Wer bin ich, und wenn ja, wie viele? Fortschritte in der bakteriologischen Diagnostik

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1 Universität des Saarlandes Medizinische Fakultät Homburg Wer bin ich, und wenn ja, wie viele? Fortschritte in der bakteriologischen Diagnostik M. Herrmann Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Universität des Saarlandes Unter Verwendung von Materialien von L. von Müller

2 Dr. Mayer s wishlist Zusammenfassung Ich wünsche mir Eine möglichst schnelle Befunderstellung Einen Kommentar zum Ergebnis mit Bezug zum klinischen Zusammenhang Bedeutet eine Mitteilung an den Mikrobiologen über den klinischen Zusammenhang bei der Befundanforderung! Eine Beratung zum Vorgehen (Medikation, Isolation, Epidemiebegrenzung) in schwierigen Situationen Eine möglichst schnellen Transfer von mikrobiologischen Neuerungen in die klinische Routine Mein Wünsch Dir was ist ein Plädoyer für eine klinische Mikrobiologie/Infektiologie 2

3 Bakteriologische Analytik klassische Verfahren Patient mit Infektionsverdacht Entnahme von Probenmaterial 1 Stunde Befund, Versand 1-18 Stunden Empfindlichkeitsprüfun 18 Stunden g Therapie beendet Patient entlassen Patient verstorben Arztbrief Kalkulierte Therapie (immer Omnispektrum ) Mikrobiologische Diagnose nach 5-6 Tagen Keine Therapieanpassung Ausfüllen Begleitschein 30 Minuten Versand 10 Minuten 18 Stunden Manuelle Probenanlage 1-4 Stunden Erreger-Identifizierung (klassischmikrobiologische und biochemische Verfahren) 10 min- 18 Stunden evtl. Erreger-Isolierung Vermehrung 18 Stunden Übernacht Bebrütung Stunden 3

4 Befundbewertung, Validierung, online Befundübermittlung kumulativer Befund 30 Minuten Empfindlichkeits prüfung (rapid system) 6-9 Stunden Integrierte Mikrobiologische Diagnostik - essentiell zur Bekämpfung von Infektionen und Multiresistenz - Gezielte Therapie (häufig Schmalspektrum) gem. Erreger und Resistenz Erreger-Identifizierung (MALDI-TOF) Patient mit Infektionsverdacht Kalkulierte Therapie (häufig Breitspektrum) sofort! Entnahme relevanten Probenmaterials (Gewebe, Aspirate, hochresorbierende Tupfer) < 1 Stunde Mikrobiologische Diagnose + resistenzadaptierte Therapie = < 24 Stunden! Übernacht Kultur online order entry (OOE) 5 Minuten Schneller Transport (z.b. Rohrpost) 10 Minuten Automatisierte Probenanlage 10 Minuten < 1 Stunde Stunden 4

5 geflockte Tupfer vermitteln deutlich größere Probeaufnahme konventionell eswab 5

6 eswab Wiederfindungsraten 6

7 Verbindung mit automatisierter Probenverarbeitung 7

8 Universitätsklinikum des Saarlandes Universität Institut des für Saarlandes Medizinische Mikrobiologie Medizinische Fakultät Homburg Sensitivität WASP / manueller Ausstrich WASP manuell 30µl Inokulum

9 MALDI-TOF eine Revolution in der diagnostischen Mikrobiologie 9

10 MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight Prinzip: Probe (Analyt) wird auf Träger immobilisiert und in organische Matrix eingebettet Durch Laserbeschuss (UV) verdampft Matrix explosionsartig Analytmoleküle werden mitgerissen Ionisierung des Analyten Beschleunigung der Analyten-Moleküle in elektrischem Feld Ionendetektor wandelt Moleküle in elektrisches Signal um Charakteristisches Spektrum abhängig von Analyten-Komposition Bei Bakterien: Hauptsächlich ribosomale Proteine bestimmen TOF Spektrum Typisches Spektrum für unterschiedliche Spezies 10

11 Klinische Anwendung - PubMed Juli

12 MALDI-TOF Direktnachweis aus Blutkultur 12

13 Schnelle Empfindlichkeitsprüfung, z.b. Vitek2 13

14 einschliesslich Multiresistenzen, z.b. ESBL 14

15 dennoch: Mikrobiologie wird nie ein Automaten -Fach Komplexe bakterielle Genetik Punktmutationen (SNPs) Gencluster komplexe Expressionsmechanismen irnas Hohe Adaptivität (siehe EHEC) Unerklärte Fitnessfaktoren (siehe weltweite klonale Ausbreitung) Komplexe Resistenzmechanismen 15

