Grundlagen der Immungenetik PD Dr. S. Immenschuh Institut für Transfusionsmedizin, MHH
MHC = Major Histocompatibility Complex umfasst eine Gruppe von Genen, die Proteine codieren, welche für - die Immunerkennung, - die Gewebeverträglichkeit (Histokompatibilität) bei Transplantationen, - die immunologische Individualität wichtig sind p21 bei jeder Species unterschiedlich: - Mensch: HLA - humanes Leukozytenantigen - Schwein: SLA - Schweine Leukozytenantigen - Maus: H2 - Ratte: RT beim Menschen sind die HLA Gene auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6p21.31) p21
Humane Leukozyten Antigene - HLA Definition und Genetische Organisation der HLA Gene Struktur und Funktion des HLA Komplexes Typisierung und Nomenklatur von HLA Molekülen Polymorphismus von HLA Molekülen Klinische Bedeutung des HLA Systems Minor Histokompatibilitätsantigene Histokompatibilität und Transplantation Mechanismen der Fremderkennung
Das HLA System Definition und Genetische Organisation
Die HLA Gene
Diversität von HLA durch Polygenie und Polymorphismus Polygenie Polymorphismus Beteiligung mehrerer Gene an Auftreten einer Genvariation (Allel) der Ausbildung eines Phänotyps in einer Population
Das HLA System Polygenie und Polymorphismus tragen zur Diversität der HLA- Moleküle eines Individuums bei Polygenie = mehrere Genorte HLA Klasse I: HLA-A, HLA-B, HLA-C HLA-Klasse II: HLA-DRB1, DQB1 Polymorphismus = allelische Vielfalt HLA-A 630 Allele 649 Allele 697 Allele HLA-B 979 Allele 1029 Allele 1109 Allele HLA-C 338 Allele 350 Allele 381 Allele HLA-DRB1 633 Allele 640 Allele 690 Allele HLA-DQB1 90 Allele 91 Allele 95 Allele 2670 Allele 2759 Allele 2972 Allele Stand 01/2008 Stand 04/2008 Stand 10/2008 + 302 neue Allele
Entdeckung neuer HLA Allele seit 1968
Struktur und Biologische Funktion des HLA System
Expression von HLA Antigenen T-Zellen B-Zellen Makrophagen Antigenpräsentierende Zellen (APC) Granulozyten Thrombozyten Leberzellen Nierenzellen Erythrozyten Klasse I +++ +++ +++ +++ +++ +++ + + - Klasse II + +++ +++ +++ - - - - - HLA-Klasse I Expression auf nahezu allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten HLA-Klasse II Expression ausschließlich auf Zellen des Immunsystems
Struktur von HLA Klasse I und II Molekülen
Antigenpräsentation über HLA Moleküle
HLA Klasse I und II Pathways
Biologische Funktion des HLA-Systems MHC-Restriktion Antigene werden nicht als frei lösliche Proteine von T Zellen erkannt, sondern nur wenn diese ihnen als Proteinfragmente (= Peptide) durch HLA Moleküle präsentiert werden Unterscheidung von selbst und fremd Schlüssel-Moleküle für die Initiierung der spezifischen (adaptiven) immunologischen Antwort Ligand für Natürliche Killerzellen (NK Zellen) Reifung der T-Lymphozyten
Zusammenfassung HLA-Klasse I Moleküle Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion, Initiierung einer adaptiven Immunantwort Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten (nicht auf Erythrozyten) Präsentation der Peptide an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen) - zytotoxische Zellen geben Proteine (Perforine, Granzyme) ab - Membran der Zielzelle wird durchlässig = Tod der infizierten Zelle HLA-Klasse II Moleküle Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur Initiierung einer adaptiven Immunantwort Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen (z.b. DCs, B-Zellen) Präsentation der Peptide an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen) - Zytokine, Chemokine werden ausgeschüttet - Immunreaktionen anderer Zellen (B Zellen, T Zellen) wird verstärkt
Polymorphe Regionen α1- und α2-domäne β1-domäne - Die Positionen der allelischen Vielfalt liegen in den Antigen-bindenden Regionen der HLA-Moleküle - Sie beeinflussen damit direkt deren Bindungsaffinität und indirekt die Antigenerkennung durch T-Lymphozyten
Interaktion zwischen HLA Molekül und Peptid HLA Klasse I Peptide binden über Ankeraminosäuren an HLA Moleküle (z.b. P2 und P9) J. Klein et al. N Engl J Med 2000; 343: 702-709
HLA Typisierungsmethoden Nachweis von HLA Antigenen und HLA Antikörpern HLA Nomenklatur
Indikationen zur Typisierung von HLA Antigenen und Antikörpern Transplantation Nieren- und Stammzelltransplantation Transfusion Nachweis von Antikörpern gegen fremde HLA-Antigene bei polytransfundierten Patienten Krankheitsassoziation Morbus Bechterew assoziiert mit HLA-B27 Forensik Abstammungsbegutachtung/Vaterschaftsgutachten
