Sind atypische Mykobakterien im Trinkwasser eine Gefahr für neutropene Patienten?

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1 Universitätsklinikum Ulm Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Steffen Stenger Sind atypische Mykobakterien im Trinkwasser eine Gefahr für neutropene Patienten? DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Adrian Forke geboren in Mühlacker 2012

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Heike von Baum 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Nele Wellinghausen Tag der Promotion:

3 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I - II Abkürzungsverzeichnis...III - IV 1 Einleitung Geschichte und Taxonomie Mikrobiologische Eigenschaften atypischer Mykobakterien Natürliches Vorkommen Pathogenese und klinische Manifestation Lymphadenitiden Pulmonale Erkrankungen Haut- und Weichteilinfektionen Disseminierte Infektionen Iatrogene Infektionen Seltene Erkrankungsformen Diagnostik, Therapie und Prognose atypischer Mykobakterien Diagnostik Therapie Prognose Mykobakterien in künstlichen Wassersystemen Epidemiologie Persistenz Klinische Bedeutung Fragestellung Material und Methoden Reagenzien Kommerzielle Kits Laborbedarf Patientenkollektiv Probenentnahme und Verarbeitung der Proben Identifizierung und Quantifizierung der Mykobakterien... 23

4 II 3 Ergebnisse Patientenkollektiv und Daten zur Wasserverarbeitung Patientenkollektiv Wohnsituation Entnahmeorte und Wasserversorgung Grunderkrankungen im Patientenkollektiv Medikamentöse Antibiotikaprophylaxe Stationäre Wiederaufnahme Ergebnisse der Mykobakterienkulturen Gesamtergebnisse aus warmen und kalten Wasserproben Mykobakterien in Warmwasserproben Mykobakterien in Kaltwasserproben Vergleich der Bebrütung bei 30 C und 36 C Keimkonzentration und Wasseraufbereitung Keimkonzentration und Warmwasserherstellung Infektionen im Patientenkollektiv Patient Diskussion Artenspektrum und Konzentration der nachgewiesenen Mykobakterien Einfluss der Herkunft des Trinkwassers Einfluss der Wasser- und Bebrütungstemperatur Einschränkungen der durchgeführten Methodik Klinische Bedeutung der Ergebnisse Ausblick und Konsequenzen Zusammenfassung Literaturverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis... V Anhang...VI Danksagung... VII Lebenslauf...VIII Publikation und Vorträge.IX

5 III Abkürzungsverzeichnis Grad µl Mikroliter Aqua dest. Destilliertes Wasser ALL Akutle lymphatische Leukämie AML Akute myeloische Leukämie AS Additional Species BCG Bacillus Calmette-Guérin Bp Basenpaar bzw beziehungsweise C Celsius ca circa CD4 Cluster of differentiation 4 CM Common mycobacteria CM Common mycobacteria CPC Cetylpyridiniumchlorid CT Computertomographie DNA Desoxyribonucleinacid dntp Desoxyribonukleosidtriphosphat h Stunde HIV Humanes Immundefizienzvirus M Mykobakterium MAC Mycobacterium avium complex mg Milligramm min Minute ml Milliliter MOTT Mycobacteria other than tuberculosis N Anzahl NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid

6 Einleitung IV NTM Nichttuberkulöses Mykobakterium o.ä. oder ähnliche OADC Oleic acid, albumin, dextrose, Catalase PCR Polymerase chain reaction PFGE Pulsfeldgelelektrophorese pmol Picomol RGM Rapid growing mycobacteria SDS Sodiumdodecylsulfat sec Sekunde Tbl. Tabelle U Units z.b. zum Beispiel ZVK Zentraler Venenkatheter

7 Einleitung 1 1 Einleitung Mykobakterien sind unbewegliche, nicht sporenbildende, säurefeste Stäbchenbakterien. Der bedeutendste Vertreter der Mykobakterien ist Mycobacterium (M.) tuberculosis, der Auslöser der Tuberkulose. Lepra, ausgelöst durch M. leprae, ist eine weitere, durch diese Gattung verursachte Infektionskrankheit. Daneben gibt es eine Vielzahl anderer Mykobakterien, die unterschiedlichste Krankheitsbilder hervorrufen können. Sie werden in ihrer Gesamtheit als nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) oder atypische Mykobakterien bezeichnet [17]. 1.1 Geschichte und Taxonomie Nach Robert Kochs (Abb. 1) Erstbeschreibung des Tuberkelbazillus im Jahr 1882 [17] wurden zu Beginn und Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts weitere Mykobakterien beschrieben, die nicht identisch mit M. tuberculosis waren [50, 51]. Erstmals prägten Abb. 1: Robert Koch Historische Aufnahme [89] Timpe und Runyon 1954 den Begriff der,,atypischen Mykobakterien. Sie beschrieben damit aus Patientenproben isolierte, säurefeste Bakterien, die von Patienten mit tuberkuloseähnlichen Lungenerkrankungen stammten, aber keine Tuberkelbazillen waren [126]. In den fünfziger Jahren wurde entgegen früherer Annahmen nachgewiesen, dass diese,,atypischen Mykobakterien fakultativ pathogene Keime sind [24]. In den folgenden Jahrzehnten wurden immer wieder neue Mykobakterien entdeckt und auf Grund ihrer biochemischen Eigenschaften bestimmten Gruppen zugeordnet [143].

8 Einleitung 2 Diese Einteilung geht auf Runyon 1959 zurück (Tab. 1) und behielt bis in die neunziger Jahre ihre Gültigkeit [108]. Tab. 1: Einteilung der Mykobakterien nach Runyon von 1959 M.: Mycobacterium [108] Runyon-Gruppe Mykobakterien Langsam wachsende: Photochromogene (Pigmentbildung bei Lichtexposition) Scotochromogene (Pigmentbildung ohne Lichtexposition) Non-chromogene (stets unpigmentiert) Sonstige Schnell wachsende: M. kansasii M. marinum M. simiae M. gordonae M. scrofulaceum M. szulgai M. xenopi M. avium M. haemophilum M. intracellulare M. malmoense M. shimodei M. ulcerans M. genavense M. paratuberculosis M. abscessus M. chelonae M. fortuitum Die Etablierung und Verbreitung molekulargenetischer Methoden verdrängte zunehmend die aufwändigen biochemischen Untersuchungsverfahren und neue taxonomische Einteilungen wurden erarbeitet [18, 128]. Springer et al. beschrieben 1995 M. mucogenicum, nachdem sie es mittels 16S rrna- Gensequenzierung von anderen Mykobakterien abgrenzen konnten [118]. Eine Reihe von Neubeschreibungen nichttuberkulöser Mykobakterien zeigte, dass die molekularen Untersuchungstechniken der Vielfalt der Mykobakterien besser gerecht werden [121, 139, 144]. Neue Spezies werden laufend entdeckt, so z.b M. insubricum, M. kyorinense oder M. noviomagense [99, 129, 134]. Neue Ansatzpunkte wie die rpob-gensequenzierung

