Seminararbeit: Modeling DNA Sequences

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1 Seminararbeit: Modeling DNA Sequences Lisa Klein-Schmeink 29. März 22 Inhaltsverzeichnis Einleitung 2 Methoden zur Analyse einer DNA-Sequenz? 3 3 Lange Ketten 4 4 r-scans 7 4. Geballtes Auftreten Auftreten in regelmäßigen Intervallen Fazit 2

2 Einleitung Abbildung : DNA-Struktur Dieser Seminarvortrag gibt eine Einführung in die Modellierung von DNA-Sequenzen auf Basis von Statistical Methods in Bioinformatics: An Introduction Ewans, Grant, 25). Bevor man diese analysieren kann, muss man zunächst natürlich verstehen, was sich hinter einer DNA-Sequenz tatsächlich verbirgt. DNA-Sequenzen Desoxyribonukleinsäure) sind Moleküle, die einen Hauptbestandteil der Zellkerne aller Lebewesen der Eukaryoten) darstellen und als Träger von Erbinformationen dienen. DNA-Sequenzen sind Nukleinsäuren, die aus Nukleotiden aufgebaut sind. Diese bestehen aus einer Phosphatgruppe, einem Zucker Desoxyribose bei DNA) und einer stickstoff-

3 haltigen Base Adenin A), Cytosin C), Guanin G) oder Thymin T). Diese bilden das DNA-Alphabet {A, C, G, T }. Dabei liegt eine komplementäre Basenpaarung vor: Adenin ist verbunden mit Thymin A-T) und Cytosin mit Guanin C-G). Ein DNA-Molekül hat die Form einer Doppelhelix. Die Längsstränge dieser verdrehten Strickleiter bestehen aus sich abwechselnden Desoxribose- und Phosphatmolekülen. Die beiden Stränge verlaufen in entgegengesetzter Richtung, so dass ein 3 -Ende eines Stranges einem 5 -Ende gegenüber liegt. Daher wird auch nur ein Strang einer DNA-Sequenz angegeben, um diese zu charakterisieren. Meist betrachtet man die proteinkodierenden Gene, das sind die Teilstücke eines DNA- Strangs, durch die Proteine erstellt werden können. Proteine sind Makromoleküle, die aus den 2 verschiedenen Aminosäuren bestehen. Der Hauptbestandteil dieser proteinkodierenden Gene sind Nukleobasen-Tripletts Codons), die jeweils eine Aminosäure kodieren. Der genetische Code ist die Art, wie die Codons in Aminosäuren übersetzt werden. Ein solches Gen beginnt mit einem Start-Codon und endet mit einem Stop- bzw. Nonsense-Codon. Abbildung 2: Schema der Proteinsynthese Proteine werden aus Genen gewonnen, indem sie zunächst durch Transkription in RNA umgewandelt wird. Dabei werden nur die kodierenden Bereiche, die Exons für expressed region), 2

