Praktikum: Vergleichende Analyse viraler und zellulärer Signalwege in der Tumorbiologie. PD Dr. Bettina Kempkes

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1 Übersicht und Zeitplan Praktikum: Vergleichende Analyse viraler und zellulärer Signalwege in der Tumorbiologie PD Dr. Bettina Kempkes Beginn: 9.00 Uhr Ort: Hämatologikum der GSF Marchioninistr München Vor Raum 433 EBENE 4 Telefon: /354 Fax: kempkes@gsf.de Übersicht zu den Experimenten und Zeitplan: Experiment 1: Funktionelle Analyse der EBNA-2/CBF1 1 und Notch/CBF1 Interaktion (B-Zelltransfektion/Promotorreportertest) Experiment 2: Nachweis der Proteinexpression und Interaktionen von EBNA-2 und CBF1 (Proteinextraktion/ Affinitätsreinigung von EBNA-2/CBF1 Komplexen/Westernblot/Proteindetektion) Experiment 3: Nachweis der Protein/Proteinwechselwirkung von EBNA-2/CBF1 und Notch/CBF1 in der Hefe (Hefetransformation/Replikaplattierung/ ß-Gal Assay/Wachstum unter selektiven Bedingungen) Experiment 4: Funktionelle Analyse des CBF1 Signalweges in verschiedenen Zelllinien (Das experimentelle Vorgehen wird im Team entwickelt!) 1 CBF1=RBP-J! 1

2 Übersicht und Zeitplan Zeitplan 2 Tag 1 Experiment 3: Experiment 2 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 8 Tag 9 Experiment 1: Experiment 2: Experiment 2: Experiment 3: Experiment 1: Experiment 3: Experiment 3: Experiment 1: Experiment 2: Experiment 2: Experiment 3: Experiment 4: Experiment 2. Experiment 3: Experiment 4: Experiment 2 Experiment 3: Experiment 2: Experiment 3: Experiment 4: Tag 10 Experiment 1-4: Hefe Two-Hybrid System: Hefetransformation und Plattierung Transformation von BL21 Bakterien mit GST-Fusionsprotein- Expressionsplasmiden B-Zelltransfektion für funktionelle Studien (DG75) Vorkultur der Bakterien für bakterielle Expression Bakterielle Expression der GST 3 -Fusionsproteine Ernte der Zellen, Herstellung der Zellextrakte, Proteinbestimmung Hefe Two-Hybrid System:Ausstriche der Transformanden B-Zelltransfektion für funktionelle Studien: Messung und Auswertung Hefe Two-Hybrid System: Replikaplattierung der Ausstriche Hefe Two-Hybrid System: Replikacleaning/ß-Gal Test B-Zelltransfektion für funktionelle Studien: Messung und Auswertung 'Coomassiegel' giessen Aufarbeitung der GST-Fusionsproteine/Pulldown Darstellung der GST-Fusionsproteine im Coomassie-Gel Hefe Two-Hybrid System: Auswertung des Koloniewachstums auf Selektivmedien Entwurf der Experimente Pulldown: Gel und Westernblot/Darstellung der GST- Fusionsproteine im Coomassie-Gel Hefe Two-Hybrid System: Auswertung des Koloniewachstums auf Selektivmedien Durchführung Gel und Western Hefe Two-Hybrid System: Auswertung des Koloniewachstums auf Selektivmedien Detektion - Western Hefe Two-Hybrid System:Auswertung des Koloniewachstums auf Selektivmedien Durchführung Auswertungen ev. Abschluss einzelner Experimente 2 Der Zeitplan wird sich im Laufe des Praktikums in der Regel nach Absprache mit Betreuern und Studenten noch ändern. 3 Glutathion-S-Transferase 2