9 Einleitung 3 lassen vermuten, dass die Anzahl von heute circa 160 bekannten Arten noch ansteigen wird [2]. 1.2 Mikrobiologische Eigenschaften atypischer Mykobakterien Atypische Mykobakterien sind in der Regel frei lebende Umweltsaprophyten. Einige, beispielsweise M. avium, sind fakultativ pathogen. Ebenso wie M. tuberculosis sind auch die anderen Vertreter der Familie der Mycobacteriaceae säurefeste, unbewegliche, nicht sporenbildende, aerobe Stäbchenbakterien. Die Säurefestigkeit wird bei der Kinyoun- oder Ziehl-Neelsen Färbung genutzt. Neben dieser sorgt die lipidreiche, hydrophobe Außenmembran für andere charakteristische Eigenschaften dieser Bakterien, die die hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Umweltstress ausmachen und eine zentrale Rolle in dieser Dissertation spielen. Der Anteil der für die Mykobakterien charakteristischen Lipide macht am Trockengewicht einen Anteil von 60 % aus. Die atypischen Mykobakterien lassen sich auf Grund ihres Wachstumsverhaltens in schnellwachsende (Generationszeit 1-4 Stunden) und langsamwachsende (Generationszeit 6-24 Stunden) Arten unterteilen [17]. 1.3 Natürliches Vorkommen Nichttuberkulöse Mykobakterien kommen in der Umwelt ubiquitär vor. Sie leben als Saprobionten im Erdboden [76, 131]. Viele verschiedene Mykobakterien konnten aus den verschiedensten Böden isoliert werden, so M. fortuitum aus Staub und Erdboden oder M. kansasii, M. gordonae, M. chelonae aus Torf und Moos [26, 74, 125]. Die Keime werden aus Böden herausgespült und gelangen so ins Grundwasser. Gruft et al. konnten sie in den USA in Flussmündungen und im Meer, damit in Salzwasser, nachweisen [61]. Aus dem Boden gelangen sie ebenfalls ins Grundwasser und darüber ins Trinkwasser, an Nahrungsund Genussmittel [8, 33, 40, 46].

10 Einleitung Pathogenese und klinische Manifestation Infektionen mit atypischen Mykobakterien können auf unterschiedlichen Wegen erfolgen. Am häufigsten ist der Infektionsweg per inhalationem, möglich ist auch Inokulation in kleinste Hautläsionen oder durch Ingestion. Eine Tier-zu-Mensch- oder Mensch-zu- Mensch-Übertragung ist nicht beschrieben [4, 62, 94, 122, 136]. Nichttuberkulöse Mykobakterien können sowohl symptomatische als auch asymptomatische Infekte verursachen. Zunächst werden Mykobakterien im Körper durch Makrophagen phagozytiert, überleben aber intrazellulär [17]. Welche den Krankheitsausbruch begünstigende Faktoren eine Rolle spielen, ist nicht gesichert. Allerdings haben sich in der Vergangenheit drei Beobachtungen herauskristallisiert, die für einen Ausbruch einer NTM-Infektion von Bedeutung sind. Bei HIV-positiven Patienten treten Infektionen meist erst dann auf, wenn die CD4+-T-Lymphozyten stark abgefallen sind. Somit scheint in der Abwehr die zelluläre Immunantwort eine wichtige Rolle zu spielen. Des Weiteren sind bei HIV-negativen Patienten mit disseminierten Infektionen Mutationen im Bereich der Interleukin- und Interferon-Synthese festgestellt worden. Zudem sind Patienten in schlechtem Allgemeinzustand und mit schwerwiegender Grunderkrankung prädisponiert. Besonders anfällig sind immunkompromittierte Patienten, beispielsweise nach Knochenmarkstransplantation oder Chemotherapie [48, 60]. Die wichtigsten Krankheitsbilder, die von atypischen Mykobakterien ausgelöst werden, umfassen Lymphknoten-, Lungen- und Hautinfektionen sowie disseminierte Mykobakteriosen, die im Folgenden näher beschrieben werden Lymphadenitiden Die Chronische Lymphadenitis tritt meist einseitig bei ansonsten gesunden Kindern zwischen einem und fünf Jahren auf. Die Schwellung ist oft schmerzlos an den zervikalen, submandibulären und submaxillären Lymphknoten lokalisiert. Die Eintrittspforte sind bevorzugt Läsionen im Mundbereich. Der häufigste Erreger ist M. avium. Während der Zeiten der regelmäßigen BCG-Impfungen war es M. scrofulaceum [18, 30, 78, 104].

11 Einleitung Pulmonale Erkrankungen Die Lunge ist das Organ, das am häufigsten von atypischen Mykobakterien befallen wird. Meist tritt eine Erkrankung auf dem Boden einer anderen strukturellen Vorschädigung auf [60]. Es gibt dennoch auch Berichte über Erkrankungen ohne erkennbare prädisponierende Faktoren oder bei HIV-negativen Patienten [53, 59, 80]. Zu den prädisponierenden Faktoren zählen unter anderem die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), cystische Fibrose und Pneumokoniosis [56, 60, 117]. Die erkrankten Patienten sind meist älter als 40 Jahre [77]. Symptome sind chronischer Husten, Dyspnoe, Hypoxie, Fieber und Gewichtsverlust [34]. Der Verlauf ist langsam progredient mit langen Krankheitsphasen. Die radiologischen Veränderungen können denen der Tuberkulose sehr ähnlich sein oder sich diskret darstellen, so dass per Dünnschichtcomputertomographie gezielt danach gesucht werden muss (Abb. 2) [52, 53]. Der häufigste Erreger einer Lungenerkrankung ist M. avium- Complex (MAC). Es konnten aber auch andere NTM nachgewiesen werden, darunter unter anderem M. kansasii, M. chelonae und M. fortuitum [7, 18, 34, 35, 59, 103]. Abb. 2: CT-Thorax mit klassischen Kavernen bei M. kansasii-infektion im rechten Lungenoberlappen [83] M.: Mycobacterium, CT: Computertomographie, L: links, R: rechts Seit einiger Zeit wird MAC mit einer Lungenkrankheit, die sich wie eine Überempfindlichkeitsreaktion äußert, in Verbindung gebracht. Dieses Syndrom wird,,hot tub lung genannt. Die Patienten sind häufig M. avium-enthaltenden Warmwasseraerosolen ausgesetzt und ansonsten gesund [5, 20, 43, 60, 106].