4 benutzt während die nicht-kodierenden Regionen, die Introns für intervening region), durch die sie unterbrochen werden, aus der Sequenz herausgespleißt werden. RNA Ribonukleinsäure) sind einzelsträngige Ketten von Nukleotiden ähnlich der DNA, die als Zucker Ribose verwenden und bei dem die Base Thymin durch Uracil U) ersetzt sind. Die durch die Synthese anhand von DNA gewonnene RNA wird auch Boten-RNA oder mrna für messenger RNA) genannt. Im zweiten Schritt, der Translation, wird die mrna benutzt, um ein Protein zu generieren. 2 Methoden zur Analyse einer DNA-Sequenz? Bei der Analyse von uncharakterisierten DNA-Sequenzen interessiert man sich häufig dafür, ob diese in einer kodierenden Region liegen. Introns und intergenische Bereiche weisen andere Eigenschaften als Exons auf, so dass z.b. unter der simpelsten Annahme, der unabhängigen und identischen Verteilung i.i.d.) der Nukleotiden, die Auftrittshäufigkeiten der einzelnen Nukleotiden in Exons bzw. Introns betrachtet werden. Dafür ermittelt man aus schon charakterisierten Sequenzen, sogenannten Trainingsdaten, die Verteilung der Nukleotiden. Man testet die Unabhängigkeits-Hypothese mit Hilfe von Markov-Ketten gegen die Alternative, dass die Nukleotiden Markov-abhängig sind, d.h. dass die Auftrittswahrscheinlichkeit eines Nukleotides nur von der vorhergehenden Nukleotiden abhängt, bzw. gegen Markov-Abhängigkeit höherer Ordnung bzw. nichtlinearer. Definition. Eine stochastische Folge M = M n ) n, also eine Folge von Zufallsexperimenten, mit Zustandsraum S, S) heißt Markov-Kette, wenn sie die Markov-Eigenschaft besitzt, d.h. PM n+ A M,..., M n ) = PM n+ A M n ) für alle n und alle A S. ) Die stochastische Folge heißt Markov-Kette k-ter Ordnung, wenn sie folgender Eigenschaft genügt PM n+ A M,, M n ) = PM n+ A M n t+,..., M n ) 2) für alle n und alle A S. Die Wahrscheinlichkeit für M n+ hängt hier also von den k vorherigen M i ab. In den meisten Fällen ergibt ein solcher Assoziationstest, dass die Markov-Modelle die Realität weit aus besser widerspiegeln, wobei auch sowohl Hypothese und Alternative falsch seien können. In der Praxis testet man ob die betrachtete DNA-Sequenz zu einem Signal gehört. Definition 2. Ein Signal ist eine kurze Sequenz, die einem spezifischen Zweck, wie eine Grenze zwischen Exon und Intron zu definieren, dient. Dies ermöglicht, dass Gene erkannt und in Proteine umgewandelt werden können. Dabei existieren oft viele Mitglieder eines Signals, also DNA-Sequenzen, die die gleiche Funktion haben. Meist sind nicht alle Mitglieder bekannt, so dass diejenigen, die bekannt sind, benutzt werden, um festzustellen, ob die betrachtete Sequenz auch zu dem Signal gehört. Außerdem kommen sie manchmal auch zufällig in nichtkodierenden Regionen vor. Man schränkt das Modell auf die empirisch meist begründete Annahme ein, dass Mitglieder eines Signals durchgängig die gleiche Länge n haben. 3

5 3 Lange Ketten Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Hypothese, dass ein Nukleotid zufällig auftritt gegen die Alternative, dass eine Tendenz für ein wiederholtes Auftreten dieses Nukleotiden in Folge besteht, zu testen. Definition 3. Definiere unter der Zufälligkeits-Hypothese die Zufallsvariable Y als die Länge einer Kette der Nukleotiden a in einer DNA-Sequenz der groß genügenden Länge N nach dem letzten Auftreten eines anderen Nukleotiden. Da dies der Anzahl der Erfolge nach einem Misserfolg entspricht, hat sie eine geometrische Verteilung mit einem bekannten Parameter p. Die Wahrscheinlichkeit, dass a an einem beliebigen Ort in der Sequenz auftritt ist also: P Y y) = PY = y) = p)p y 3) Definition 4. Unter einer Ordnungsstatistik X ),..., X n) versteht man die Ordnung der Realisationen x,..., x n einer Zufallsvariablen X der Größe nach. X i) bezeichnet die i-te Ordnungsstatistik. Insbesondere sind damit X max und X min die n-te bzw. die -te Ordnungsstatistik. Satz 5. Für n solche Sequenzen folgt dann für die längste unter diesen Sequenzen, der Ordnungsstatistik Y max : PY max y) = p y ) n 4) Beweis. Sei F Ymax y) die Verteilungsfunktion von Y max, dann gilt PY max y) = PY max y ) = F Ymax y)) n = p y ) n Um den Wert in 4) zu bestimmen, muss die Anzahl dieser Sequenzen n approximiert werden. Im folgenden sei unter ein gerundetes Ergebnis und unter die asymptotische Annäherung d.h. für n ) gemeint. Lemma 6. Man geht unter der Hypothese davon aus, dass die Misserfolge binomialverteilt sind, also lässt sich die Wahrscheinlichkeit, dass Y max größer als ein beobachteter Wert y max ist, wie folgt abschätzen: PY max y max ) p ymax ) p)n 5) Beweis. Da man von einer Binomialverteilung ausgeht, wird erwartet, dass p)n Misserfolge und, da Ketten von Erfolgen wobei diese auch die Länge haben dürfen) sich einem Misserfolg anschließen, ebenso auch p)n Erfolge auftreten. Damit erhält man das gewünschte Ergebnis für eine maximale beobachtete Länge y max. Korolar 7. Wenn p)np ymax ist, gilt sogar PY max y max ) e p)npymax 6) 4