3 Experiment 1 Experiment 1) Funktioneller Nachweis von Signalwegen in der Zelle: Die Aktivierung der CBF1 vermittelten Transaktivierung von Promotoren durch EBNA2 oder Notch-IC Prinzip des Promotor-Reporter Testes Um die Aktivität eines Promotors eines Gens X in der Zelle zu untersuchen, kann dieser Promotor mit einfachen molekularbiologischen Methoden vor ein Reportergen kloniert werden. Dieses Reporter-Promotor-Plasmid wird dann durch Transfektion in Zellen eingebracht werden. Der Promotor steuert jetzt die Aktivität dieses Reportergens und die Regulation dieses Promotors kann unabhängig von der Funktion des Gens X in der Zelle untersucht werden. In der Regel werden Reportergene eingesetzt, deren Expression mit einfachen Techniken leicht nachzuweisen sind. Dies sind zum Beispiel das ß- Galaktosidasegen oder das Luziferasegen. Materialien: Zellen: DG 75 Burkitt s Lymphomzellen Zellkulturmedium: RPMI Penicillin /Streptomycin und Glutamin Plasmide: s.u. Zellextraktionspuffer (als 5-fach konzentrierte Stammlösung): 50% (w/v) Glyzerin 5% (w/v) Triton X mM EDTA 125mM Tris 1M DTT Luziferase Testpuffer: 20 mm Tricin 01,07mM Magnesiumkarbonat-5-H 2 O 2,67mM MgSO4 0,1mM EDTA 33,3mM DTT 270µM CoenzymA 470µM Luciferin 530µM ATP

4 ß-Gal Reaktionspuffer (A) 4 : Endkonz. Lösung: ansetzen: 100mM Na-P, ph 8.0 1M 500µl Glacton-Plus/Serva (1%) 50µl 0,1 mm MgCl 2 1M 50µl H 2 O 4,4 ml ß-Gal Verstärkungspuffer (S) 1 : Endkonzentration: ansetzen: 1 M NaOH (Endkonzentration 0,2M) 1ml Emerald Enhancer 0,5 ml H 2 0 3,5 ml Durchführung (Steriles Arbeiten!): A) Transfektion Vorbereiten: 1. Kleine Zellkulturflaschen mit je 10 ml RPMI1640 Medium 2. DNA Mix für Transfektion, jeden Ansatz als Triplikat 5 in Röhrchen vorlegen Ansatz Plasmid 1 Plasmid 2 Plasmid 3 Nr. (5µg) (2µg) (5 µg) 1 CBF1 Luc 7 CMV ßGal psg5 psg5 2 CBF1 Luc CMV ßGal mnotch1 full length (AS 8 :1-2531) 3 CBF1 Luc CMV ßGal mnotch1-ic (AS: ) Bezeichnung im Labor 6 ED1 4 CBF1 Luc CMV ßGal RAM ED3 (AS: ) 5 CBF1 Luc CMV ßGal mnotch1-ic delta RAM ED4 (AS: ) 6 CBF1 Luc CMV ßGal EBNA2 psg5 EBNA2 7 CBF1 Luc CMV ßGal EBNA2 + RAM* (AS: ) psg5 EBNA2 + GB103* 8 CBF1 Luc CMV ßGal CMV LTR Luc Vorbereitung der Zellen: 1. Lebendzellzahl bestimmen (Trypanblaufärbung) 4 jeweils frisch ansetzen (c.a. 5 ml pro Gruppe) 5 Bezeichnung der Röhrchen mit 1A; 1B; 1C usw. 6 Diese Bezeichnungen finden Sie auf ihren Röhrchen. 7 Ga = CBF1 Luc 8 AS: Aminosäure 4

5 2. DG75 Zellen steril ernten und in 50 ml Zentrifugationsröhrchen überführen 3. Zentrifugation: 300g in der Heräus Varifuge 3.2, 10 Min. 4. Überstand abgießen, Zellsediment in 50 ml Zellkulturmedium resuspendieren 5. Zentrifugation: 300g in der Heräus Varifuge 3.2, 10 Min. 6. Zellen in Medium resuspendieren: Zellkonzentration auf 2 x 10 7 Zellen/ml einstellen 7. Zellen bei Raumtemperatur stehen lassen Elektroporation: 1. DNAs in sterile 1,5 ml Zentrifugengefäßen vorlegen (s.o.) 2. Jeweils 250µl Zellsuspension zugeben Mischen! 3. DNA/Zellmix in Elektroporationsküvette (4 mm Elektrodenabstand) überführen 4. Puls: 250 V, 950 µf 5. Zellsuspension möglichst vollständig mit Pasteurpipette in Zellkulturflasche überführen Tage: Expression B) Zellernte für Luziferase- und ß-Gal-Test: Vorbereiten: Luziferase Extraktionspuffer verdünnen und DTT frisch zugeben (2mM, Endkonzentration d.h. 1:500 verdünnen) Eisbäder 1. Zellen ernten und in 15ml Zentrifugationsröhrchen überführen 2. Zellen 10 min. 300g, 20 C zentrifugieren 3. Zellsediment in 15 ml PBS resuspendieren 4. Zellen 10 min. 300g, 20 C zentrifugieren 5. Zellen in 1 ml PBS resuspendieren und in 1,5 ml Eppendorfgefäß überführen g, +4 C 10 min zentrifugieren 5

