Thema Gentechnologie. Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Vorlesung #

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1 Thema Gentechnologie Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Vorlesung #

2 Gentherapie mit Hilfe von Stammzellen

3 Bedeutung embryonaler Stammzellen

4 Was sind (embryonale) Stammzellen? Wozu brauchen wir sie? totipotent oder pluripotent?

5 Was ist Totipotenz, was ist Pluripotenz? Totipotenz: die Zellen sind in der Lage sich in alle in einem Organismus jemals vorhandene Zellen zu differenzieren (z. B. auch in Trophoblastenzellen) daraus folgt: aus solchen Zellen kann sich ein Mensch entwickeln Pluripotenz: die Zellen können sich noch in sehr viele verschiedene Zellen differenzieren, aber nicht mehr in alle ( z. B. nicht mehr in Trophoblasten-Zellen)

6 Totipotente Zellen können sich in Zellen aller drei Keimblätter entwickeln Ektoderm Endoderm Mesoderm

7 Ein Organismus entwickelt sich aus einer einzigen Zelle: der befruchteten Eizelle Eizelle Zweizellstadium Achtzellstadium

8 Es gibt verschiedene Arten von Stammzellen: embryonale Stammzellen (ES-Zellen) embryonale (fetale) Keim -Stammzellen (EG-Zellen, von embryonic germ cells ) adulte Stammzellen z. B. hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark

9 Die verschiedenen Stammzellen werden nach ihrer Herkunft benannt ES-Zellen werden aus frühen Embryonen gewonnen EG-Zellen werden aus primordialen Keimzellen aus Foeten isoliert Adulte Stammzellen werden aus verschiedenen Organen (Knochenmark, Gehirn, Blut, Leber, Retina etc) gewonnen

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11 Die verschiedenen Stammzellen unterscheiden sich in ihren Eigenschaften ES-Zellen und EG-Zellen sind pluripotent (differenzieren zu Zellen aller drei Keimblätter) und bilden sog. embryonic bodies in Kultur ES-Zellen wachsen besser (>500 Verdopplungen) in Zellkultur als EG- Zellen (max. 80 Verdoppl.) ES-Zellen bilden Teratome, EG-Zellen keine T. Adulte Stammzellen sind nicht pluripotent, die Plastitzität der Zellen ist noch nicht abschließend geklärt

12 Gewinnung von Stammzellen ES-Zellen werden aus frühen Embryonen im Blastocystenstadium gewonnen

13 Entnahme embryonaler Stammzellen

14 Entwicklung eines menschlichen Embryos:

15 Verfügbare ES-Zelllinien Zur Zeit gibt es zwischen mehr als 60 humane ES- Zelllinien; aus der National Stem Cell Bank (USA) können zurzeit 279 verschiedene ES-Linien bezogen werden; NIH hes Cell Registry finden sich 400 Zelllinien davon 121 in der Prüfung (Stand ) htm

16 Gewinnung von ES-Zellen : Herkunft der Embryonen die menschlichen Embryonen stammen aus IVF-Behandlungen und sind überzählig und werden gespendet weltweit werden derzeit mehr als überzählige Embryonen tiefgekühlt gelagert

17 Gewinnung von Stammzellen: ES-Zellen

18 Die früheste Differenzierung der embryonalen Stammzellen: Erste Differenzierung in Trophoektoderm und primitives Endoderm wird durch differenzielle Oct4- Genexpression erreicht (aus Pesce and Schöler)

19 Etablierung einer Stammzelllinie: Wie viele Eizellen werden für eine Stammzelllinie benötigt? Bei der Etablierung der ersten menschlichen ES- Zelllinien (Thomson et al. 1998) wurden 36 Embryonen eingesetzt, 20 entwickelten sich bis zur Blastocyste, davon wurden 14 Embryoblasten isoliert und kultiviert, daraus konnten erfolgreich 5 Zelllinien etabliert werden (jede Zelllinie jeweils nur von einem Embryo)

