Dissenation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Chemisch-analytische und pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen PAF-Antagonisten und Inhibitoren der Thrombozytenaggregation (AUium-Arten, Ginkgo biloba, Pinellia ternata) Bemice Steinke aus New York 1993
Inhaltsverzeichnis A. Einleitung 1 Seite B. In vitro Methode zur Untersuchung von Inhibitoren der Thrombozytenaggregation 2 1 Thrombozytenaggregation 2 1.1 Trombozytenphysiologie und Thrombozytenfunktionen 2 1.2 Thrombozytenaktivierung 2 1.3 Aggregation 2 1.4 Angriffspunkte für die Beeinflußung der Thrombozytenaggregation 3 2 In vitro Testmethoden S 3 Turbidimetrische Messung der Thrombozytenaggregation 7 3.1 Methodik 7 3.2 Experimentelle Parameter 10 3.2.1 Standardbedingungen, 10 3.2.1.1 Blutentnahme 10 3.2.1.2 Kontrollmessungen 11 3.2.1.3 Inkubationsmedium 12 3.2.1.4 ph-wert 13 3.2.1.5 Temperatur 13 3.2.2 Optimierung und Validierung der Methode 13 3.2.2.1 Verwendbare Lösungsmittel 13 3.2.2.2 Indifferente Drogenbegleitstoffe 14 3.2.2.3 Reproduzierbarkeit und Validierung der Methode 14 3.2.2.4 Fehlerquellen 16 3.3 Diskussion 17 4 Antiaggregatorische Aktivität von Verbindungen aus AUium-Arten und von AIIium-Extrakten lg 4.1 Bisher bekannte antiaggregatorische Verbindungen aus Allium-Arten 18 4.2 Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Knoblauch- und Bärlauch-Extrakte 24
4.3 Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Zwiebel-Extrakte 27 4.4 Vergleich von Knoblauch-, Bärlauch- und Zwiebel-Extrakten 30 4.5 Diskussion 34 C. Biologie und Analyse von PAF-Antagonisten 35 1 Der Mediator PAF 35 1.1 Metabolismus 36 1.2 Zelluläre Wirkungen 38 1.3 Pathophysiologie 40 1.4 PAF-Rezeptor 42 1.5 PAF-Antagonisten 45 1.5.1 Nicht-spezifische Hemmung 45 1.5.2 Spezifische Hemmung 45 1.5.2.1 Synthetische PAF-Antagonisten 45 1.5.2.2 Naturstoffe mit PAF-antagonistischer Wirkung 47 1.6 Bisher bekannte Struktur-Wirkungs-Beziehungen 53 1.6.1 Ginkgolide 53 1.6.2 Lignane 54 1.6.3 Cumarine 57 1.6.4 Zusammenfassung ' 57 2 Screening von Arzneipflanzen nach PAF-Äntagonisten und Thrombozytenaggregationshemmern 59 2.1 In vitro Testmethoden für das Screening von PAF-Antagonisten 59 2.2 Modifizierung des etablierten Testsystems für das Screening von PAF-Antagonisten 60 2.2.1 Verwendete Thrombozytenspezies 60 2.2.2 PAF-Konzentration 61 2.2.3 Spezifität des Wirkmechanismus 63 2.3 "Bewertungsschlüssel" für die Wirkstärke 64 2.4 Screening ausgewählter Pflanzenextrakte 65 2.5 Screening verschiedener pflanzlicher Inhaltsstoffe 67-
3 Biologische Wirkwertbestimmung verschiedener Ginkgo-Extrakte 75 3.1 Ginkgo biloba 75 3.1.1 Extrakte und Handelspräparate 75 3.1.2 Zusammensetzung eines Ginkgo-Spezialextrakts 78 3.1.3 Pharmakologie und Indikationen 79 3.2 Begründung für die Entwicklung einer biologischen Wirkwertbestimmung von Ginkgo-Extraktpräparaten 81 3.3 Bisherige Qualitätsbestimmungen von Terpenen in Ginkgo-Extrakten 81 3.4 Voraussetzungen und Strategie für die Entwicklung einer biologischen Standardisierungsmethode 82 3.5 Methode zur in vitro Bestimmung des biologischen Wirkwerts 84 3.5.1 Meßanordnung 84 3.5.2 Spezifität der Ginkgolid-Wirkung 84 3.5.3 Ermittlung des Wirkwerts als äquieffektiver Ginkgolid B-Gehalt 85 3.6 Biologische Wirkwerte verschiedener Ginkgo-Extrakte 86 3.7 Standardisierungsvorschlag 88 3.8 Umrechnung des äquieffektiven Ginkgolid B-Gehalts auf den Gesamtginkgolidgehalt 88 3.9 Vergleich biologisch bestimmter und chemisch-analytisch ermittelter Ginkgolidgehalte 91 3.10 Experimentelle Untersuchungen zur Kombinationswirkung von Ginkgoliden 92 3.11 Diskussion 96 D. Chemische und pharmakologische Untersuchungen von PineUia ternata (Thunb.) Breit. 98 1 Allgemeine Übersicht 98 1.1 Systematik 98 1.2 Botanische Beschreibung 98 1.3 Volksmedizinische Verwendung 100 1.4 Bisher bekannte Inhaltsstoffe 101