6 Beweis. Da für große n und t gilt, dass + t n) n e n, folgt für p)np ymax : PY max y max ) p ymax ) p)n e p)npymax Im folgenden Beispiel erkennt man, dass diese Abschätzungen gute Ergebnisse liefern: Beispiel 8. Sei N =,, p = 4, dann ergibt Gleichung 5) ungefähr und 6) Auch die Annahme, dass die Misserfolge binomialverteilt sind, lässt sich hiermit nachvollziehen. Für p = 3 4 und Y max folgt mit dem binomischen Lehrsatz a + b) n = n n k= k) a k b n k : PY max ) = = =, j=, j= 3 =, j= 4 + 4, j, j ) 3 4 ) j ), j 4 ) ) 3 j ), j 4 4 ) ), 3 j ), j ) ) j j ), ) ) ) 3, ) ), ) ) j 4 Somit stimmen die Wahrscheinlichkeiten bei 4) - 6) bis zur siebten Nachkommastelle überein. Für diese Werte könnte man allerdings für keinen der gängigen Fehler. Art, also das Zurückweisen der Hypothese, obwohl diese wahr ist, die Hypothese ablehnen. Als Fehler. Art wird meist.5 oder. gewählt. Satz 9. Der Erwartungswert und die Varianz von Y max seien definiert durch: 7) µ max γ + logn) logp) Dabei sei γ.5772 die Eulerkonstante. 2, σ2 max π 2 6log p) ) Beweis. Definiere zunächst eine Z max Expp), so dass Y max = Z max mit p = e λ. Dies gilt, da der ganzzahlige Anteil einer exponentialverteilten Zufallsvariablen geometrisch verteilt ist: P Z max y) = Py Z max < y+) Expe λ ) = e λy+) ) n e λy ) n 4) = PY max y) 5

7 Definiere nun die Zufallsvariable D = Z max Z max. Da D, ) und für große n die Wahrscheinlichkeiten aller möglichen Werte annähernd identisch ist, gilt approximativ D R, ). Damit folgt EZ max ) 2 und VZ max) 2. Weiter ist EZ max ) = λ λn wegen der Eigenschaft der Gedächtnislosigkeit der Exponentialverteilung) und auf Grund ihrer Unabhängigkeit somit ebenso VZ max ) = Wegen der Eigenschaften der harmonischen Reihen λ 2 λn) n 2 *) k γ + logn) und **) = π2 6 folgt k= k= k 2 EY max ) = EZ max ) ED) = λ... λn 2 = λ = γ + logn) logp) 2. Und da die Kovarianz KZ max, D) = für n n k= VY max ) = VZ max ) + VD) = λ λn) = λ 2 ) γ + logn) λ 2 = π ) ) γ + logn) k 2 λ 2 n k= ) k Korolar. Seien µ = µ max + 2, σ ) 2 = σmax 2 2. Dann lässt sich Gleichung 4) durch sehr gut abschätzen. PY max y max ) e e πymax µ )/σ 6)+γ) 9) Beweis. Parametrisiere p als p = e λ um und setze λ = π σ, damit ist 6 PY max y max ) = p ymax ) n = e λymax ) n e n e λymax ), wegen lim + t n = e n n) t für beliebige t Da λ y max logn) ) λ = e e λymax logn)/λ) ) = λ y max logn) ) = λ logp) πymax µ ) ) = σ + γ folgt somit die Abschätzung. 6 y max logn) logp) γ ) ) + γ λ 6