20 Müssen Embryonen speziell für die Stammzellerzeugung gezüchtet werden? Die ersten humanen ES-Zelllinien (Thomson et al. 1998) stammen sowohl aus eingefrorenen als auch aus frischen Embryonen. Die Autoren erwähnen keine auffälligen Unterschiede zwischen eingefrorenen und frischen Embryonen

21 Kann man ES-Zellen im Reagenzglas zu Organen heranzüchten? Kultivierte Mensch-ES-Zellen konnten zur Differenzierung in mehr als 10 verschiedene Zell-/Gewebetypen angeregt werden: z.b. Herzmuskelzellen, Gehirnzellen, Knochen- und Knorpelzellen, Nierenzellen, Leber, Pankreas, Ganglienzellen, glatte Muskelzellen, Darmepithel u. a.. Fraglich ist, ob sich daraus Keimzellen entwickeln können. Das scheint nach neuesten Erkenntnissen aber möglich zu sein! Kultivierte Maus-ES-Zellen konnten zur Differenzierung in mehr als 34 verschiedene Gewebe/Zellen angeregt werden

22 Ist schon bewiesen, dass ES-Zelltransplantationen Erkrankungen heilen können? In Tierversuchen, eindeutig ja: Beispiele Autoimmunerkrankungen(Maus), Diabetes (Maus), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS, deg Motoneuronen, Ratte) Parkinson (Mensch, fetale Stammzellen -ohne Doppelblind-Studie-) Herzinfarkt (Maus, Ratte, mit adulten Stammzellen)

23 Gentechnische Modifikation zur Verhinderung der Abstoßungsreaktion

24 Künstliche Embryonale Stammzellen (ips) aus Fibroblasten durch Aktivierung der Gene Oct4, Sox2, cmyc und Klf4. Ca. 1 von 1000 Zellen entwickelt ES-Cell Phänotyp.Takahashi, K., and Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: , Marius Wernig(1*), Alexander Meissner(1*), Ruth Foreman(1,2*), Tobias Brambrink(1*), Manching Ku(3*), Konrad Hochedlinger(1^), Bradley E. Bernstein(3,4,5) & Rudolf Jaenisch(1,2), Nature Juni 2007

25 Herstellung künstlicher ES-Zellen

26 Chimäre Maus mit künstlichen ES-Zell- Arealen

27 Aus: In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state Marius Wernig, Alexander Meissner, Ruth Foreman, Tobias Brambrink, Manching Ku, Konrad Hochedlinger, Bradley E. Bernstein & Rudolf Jaenisch Nature 448, (19 July 2007)

28 1. de Peppo, G. M., I. Marcos-Campos, D. J. Kahler, D. Alsalman, L. Shang, G. Vunjak- Novakovic, and D. Marolt Engineering bone tissue substitutes from human induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences (May). 2. Marolt, D., I. M. Campos, S. Bhumiratana, A. Koren, P. Petridis, G. Zhang, P. F. Spitalnik, W. L. Grayson, and G. Vunjak-Novakovic Engineering bone tissue from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 109(22):

29 Thera- peutisches Klonen?

30 Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer Masahito Tachibana et al. Cell,153, 1-11, 15 May (June6) 2013

31 Großbritannien erlaubt Herstellung von Mensch-Tier-Embryonen (Spiegel on line, ) Die Debatte war kontrovers, aber am Ende stand eine deutliche Mehrheit: Das britische Unterhaus hat der Herstellung von Embryonen aus menschlichem Erbgut und Eizellen von Tieren für die Stammzellenforschung zugestimmt. Kritiker befürchten jetzt eine "Frankenstein-Wissenschaft". London - Das britische Unterhaus stritt heftig, Premierminister Gordon Brown warb für die Stammzellenforschung, und am Ende konnte er zufrieden sein: In Großbritannien können Embryonen aus menschlichem Erbgut und Eizellen von Tieren für die Forschung geschaffen werden. Das Unterhaus in London stimmte am Montagabend mit 336 zu 176 Stimmen gegen einen Antrag, generell die Produktion von solchen Chimären zu verbieten. Damit unterstreicht Großbritannien seinen Ruf als eines der weltweit liberalsten Länder in der Stammzellenforschung. Ebenfalls wurde im Unterhaus ein Antrag zum Verbot der Produktion sogenannter "Helferoder Rettergeschwister" mit Mehrheit abgelehnt. Dabei geht es um die künstliche Erzeugung von Embryonen, die einem lebenden Kind genetisch weitgehend entsprechen und ihm bei Krankheiten Zellen oder genetisches Material für die Behandlung liefern sollen.