12 Einleitung Haut- und Weichteilinfektionen Zu den häufigsten Haut- und Weichteilinfektionen verursachenden NTM gehören M. fortuitum, M. abscessus und M. chelonae. Häufig verursacht M. ulcerans das in den Tropen vorkommende Buruli-Ulkus [93]. Weltweit hingegen kommt das so genannte Schwimmbadgranulom vor, welches von M. marinum ausgelöst wird [18, 60, 140]. Beschrieben sind des Weiteren iatrogene Infekte zum Beispiel nach Fettabsaugung (Abb. 3), nach plastischer Chirurgie oder Laparaskopie [95, 109, 135]. Abb. 3: Hautläsionen durch M. chelonae nach Fettabsaugung (Liposuktion) [95], M.: Mycobacterium Disseminierte Infektionen Disseminierte Infektionen kommen am häufigsten bei Patienten mit einer weit fortgeschrittenen HIV-Infektion vor. In über 90 % dieser Fälle lässt sich MAC als Ursache nachweisen [48, 69, 138]. Eine disseminierte Infektion unter Immunsuppression oder bei hämatologischer Grunderkrankung ereignet sich regelhaft [58, 75]. Die hierbei häufigsten Erreger sind M. chelonae [141] und M. abscessus. Auch M. fortuitum ist beschrieben [55]. Die Symptome einer disseminierten Infektion sind uncharakteristisch. Sie umfassen in den meisten Fällen Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust, sogenannte B-Symptomatik.

13 Einleitung 7 Diese Tatsache lässt die Infektion mit NTM nur schwer von anderen, eventuell gleichzeitg auftretenden opportunistischen Infektionen abgrenzen [44, 60] Iatrogene Infektionen Neben den im Abschnitt bereits genannten iatrogenen Hautmanifestationen gibt es neben katheterassoziierten Infektionen Berichte über Pseudoausbrüche mit M. gordonae durch kontaminierte Infusionslösungen oder disseminierte Infektionen nach Peritonealdialyse/Hämodialyse [12, 16, 82, 127]. Bei mehreren Rückenmarksinfekten nach Bandscheibenentfernung konnte Wasser, das zum Spülen der chirurgischen Instrumente benutzt worden war, als Infektionsquelle ausgemacht werden [11] Seltene Erkrankungsformen Andere Erkrankungen wie Otitis media, Endokarditis, Osteomyelitis oder Infektionen des zentralen Nervensystems sind selten. Nichtsdestotrotz sind sie als schwerwiegend anzusehen [3, 13, 42, 91, 100].

14 Einleitung Diagnostik, Therapie und Prognose atypischer Mykobakterien Diagnostik In der Diagnostik einer möglichen NTM-Infektion stehen mikroskopische, kulturelle und molekulare Nachweismethoden zur Verfügung. In der Färbung wird die säurefeste Außenmembran der Mykobakterien genutzt. Es lassen sich säurefeste Stäbchenbakterien nachweisen. Eine Speziesdifferenzierung auf Grund der Morphologie oder anderer durch die Mikroskopie darstellbaren Eigenschaften ist jedoch nicht möglich. Für den kulturellen Nachweis werden spezielle Nährböden verwendet. Dazu gehören der Löwenstein-Jensen-Agar und der Middlebrook-Agar, die spezifische, auf Mykobakterien abgestimmte Nährstoffzusammensetzungen aufweisen. Des Weiteren werden das Wachstumsverhalten und bei sichtbaren Kolonien die Morphologie und deren biochemische Eigenschaften genutzt, um entsprechend der Einteilung nach Runyon die Stämme zu identifizieren. Eine eindeutige Spezieszuordnung bleibt dieser Methode allerdings verwehrt [17, 108]. Heute spielen molekulargenetische Methoden eine wesentliche Rolle. Zum Beispiel stehen kommerzielle Kits für angezüchtete Isolate zur Verfügung. Die Entwicklung von real-time PCR-Verfahren ermöglichte, einen Direktnachweis aus verschiedenen klinischen Materialien und Umweltproben, wie Leitungswasser, zu erreichen. Für die Bestimmung atypischer Mykobakterien, in Kultur angezüchtet, wird die Sequenzierung bestimmter Genabschnitte herangezogen. Hierbei liegen für den Genabschnitt der 16S rrna und dessen Sequenzvariationen die meisten Daten vor. Öffentlich zugängliche Gendatenbanken (GenBank, Ridom Datenbank) ermöglichen die Interpretation der Sequenzen [27, 37, 65] Therapie Die Therapie von NTM-Infektionen ist generell schwierig und oft langwierig. Je nach Erreger werden unterschiedliche antimikrobielle Substanzen empfohlen, die zum Teil auch

15 Einleitung 9 gegen die Tuberkulose eingesetzt werden. Die Therapiedauer beträgt je nach Mykobakterien-Spezies mehrere Wochen oder Jahre. Daher ist eine eindeutige Identifizierung der NTM-Spezies essentiell für die Durchführung einer adäquaten Therapie [7, 36, 52, 53, 64, 70, 73] Prognose Die Prognose einer Infektion mit atypischen Mykobakterien ist stark von Allgemeinzustand und Immunstatus des Patienten abhängig. Während lokale Infektionen beim Gesunden in aller Regel von selbst abheilen, gehen disseminierte Infektionen bei Immungeschwächten mit einer hohen Sterblichkeit einher [44, 59].

