Mikrobiologisches Grundpraktikum: Ein Farbatlas

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1 Steve K. Alexander / Dennis Strete Mikrobiologisches Grundpraktikum: Ein Farbatlas Deutsche Bearbeitung von Erika Kothe Aus dem Amerikanischen von Hans W. Kothe und Erika Kothe Ein Imprint von Pearson Education München Boston San Francisco Harlow, England Don Mills, Ontario Sydney Mexico City Madrid Amsterdam

2 Färbetechniken für Bakterien 3 Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Darstellung morphologischer Merkmale Anwendung im Labor: Einfachfärbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Ü b e r b l i c k Anwendung im Labor: Negativkontrastierung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Differenzierende Färbungen Anwendung im Labor: Gram-Färbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Färbung von Zellstrukturen Anwendung im Labor: Kapselfärbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Anwendung im Labor: Endosporenfärbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate Anwendung im Labor: Geißelfärbung Ziel und Vorgehensweise Tipps für die Praxis Zu erwartende Resultate

3 3 Färbetechniken für Bakterien Werden Bakterien vor der mikroskopischen Untersuchung angefärbt, erkennt man ihre typischen Merkmale zumeist sehr viel besser, etwa die genaue Größe, die Form und die Anordnung der Zellen, aber oft auch bestimmte chemische Eigenschaften oder andere Besonderheiten des untersuchten Bakteriums. Dadurch ist es dann in vielen Fällen sehr viel leichter, die entsprechenden Mikroorganismen zu bestimmen. In diesem Kapitel sollen die wichtigsten Färbemethoden für Bakterien vorgestellt werden, die man in mikrobiologischen Labors routinemäßig zur Untersuchung von Bakterien verwendet. Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung Ziel und Vorgehensweise Sowohl aus der Natur isolierte Bakterien als auch bakterielle Krankheitserreger aus der klinischen Praxis werden normalerweise auf Agar-Nährböden oder auch in Flüssigmedien kultiviert (siehe Kapitel 4). Um diese Organismen anfärben zu können, muss man zunächst Ausstrichpräparate anfertigen, das heißt, man überträgt Teile der Kultur mit einer sterilen Impföse auf einen Objektträger. Dazu müssen Zellen, die von festen Nährböden stammen, sorgfältig in einen kleinen Wassertropfen auf dem Objektträger gemischt werden, bis die Flüssigkeit eine leicht milchige Farbe angenommen hat, während man aus einer hoch gewachsenen Flüssigkultur einfach einen Tropfen Flüssigkeit entnimmt und diesen auf den Objektträger überführt. Anschließend lässt man die Flüssigkeit an der Luft eintrocknen und zieht den Objektträger dann mehrmals durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die Zellen fest auf dem Glas zu fixieren (Hitzefixierung). Zu erwartende Resultate Nach der Färbung ähnelt ein gutes Ausstrichpräparat der Aufnahme aus EAbb Da die die Dichte der Zellen am Rande normalerweise etwas geringer ist, beginnt man mit der mikroskopischen Untersuchung am besten in der Mitte und fährt von dort nach außen, bis man eine Stelle gefunden hat, wo die Zellen nicht mehr übereinander liegen. Tipps für die Praxis Bringen Sie die Flüssigkeitstropfen in der Mitte des Objektträgers auf, damit Sie die Objekte beim Färben und bei der mikroskopischen Untersuchung leichter finden. Abb. 3.1 Ein hitzfixierter und mit Kristallviolett gefärbter Bakterienausstrich auf einem Objektträger. Die Mitte solcher Präparate ist für die Untersuchung zumeist ungeeignet, weil die Zellen dort zu dicht liegen, so dass man sich am besten eine Stelle in den äußeren Bereichen heraussucht. Achten Sie darauf, dass die Objekte auf einen kleinen Bereich beschränkt bleiben, damit das Färbemittel auch alle Zellen erreicht. Versuchen Sie ein Zusammenklumpen der Zellen zu vermeiden, weil das Färbemittel die Bakterien im Inneren eines solchen Haufens zumeist nicht erreicht. 36