6 7. Zellsediment in 100µl Luziferase-Extraktions-Puffer resuspendieren 8. bei rpm 15 min in 4 C vorgekühlter Zentrifuge zentrifugieren 9. Überstand in neues Eppendorf auf Eis überführen 6

7 C) Durchführung der Messung: Luziferase Assay: 1. Je 10µl einer Probe auf 2 benachbarte Felder einer 12 x 8 Felder Meßplatte für Doppelmessungen 2. Vorbereiten: 100µl Luciferase-Assay-Puffer/Probe (Raumtemperatur) plus 600µl Vorlauf ß-Gal Assay: 1. Je 10µl einer Probe auf 2 benachbarte Felder einer 12 x 8 Felder Meßplatte für Doppelmessungen 2. Je 100µl ß-Gal Assaypuffer A zugeben (15-20 Min. bei Raumtemperatur) 3. Vorbereiten: ß-Gal Verstärkungspuffer (S) je 100µl/Probe vorbereiten plus 600µl für Vorlauf 4. Messung am Luminometer (Orion Microplate Luminometer) Automatische Injektion der Meßpuffer und Messung (Einweisung am Gerät) Auswertung: Darstellung der Transaktivierung des Reportergens als relative Meßeinheiten normalisiert auf Meßwerte des ß-Galaktosidasetest Berechnung der relativen Transaktivierung im Vergleich zur Transfektion des Leervektors 7

8 Experiment 2 Experiment 2: Affinitätsreinigung von CBF1 an EBNA-2 Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteinen Prinzip der Methode Bakteriell exprimierte Fusionproteine werden zur Affinitätsreinigung von Proteinen aus Zellextrakten eingesetzt. Materialien Plasmide: pgex4t2 pkf214 pah363 (ev. weitere Plasmide nach Absprache) Bakterien: BL21 chemisch kompetent PMSF 9 Lösung (100mM) HEMGN Bindepuffer: 500ml HEPES (ph 7,6; KOH) 25mM 12,5ml aus 1M Stocklösung EDTA ph 8 0,1mM 100μl aus 0,5 M Stocklösung MgCl 2 12,5mM 6,25 ml aus 1M Stocklösung Glycerol 10% 50ml Igepal 0,1% 500μl KCl 1mM 16,66ml aus 3M Stocklösung PMSF 1mM 5ml aus 100mM Stocklösung DTT 1mM 500μl aus 1M Stocklösung Affinitätsmatrix Glutathion gekoppelte Sepharosebeads LB-Medium/ LB-Agarplatten Zellinien: DG75 50 ml Suspensionskultur Lysepuffer: 50ml HEPES (ph 7,6; KOH) 50mM 2,5ml aus 1M EDTA ph 8 5mM 500μl aus 0,5 M NaCl 150mM 1,5 ml aus 5M Igepal 0,1% 500μl aus 10% PMSF 1mM 500μl aus 100mM 9 Phenylmethylsulfonylfluorid (sehr giftig) 8

9 Experiment GST- Fusionsproteinherstellung A) Transformation 1. zur Transformation je 100ng der Plasmide mit 100μl chemisch-kompetenten E.coli (BL 21) mischen 2. Bakterien 30 min. auf Eis 3. 1 min. bei 42 C inkubieren (Hitzeschock) 4. zu jedem Ansatz 300μl LB-Medium ohne Ampicillin zugeben 5. 1h bei 37 C auf Thermoschüttler inkubieren 6. Ausplattieren auf Ampicillin-haltigen LB-Mediumplatten und über Nacht bei 37 C kultivieren B) Expression der Fusionsproteine 1. Bakterienrasen in je 1ml LB-Medium resuspendieren 2. Vorkulturen (100ml LB mit Ampicillin 50μg/ml) mit Bakteriensuspension animpfen und über Nacht im Schüttler bei 37 C inkubieren 3. Mit 100ml Vorkultur je 1l LB-Medium (Ampicillin 50μg/ml) animpfen 4. Wachstum bis OD 595 = 0,6 5. Induktion der T7 RNA-Polymerase durch Zugabe von 1ml IPTG 10 (Endkonzentration 1mM)) 6. 3h Schüttelkultur bei 30 C 7. Bakterien sedimentieren bei 4500rpm, 10min (Sigmazentrifuge 6K10, Rotor Nr ) 8. Pellet bei -80 C einfrieren 2.2. Aufreinigung der GST-EBNA2 Fusionsproteine nach der bakteriellen Expression A) Kopplung der GST-Fusionsproteine an Glutathion Sepharose Beads 1. Resuspension der Bakterienpellets in je 20ml Bindepuffer 10 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid 9