16 Einleitung Mykobakterien in künstlichen Wassersystemen Atypische Mykobakterien wurden 1922 erstmals in Trinkwasser nachgewiesen. Sie wurden deskriptiv als M. aquae bezeichnet [28]. Es folgte die Umbenennung der Spezies in M. gordonae. Zudem zeigte sich, dass der Begriff M. aquae noch einige andere scotochromogene NTM-Spezies umfasste, wie M. flavescens und M. scrofulaceum [143] Epidemiologie Heute werden NTM regelmäßig aus den verschiedensten künstlichen Trinkwassersystemen weltweit isoliert. Zum einen lassen sie sich in den kommunalen Wassersystemen finden, zum anderen direkt in häuslichen Wassersystemen, im Wasser direkt aus dem Wasserhahn [10, 29, 47, 115]. Dabei gelingt der Nachweis nicht nur im Wasser, sondern auch in Abstrichen von Ablagerungen, so genannten Biofilmen. Sämtliche andere Orte, an denen der Mensch mit aufbereitetem Wasser in Kontakt kommt, können NTM enthalten. Sie wurden beispielsweise in beim Duschen entstandenen Aerosolen gefunden [28]. Isoliert wurden außerdem M. avium und andere in Swimmingpools, Whirlpools, Aquarien und in Flaschen abgefülltem Mineralwasser [1, 14, 21, 66, 92]. Selbst in Eismaschinen ließen sich besonders kälteresistente Stämme wie M. peregrinum nachweisen [31, 85]. Folglich wurden auch in Krankenhauswassersystemen fakultativ pathogene nichttuberkulöse Mykobakterien, wie M. avium oder M. simiae gefunden [23, 41, 57]. Ebenfalls konnten die Bakterien in medizinischem Gerät, wie Hämodialysegeräte, nachgewiesen werden [22] Persistenz Die Gründe für das häufige Auftreten von NTM in gut kontrollierten Systemen hängen eng mit den mikrobiologischen Eigenschaften dieser Bakterien zusammen. Unter den atypischen Mykobakterien existieren äußerst kälteresistente Stämme, wie das Beispiel der Isolation von M. peregrinum aus einer Eismaschine verdeutlicht [31]. Auf der

17 Einleitung 11 anderen Seite ist M. avium mit einer Wachstumsfähigkeit zwischen C und nachgewiesenen Konzentrationen von 2500 KBE/500 ml sehr gut an künstliche Warmwassersysteme angepasst [38]. Am hitzeresistentesten ist M. xenopi mit einer Überlebensfähigkeit bis 70 C [113]. Ein weiterer günstiger Faktor für die Besiedlung von Trinkwassersystemen ist die hohe Toleranz gegenüber geringem Nährstoffgehalt im Wasser [45]. Die hohe Widerstandsfähigkeit gegen Desinfektionsmittel weist einen wichtigen Selektionsvorteil gegenüber anderen potentiellen Krankheitserregern auf [46]. Mehrfach wurde die Resistenz gegen Chlor, dem verbreitetsten Desinfektionsmittel in Trinkwasser, untersucht [98, 102, 132]. Es ergaben sich unterschiedliche Ergebnisse der verschiedenen Spezies. Bereits die empfindlichsten Keime, wie M. aurum und M. gordonae, sind um 300-fach resistenter gegen Chlor als Escherichia coli, ein Fäkalkeim. Zu den widerstandsfähigsten Spezies zählen M. fortuitum und M. chelonae [87]. In den USA führte die Umstellung des Desinfektionsmittels Chlor auf Monochloramin zu einer Steigerung der Mykobakterienkonzentration in den Wasserleitungen. Ebenfalls zeigte sich eine hohe Toleranz gegen andere gebräuchliche Mittel wie Chlordioxid und Ozon. Die langsam wachsenden Spezies zeigen sich resistenter als die schnell wachsenden NTM [123]. Auch Filtration kann eine Besiedlung von Wassersystemen nicht verhindern [67]. Zusätzlich begünstigt die Fähigkeit, Biofilme zu besiedeln oder zu bilden, das Überleben in Fließrichtung Bakterien Oberfläche der Wasserleitung Abb. 4: Schemazeichnung eines Biofilms in einer Wasserleitung. Bakterien sind in eine extrazelluläre Matrix eingebettet und dadurch vom Wasserfluss geschützt [71] geschlossenen Rohrsystemen [25, 114]. So ist M. fortuitum in der Lage innerhalb von 48 h einen Biofilm zu bilden [63]. Darin sind die Mykobakterien wochenlang nachweisbar und gelangen von dort ins fließende Wasser [33]. Neben M. fortuitum sind M. gordonae und M. chelonae häufig nachgewiesene Spezies [114, 116]. Die Bakterien sind in diesen Biofilmen noch

18 Einleitung 12 widerstandsfähiger gegenüber Chlor und anderen Desinfektionsmitteln [63, 119]. Zur Verdeutlichung des Prinzips des Biofilms siehe Abb. 4. Eine weitere Anpassung von NTM an das Habitat Wasser ist ihre Überlebensmöglichkeit in Protozoen. Mykobakterien sind in der Lage, sich von Amöben phagozytieren zu lassen und in deren Vakuolen intrazellulär zu überleben. Auf diese Weise sind sie zusätzlich vor Desinfektionsmaßnahmen geschützt [67, 120] Klinische Bedeutung Die klinische Relevanz von NTM in künstlichen Wassersystemen wurde lange Zeit unterschätzt. Infektionen mit atypischen Mykobakterien wurden wiederholt auf Trinkwasser als Infektionsquelle zurückgeführt. Dabei handelte es sich meist um immunkompromittierte Patienten wie an AIDS erkrankte oder Patienten unter Chemotherapie [46, 75, 82]. Auch bei Patienten, die weder strukturelle Lungenerkrankungen noch sonstige Grunderkrankungen aufwiesen, konnten durch NTM ausgelöste Lungenerkrankungen nachgewiesen werden [20, 43]. Ganze Ausbrüche von Infektionen wurden mit kontaminiertem Trinkwasser, beispielsweise auf einzelnen Krankenhausstationen, in Verbindung gebracht. Allerdings führten sogenannte Pseudo-Ausbrüche mit nichttuberkulösen Mykobakterien zu einigen Problemen. Unter Pseudo-Ausbruch wird im konkreten Fall der fälschlich als krankheitsrelevant eingeschätzte Keim verstanden, welcher aus Patientenproben isoliert wurde. Dies führte zu antituberkulösen Therapien, einschließlich der unerwünschten Nebenwirkungen und finanziellen Belastungen für die Gesundheitssysteme. Des Weiteren wurden Pseudoinfektionen durch kontaminierte Reagenzien in den Analyselaboren verschiedener Autoren beschrieben [9, 19, 32, 86, 135, 142].