32 Dolly Dolly with her first newborn, Bonnie Born in July 1996 at the Roslin Institute in Scotland First mammal to be cloned from an adult mammal using the nuclear transfer technique 277 attempts were made before the experiment was successful Dolly died in February 14, 2003 of progressive lung disease at the age of 6; whereas normal sheep can live up to 12 years of age.

33 Mammal Cloning uffworks.com/cloni ng.htm/printable January 8, 2001 Noah, a baby bull gaur, became the first clone of an endangered animal.

34 Mammal Cloning Timeline 1984 A live lamb was cloned from sheep embryo cells 1986 Early embryo cells were used to clone a cow 1993 Calves were produced by transfer of nuclei from cultured embryonic cells 1995 Two sheep, named Megan & Morag, were cloned using embryo cells Megan and Morag Dolly 1996 Birth of Dolly, the first organism to be cloned from a fully differentiated adult cell 1997 Transgenic sheep named Polly was cloned containing a human gene /WORLD/europe/08/06/clo ne.critics/index.html

35 Tetra mice were cloned in three generations from a single mouse calves were cloned from a single adult cow, but only 4 survived to their first birthday 1999 A female rhesus monkey named Tetra was cloned by splitting early embryo cells Pigs and goats reported cloned from adult cells 2002 Rabbits and a kitten reported cloned from adult cells hspva/academic/science/ Thinkquest/gail/text/bene fits.html

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37 Vergleich der Erfolgsrate bei verschiedenen Tieren Species Number of oocytes used Number of live offspring Notes Mouse (1.3%) - Bovine (1.4%) 2 died Sheep (3.4%) 11 died within 6 months Pig (0.5%) - Goat (1.1%) - The table shows success rates of cloning when mature mammal cells were used. Yanagimachi, R "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.

38 Development and survival of cloned mouse embryos Majority of the embryos die before and after implantation. This figure shows that the present cloning technique is highly inefficient. Yanagimachi, R "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.

39 Table 1. Comparison of cloning success rates in various animals As many investigators did not describe the original numbers of the oocytes used for nuclear transfer, success rates of cloning shown here are based on the numbers of reconstructed oocytes. Molecular and Cellular Endocrinology Volume 187, Issues 1-2, 22 February 2002, Pages

40 Biotechnology of Mammalian Cloning Embryo Splitting /cloning.htm earliest method of cloning success limited to embryos split before implantation Parthenogenesis only possible in females to give female progeny still investigating so far mostly failed attempts Nuclear transplantation main technique in current cloning experiments

41 Kern - Transplantation Enucleation of donor cell Nuclear Transfer the nucleus of the individual to be cloned is transferred to the cytoplast in one of the 2 ways: 1) electrofusion whole nucleus donor cell injected beneath the zona pellucida (the outer membrane of the oocyte) and fusion of cells induced by electrical impulses 2) nuclear injection naked nucleus microinjected into cytoplast

42 Zusammenfassung oocyte ENUCLEATION cytoplast cytoplast NUCLEAR TRANSFER clone cell

43 genetic reprogramming Induktion der Embryo- Entwicklung developing embryo in culture Implantation embryo uterus of surrogate mother

44 Electrofusion fusion pulse Cells brought close together Heterokaryon phase: nuclei distinct fusion product Fusion induced by electric pulse

45 Genetische Reprogrammierung Fig. 5 from Nature Reviews Genetics 3: 671

46 Cloning Humans

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