4 Darstellung morphologischer Merkmale Darstellung morphologischer Merkmale Um morphologische Merkmale von Bakterien darzustellen, werden entweder die Zellen oder auch der Hintergrund des Präparates gefärbt, weil man dadurch normalerweise genauere Informationen über Zellgröße oder Form und Anordnung der Objekte erhält. Grundsätzlich lassen sich die verwendeten Farbstoffe in zwei Gruppen unterteilen: In basische, positiv geladene und saure, negativ geladene Färbemittel. Der Unterschied besteht darin, dass sich basische Farbstoffe an negativ geladene, also basophile (saure) Komponenten des Untersuchungsobjektes anlagern, während es bei sauren Farbstoffen die positiv geladenen, also azidophilen (basischen) Komponenten sind. Daher gilt bei Bakterienfärbungen: basische Farbstoffe färben die negativ geladene Bakterienzellwand, während saure, negativ geladene Färbemittel abgestoßen werden. Dadurch nehmen die Zellen im erstgenannten Fall die Farbe des Färbemittels an, während im zweiten Fall nur die Umgebung der Zelle gefärbt wird, was allerdings die Umrisse der Bakterien deutlicher hervortreten lässt (Negativfärbung). Typische, basische Farbstoffe sind Kristallviolett, Methylenblau und Safranin; zu den sauren Farbstoffen gehören Kongorot, Nigrosin und Eosin. Anwendung im Labor: Einfachfärbung Ziel und Vorgehensweise Im einfachsten Fall werden Bakterien mit nur einem Farbstoff gefärbt, um Größe, Form und Anordnung der Zellen besser erkennen zu können. Das Färbemittel wird auf das hitzefixierte Präparat getropft und anschließend mit Wasser wieder abgespült. Nach dem Trocknen kann das Präparat dann im Mikroskop untersucht werden. Tipps für die Praxis Achten Sie darauf, dass das Färbemittel über den gesamten Ausstrich verteilt ist. Drücken Sie beim Spülen des Präparats mit der Spritzflasche nicht zu stark, damit die Objekte nicht abgewaschen werden. Abb. 3.2 Mit Kristallviolett gefärbte, kugelförmige Zellen von Staphylococcus aureus (x 2.500). Spülen Sie das Präparat so lange, bis sich keine Farbwolken mehr lösen. Wischen Sie das Präparat keinesfalls ab, sondern lassen Sie es an der Luft trocknen. Zu erwartende Resultate Die EAbb. 3.2 bis 3.4 zeigen Bakterien, die mit Kristallviolett oder Methylenblau gefärbt wurden. Da die Zellen die Farbe des jeweiligen Färbmittels angenommen haben, sind Größe, Form und Anordnung besser zu erkennen. Abb. 3.3 Mit Methylenblau gefärbte, stäbchenförmige Zellen von Escherichia coli (x 2.500). 37

5 3 Färbetechniken für Bakterien Kokken Stäbchen Abb. 3.4 Mit Methylenblau gefärbte Mischkultur von kugelförmigen Staphylococcus aureus- und stäbchenförmigen Escherichia coli- Zellen (x 2.500). Anwendung im Labor: Negativkontrastierung Ziel und Vorgehensweise Bestimmte Bakterien, etwa Spirillen oder Spirochäten, lassen sich mit basischen Farbstoffen nur sehr schlecht anfärben, so dass man bei ihnen normalerweise eine Negativfärbung mit sauren Farbstoffen durchführt. Dabei nimmt die Umgebung der Zellen die Farbe des Färbemittels an, mit dem Ergebnis, dass die Größe, Form und Anordnung der Bakterien deutlicher hervortritt. Die Negativkontrastierungen haben aber noch einen weiteren Vorteil: Da bei ihnen keine Hitzefixierung notwenig ist und zudem keine Färbung der Zellen selbst erfolgt, ist die Veränderung der Bakterien durch äußere Einflüsse deutlich geringer, so dass sich die Form und Größe der Untersuchungsobjekte zumeist sehr viel genauer bestimmen lässt. Zur Präparation werden die Bakterien in einen Tropfen Nigrosin (oder eine andere saure Färbelösung) auf einen Objektträger überführt. Anschließend streicht man den Tropfen mit einem zweiten Objektträger zu einem dünnen Film aus und lässt das Präparat an der Luft trocknen. Danach kann die mikroskopische Untersuchung dann durchgeführt werden. Tipps für die Praxis Verwenden Sie unbedingt sehr saubere, fettfreie Objektträger. Überführen Sie die Bakterien in einen möglichst kleinen Tropfen Nigrosin. Setzen Sie die Kante des zweiten Objektträgers an den Rand des Tropfens, damit die Flüssigkeit sich kapillar am Glas verteilt, und ziehen sie ihn dann über den unteren Objektträger. Durch Schieben wird eine schlechte Verteilung erzielt. Führen Sie keine Hitzefixierung durch, sondern lassen Sie das Präparat vollständig an der Luft trocknen. Zu erwartende Resultate Nach einer Negativfärbung erscheint die Umgebung der Zellen farbig, während die Zellen selbst ungefärbt bleiben. Das Resultat einer solchen Färbung zeigt EAbb