8 Ähnlich kann man auch auf wiederholtes Auftreten beliebiger Nukleotiden testen. Dies wird besonders für Basentripletts bei der Untersuchung auf Krankheiten benutzt. Korolar. Für den einfachen Fall, dass die Wahrscheinlichkeiten für alle Nukleotiden gleich sind, also p = 4, folgt für den Erwartungswert und die Varianz von Y max damit: µ max γ + logn) log4) + 2, σ2 max π 2 6log 4) ) Beweis. Die gleichen Varianzen und nur um verschobenen Erwartungswerte ergeben sich bei Betrachtung des Auftretens eines Nukleotiden an einem beliebigen Ort, definiert als Erfolg. Es sei Y die Länge einer Folge von Erfolgen. Bei Betrachtung beliebiger Wiederholungen liegt ein Erfolg vor, wenn eine Nukleotide mit einer benachbarten übereinstimmt. Die Länge einer solchen Abfolge beläuft sich dann auf + Y 2, die erste Nukleotide plus die Länge der sich anschließenden Folge. Da für identische Nukleotidenwahrscheinlichkeiten Y und Y 2 die gleiche Verteilung haben, ist E + Y 2 ) = + EY 2 ) = EY ) und V + Y 2 ) = VY ). 4 r-scans Als nächstes teste man, ob bestimmte genomische Eigenschaften, wie Gene, an unabhängigen und gleichverteilten Orten innerhalb eines Teils des Genoms auftreten. Diese Tests für die räumliche Ungleichmäßigkeit der Verteilung der Eigenschaft werden r-scans genannt. Man nimmt an, dass die Gene relativ zur betrachteten Sequenz so kurz sind, dass ihre Lage als Punkt verstanden werden kann. Im Folgenden werden Tests unter der Hypothese der Unabhängigkeit und Gleichverteilung hier normiert auf die Gleichverteilung auf dem Intervall, )) gegen die Alternativen. des geballten Auftretens der Gene Teststatistik: U max 2. des Auftretens in regelmäßigen Intervallen Teststatistik: U min vorgestellt. Definition 2. Seien X,..., X n die Lagen der n Punkte. Man betrachte ihre Ordnungsstatistiken X ),..., X n), die das Intervall, ) in n + Teilintervalle der Längen U,..., U n+ teilen. Dabei seien U = X ), U 2 = X 2) X ),..., U n+ = X n) U U 2 U n U n+ X ) X 2) X n ) X n) Lemma 3. Die gemeinsame Dichtefunktion der Ordnungsstatistik X i) ist: f X),...,X n) x ),..., x n) ) = n! ) 7