Enstehung von HLA Antikörpern Transplantationen Transfusionen Schwangerschaft
HLA Typisierungsmethoden nach dem Verfahren - serologisch komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest (Mikro-Lymphozytotoxizität nach Terasaki) - molekularbiologisch PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) PCR-SSP (sequence-specific primers) Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT) PCRbasierend nach Auflösungsgrad - niedrige Auflösung (low resolution) serologisch, molekularbiologisch = 2 stellig: HLA-A24 - hoche Auflösung (high resolution) molekularbiologisch = 4 stellig: HLA-A*2402
Prinzip der Benennung von HLA Allelen Molekularbiologie Serologie
Serologische HLA-Typisierung Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest R. Waßmuth. Einführung in das HLA System, 1995
Serologische HLA-Typisierung Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest positives Testergebnis lysierte Zellen positives Testergebnis lysierte Zellen negatives Testergebnis intakte Zellen
Nachteile der serologischen Typisierung Niedrigauflösend (low resolution) = 2 stellig: HLA-B24 Hohe Fehlerrate (insbesondere HLA-DR > 30%)
HLA Typisierungsmethoden Molekularbiologische Verfahren PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) PCR-SSP (sequence-specific primers) Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT)
Molekularbiologische HLA Typisierung PCR-SSP (sequence-specific primers) Valin (V, GTT) EXON GTT 167 bp 5 CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3 Extension 5 GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3 Isoleucin (I, ATT) EXON ATT 167 bp 5 CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3 Extension 5 GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3
Molekularbiologische HLA Typisierung PCR-SSP (sequence-specific primers) Valin (V, GTT) EXON GTT 5 CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC A 3 STOPP 167 bp 5 GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3 Isoleucin (I, ATT) EXON ATT 5 CG GAG AAC AAA CTG AAC GAC G 3 STOPP 167 bp 5 GGG TCG TGG CCC GGT ATA CT 3
Molekularbiologische HLA Typisierung PCR-SSP (sequence-specific primers) Kontrollbande (hgh) spezifisches Amplifikat Valin (V, GTT) Kontrollbande (hgh) spezifisches Amplifikat Isoleucin (I, ATT) Proben 1 2 3 4 5 6 7 8 Ergebnis: V/V V/V V/V V/I V/I V/V V/V V/V
Molekularbiologische HLA Typisierung SBT (sequencing-based typing) A G A C C C A G C G G C T G Heterozygot A/G A G A C C C A G C G G C T Homozygot A Homozygot G A G A C C C G G C G G C T
Molekularbiologische HLA Typisierung SBT (sequencing-based typing)
Klinische Bedeutung des HLA System
Klinische Bedeutung des HLA-Systems Transplantationsmedizin - Knochenmark- und Stammzelltransplantation - Nierentransplantation Assoziation zwischen HLA-Antigenen und diversen Erkrankungen Abstammungsbegutachtung
Mechanismen der Fremderkennung
HLA-vermittelte Interaktion zwischen zytotoxischer T-Zelle und Zielzelle Die Aktivität der zytotoxischen T-Zellen endet Transplantation für die betroffene Zelle immer tödlich! zerstört T-Zelle Spender zerstört T-Zelle HLA Molekül Virusinfizierte Zelle fremdes HLA Molekül fremde Zelle Patient Transplantationssituation Klinische Manifestation: Spender-gegen-Patienten Reaktion Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD)
A) Direkte Erkennung von allogenen HLA- Molekülen
Direkte Erkennung von allogenen HLA- Molekülen A. Direkte Fremderkennung von HLA Klasse I: Allo-HLA Klasse I Molekül wird durch zytotoxische T-Lymphozyten des Empfängers erkannt.
B) Indirekte Erkennung von allogenen HLA- Molekülen
Indirekte Erkennung von Alloantigenen B.
C) Erkennung von allogenen Peptiden
Peptidantigene werden durch HLA Moleküle präsentiert und vom T Zell-Rezeptor erkannt C.
Akute Abstoßung: MHC und Peptide Isotransplantat Allogene MHCdifferente Transplantation Allogene MHCidentische Transplantation MHC a MHC a MHC a MHC a MHCb MHC a Toleranz schnelle Abstossung langsame Abstossung Anzahl vitaler Transplantate 100% 50% 0% 0 60 120 0 60 120 0 60 120 Transplantatüberlebensdauer -> Akute Abstoßungsreaktionen kommen sowohl bei MHCdifferenter als auch -identischer Transplantation vor.