10 Experiment 2 2. Überführen in 50ml Falcons 3. Ultraschallbehandlung der Lysate: Einstellungen am Branson Sonifier: Output control 6 3 x 20 sec. Lysat muss nach der Ultraschallbehandlung dünnflüssig sein. 4. Lysat in Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen überführen 5. Zentrifugation bei 12000rpm, 20min, 4 C (Sorvall, Rotor SS34 oder SA600) 6. Von jedem Bakterienlysat 30µl Aliquot für Analyse im Gel sichern Dazu 100µl Bakterienlysat mit 100µl Lämmeli-Puffer mischen, bei +4 C lagern 7. Vorbereitung der Affinitätsmatrix (während der Zentrifugation unter 5.): Equilibrierung der Sepharose-Glutathion-Beads in Bindepuffer: 2 x mit Bindepuffer waschen Als 50% -ige Suspension (Beads/Puffer) weiter verwenden 8. pgex 4T2: 10ml Bakterienlysat + 50 μl resuspendierte Beads + 100μl PMSF pkf 214: 20ml Bakterienlysat + 50 μl resuspendierte Beads + 200μl PMSF AH 363: 20ml Bakterienlysat + 50 μl resuspendierte Beads + 200μl PMSF 9. Bei 4 C für 1h auf den Schüttler (Affinitätskopplung der Fusionsproteine an die Beads) 10. Zentrifugation 5min, bei 500g Überstand verwerfen 11. Beads 3 x mit je 20ml Bindepuffer waschen (s.10.) 12. Beads in 3ml Bindepuffer resuspendieren, 120μl Proteinaseinhibitor (Roche Complete) zugeben und über Nacht bei + 4 C lagern B) Darstellung der GST-Fusionsproteine nach Coomassiefärbung im reduzierenden, denaturierenden Polyacrylamidgel 1. Jeweils 1ml der resuspendierten, gekoppelten Beads in neue Eppendorfzentrifugationsröhrchen überführen und abzentrifugieren (Sigma 2K15, 2000 rpm, 3 min.) 2. Überstand abnehmen und die Beads mit je 30μl Lämmli-Puffer mischen Proben für das Gel (10µl) 3. Als semiquantitative Kontrolle setzen wir BSA (500ng und 1μg) ein. Je 500ng und 1µg BSA in 5μl Bindepuffer + 10μl Lämmli-Puffer Proben für Coomassie gefärbtes Gel (12% red. SDS-PAGE): Bakterienlysat vor der Kopplung/GST-Fusionsprotein gekoppelte beads, BSA, Marker C) Affinitätsreinigung von EBNA-2 assoziierten Proteinen aus Zellextrakten 10

11 Experiment 2 1. Bestimmung der Zellkonzentration einer DG75 Zellsuspension (Lebendzellzahl) 2. 1x10 8 Zellen ernten (3x107 Zellen pro GST-Pulldown Ansatz) und in 50ml Zentrifugationsröhrchen überführen 3. Zentrifugation 10min bei 300g 4. Pellet in 50ml PBS resuspendieren 5. Zentrifugation 10min bei 300g 6. Pellet in Lysepuffer (1ml Lysepuffer/ 1x10 7 Zellen) aufnehmen 7. auf Eis für 30min 8. Ultraschall behandlung der Extrakte (30 sec) 9. Zentrifugation 10 min g Proteinbestimmung: Vorbereiten: Meßreagenz 4 ml Bioradreagenz 16 ml H 2 O mischen je 1,3,5,6,7,10 µg Proteinstandards in Plastikmeßküvette vorlegen (Eichkurve) jeweils 3 4 µl ihrer Proben in Plastikküvette vorlegen zu jeder Probe: 1 ml Meßreagenz zugeben mischen OD595 im Photometer messen Eichkurve zeichnen und Proteinkonzentration der Proben ermitteln 20 µg des Zelllysates zur Westernblotanalyse einsetzen 10. Gesamtzelllysat auf 3 neue Eppendorfzentrifugationsröhrchen aufteilen und abzentrifugieren bei 12000rpm, 10min x 20μl Lysat in 20μl Lämmli-Puffer aufnehmen und bis zum Auftragen bei +4 C lagern Proben für Westernblot (Gesamtzelllysat) 12. restliche Lysate in 3 x 15ml Falcons überführen und je 2ml resuspendierte und gekoppelte Beads aus dem Kühlschrank dazu geben 13. mit Bindepuffer auf 5ml auffüllen 11