9 Beweis. Da die X i) i.i.d. verteilt sind, folgt n f X),...,X n) x ),..., x n) ) = n! f Xi) x i) ) = n! ) n = n! i= Um nun die gemeinsame Verteilung der U,..., U n+ zu bestimmen, muss die Dichte in ) auf die Funktionen U i = U i X ),..., X n) ), i =,..., n transformiert werden. Dafür wird folgender Satz benötigt: Satz 4. Seien X,..., X n stetige Zufallsvariablen und V i = V i X,..., X n ) für i =,..., n injektive und differenzierbare Funktionen von X,..., X n mit einer differenzierbaren Inversen. Dann ist die gemeinsame Dichtefunktion der V,..., V n definiert durch mit der Jakobi-Matrix J = f Vi v,..., v n ) = f Xn) x ),..., x n) ) J v v x v 2 v 2 x v x 4 v 2 x 4 x 2 x v 4 x v 4 x 2 Beweis. siehe z.b. Nichtparametrische statistische Methoden Brüning, Trenkle, 994) Korolar 5. Die gemeinsame Dichte der U i ist: v 4 x 4 f Ui u,..., u n ) = n!, u j >, n u j. 2) Dabei sei U i = U,..., U i ), i =,..., n+, wobei U n+ wegen U n+ = U + +U n ) durch U i,..., U n bestimmt wird. ) Beweis. Die Jakobi-Matrizen der U i sind J =. j=.... J =. J = ist. Dadurch erhält man die gemeinsame Dichte der U i : f Ui u,..., u n ) = f Xn) x ),..., x n) ) J = n!......, so dass 4. Geballtes Auftreten Man teste nun zunächst die Hypothese gegen die Alternative, dass die Punkte, an denen die Genomeigenschaft auftritt, geballt auftreten, also Klumpen bilden. Dafür betrachte man als die Teststatistik das Maximum U max der U,..., U n+ und bestimme ihre Verteilung unter der Hypothese. Wenn zufällig g der Teilintervalle U,..., U n+ ausgewählt werden, suche zunächst 8

10 die Wahrscheinlichkeit, dass alle der g gewählten U i länger als ein beliebiges u, ) sind. Dabei sei ohne Einschränkung ug <, da für ug > die Wahrscheinlichkeit ist. Die gemeinsame Dichtefunktion f Ug u,..., u g ) einer g-elementigen Teilmenge der U,..., U n+ ist unabhängig von der Wahl der Teilmenge, da die Dichte 2) symmetrisch ist. Lemma 6. Die gemeinsame Dichte der U,..., U g ist: f Ug u,..., u g ) = n! n g)! u u g ) n g 3) Beweis. Die gemeinsame Dichte berechnet sich dann als Randdichte von U,..., U g, wobei die oberen Intervallgrenzen wegen n j= u j durch w j = u u j i definiert sind. Dies ergibt: wg+ wn f Ug u,..., u g ) = n! u u n ) du n... du g+ wg+ wn 2 [ ] = n! u u n 2 )u n u2 wn n du n 2... du g+ 2 wg+ wn 2 n! = 2 u u n 2 ) 2 du n 2... du g+ wg+ wn 3 n! = [ u u n 2 ) 3 ] wn 2 du n 3... du g+ 2 3 wg+ wn 3 n! = u u n 2 ) 3)) du n 3... du g+ 6 = n! = n g)! u u g ) n g Beachte, dass dies auch als f Ug u,..., u g ) = n g) n j= u j) n g g! geschrieben werden kann. Korolar 7. Die Wahrscheinlichkeit, dass alle Abstände U,..., U g größer als u sind, ist damit: PU > u,..., U g > u) = gu) n 4) Beweis. Die gesuchte Wahrscheinlichkeit ergibt sich durch Integration über die verbleibenden U,..., U g wobei wie oben die oberen Intervallgrenzen ergeben. PU > u,..., U g > u) = = w u u = wg u u wg u = gu) n n! n g)! u u g ) n g du g du n! n g + )! u u g u) n g+ du g du 9