6 Differenzierende Färbungen Abb. 3.5 Durch die Negativfärbung des Bacillus-Präparates mit Nigrosin treten die stäbchenförmigen Zellen deutlicher hervor (x 3.600). Differenzierende Färbungen Mit Hilfe differenzierender Färbungen, zu denen die Gram- Färbung und die Säurefestigkeitsfärbung gehören, lassen sich Bakterien anhand der unterschiedlichen Zusammensetzung ihrer Zellwand einordnen. Zur Durchführung einer solchen Färbung werden zwei verschiedene Färbelösungen benötigt, von denen man die erste für die Primärfärbung und die zweite für die Gegenfärbung nimmt; außerdem wird zwischen den beiden Färbungen ein Entfärbungsschritt durchgeführt. Abhängig vom Zellwandtyp der Bakterien findet dabei eine Entfärbung statt und es kann eine Gegenfärbung erfolgen, oder die Primärfärbung bleibt trotz des Entfärbungsschrittes erhalten. Anwendung im Labor: Gram-Färbung Ziel und Vorgehensweise Die Zellwand der meisten Eubakterien besteht aus Peptidoglykan, wobei grampositive Bakterien bis zu 40 Peptidoglykanschichten besitzen, während bei gramnegativen Bakterien nur eine dünne Peptidoglykanschicht, dafür aber zusätzlich eine äußere Membran mit Lipopolysacchariden vorliegt. Diese Unterschiede lassen sich durch die Gram-Färbung sichtbar machen, so dass man mit Hilfe dieser Methode zwei verschiedene Gruppen unterscheiden kann. Verwendung findet diese Methode vor allem bei der Identifizierung unbekannter Isolate aus der Natur oder aus dem klinischen Bereich. Bei der Gram-Färbung wird der fixierte Ausstrich zunächst mit Kristallviolett gefärbt und dann, nachdem ge spült wurde, mit einer Jodlösung behandelt. Anschließend entfärbt man die zu untersuchende Probe mit 96%-igem Alkohol und macht dann eine Gegenfärbung mit Safranin. Die sichtbaren Unterschiede entstehen dadurch, dass die grampositiven Bakterien wegen der dicken Peptidoglykanschicht nach der Alkoholbehandlung nicht mehr entfärbt werden können, sondern weiterhin das Kristallviolett des ersten Färbungsschrittes enthalten, während das Färbemittel bei gramnegativen Bakterien durch den Alkohol ausgewaschen wird, so dass sie sich anschließend durch Safranin anfärben lassen. Durch eine Gram-Färbung enthält man aber nicht nur Hinweise auf den Bau der Bakterienzellwand, sondern man kann die Größe, Form und Anordnung der Zellen auch besser erkennen. 39