19 Einleitung Fragestellung Patienten mit hämatologischen Erkrankungen wie zum Beispiel AML, CML oder anderen werden in den letzten Jahren immer früher aus dem Krankenhaus in ihr häusliches Umfeld entlassen. Diese Patienten haben ein zum Teil noch stark geschwächtes Immunsystem und werden zu Hause mit einem Keimspektrum im Wasser und in der Luft konfrontiert, welches sich von dem in der Klinik unterscheidet und Ursache schwerwiegender Infektionen sein kann. Zu den möglicherweise gefährdenden Keimen zählen atypische Mykobakterien im häuslichen Trinkwasser. Während es bezüglich der Belastung von Trinkwasser in Kliniken inzwischen einige Daten gibt und auch Fälle nosokomialer Mykobakterien-Infektionen beschrieben wurden, liegen keine Informationen zur Mykobakterien-Belastung häuslichen Trinkwassers vor. Eine Untersuchung auf Mykobakterien ist auch nach der Trinkwasserverordnung nicht vorgeschrieben. Ziele dieser Studie sind daher die Konzentrationen und das Artenspektrum von Mykobakterien im Trinkwasser im häuslichen Bereich hämatologischer Patienten zu erfassen und das daraus resultierende Gefährdungspotential abzuschätzen. Zu diesem Zweck sollen in Haushalten von Patienten, die in Neutropenie aus der Hämatologischen Abteilung des Universitätsklinikums Ulm entlassen werden, Wasserproben entnommen und mittels kultureller und molekularbiologischer Verfahren auf das Vorhandensein von Mykobakterien untersucht werden. Einflussfaktoren einer möglichen Mykobakterien- Belastung, wie Art der Wasserversorgung, sowie mögliche Infektionen durch Mykobakterien in einem Nachbeobachtungszeitraum nach Probenentnahme sollen ebenfalls erfasst werden. So soll ein möglicher Zusammenhang zwischen häuslicher Exposition mit atypischen Mykobakterien und auftretenden Infektionen gezeigt werden.

20 Material und Methoden 14 2 Material und Methoden 2.1 Reagenzien Chemikalien und Enzyme Aqua bidest. (Fresenius Kabi, Bad Homburg) Aqua dest. (Fresenius Kabi, Bad Homburg) Cetylpyridiniumchlorid (CPC) (Merck, Hohenbrunn) Ethanol 100% (Berkel AHK, Ludwigshafen) Isotonische Kochsalzlösung 0,9% (Fresenius Kabi, Bad Homburg) Kinyoun-Färbung-Farbstoffe (Becton Dickinson, Heidelberg) Natrium-Acetat 3M (Sigma, München) Lysozym (AppliChem GmbH, Darmstadt) Proteinkinase K (Fermentas, St. Leon-Rot) XbaI (Fermentas, St. Leon-Rot) Agarose (Biomol GmbH, Hamburg) Lösungen und Puffer CPC 5% Lösung - 5 g Cetylpyridiniumchlorid ad 100ml Aqua dest., zur Auflösung schütteln TRIS-EDTA-Puffer (TE-Puffer), ph 8,0-0,5 ml Tris-EDTA ph 8,0 (100x), (Sigma, München) - 0,5 ml 1% Triton X100 (Sigma) - 0,25 ml 0,5% Tween 20 (Sigma) - 50ml Aqua dest. CSB Puffer, ph 8,0-100 mm Tris-EDTA (Sigma, München) EC Puffer - 6 mm Tris

21 Material und Methoden mm EDTA - 1 M NaCl - 0,5 % BriJ 58 (AppliChem GmbH, Darmstadt) - 0,2 % Desoxycholate Lysepuffer - 50 mm Tris - 50 mm EDTA - 1 % Sarcosyl Dummy-No-Salt Puffer, ph 8,0-100 mm Tris - 5 mm MgCl 2 (Loxo GmbH, Dossenheim) Nährmedien und Konservierungssysteme Microbank TM Bacterial and Fungal Preservation System (Inverness Medical Deutschland GmbH, Köln) Middlebrook 7H10 Agar mit OADC (Heipha Dr. Müller GmbH, Eppelheim) Middlebrook 7H11 Schrägagar mit OADC und PACT (Heipha Dr. Müller GmbH) Primer Myco 1046 rev: 5`-TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA (Termo Electron GmbH, Ulm) Myco 361 rev: 5`-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AG (Termo Electron GmbH) Myco 609 rev: 5`-TTT CAC GAA CAA CGC GAC AA (Termo Electron GmbH) Myco 9 for: 5`-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG (Termo Electron GmbH)

22 Material und Methoden Kommerzielle Kits Kommerzielle Kits für PCR Taq DNA Polymerase für Thermocycler (Qiagen, Hilden) Thermostabile Hotstart-DNA-Polymerase inklusive Puffer (HotStarTaq Polymerase 50 units) (Qiagen, Hilden) Kommerzielle Kits für Sequenzierung QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) zur Aufreinigung der DNA BigDye Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction Kit Version 1.1 (Applied BioSystems, Darmstadt) für die Sequenzierreaktion DNA Polymerization Mix (Amersham Bioscience, England) Kit für die Indentifizierung von Mykobakterien Genotype Mycobacterium AS (HAIN Lifescience GmbH, Nehren) Genotype Mycobacterium CM (HAIN Lifescience GmbH) 2.3 Laborbedarf Verbrauchsmaterial Duran Glasflasche 500 ml, 1000 ml (Schott, Mainz) Eppendorf-Reaktionsgefäß Filterträger Millipore (Millipore, Schwalbach) Gaskartusche C g (Campingaz, Hungen-Inheiden) Impfnadel orange (Sarstedt, Nümbrecht)