Minor Histokompatibilitätsantigene
Erkennung von allogenen Peptiden Minor Histokompatibilitätsantigene sind Peptide, die von polymorphen zellulären Proteinen abstammen.
HLA mismatches versus graft survival Stammzelltransplantation 1.0 HLA Mismatch: 3 Loci 0.8 2 Loci Probability 0.6 0.4 1 Locus 0 Locus HLA Genotypic Match HLA effect? HLA effect 0.2 non HLA effect 0 0 20 40 60 80 100 Days after Transplant
Minor Histokompatibilitätsantigene (mhags) Funktionelle Kriterien für mhags PEPTIDE Peptide aus polymorphen Regionen endogener Proteine werden durch alloreaktive T Zellen erkannt verursachen GvH-and GvL-Reaktionen Strukturelle Kriterien für mhags relevante Phänotyp-Frequenzen mit niedrigem Polymorphismus (meist 2 Allele) Segregation unabhängig von HLA definiertes Expressions-Profil - Zellen von Haut, Leber und/oder Darm GvHD - hämatopoetischen Zellen und/oder Stammzellen GvL Reaktion
Graft-versus-Leukemia oder Graft-versus- Host Reaktion GvHD T-cell T-cell GvL NATURE REVIEWS CANCER VOLUME 4 MAY 2004 373
Allogene Inkompatibilitäten MHC non-mhc D/R relation Clinical situation Incompatibility identical identical syngen Identical Twins none identical different allogen RD, URD minor different different allogen RD, URD major + minor Minor Histokompatibilitäts Antigene HLA Klasse I Molekül Intrazelluläres polymorphes Protein D/R relation RD URD Donor/Recipient relation Related Donor Unrelated Donor
Minor Histokompatibilitätsantigene Y-chromosomal kodierte mhags Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression A1/HY HLA-A1 DFFRY (USP9Y) broad A2/HY HLA-A2 SMCY broad A33/HY HLA-A33 TMSB4Y broad B52/HY HLA-B52 RPS4Y1 restricted B60/HY HLA-B60 UTY broad B7/HY HLA-B7 SMCY broad B8/HY HLA-B8 UTY restricted DQ5/HY HLA-DRB1*05 D0X3Y (DBY) broad DRB1*1501/HY HLA-DRB1*1501 D0X3Y (DBY) broad DRB1*0301/HY HLA-DRB1*0301 RPS4Y1 broad
Minor Histokompatibilitätsantigene Autosomal-kodierte Minor Histokompatibilitätsantigene Minor Antigen HLA Restriktion Gen Expression HA-1 HLA-A2/B60 HA-1/KIAA*0223 restricted HA-2 HLA-A2 Myosin 1G restricted HA-3 HLA-A1 LBC Oncogene broad HA-8 HLA-A2 KIAA0020 broad HB-1 HLA-B44 unknown restricted ACC-1 HLA-A24 BCL2A1 restricted ACC-2 HLA-B44 BCL2A1 restricted UGT2B17 HLA-A29 UGT2B17 restricted LRH-1 HLA-B7 P2X5 restricted
Minor Histokompatibilitätsantigen HA-1 Expression in hämatopoetischen Zellen zwei allelische Varianten des Peptides HA-1 H V-L-H-D-D-L-L-E-A HA-1 R V-L-R-D-D-L-L-E-A Null-Allel Präsentation durch HLA-A*0201 Moleküle Erkennung durch alloreaktive CD8+ zytotoxische T Zellen Mismatching für HA-1 H ist assoziert mit dem Auftreten der GvL-Reaktion
Vorhersage von Inkompatibilitäten für Minor Histokompatibilitätsantigene Identifizierung von Graft-versus-Host und Host-versus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischen Spender/Empfängerpaaren http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Identifizierung von Graft-versus-Host und Hostversus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischen Spender/Empfängerpaaren Spender Empfänger HA-1H/H = HA-1H/R keine Reaktion Spender HA-1H/H Empfänger HA-1R/R Host-versus-Graft Reaktion (Transplantatabstoßung) http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Identifizierung von Graft-versus-Host und Hostversus-Graft Reaktivitäten in HLA-identischen Spender/Empfängerpaaren Spender Empfänger HA-1R/R HA-1H/H Graft-versus-Leukämie Reaktion http://www.lumc.nl/5033/dbminor/
Balance zwischen GvHD und GvL Reaktion Abstoßung Immuntherapie GvHD T Zellen gegen GvHD-assozierte mhags GvL T Zellen gegen GvL-assozierte mhags
HA-1 and HA-2 specific CTLs are able to induce complete remission in case of relapse CD8 + /HA-2-specific T cells CD8 + /HA-1-specific T cells white blood cell count Marijt et al., 2003