2 Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen 103 2.1 Voruntersuchungen 103 2.1.1 Extrakte 103 2.1.2 DC-Screening 103 2.1.3 HPLC-Fingerprintanalyse 105 2.1.4 Pharmakologische Voruntersuchungen 109 2.2 Isolierung lipophiler Inhaltsstoffe durch "bioguided fractionation" HO 2.2.1 Strukturaufklärung der Lignane 113 2.2.1.1 Strukturaufklärung von Pll ((+)-Lariciresinol) 113 2.2.1.2 Strukturaufklärung von P13 ((-)-Pinoresinol) 116 2.2.2 Strukturaufklärung der Phenylpropan-Verbindungen 119 2.2.2.1 Strukturaufklärung von P8 (Coniferylalkohol) 119 2.2.2.2 Strukturaufklärung von P12 (Dehydrodiconiferylalkohol) 121 2.3 Isolierung hydrophiler Inhaltsstoffe durch "bioguided fractionation" 123 2.3.1 Strukturaufklärung von P3 (Adenosin) 126 2.3.2 Strukturaufklärung von P2 (Adenin) 129 2.3.3 Strukturaufklärung der Flavon-C-glykoside P7 (Vicenin-1) und P9 (Corymbosid) 129 2.3.4 Identifizierung von Pflanzensäuren 132 2.4 Untersuchung des hämolyü'schen Prinzips 133 2.5 Prüfung auf irritierende Wirksubstanzen 136 2.6 Pharmakologie der isolierten Verbindungen 137 2.6.1 Eigene pharmakologische Untersuchungen 137 2.6.2 Diskussion 140 2.6.2.1 Lignane 140 2.6.2.2 Adenosin 141 3 Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters zur Identitätsprüfung und Qualitätsbeurteilung 144 3.1 Vergleichende DC-Untersuchungen verschiedener Drogenmuster 144 3.2 Vergleichende HPLC-Untersuchungen verschiedener Drogenmuster 147 3.3 Diskussion 149 E. Zusammenfassung 150
Experimenteller Teil Seite 1 Herkunft des Drogenmaterials, der Extrakte, Fertigpräparate und Vergleichssubstanzen 1.1 Allium 1.1.1 Knoblauch- und Bärlauch-Extrakte 1.1.2 Zwiebel-Extrakte 1.1.3 Vergleichssubstanzen 1.2 Ginkgo biloba 1.2.1 Ginkgo-Extrakte 1.2.2 Fertigpräparate 1.2.3 Vergleichssubstanzen 1.3 Drogen und Reinsubstanzen für das in vitro Screening 1.3.1 Drogen 1.3.2 Reinsubstanzen 1.4 Pinellia ternata (Thunb.) Breit. 1.4.1 Droge 1.4.2 Vergleichssubstanzen 155 155 155 157 157 157 2 Pharmakologische Untersuchungen In vitro Testsystem für antiaggregatorische und PAF-antagonistische Wirkstoffe (Thrombozytenaggregationshemmtest) 158 2.1 Chemikalien und Referenzsubstanzen 158 2.2 Stammlösungen 158 2.3 Modifizierter Tyrode-Puffer 159 2.4 Herstellung der Prüflösungen 159 2.5 Blut 160 2.5.1 Spender 160 2.5.2 Enmahmetechnik 160 2.5.3 Thrombozytenpräparaü'on 160 2.5.4 Bestimmung der Thrombozytenzahl 161 2.6 Testdurchführung 161 2.7 Ermittlung der IC S0 -Werte 161
Chemisch-analytische Untersuchungen 162 3.1 Allgemeine Arbeitsmethoden 162 3.1.1 Spektroskopische und physikalische Methoden 162 3.1.1.1 Optische Drehung 162 3.1.1.2 UV-Spektroskopie 162 3.1.1.3 IR-Spektroskopie 162 3.1.1.4 Massenspektrometrie 163 3.1.1.5 'H-NMR-Spektroskopie 163 3.1.2 Chromatographische Arbeitsmethoden 163 3.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 163 3.1.2.2 Säulenchromatographie 166 3.1.2.3 Mitteldruckflüssigchromatographie (MPLC) 167 3.1.2.4 Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) 167 3.1.3 Chemische Methoden 170 3.1.3.1 Hydrolysen 170 3.1.3.2 Modifizierte Permethylierung nach Brimacombe 171 3.2 Spezielle Arbeitsmethoden 172 3.2.1 Phytochemische Untersuchung von Pinellia ternata (Thunb.) Breit. 172 3.2.1.1 Extraktion 172 3.2.1.2 Isolierung der lipophilen Inhaltsstoffe 172 3.2.1.3 Isolierung der hydrophilen Inhaltsstoffe 173 3.2.1.4 DC-Analyse und HPLC-Fingerprintanalyse zur Idenütäts- und Qualitätsbeurteilung 174 3.2.2 Gaschromatographische Gehaltsbestimmung der Ginkgolide aus Ginkgo-Extrakten 175 3.2.2.1 Gaschromatographische Bedingungen 176 3.2.2.2 Probenvorbereitung 176 3.2.2.3 Referenzlösungen 176 3.2.2.4 Auswertung 177 3.3 Physikalische Daten 177 3.3.1 (+)-Lariciresinol 177 3.3.2 (-)-Pinoresinol 178 3.3.3 Coniferylalkohol 178 3.3.4 Dehydrodiconiferylalkohol 179
3.3.5 Linolsäure 179 3.3.6 Adenosin 180 3.3.7 Adenin 180 3.3.8 Corymbosid 181 3.3.9 Vicenin-1 181 G. Literaturverzeichnis 182