7 3 Färbetechniken für Bakterien Tipps für die Praxis Beenden Sie das Spülen mit Alkohol, wenn die ablaufende Flüssigkeit klar bleibt. Benutzen Sie Präparate von bekannten Stämmen zum Vergleich Ihrer Färbungen. Solche Kontrollpräparate sind im Fachhandel erhältlich (EAbb. 3.6); man kann sie sich aber auch selbst anfertigen. Führen Sie die Gram-Färbung mit Ansätzen durch, die etwa 24 Stunden gewachsen sind, da man bei älteren Kulturen häufig uneinheitliche Ergebnisse erhält. So sind beispielsweise 24 Stunden alte Zellen von Staphylococcus aureus nach einer Gram-Färbung erwartungsgemäß durchgehend grampositiv gefärbt (EAbb. 3.7), während man in 48 Stunden alten Kulturen bereits einige Bakterien findet, die die Gram- Färbung nicht aufgenommen haben (EAbb. 3.8), und nach 72 Stunden hat dieser Anteil noch deutlich zugenommen(eabb. 3.9). Auf der anderen Seite sind 24 Stunden alte Escherichia coli-zellen durchgehend gramnegativ (EAbb. 3.10), während es in 48 und 72 Stunden gewachsenen Kulturen zahlreiche Zellen gibt, die die Gegenfärbung schlecht angenommen haben (EAbb und 3.12). Abb. 3.6 Ein handelsüblicher Objektträger mit einer grampositiven Kontrolle (oben) und einem Gram-negativen Vergleichsorganismus (unten). Abb Stunden alte Kultur von Staphylococcus aureus nach einer Gram-Färbung. Alle Bakterien sind tiefviolett gefärbt, zeigen also eine grampositive Reaktion. 40

8 Anwendung im Labor: Gram-Färbung Zu erwartende Resultate Grampositive Bakterien zeigen im mikroskopischen Bild eine tiefviolette Färbung. Färbt man eine Mischkultur, dann lassen sich grampositive und gramnegative Bakterien gut voneinander unterscheiden (EAbb. 3.13), und das gilt auch für klinische Abstriche (EAbb. 3.14). Neben der bereits mehrfach erwähnten Art Staphylococcus aureus gehören u.a. Bacillus cereus (EAbb. 3.15), Enterococcus faecalis (EAbb. 3.16), Micrococcus luteus (EAbb. 3.17) und Staphylococcus epidermidis (EAbb. 3.18) zu den grampositiven Bakterien. Gramnegative Bakterien sind im mikroskopischen Bild rötlich gefärbt. Einige Beispiele gramnegativer Bakterien sind: Escherichia coli (EAbb. 3.10), Alcaligenes faecalis (EAbb. 3.19), Enterobacter aerogenes (EAbb. 3.20), Pseudomonas aeruginosa (EAbb. 3.21) und Serratia marcescens (EAbb. 3.22). Abb. 3.9 Bei dieser 72 Stunden alten Kultur der grampositiven Bakterien-Art Staphylococcus aureus zeigen fast ebenso viele Zellen eine gramnegative wie eine grampositive Reaktion (x 3.600). Abb. 3.8 Eine Gram-gefärbte, 48 Stunden alte Kultur der grampositiven Bakterien-Art Staphylococcus aureus. Zwar zeigen die meisten Zellen in diesem Präparat die erwartete violette Färbung, es gibt aber auch eine Reihe von Bakterien, die rötlich aussehen, was einer gramnegativen Reaktion entspricht (x 3.600). Abb Eine Gram-gefärbte, 24 Stunden alte Kultur des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli. Das Ergebnis ist eindeutig, denn alle Zellen sind stark rötlich gefärbt (x 3.600). 41

9 3 Färbetechniken für Bakterien Abb Auch in diesem Gram-gefärbten Präparat, das mit einer 48 Stunden alten Escherichia coli-kultur hergestellt wurde, haben die meisten Zellen eine kräftige, rosa Farbe, aber es gibt eine Reihe von Bakterien, die nur schwach gefärbt sind (x 3.600). Abb Eine Gram-gefärbte, 72 Stunden alte Kultur von Escherichia coli. Es sind nur noch wenige Zellen kräftig rosa gefärbt, wogegen die meisten Bakterien eine untypisch helle Färbung zeigen (x 3.600). Abb In diesem Präparat wurde eine Mischkultur aus der grampositiven Art Staphylococcus aureus und dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli einer Gram-Färbung unterzogen. 42