23 Material und Methoden 17 Impfschlingen blau 10 µl (Sarstedt) Latexhandschuhe Semperlax (Semperit Techn. Prod. Ges.m.b.H, Wien) Membranfilter ME 25 0,45 µm (Whatman GmbH, Dassel) Objektträger 76x26 mm (Menzel Glas, Braunschweig) Geräte Abzug LaminAir HB 2448 (Heraeus instruments, Osterode) Brutschrank BBD6220 (Heraeus instruments) Bunsenbrenner Labogaz 206 (Campingaz) Thermonmixer (Eppendorf) Ultraschallbad Sonorex TK52 (Bandelin electronic GmbH, Berlin) Vakuumpumpe (Millipore) Zentrifuge Biofuge fresco (Heraeus instruments) CHEF DR III System zur Elektrophorese (BioRad, München) Software BLAST ( Ridom TraceEditor (Ridom GmbH, Würzburg) Diversity Database software (BioRad, München)

24 Material und Methoden Patientenkollektiv Auswahl der Patienten Für die Studie wurden Patienten ausgewählt, die eine hämatologisch-onkologische Grunderkrankung haben und im Universitätsklinikum Ulm, Innere Medizin III, behandelt wurden. Patienten in Neutropenie und mit einer voraussichtlichen Neutropeniedauer von mindestens fünf Tagen, die in ihr häusliches Umfeld entlassen wurden, wurden unselektioniert in die Studie eingeschlossen, sofern sie der Studie zugestimmt hatten. Innerhalb von fünf Tagen nach Entlassung wurden die Wasser- und Luftproben in der häuslichen Umgebung entnommen Umfeld und klinische Daten Um eine vollständige Erhebung von Patientendaten und deren Umfeld zu erreichen, wurden drei verschiedene Erfassungsbögen verwendet, die alle notwendigen Daten für die drei Studienteile enthalten. Die drei Bögen sind in folgende Hauptschwerpunkte gegliedert: Der erste Bogen dient der Erhebung der Patientenstammdaten. Auf diesem wurden Name, Geburtsdatum, Adresse und Telefonnummer festgehalten. Des Weiteren wurde dem Patienten eine Codenummer zur Anonymisierung zugeteilt. Dieser Bogen ist für eine korrekte Zuordnung von Studienergebnissen zu Arztbriefen und anderen späteren Recherchen nötig. Zusätzlich wurden Daten zur Grunderkrankung, Erstdiagnose und durchgeführter Chemotherapie erfasst. Der zweite Bogen enthält Daten über die Entnahme und das Umfeld der Entnahmestelle. Das Erregerspektrum und die Erregerdichte hängen vom Umfeld ab. Aus diesem Grund wurden folgende Angaben notiert: - Art des Hauses (Einfamilien-/Mehrfamilienhaus) - Anzahl der Bewohner - Haustiere (vorhanden ja/nein) - Wasserversorgung (Heißwasserboiler, Durchlauferhitzer o.ä.) - getrennte Kalt- und Warmwasserversorgung (vorhanden ja/nein)

25 Material und Methoden 19 - eingestellte Wassertemperatur in C der Warmwasserversorgung Auf dem dritten Bogen werden die klinischen Falldaten der Patienten dokumentiert. Als weiterer bedeutender Parameter wurde der Immunstatus der Patienten an Hand der Klinikdaten ermittelt. Dazu gehörte der zeitliche Verlauf der Neutropenie beziehungsweise Aplasie und die Entwicklung des Differentialblutbildes. Das Chemotherapieschema und eventuelle Erhaltungstherapien wurden zur Dokumentation und dem Verlauf der Immunsuppression notiert. Als dritter Punkt wurden stattgehabte Infektionen und die jeweilige medikamentöse Therapie erfasst. Die Erfassungsbögen sind im Anhang einsehbar.

26 Material und Methoden Probenentnahme und Verarbeitung der Proben Entnahmestellen/Probenentnahme Die Wasserproben wurden im Zeitraum von Dezember 2006 bis Dezember 2007 entnommen. Die Entnahmeorte richteten sich nach den Wohnorten der einbezogenen Patienten. Der Einzugsbereich erstreckte sich vor allem über das östliche Baden- Württemberg und das westliche Bayern. Es wurden Proben aus Wasserhähnen untersucht, die entweder über eine Mischbatterie verfügten oder über eine getrennte Kalt- und Warmwasserversorgung. Es wurden die Wasserhähne der von den Patienten genutzten Badezimmer untersucht. Insgesamt drei Wasserproben pro Haushalt (zwei Kaltwasserproben und eine Warmwasserprobe) wurden für die Mykobakteriendiagnostik entnommen. Die Studie beinhaltet zwei weitere Teile, für die ebenfalls Wasserproben entnommen wurden. Diese Studienteile befassen sich zum einen mit dem Vorkommen von Legionellen, Pseudomonas aeruginosa und Inquilinus limosus und zum anderen mit vorhandenen Schimmelpilzen in Trinkwasser und Raumluft. Bei der eigentlichen Probenentnahme wurden zunächst die Proben der beiden anderen Studienteile abgenommen, zunächst aus dem kalten Waschbeckenwasser 100 ml für die Pseudomonaskulturen und anschließend 500 ml für die Pilzkulturen. Es folgten je zweimal 500 ml Kaltwasserentnahmen für die Mykobakterienkulturen. Bei dem warmen Waschbeckenwasser wurden in einem ersten Schwall für die Legionellenkultur 500 ml und für die Legionellen-PCR 100 ml entnommen. Nachdem 100 ml für eine Inquilinuskultur und wiederum 500 ml für Schimmelpilze abgenommen waren, folgten 500 ml für die Mykobakterienkultur (Tab. 2). Die Proben wurden umgehend nach Abnahme gekühlt ins Labor transportiert und innerhalb von acht Stunden verarbeitet.