12 Experiment h bei 4 C rollen 15. Zentrifugieren bei 500g, 2,5min x Waschen mit 10ml Bindepuffer; zwischen jedem Waschschritt zentrifugieren wie in nach dem 2. Waschschritt in Eppendorfgefäß überführen 18. Überstand abnehmen und Beads in je 40μl Lämmli-Puffer aufnehmen Pulldown Proben für Western Blot 19. Proben für Westernblot: Gesamtzelllysat (20µg), Pulldown Proben, gekoppelte Beads D) Analyse der Proben in der Gelelektrophorese Vorbereiten der Polyacrylamidgele für die Diskelektrophorese: Die Auftragung der Proben erfolgt nach Absprache. (Vor dem Aufbau der Elektrophoreseeinheit die Glasplatten mit 0,1 % SDS und dann Äthanol putzen! ) Trenngel (12 %): 10ml ml Tris-HCl ph 8.8 (1,5 M) 2,5 H 2 O 3,3 SDS (10%) 0,1 Acrylamid/Bisacrylamid 11 (30:1) 4 APS (10%) 0,1 TEMED 0,004 Gelsockel: 500µl Trenngel vor APS und TEMED plus 40µl APS plus 4µl TEMED Gele mit 0,1% SDS überschichten Polymerisationszeit der Trenngele: c.a.45 Minuten Sammelgel: 5 ml Tris-HCl ph 6.8 (1 M) 0,63 H 2 O 3,4 SDS (10%) 0,05 Acrylamid/Bisacrylamid (30:1) 0,83 APS (10%) 0,05 11 Unpolymerisierte Acrylamid ist toxisch 12

13 Experiment 2 TEMED 0,005 Polymerisationszeit der Sammelgele: mindestens 10 Minuten Elektrophoresepuffer: 25mM Tris-HCl, 200mM Glyzin, 0,1% SDS Vorbereiten der Proben: Thermoblock auf 95 C! Proteinextrakt µl 2x Ladepuffer µl Einzelprobe bis zu 15 µl 3, 95 C, abzentrifugieren Marker 5 µl Gellauf bei 25mA 1,5 Stunden. Gellauf stoppen, bevor der Blaumarker aus dem Gel läuft. Vorbereiten des Transferpuffers: Für 2 Liter: 6g Tris-HCl 28,8 g Glyzin 20 ml 10% SDS auf 1,6 ml mit H 2 O auffüllen 400ml Methanol Transfer der Proben auf PVDF Membran: PVDF Membran 5 in Methanol einlegen, dann 5 in Blotpuffer Glasplatten vorsichtig trennen Blot aufbauen (luftblasenfrei): Schwamm / Whatmann 2x / Gel / PVDF Membran / Whatman 2x / Schwamm Orientierung der Sandwiches beachten: Gel zur Kathode (-; schwarz); Membran zur Anode (+; rot) Transfer: 400mA, 1 Stunde 13