10 Anwendung im Labor: Gram-Färbung Epithelzelle grampositive Stäbchen grampositive Streptokokken Abb Gram-Färbung bei Bacillus cereus, einem stäbchenförmigen, grampositiven Bakterium (x 2.500). grampositive Staphylokokken Hefezellen Abb Gram-gefärbtes Abstrichpräparat von menschlichen Zähnen. Wie unschwer zu erkennen ist, überwiegen die grampositiven Bakterien (x 3.600). Tetraden Abb Gram-gefärbtes Präparat von Enterococcus faecalis, einem grampositiven Kokkus. Typisch für diese Art ist die Bildung von Zellketten (x 2.500). Abb Präparat von Micrococcus luteus, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium nach einer Gram-Färbung. Typisch für diese Art ist die Tetradenbildung (x 2.500). Abb Gram-gefärbtes Präparat von Staphylococcus epidermidis, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium. Charakteristisch für die Gruppe der Staphylokokken ist die traubenartige Zusammenlagerung mehrerer Zellen (x 2.500). 43

11 3 Färbetechniken für Bakterien Abb Gram-Färbung bei einer Kultur von Alcaligenes faecalis, einer gramnegativen Art, bei der die kurzen Stäbchen alle etwa die gleiche Länge haben (x 2.500). Abb Präparat von Enterobacter aerogenes, einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind einige der stäbchenförmigen Zellen so kurz, dass man sie leicht für Kokken halten könnte (x 2.500). Abb Gram-gefärbtes Präparat von Pseudomonas aeruginosa, einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen etwa 1,5- bis 2-Mal so lang wie die von Alcaligenes faecalis (Abb. 3.19; x 2.500). Abb Bei einer Kultur von Serratia marcescens durchgeführte Gram-Färbung. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen ebenfalls so kurz, dass man sie leicht mit Kokken verwechseln kann (x 2.500). Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung Ziel und Vorgehensweise Mit Hilfe der Säurefestigkeitsfärbung lassen sich eine Reihe von Bakterien zuordnen, die einen hohen Gehalt an hydrophoben Substanzen (Wachsen) in der Zellwand aufweisen und daher auf eine herkömmliche Gram-Färbung nicht ansprechen. Dafür wird allerdings Karbolfuchsin aufgenommen und auch durch Waschen mit einem Salzsäure-Ethanol-Gemisch nicht wieder freigesetzt, so dass man solche Bakterien als säurefest bezeichnet. Andere Arten, denen der hohe Anteil an hydrophoben Substanzen fehlt, lassen sich dagegen durch das Säure-Ethanol-Gemisch entfärben und mit Methylenblau nachfärben. Solche Bakterien werden als nicht säurefest bezeichnet. Eingesetzt wird diese Form der Färbung vor allem zur Identifizierung von säurefesten Arten aus der Gattung Mycobacterium, darunter Mycobacterium tuberculosis, des Erregers der Tuberkulose und Mycobacterium leprae, einer Art, die Lepra verursacht. 44

12 Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung Bei der Säurefestigkeitsfärbung nach Ziehl-Neelsen, der am häufigsten verwendeten Form dieser Methode, wird ein Ausstrichpräparat mit Fließpapier bedeckt, das man anschließend mit Karbolfuchsinlösung tränkt. Danach wird der Objektträger vorsichtig über einem Wasserbad erhitzt, bevor man das Fließpapier entfernt und den Ausstrich mit Wasser spült. Schließlich entfärbt man das Präparat mit einem Salzsäure-Ethanolgemisch und führt zum Schluss eine Gegenfärbung mit Methylenblau durch. Tipps für die Praxis Wenn die zu untersuchenden Bakterien bei der Präparation mit Ovalbumin vermischt werden, haften sie besser am Objektträger. Während der Hitzefixierung sollte weiteres Karbolfuchsin zugegeben werden, um ein völliges Austrocknen des Präparates zu verhindern. Das Auswaschen mit dem Säure-Ethanolgemisch kann beendet werden, wenn die Flüssigkeit klar abfließt. Zu erwartende Resultate Säurefeste Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis sehen unter dem Mikroskop rötlich aus (EAbb. 3.23), während nicht säurefeste Arten blau gefärbt sind (EAbb. 3.24). Säurefeste Stäbchen Nicht säurefeste Stäbchen Abb Gefärbtes Präparat von Mycobacterium tuberculosis. Die säurefesten, stäbchenförmige Zellen erscheinen im Mikroskop rötlich gefärbt (x 3.600). Abb Pseudomonas aeruginosa ist eine nicht säurefeste Art. Die stäbchenförmigen Zellen erscheinen im Mikroskop blau gefärbt (x 3.600). 45