27 Material und Methoden 21 Tab. 2: Entnahmeschema der Wasserproben der Reihenfolge nach, erst kaltes Wasser, dann warmes Wasser PCR: polymerase chain reaction Waschbeckenwasser kalt Waschbeckenwasser warm Legionellenkultur: 500 ml Legionellen-PCR: 100 ml 1. Pseudomonas: 100 ml 3. Inquilinus: 100 ml 2. Schimmelpilze: 500 ml 4. Schimmelpilze: 500 ml 3. Mykobakterien: 2x 500 ml 5. Mykobakterien: 500 ml Dekontamination und Anlage der Proben Um die im Wasser vorhandene Begleitflora zu unterdrücken und dabei möglichst wenige Mykobakterien abzutöten, wurde den Proben vor Filtrierung eine CPC-Lösung beigesetzt. Diese Methode hat sich im Gegensatz zu anderen als besonders effektiv erwiesen [72]. Durchführung: ml Wasser mit 0.02 % CPC für 15 min dekontaminieren (d.h. 2 ml 5 % CPC auf 500 ml Wasserprobe). Probe währenddessen ca. 2-3 mal schütteln 2. Wasser filtrieren und mit 500 ml Aqua dest. den Filter nachspülen 3. den Filter plan auf den Middlebrook-Agar legen (eventuelle Luftblasen mit der sterilen Pinzette vorsichtig entfernen) 4. Agar in Brutschrank entweder bei 36 C mit CO 2 oder bei 30 C mit CO 2 bebrüten Die Proben aus dem Warmwasser wurden bei 36 C unter 5 % CO 2 -Spannung bebrütet, die Kaltwasserproben einmal bei 36 C mit CO 2 und zusätzlich bei 30 C mit CO 2.

28 Material und Methoden Kultivierung von Mykobakterien Alle Filter wurden zur Bebrütung direkt auf Middlebrook-Agar 7H10 aufgebracht. Um die Platten vor Schimmelbefall und vorzeitiger Austrocknung zu schützen, wurden sie mit Parafilm beklebt. Bei jeder Platte wurde eine Bebrütungszeit von insgesamt 90 Tagen angestrebt. Einmal pro Woche erfolgte die Überprüfung der Nährmedien auf Mykobakterienwachstum.

29 Material und Methoden Identifizierung und Quantifizierung der Mykobakterien Quantifizierung, Morphologie, Farbe Die Quantifizierung wurde durchgeführt, indem bei jeder Inspektion (1 x pro Woche) alle verdächtigen und morphologisch gleichen Kolonien auf dem entsprechenden Filter ausgezählt wurden. Nach dem Ende der Bebrütungszeit wurden die Kolonien ein letztes Mal ausgezählt und diese Anzahl als die Menge pro 500 ml gewertet. Ein Bakterienrasen ging als eine Konzentration von 1000 KBE/500 ml in die Auswertung ein. Bei Wachstum von verdächtigen Kolonien wurden zunächst die Form, die Größe und die Farbe beurteilt. Von den entsprechenden Kolonien wurde im Anschluss auf einem Middlebrook-Agar eine Subkultur zur Färbung angelegt. Um keine Mykobakterien-Spezies zu übersehen, wurden auch nur gering unterschiedliche Kolonien subkultiviert. Ergänzend kam eine Methode zum Einsatz, die Mykobakterien auf Grund ihres Wachstumsverhaltens unter verschiedenen Bedingungen differenziert. Dazu wurden von den entsprechenden Kulturen 7H11-Schrägagars angelegt. Die eine Hälfte der Agars wurde mit Alufolie lichtundurchlässig eingewickelt. Bestimmte Spezies bilden ausschließlich im Licht Pigmente Kinyoun-Färbung Um den Verdacht auf atypische Mykobakterien zu erhärten, wurde die Kinyoun-Färbung durchgeführt. Sie diente dem mikroskopischen Nachweis säurefester Stäbchenbakterien aus festen und flüssigen Nährmedien. Durchführung: 1. ein Tropfen Natriumchlorid (NaCl) auf einen Objektträger auftropfen und einige sichtbare Kolonien vom Nährmedium mit Tropfen vermischen 2. Präparat unter Sicherheitswerkbank lufttrocknen 3. Hitzefixierung mittels Bunsenbrenner (dreimal durch die Flamme ziehen) 4. mit TB-Karbolfuchsin 5 min bei Raumtemperatur färben

30 Material und Methoden mit Aqua dest. vorsichtig abspülen 6. mit TB-Decolorizer ca. 30 sec entfärben (bis keine Farbwolken mehr sichtbar sind) 7. mit Aqua dest. vorsichtig abspülen 8. mit TB-Brilliant Green 30 sec gegenfärben 9. mit Aqua dest. vorsichtig abspülen 10. Präparat lufttrocknen lassen Säurefeste Stäbchenbakterien erscheinen im Mikroskop rot bis pink, die Form kann von kokkoid bis zu langen, leicht gebogenen Stäbchen variieren. Andere Bakterien erscheinen grün Aufbewahrung der Mykobakterienstämme Alle als Mykobakterien identifizierten Stämme wurden auf zwei verschiedene Weisen aufbewahrt. Zum einen wurden Subkulturen auf 7H11 Schrägagar angelegt. Diese eindeutig beschrifteten Agars sind gekühlt mehrere Monate zur Neuanlage von Reinkulturen geeignet. Die zweite Methode war die Aufbewahrung mittels Microbank TM. Nach eindeutiger Beschriftung der Gefäße wurden die Reinkulturen nach Herstellerangaben in die Gefäße übertragen und zum Einfrieren vorbereitet. Die Stämme sind bei -70 C eingefroren mehrere Jahre haltbar Spezies-Identifikation der gewachsenen Mykobakterien Alle kultivierten Mykobakterien wurden mittels molekularer Methoden identifiziert. In Einzelfällen waren zusätzliche Merkmale erforderlich, wie das spezielle Wachstumsverhalten mit und ohne Lichteinfall.

31 Material und Methoden Isolierung der Mykobakterien-DNA aus Reinkultur Die DNA wurde aus Reinkulturen der aus dem Wasser gewonnenen Mykobakterien wie folgt isoliert: µl TE-Puffer in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettieren 2. mit einer Öse mehrere sichtbare Kolonien von der Agar-Platte direkt in den TE-Puffer suspendieren und anschließend vortexen 3. das Reaktionsgefäß für 15 min im Gensonden-Ultraschall-Bad (35 khz) behandeln 4. anschließend die Probe im Thermomixer bei 95 C für 10 min kochen 5. 5 min bei U/min zentrifugieren Anschließend wurden 200 µl des die isolierte DNA enthaltenen Überstandes in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und im Kühlschrank bei 2-8 C aufbewahrt Sonden-Hybridisierungsverfahren Die Testsysteme GenoType Mycobacterium CM und GenoType Mycobacterium AS sind Tests der Firma HAIN Lifescience zur Differenzierung von Mykobakterien aus Reinkulturen. Beide Tests beruhen auf der DNA-Strip-Technologie und sind in folgende zwei Phasen untergliedert: Amplifikation der Zielgene und anschließende reverse Hybridisierung. Der GenoType Mycobacterium CM-Test (Common Mycobacteria) erlaubt die molekulargenetische Identifikation folgender Mykobakterienarten: M. avium ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/m. ulcerans, der M. tuberculosis-komplex und M. xenopi. Der Genotype Mycobacterium AS-Test (Additional Species) ermöglicht die Identifizierung folgender Mykobakterienarten: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M.. szulgai/m. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum und M. shimoidei.

