie-online.com Hämostaseologie 32014 Schattauer 2014