13 3 Färbetechniken für Bakterien Färbung von Zellstrukturen Einige Färbungen lassen sich verwenden, um spezielle Zellstrukturen im Mikroskop sichtbar zu machen, etwa Kapseln, Endosporen oder Geißeln. Das ist insofern wichtig, als diese Bestandteile wichtige Merkmale für die Bestimmung sein können. Anwendung im Labor: Kapselfärbung Ziel und Vorgehensweise Einige Bakterien scheiden während Wachstums Polysaccharide und Polypeptide aus und bilden so außerhalb der Zelle charakteristische Schleimkapseln. Zu den Arten mit solchen Kapseln gehören auch einige Krankheitserreger, darunter Klebsiella pneumoniae und Streptococcus pneumoniae, die Lungenentzündung verursachen können. Für diese Bakterien spielen die Kapseln eine wichtige Rolle, denn sie schützen die Zelle vor Phagozytose durch Makrophagen im Wirt. Da sich Bakterienkapseln nicht anfärben lassen, färbt man die Zelle und den Hintergrund des Präparates, um die Kapseln deutlich hervortreten zu lassen. Verwendet wird dazu eine Kombination aus Negativ- und Einfachfärbung, wobei man eine saure Färbelösung wie Kongorot, Nigrosin oder Tusche (India Ink) benutzt, um den Hintergrund zu färben, während die Zelle mit einem basischem Farbstoff wie Kristallviolett oder Karbolfuchsin angefärbt wird. Zu erwartende Resultate Im mikroskopischen Bild erscheinen die Kapseln als helle Zonen zwischen den aufgrund der Einfachfärbung farbig erscheinenden Zellen und dem durch eine Negativfärbung ebenfalls farbigen Hintergrund. EAbb zeigt eine Kapselfärbung bei Klebsiella pneumoniae. Kapseln Stäbchenförmige Zellen Tipps für die Praxis Damit auch tatsächlich eine Kapselbildung erfolgt, sollten Sie die entsprechenden Bakterien auf Magermilch-Agar wachsen lassen. Führen Sie keine Hitzefixierung durch, weil die Bakterien dabei leicht schrumpfen, so dass sich ein falsches Bild der Kapsel ergeben kann. Spülen Sie die Präparate sehr vorsichtig, damit die Zellen nicht abgewaschen werden. Dehnen Sie das Spülen nicht unnötig aus, denn das Kapselmaterial ist wasserlöslich. Gefärbter Hintergrund Abb Kapselfärbung bei Klebsiella pneumoniae, einer Bakterien-Art mit stäbchenförmigen Zellen. 46

