Möglichkeiten moderner mikrobiologischer Diagnostik

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1 Möglichkeiten moderner mikrobiologischer Diagnostik Univ. Prof. Dr. Andrea Grisold, MBA Institut für Hygiene, Mikrobiologie und Umweltmedizin

2 Mikrobiologie Bakteriologie Virologie Parasitologie Bakteriologie Mykologie Klass. Virologie Serologie Molekulare Erregerdiagnostik Ektoparasiten Endoparasiten Mikrobiom 2

3 Mikrobiologie Diagnostik Neu Automatisation MaldiTOF Multiplex PCRs Whole genome sequencing NGS (Next Generation Sequencing) CIDTs (Culture independent diagnostic kits) Klassisch Kultureller Nachweis PFGE MLST Diversilab Erreger MRSA x 3 3 MRGN/ 4 MRGN MDR Variants ESBL VRE PRP Themen MDR und Patient MDR und Umwelt Mikrobiom 3

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8 Distribution of areas by type of Zika virus transmission, worldwide, as of 27 March

9 2016 UK IT FR BG RO DE other s Number of cases Measles cases by month of reporting in selected EU/EEA Member States, Jan Oct UK IT FR BG RO DE others Bulgaria : > 24,300 Cases 24 Deaths France: >20,000 Cases 10 Deaths 0 Italy: > 30,000 Cases 3 Deaths Source: ECDC, TESSy Wales: > 1,200 Cases 1 Death Netherlands: Bible belt >2,700 Cases 1 Death Germany: >2,300 Cases 1 Death Romania: >2,300 Cases 15 Deaths

10 Measles: Occurence of different genotypes 10

11 Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher Einfache Testsysteme Gramfärbung Oxidase Reaktion Katalase Reaktion Coagulase Reaktion Gramfärbung Einsatz von verschiedenen Medien (Chromagar) Vermehrung für weitere Reaktionen NH-Api Diverse biochemische Tests wie API oder Vitek II Je nach Keimgruppe Auswahl der richtigen Methode Kombination aus verschiedenen phänotypischen Methoden sowie Erfahrungswerten Vitek II

12 Anzucht und Identifizierung von Mikroorganismen bisher Nachteile der herkömmlichen v.a. biochemische Methoden Teilweise viel Koloniematerial für weitere Testungen notwendig Je nach Test dauern Identifizierungen ca h Manche Mikroorganismen lassen sich sehr schwer nach Morphologie und Stoffwechselleistungen einteilen

13 Automatisation in der klin. Mikrobiologie- warum so spät? 13

14 Anforderungen Vereinheitlichung der Probenmaterialien bzw. Einsendung mit Universal Flüssigkeitsmedien (z.b. Eswab) 14

15 Identifizierung von Mikroorganismen 15

16 Neue Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation- Time Of Flight MassenSpektromety (MALDI-TOF MS) Kommt aus dem Bereich der Proteomik Das Massenspektrum einer Molekülverbindung kommt durch Ionisation der (neutralen) Moleküle und nachfolgender Bestimmung der Molekülmasse der beim Ionisationsprozeß gebildeten primären Ionen und deren Zerfallsprodukten im Hochvakuum zustande. Dr. Markus Wunderlin

17 Arbeitsablauf 1. Probe auftragen 2. Matrix dazugeben 3. Massenspektrum aufnehmen 4. Datenbankvergleich

18 Positive Aspekte durch MALDI-TOF Genaue, schnelle Identifizierung von vielen Mikroorganismen Staphylokokken auf Spezies-Ebene Schnellere Teilbefunde möglich Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Schnellere Endbefund-Ergebnisse durch schnellere Anaerobier Diagnostik Bacteriodes spp., Prevotella spp., Propionibacterium spp., am Tag der Erst-Befundung der Anaerobier Schneller relevante Befunde möglich Campylobacter fetus im Kniegelenkspunktat Corynebacterium diphtheriae im Rachenabstrich Verbesserte Diagnostikansätze Actinobaculum schaalii im Harn bei chron. rez. HWI

19 MALDI-TOF: Weiterentwicklungen (?) Identifikation der Keime direkt aus Urin Identifikation direkt ab gewachsener Blutkultur Stammtypisierung Bestimmung bestimmter Resistenzgene: PB2a für MRSA Carbapenemasen bei MRGN Bestimmung bestimmter Virulenzfaktoren (z.b. Toxine)

20 Limitation Keimzahl Limitation polymikrobiell Limitation Gender (?) 20

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22 Keywords: MRSA, Phage amplification, Antibiotic resistance, MALDI + 5 Stunden 22 Aures Bericht 2015

23 PCR`s 23

24 PCR`s- automatisiert 24

25 PCR`s- automatisiert 658 Tests 97.6% übereinstimmende Ergebnisse 16 Fälle, die überprüft werden mussten 25

26 PCR`s- automatisiert 26

27 PCR`s- automatisiert 27

28 PCR`s- automatisiert 28

29 C. difficile Toxin-EIAs Enzym Immunoassays in unterschiedlichen Formaten Assay muss Toxin B detektieren, da auch Toxin A neg./toxin B pos. Stämme pathogen sind GDH-EIAs Glutamat-Dehydrogenase Alle CD auch nicht toxigene und auch C. sporogenes etc. reagieren hier Weist nur Erreger - nicht Toxin nach PCR Weisen die Gene für das Toxin oder deren Regulation nach (tcdb, tcda, tcdc) In der Diagnostik sollte ein 2 Stufen Verfahren angewendet werden Erster Test sollte einen hohen Negativen Vorhersagewert haben EIA auf GDH, EIA Toxine A&B, PCR tcdb Zweiter Test sollte die Positivität bestätigen

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31 FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel for the simultaneous detection of 22 different enteric pathogens directly from stool specimens. Panel`s

32 Panel`s Respiratory panel: 20 targets GI- panel: 22 targets MP- panel: 14 targets

33 33 Bacteria isolated in culture but not included in the panel were C. diverus, Klebsiella pneumoniae und P. stuartii, as well as S. epidermidis, S. haemolyticus and S. warneri.

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36 Whole genome sequencing (WGS) 36

37 Whole genome sequencing (WGS) 37

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41 41 KEY WORDS: viral microbiome next-generation sequencing viral dark matter bacteriophages

42 Mikrobiomanalysen- auch aus Mischkulturen möglich Keine Spezies, aber Gattung bzw. Phylum- Hinweis auf die Vielfalt 42

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46 Recently the paradigm that the healthy lung is sterile was challenged and it is now believed that the lungs harbor a diverse microbiota also contributing to the pathogenesis of various diseases..we need to proceed with elucidation of the role of mycobiota in healthy LRT and LRT diseases to hopefully improve patient care. 46

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49 CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 49

50 CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 50

51 CIDT`s: Culture independent diagnostic testing 51

52 SF: 125+ (26.6%) und 98/120 potential pathogens BC: 71+ (15.1%) und 63/120 potential pathogens False negative rate of SF: 3.7% 52

53 Zusammenfassung Diagnostik Neu Automatisation MaldiTOF Multiplex PCRs Whole genome sequencing NGS (Next Generation Sequencing) CIDTs (Culture independent diagnostic kits) Klassisch Kultureller Nachweis PFGE MLST Ergebnisse Schneller, umfangreicher,??? Interpretation..further studies have to be conducted Herzlichen Dank für ihre Aufmerksamkeit! 53