14 Experiment 2 Blot abbauen und an der Luft trocknen oder über Nacht blocken (s.u.) DETEKTION 1. Kolloidale Coomassie-Blaufärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen Coomassie-Färbelösung 1,25 g Coomassie Blau 225ml Äthanol 225ml H2O 56ml 7% konz. Essigsäure Coomassie-Entfärbelösung: 1l 10% Äthanol 7% konzentrierte Essigsäure 1. Gel zunächst für 30 min in Färbelösung schwenken bis das gesamte Gel tiefblau gefärbt ist. 2. Gel in Entfärbelösung überführen und diese gelegentlich wechseln bis Bandenmuster deutlich wird. 3. Gele trocknen. 2. Immunfärbung von Proteinen nach Westernblot: Blocklösung : 50ml Stocklösung Milchpulver 5% 2,5 g Tris-HCL, ph:7,5 50mM 250µl 1M NaCl 150mM 1,5 ml 5M Waschlösung: PBS/TWEEN 0,05% - Blot in Methanol 5 schwenken -in PBS schwenken Blocken: 30 in 30 ml Blockpuffer Inkubation 1. Antikörper: 60 (1:10) Wir werden folgende Antikörper einsetzen: (Verteilung nach Absprache im Labor) 6G9: monoklonaler Ratten anti GST-Antikörper RBP 7A11: monoklonaler Ratten anti CBF1 Antikörper Waschen: 45, 6 Pufferwechsel mit Waschpuffer 14

15 Experiment 2 Inkubation 2. Antikörper: 60 Ziege anti Ratte Peroxidase gekoppelt (Verdünnung 1: 5000 in 5ml Blockpuffer) Waschen: 60, 6 Pufferwechsel mit Waschpuffer, 1x mit PBS Darstellung der Peroxidase Färbung über Chemiluminiszenz Blots auf Folie legen jeweils 0,5 ml Lösung 1 und 2 mischen, mit der Pipette auf den Blots gleichmässig verteilen 1 inkubieren, dann abtupfen In Expositionskassette legen Exponieren: 2-10 Minuten 15

16 Experiment 3 Experiment 3. Hefetransformation und Test auf Protein/Proteininteraktion im Yeast Two-Hybrid System Protein/Protein Wechselwirkungen in vivo Das Prinzip des Two-Hybrid Systems Das Two-Hybrid System nutzt unser Wissen, daß Aktivatoren der Transkription (wie zum Beispiel das Hefeprotein Gal4) modular aufgebaut sind. DNA Bindungsdomäne (DB) und Transaktivierungsdomäne (AD) sind unabhängige Einheiten und müssen nur in räumliche Nähe zueinander gebracht werden, um das Transaktivierungspotential des Transkriptionsfaktors zu rekonstituieren. Die Protein/Protein Interaktion zweier Proteine X und Y kann diese Rekonstitution leisten. Sie werden als Hybridgene - fusioniert an DB oder AD - exprimiert und die Interaktion dieser Proteine X und Y führt zur Aktivierung der Transkription. Gemessen wird die Aktivierung der Transkription über die Aktivierung von Promotor-Reportergenen, die den Proteinkomplex aus X und Y über Erkennungsmotife des Gal4 Proteins rekrutieren. Damit werden Protein/Protein Wechselwirkungen in Transkriptionssignale umgewandelt. Das Hefe Two-Hybrid System Das besondere Merkmal des Hefe Two-Hybrid Systems sind die Verwendung auxotropher Stämme und entsprechender Reportergene, die diese Auxotrophie überkommen können. Zum Einsatz kommen die Gene HIS3 und URA3. Die Expression dieser Reportergene erlaubt den auxotrophen Stämmen auf Histin- und Uracil freien Medien selektiv zu wachsen. Damit werden Transkriptionssignale selektiv als Proliferation gemessen. Parallel wird häufig noch das ß-Galaktosidasegen eingesetzt. Materialien: Plasmide Proteinfragment Laborbezeichnung GAL4 DB KF1 GAL4 AD KF3 mnotch1-ic/ GAL4-AD KF15 RAM/ GAL4-AD KF17 mnotch1-ic KF43 delta RAM/ GAL4-AD EBNA2/ GAL4-AD KF37 CBF1/GAL4-DB KF25 Hefestamm MaV103 (Übernachtkultur auf Vollmedium) Hefeplatten: YEPD SC-Leu,-Trp SC-Leu,-Trp,-His, 3AT 30 mm Samttücher Replikaplattierungsblocks Zahnstocher Lösungen: TE/LiAc PEG/LiAc 16