14 Anwendung im Labor: Endosporenfärbung Anwendung im Labor: Endosporenfärbung Ziel und Vorgehensweise Einige grampositiven Bakterien können unter bestimmten Bedingungen sehr widerstandsfähige Sporen, so genannte Endosporen, bilden (EAbb. 3.26). Sie entstehen durch vergleichsweise komplexe Differenzierungsprozesse in den vegetativen Zellen der Bakterien und werden freigesetzt, wenn diese absterben. Die freigesetzten Sporen sind außerordentlich robuste Strukturen, die Bedingungen überstehen können, unter denen vegetative Bakterienzellen längst abgestorben wären. Verbessern sich die Wachstumsbedingungen für die Organismen, dann findet eine Keimung der Endosporen und eine erneute Bildung vegetativer Bakterienzellen statt. Da Endosporen und ihre intrazelluläre Lage in der Mutterzelle recht unterschiedlich sein können, sind sie wichtige Merkmale für die Vertreter bestimmter Bakteriengattungen, vor allem Bacillus und Clostridium. So bildet Bacillus anthracis, der Erreger des Milzbrands, ovale Endosporen in der Mitte der vegetativen Zellen, während sie bei Clostridium botulinum, einem der häufigeren Botulismus-Verursacher, deutlich zu einer der Seiten verschoben sind. Bei Clostridium tetani, dem Tetanuserreger, sitzen die Sporen an einem Ende der Zellen. Wegen ihres speziellen Aufbaus, aber auch aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung nehmen Endosporen kein Methylenblau auf. Daher kann man die Sporen nach einer Einfachfärbung entsprechender Bakterien auch gut als ungefärbte, stark lichtbrechende Objekte innerhalb der gefärbten Zellen erkennen (EAbb. 3.27). Noch besser lassen sich Endosporen aber durch eine spezielle Sporenfärbung sichtbar machen. Eine häufig verwendete Methode zum Anfärben von Endosporen ist die Sporenfärbung nach Schaeffer-Fulton. Dazu bedeckt man ein Ausstrichpräparat mit Fließpapier und tränkt dieses mit einer Malachitgrünlösung. Anschließend wird der Objektträger vorsichtig über einem Wasserbad erhitzt, und nach dem Abkühlen und dem Entfernen des Fließpapiers mit Wasser gespült. Dabei wird der Farbstoff, der durch die Hitzeeinwirkung in die Endosporen eingedrungen ist, nicht mit ausgewaschen, so dass die Sporen anschließend gefärbt sind. Zum Schluss erfolgt dann noch eine Gegenfärbung der Zellen mit Safranin. Endosporen Vegetative Zelle Endospore Sporenbildung Vegetative Zelle Freie Endospore Sporenkeimung Auskeimende Spore Abb Lebenszyklus eines Endosporen bildenden Bakteriums. Abb Ungefärbte Endosporen in den gefärbten, vegetativen Zellen einer Bacillus-Art (x 3.600). 47

15 3 Färbetechniken für Bakterien Tipps für die Praxis Tropfen Sie während des Erhitzens weiteres Malachitgrün auf das Fließpapier, damit das Präparat nicht austrocknet. Spülen Sie das Präparat nach der Malachitgrünfärbung sehr sorgfältig aus, weil die Zellen sonst kein Safranin mehr aufnehmen. Zu erwartende Resultate Nach Durchführung der Färbung, sind die runden oder ovalen Sporen als grünliche Objekte deutlich zu erkennen, so dass sich Endosporen bildende Bakterien mit dieser Methode leicht identifizieren lassen (EAbb bis 3.30). Damit auch ausreichend Sporen vorhanden sind, sollte man ältere Kulturen verwenden, die auf nährstoffarmem Medium gezogen wurden. Wie unterschiedlich die Zahl der Endosporen in Abhängigkeit vom Alter der Kulturen sein kann, zeigen die EAbb bis Bei einer Bakterienart, die keine Endosporen ausbilden kann, sind nach einer Schaeffer-Fulton-Sporenfärbung im Präparat keine grünlich gefärbten Endosporen vorhanden, sondern nur rötlich aussehende, vegetative Zellen (EAbb. 3.31). Endospore Vegetative Zellen Vegetative Zellen Freie Sporen Abb Sporenfärbung bei einer 1-2 Tage alten Kultur von Bacillus cereus, einem Endosporenbildner. Diese junge Kultur enthält viele vegetative Zellen, aber nur wenige Endosporen (x 4.250). Abb Sporenfärbung bei einer 3-4 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind immer noch viele vegetative Zellen vorhanden, aber auch schon zahlreiche, teilweise frei gewordene Endosporen (x 4.250). 48