16 z.b. Carbapenem-Resistenz bei Enterobakterien 16

17 K. pneumoniae VIM-1 + SHV-5 Pip Tic Amx Tz G K Fox Ctx Amc Caz Cs Amk Tb Net Cf Atm Fep Tcc Sul Tmp Fos Ma Mox Imp Cip Ofx Pi MIC : imipenem 32 mg/l ; gentamicin 8 mg/l Courtesy: N. Kassis-Chikhani 17

18 K.pneumoniae IMP-R in Griechenland! A. Vatopoulos, eurosurveillance,

19 neue superbugs?? 19

20 MALDI-TOF als epidemiologisches Tool KPC K. pneumoniae Ausbruch UKS

21 kommentierter Einzelbefund 21

22 online Kumulativbefund 22

23 online Antibiogrammprofil 23

24 und Labordokumentation sämtlicher Diagnostik- und Therapieempfehlungen! 24

25 4 aktuelle Beispiele zur Epidemiologie, Diagnostik, Virulenz.. MRSAar-Netz APS - das Saarländische Prävalenz-Screening Clostridium difficile - 027, der hypervirulente Stamm: Wie ging die Entwicklung weiter? Endokarditis - Spurensicherung einer früheren Infektion aus Herzklappenmaterial EHEC O104, H4 - Was macht ihn so virulent? => einen schnellen Transfer von mikrobiologischen Neuerungen in die Klinik 25

26 1. MRSAar Aufnahme-Prävalenz- Screening - Resultate admission patients 83,6 % participation rate, 2,6% refusal upon informed consent 436 tests positive for MRSA 423 nasal/throat only 13 isolated wound only 13 combined wound and nasal/throat = 2.18 MRSA patients / 100 admissions 26

27 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% Durch Screenen von knapp 1/3 der Aufnahmepatienten 100,0% 61,0% 65,4% 66,0% 66,1% 66,7% 67,2% 50,8% 31,9% 21,7% 13,5% 14,0% 15,2% 18,5% 2,5% 6,4% 27 Hautulcus Chronische Dialysepflichtigkeit Seniorenheim Liegender Katheter Kontakt MRSA Diabetes Melitus Krankenhausaufenthalt > 6 Antibiotikatherapie Krankenhausaufenthalt > 12 Verlegung Krankenhaus Brandverletzungen Kontakt Nutztiere Kontakt Fleisch Nicht erfassbar MRSA Anamnese

28 120,00% 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 17,97% erfassen wir fast 70% unserer MRSA-Patienten BEI AUFNAHME! 100,00% 80,21% 86,20% 89,06% 89,32% 89,32% 89,58% 89,58% 55,47% 59,11% 62,24% 69,01% 51,30% 52,34% 30,99% 28 Chronische Dialysepflichtigkeit Seniorenheim Liegender Katheter Kontakt MRSA Diabetes Melitus Krankenhausaufenthalt > 6 Antibiotikatherapie Krankenhausaufenthalt > 12 Verlegung Krankenhaus Brandverletzungen Kontakt Nutztiere Kontakt Fleisch Nicht erfassbar Hautulcus MRSA Anamnese

29 MRSA Screening Kosteneffizient Verhindert unerkannte Weiterverbreitung Voraussetzung für Sektor-übergreifende Dekolonisationsstrategien Schutz des Patienten vor eigener Infektion (Wahrscheinlich) reduzierte MRSA-Morbidität und Mortalität MRSAar Netz Prävalenz-Screening: Kosten ~ Seither: Deutliche Steigerung der Sensibilität von Krankenhaus-Administratoren, Ärztlichen Direktoren, Dachgesellschaften, Politikern, Öffentlichkeit 29

30 2. Clostridium difficile Diagnostik 30

31 slpa-sequence typing (slpast) RT1 (27%) RT027 (52%) Surface-layer protein A von C. difficile RT78 (4%) smz (3%) RT66 (5%) Sleytr and Beveridge Trends Microbiol