17 Experiment 3 Salmonsperm DNA Z-Buffer X-gal ß-Mercaptoethanol Membranen Whatmanpapier Rundfilter Durchführung: A) Hefetransformation Kompetente Hefen: 1. Legen Sie 500µl H 2 O in einem Eppendorfgefäß vor 2. Hefe (Über Nacht Kultur) mit dem Zahnstocher in Eppendorfgefäß überführen 3. Abzentrifugieren, 2min. Höchstgeschwindigkeit 4. 1 ml sterilem TE/LiAc resuspendieren 5. Abzentrifugieren, 2min. Höchstgeschwindigkeit 6. Resuspendieren in 750µl TE/LiAc Die Transformation: - DNAs vorlegen (je 1µl, 300ng-1000ng): DNA Bindungsdomäne Laborbezeichnung Aktivierungsdomäne Laborbezeichnung 1 GAL4DB KF1 GAL4AD KF3 2 GAL4DB KF1 mnotch1-ic/gal4ad KF15 (AS: ) 3 GAL4DB KF1 RAM/GAL4AD KF17 (AS: ) 4 GAL4DB KF1 mnotch1-ic delta RAM/ KF43 GAL4AD (AS: ) 5 GAL4DB KF1 EBNA2/GAL4AD KF CBF1/GAL4DB KF25 GAL4AD KF3 7 CBF1/GAL4DB KF25 mnotch1-ic/gal4ad KF15 (AS: ) 8 CBF1/GAL4DB KF25 RAM/GAL4AD KF17 (AS: ) 9 CBF1/GAL4DB KF25 mnotch1-ic delta RAM/ KF43 GAL4AD (AS: ) 10 CBF1/GAL4DB KF25 EBNA2/GAL4AD KF

18 Experiment µl Salmonsperm DNA (5Min 95 C) µl kompetente Hefezellen µl PEG/LiAc - sehr gut resuspendieren Min. Inkubation bei 30 C Min. Inkubation bei 42 C 6. Transformationsansätze abzentrifugieren 7. In 50 µl sterilem H 2 O resuspendieren 8. Auf SC-Leu,-Trp Platte auftragen 9. Mit steriler Glaspipette auf je 1/6 Platte verteilen 10. Inkubation bei 30 C für 2 Tage Zusätzlich: Kontrollstämme 1-4 ausstreichen: 1: GAL4DB + GALAD 2: Retinoblastomaprotein + E2F-1 3: FOS + JUN 4: GAL4 B) Phänotyp Analyse Das Austesten der Interaktionen: Replikaplattierung auf Selektivmedium: SC-Leu, -Trp, 3AT 50mM Inkubation bei 30 C, Über Nacht Am nächsten Morgen: Replikaplatte nochmals Reinigen Inkubation bei 30 C, Platten beobachten, Wachstum dokumentieren (Photo) Im ß-Galaktosidase Test: Replikaplattierung auf Vollmediumsplatte + Membranfilter Inkubation bei 30 C, Über Nacht Membranfilter in flüssigen Stickstoff tauchen Inkubieren in 10ml Substratlösung, 30 C 10 ml Z-Puffer, 30 µl ß-Mercaptoäthanol, 400 µl X-Gal in DMF (10µg/ml) Entwicklung der Färbung beobachten und dokumentieren 18

19 Experiment 4 Experiment 4: Funktionelle Analyse des CBF1 Signalweges in verschiedenen Zelllinien Sie erhalten von uns die Suspensionskulturen von 4 Zelllinien. Bitte prüfen Sie, in welchen dieser Zelllinien der CBF1 Signalweg aktiviert oder auch aktivierbar ist und welche molekularen Mechanismen/Prozesse für diesen Aktivitätszustand verantwortlich sind. Wichtig ist, dass Sie Kontrollen durchführen, die es ihnen erlauben, geeignete Normierungen vorzunehmen. Ihr Protokoll sollte folgende Struktur aufweisen: 1. Einleitung: Nennen Sie hier die Fragestellung Ihrer Experimente! 2. Material und Methoden: Kurze Darstellung der Experimente mit allen zum Verständnis nötigen Details! 3. Ergebnisse Beschreiben Sie Ihre Ergebnisse in angemessener Form! Verweisen Sie im Text auf Abbildungen und Tabellen! Jede Abbildung oder Tabelle sollte zusammen mit ihrer Legende (Bildunterschrift) aus sich heraus verständlich sein. 4. Diskussion Interpretieren Sie Ihre Ergebnisse schrittweise a) Einzelergebnisse b) Gemeinsame Diskussion aller Teile c) Schlußfolgerung ev. Ausblick Viel Spaß, B. Kempkes 19