16 Anwendung im Labor: Geißelfärbung Vegetative Zellen Freie Sporen Abb Sporenfärbung bei einer 5-7 Tage alten Kultur von Bacillus cereus. In diesem Präparat sind nur noch wenige vegetative Zellen zu erkennen, dafür aber viele freie Endosporen (x 4.250). Abb Sporenfärbung bei einer Kultur von Escherichia coli, einem Bakterium, das keine Endosporen bildet. In dem Präparat sind ausschließlich rot gefärbte Stäbchen zu erkennen, aber keine grünlichen Endosporen (x 4.250). Anwendung im Labor: Geißelfärbung Ziel und Vorgehensweise Einige Bakterien besitzen der Beweglichkeit dienende,.fadenartige Anhänge, die Geißeln oder Flagellen genannt werden. Im Mikroskop sind diese sehr feinen Strukturen nur zu erkennen, wenn zuvor eine Quellung und Beizfärbung durchgeführt wurde. Um bewegliche Bakterien präparieren zu können, muss man zunächst eine bewachsene Agarplatte mit Flüssigmedium überschichten, um darin bewegliche Zellen aufzufangen. Anschließend wird die Flüssigkeit abgesaugt und mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, bis ein deutlicher Niederschlag (Pellet) am Boden des Zentrifugenröhrchens zu erkennen ist. Dieses Pellet nimmt man in 10%-igem Formalin auf, und überträgt davon einen Tropen auf einen Objektträger. Dieser wird anschließend etwas geneigt, damit der sich Tropfen auf dem Glas verteilen kann. Nach dem Trocknen an der Luft überschichtet man die entsprechende Stelle dann mit einer Pararosanilinlösung, und spült das Präparat mit Wasser, sobald sich ein goldfarbener Film an der Oberfläche des Färbemittels sowie ein sichtbarer Niederschlag gebildet hat. Tipps für die Praxis Verwenden Sie unbedingt sehr saubere Objektträger. Führen Sie die beschriebenen Schritte möglichst vorsichtig durch, denn Geißeln sind außerordentlich empfindliche Strukturen, die leicht abbrechen. Suchen Sie das Präparat im Mikroskop sehr gründlich ab, da nicht alle Zellen noch Geißeln besitzen werden. Vergleichsweise häufig findet man begeißelte Stadien in den Randbereichen. Zu erwartende Resultate Bei Bakterien gibt es vier Begeißelungstypen (EAbb. 3.32), die sich in vielen Fällen zur Bestimmung verwenden.lassen. So besitzt die Art Pseudomonas aeruginosa nur eine Geißel, ist also monotrich begeißelt (EAbb. 3.33), während Spirillum volutans Flagellen an beiden Seiten aufweist und somit 49

17 3 Färbetechniken für Bakterien amphitrich begeißelt ist (EAbb. 3.34). Pseudomonas marginalis hat mehrere Flagellen an einer Seite, weist also eine lophotriche Begeißelung auf (EAbb. 3.35), während Proteus vulgaris rundum, also peritrich begeißelt ist (EAbb. 3.36). Geißel Monotrich (siehe Abb. 3.33) Amphitrich (siehe Abb. 3.34) Lophotrich (siehe Abb. 3.35) Abb Monotriche Begeißelung bei Pseudomonas aeruginosa (x 3.600). Geißeln Peritrich (siehe Abb. 3.36) Abb Begeißelungstypen bei Bakterien. Monotrich begeißelte Arten haben eine einzelne Geißel an einem ihrer Zellpole, beim amphitrichen Begeißelungstyp sitzt an beiden Enden je eine Geißel. Bei Bakterien mit einem lophotrichen Begeißelungstyp sind an einem Ende mehrere Geißeln vorhanden, und bei peritrich begeißelten Arten sitzen die Fortbewegungsorgane überall auf der Zelloberfläche. Abb Amphitriche Begeißelung bei Spirillum volutans (x 3.600). Geißeln Geißeln Abb Lophotriche Begeißelung bei Pseudomonas marginalis (x 3.600). Abb Peritriche Begeißelung bei Proteus vulgaris (x 3.600). 50