11 Satz 8. Sei h u die größte natürliche Zahl so dass h u u <. Die Dichte der Ordnungsstatistik U max ist definiert durch f Umax u) = n h u g= ) n + ) g+ g gu) n 5) g Beweis. Definiere die Ereignisse A i = {U i u}, i =,..., n +. Seien weiter i,..., i g paarweise verschiedene Indizes, dann gilt, damit die Bedingung ug < nicht verletzt wird: { gu) n, g h u PA i A ig ) = 6), g > h u. Mit Hilfe des Einschluss-Ausschluss-Prinzips folgt dann für die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens eines der Ereignisse eintritt, also dass das Maximum der U i länger als u ist: PA i A ig ) = j= PA ij )+ + ) g PA i A ig ) = h u g= ) n + ) g+ gu) n. g 7) Hieraus lässt sich über die Verteilungsfunktion F Umax u) von U max die Dichte f Umax u) berechnen, weil 7) = F Umax u): f Umax u) = u F U max u)) = h u ) n + ) g+ gu) n u g g= 8) h u ) n + = n ) g+ g gu) n g g= Korolar 9. Die Wahrscheinlichkeit in 7) lässt sich durch folgende Abschätzungen vereinfachen: PU max u) e n+) e n+)u 9) Wenn n + ) e n+)u klein genug ist, gilt sogar: PU max u) n + ) e n+)u 2) ) Beweis. Benutze den Erwartungswert µ max = n+ n+ + n + + σ 2 max = und die Varianz π2 ohne Beweis, siehe Karlin and Macken 99a,b)) von U 6n+) 2 max, dann ergibt sich

12 Abschätzung 9): PU max u) e 6)+γ) e πu µmax)/σmax e e πu n+ n+ k= k)/ n+ e e n+)u k= k +γ ) e e n+)u lnn+)) n+) e n+)u e π n+) ) ) +γ Dies gilt wieder, da die asymptotische Entwicklung der harmonischen Reihe n k= k = γ + ln n + O n ) ist. Ist außerdem n + ) e n+)u klein genug, benutze weiter die Approximation: e x x + für x klein genug, um 2) zu erhalten. Das folgende Beispiel zeigt, dass die obigen Approximationen immerhin für große n gute Ergebnisse liefern. Beispiel 2. Wähle u =., n + =, dann liefert die exakte Gleichung folgendes Ergebnis: 7): 99 ) g+ g g= 9): e e.444 und 2): e.454 ).g) verglichen mit 4.2 Auftreten in regelmäßigen Intervallen Teste nun mit der Teststatistik U min die Hypothese gegen die Alternative, dass die Punkte regelmäßige Abstände haben, und lehne somit die Gleichverteilungs und Unabhängigkeits Hypothese ab, wenn die Realisation u von U min zu groß ist. Mit der Wahrscheinlichkeit aus 6) folgt für g = n +, dass für alle u, n+ ) damit wieder ug < bleibt) für die Wahrscheinlichkeit, dass alle n + Intervalllängen länger als u sind: Satz 2. Die Dichte von U min ist definiert durch: PU min u) = n + )u) n. 2) f Umin u) = n n + ) n + )u) n, < u < n + Beweis. Da Gleichung 2) wieder F Umin u) entspricht, folgt analog zu 8): f Umin u) = u F U min u) = u n + )u)n ) = n n + ) n + )u) n 22)

13 5 Fazit Dieser Vortrag hat nur einen kleinen Einblick in die Analyse von DNA-Sequenzen geben können. Es wurden zum einen die grundsätzlichen Annahmen - Unabhängigkeit gegen Markovabhängigkeiten - eingeführt. Zum anderen wurden die Tests, ob eine Tendenz zur Wiederholung von Nukleotiden vorliegt und welche Art der räumlichen Verteilung vorliegt, vorgestellt. Ein weiterer Analyseansatz, der hier nicht mehr vorgestellt werden kann, ist die Musteranalyse, die letztendlich auf einer Poisson-Verteilung basiert. Hierbei testet man zum einen, wie häufig bestimmte Wörter bzw. ganze Gruppen von Nukleotiden-Wörtern, sogenannte Motive, in einer DNA-Sequenz auftreten und zum anderen, welcher Abstand zwischen zwischen einzelnen Auftritten besteht. 2