32 Untersuchung GLDH+ / Toxin- Proben PCR (Stuhl) Toxin Gene Kultur Toxin Kultur 6 (9.8%) neg. 3 (50%) neg. 3 (50%) pos. negativ 55 (90.2%) pos. 8 (14.5%) neg. 47 (85.5%) pos. 3 (37.5%) neg. 5 (62.5%) pos. 16 (34%) neg. 31 (66%) pos. 4 (80%) neg. 1 (20%) pos. 6 (19.4%) neg. 25 (80.6%) pos. => Toxintest allein ist wenig sensitiv! 32

33 Epidemiologie von C. difficile (UKS) 30 Culture positive patients (n) Time (Month/Year) smz 012/046/ / /094 others 33

34 Zusammenfassung Clostridium difficile Was wünsche ich mir: Eine schnelle Befunderstellung sensitiver (2 Stunden) und spezifischer Nachweis (1-3 Tage) mit einer 2-Stufen Diagnostik möglich Toxin Antigen Test wenig sensitiv Die PCR als eine schnelle (<24 h), sensitive Methode zur Klärung diskrepanter Fälle Die CDI ist primär eine klinische Diagnose, die frühzeitig therapiert werden muss Eine Therapieverzögerung bei verzögerter Labordiagnostik ist nicht gerechtfertigt Möglichkeit der Beratung durch das KL 34

35 3. Was bringt uns eigentlich die PCR? Erregernachweis in Herzklappen Goldstandard Kultur Nachweis typischer Endokarditis Erreger ABER: Kultur Bias für - Anspruchsvolle Erreger (z.b. HACEK) - Nicht anzüchtbare Erreger (z.b. T. whipplei) - Antibiotisch vorbehandelte Patienten - Kontaminationsgefahr (z.b. Hautkeime) => zusätzlicher Kultur unabhängiger Erregernachweis 16S rdna PCR und Sequenzierung 35

36 Bakterien Nachweis in Herzklappen Kultur vs. 16S rdna PCR Culture and 16S rdna PCR positive samples (no.) Kultur+ PCR CoNS Corynebacteria Micrococcus Neisseria Others Tropheryma whipplei Haemophilus Enterococci S. aureus Streptococci 16S rdna PCR positive samples (no.) Kultur- PCR+ weniger typische Erreger sehr typische Erreger

37 Bakterien Nachweis in Herzklappen PCR negativ und Kultur positiv CoNS Corynebacteria Micrococcus Neisseria Others Tropheryma whipplei Haemophilus Enterococci S. aureus Streptococci Culture positive samples (no.) weniger typische Erreger Kontaminanten? sehr typische Erreger

38 4. EHEC O104,H4 ( essen Frauen >30 Jahre lieber Sprossen?? ) Alters- und geschlechtsspezifische Inzidenz 1,0 0,9 Fälle pro Einwohner 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 männlich weiblich 0, Altersgruppe 38

39 Wie waren wir auf die Diagnostik dieses Stamms (HUSEC041, O104H4) vorbereitet? O104H4 Patient E.coli wt Wasser flich4 O104 terd stx2 stx2 terd O104 flich4 Lancet 2011 UKS

40 Was macht den Erreger pathogen? STEC Toxin plus EAEC Adhäsine = EHEC (HUSEC041) EHEC Merkmale: Shiga-Toxin 1 (stx1): neg Shiga-Toxin 2 (stx2a): pos Intimin (eae): negativ Enterohämolysin: negativ EAEC/HUSEC041 Kontrollstamm EAggEC Merkmale (EAggEC Virulenzplasmid): aata-pcr: positiv (ABC-transporter protein gene) aggr-pcr: positiv (master regulator gene of virulenceplasmid genes) aap-pc: positiv (secreted protein dispersin gene) agga-pcr: positiv (AAF/I-fimbral subunit-gene) aggc-pcr: positiv (AAF/I-fimbral operon-gene) asta-pcr: negativ (enteroaggr. E. coli heat-stable enterotoxin (EAST-1) gene ) 40

41 Zusammenfassung HUSEC041 Nach Erkennung der Ausbruchssituation Diagnostik von EHEC durch PCR Schnelle Resistenzbestimmung Schnelle und sichere Diagnostik von HUSEC041 durch Spezies-spezifische PCR Whole-genome-Sequenzierung ermöglicht Identifizierung von neuen Pathogenitätsinseln bzw. Virulenzfaktor-Kombinationen Transmissionsmechanismen (Ausbruchsquelle, Wirt) Bisher ungelöst EHEC-Nachweis ausserhalb des Warmblüters Therapieoptionen 41