32 Material und Methoden 26 Diese Verfahren wurden routinemäßig bei allen Stämmen eingesetzt. Die DNA wurde aus frischer Reinkultur isoliert und der Test anschließend entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt S-rRNA-Gen-Sequenzierung Im Falle eines nicht eindeutigen Ergebnisses der Sonden- Hybridisierung, wurde ein ca bp großer Abschnitt des 16S-rRNA-Gens sequenziert Amplifikation des Zielgens Die Amplifikation des Zielgens erfolgte mittels PCR auf dem Thermocycler. Bei jeder PCR-Reaktion wurde eine Reagenzien-Negativkontrolle, bestehend aus den Reagenzien und sterilem Aqua dest. mitgeführt. Pipettierschema für die PCR: Taq Polymerase (5 U/µl, Applied Biosystems) 0,5 µl Primer Myco 9 for 0,5 µl (entspricht 10 pmol) Primer Myco 1046 rev 0,5 µl (entspricht 10 pmol) DNA 4,0 µl dntp 5 mm 1,3 µl 10 X PCR Puffer (Perkin Elmer) 10,0 µl Aqua bidest. 82,7 µl Die PCR wurde im Thermocycler Touch Down in 39 Zyklen durchgeführt: Zuerst Erhitzung bei 94 C für 5 min. Dann für jeden Zyklus: 1. Denaturierung 1 min 94 C 2. Anlagerung (Annealing) 1 min 64 C 3. Elongation (Extension) 1 min 72 C Im Anschluss 5 min 72 C für einen Zyklus und dann auf 4 C abkühlen und Temperatur halten.

33 Material und Methoden 27 Alle Reagenzien wurden für den Reaktionsansatz auf Eis gelagert und im Kühlblock pipettiert, um einen unkontrollierten, verfrühten Start der PCR und somit die Bildung unspezifischer Amplifikationsprodukte zu verhindern. Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Das Produkt sollte eine Bande bei ca bp zeigen. Um überschüssige Primer und freie Nukleotide zu entfernen, wurden die PCR-Amplifikate mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (Qiagen) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte gemäß der Standardanweisungen Sequenzierreaktion Für die eigentliche Sequenzierreaktion wurde das BIGDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) entsprechend des Herstellerprotokolls verwendet. Die Reaktion wurde dabei mit folgenden Primern durchgeführt: Myco 9 for, Myco 1046 rev, Myco 609 rev und Myco 361 rev. Da je Primer ein Ansatz hergestellt werden musste, wurden pro Isolat drei Ansätze benötigt. Pipettierschema für die Sequenzierung eines Primer-Ansatzes: - BigDye Terminator Ready Reaction Mix 4,0 µl - Sequenzing-Puffer, 5x 4,0 µl - Primer (20 pmol/µl) 0,3 µl - Aqua bidest. 6,7 µl Zu einem Ansatz wurden 5,0 µl gereinigtes PCR-Produkt zugegeben. Die Sequenzierreaktion stellt im Prinzip eine PCR dar. Sie wird im Thermocycler Touch Down mit folgenden Einstellungen durchgeführt: 1. Erhitzen auf 96 C für 30 sec 2. 4 min Abkühlen auf 60 C für 25 Zyklen Anschließend wurden die Sequenzierprodukte durch alkoholische Fällung aufgereinigt. Die Aufreinigung wurde nach Standardanweisungen des Instituts durchgeführt.

34 Material und Methoden Sequenzanalyse im Sequenziergerät Die Sequenzanalyse erfolgt als automatisierte computergestützte Bestimmung der Nukleotidabfolge im Kapillarsequenziergerät ABI Prism 310. Das Sequenziergerät trennt die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente durch Kapillarelektrophorese auf und detektiert die jeweiligen Nukleotide nach Aktivierung der Fluoreszenzmoleküle durch einen Laser. Dabei transformiert das Sequenziergerät das Emissionsmuster in Chromatogramme, die anhand spezieller Software ausgewertet werden können und somit die Nukleotidsequenz entschlüsseln Auswertung der Sequenzierungen Um für ein Isolat die vollständige DNA-Sequenz zu erhalten, müssen die einzelnen Teilstücke der drei Primer in der richtigen Reihenfolge und an den passenden Schnittstellen zusammengesetzt werden. Dies erfolgte mit Hilfe des Auswertungsprogrammes Trace Edit (Ridom GmbH). Die ermittelten Sequenzen wurden mittels des BLAST-Programmes der GenBank- Datenbank des National Center for Biotechnology Information der USA mit allen in der Datenbank enthaltenen Sequenzen verglichen. Zusätzlich wurden die Sequenzen mit der Datenbank des Ridom- Programms der GenBank des Ribosomal Differentiation of Medical Microorganism der Universität Würzburg verglichen. Diese Datenbank enthält ausschließlich Sequenzen von Referenzstämmen. Die Auswertung einer Sequenzierung gibt dabei einen Grad der Homologie zwischen zwei DNA-Sequenzen an. Eine Homologie des 16S-rRNA-Gens > 97 % und eine deutliche Diskrimination anderer Spezies zu einer Sequenz der Datenbank gilt als zuverlässige Identifizierung eines Bakteriums. Zur weiteren Veranschaulichung zeigt Abb. 5 in einem Flussdiagramm den Ablauf der Studie von der Probengewinnung über die Verarbeitung bis hin zur Identifizierung der Mykobakterien.

35 Material und Methoden ml kaltes Wasser 500 ml kaltes Wasser 500 ml warmes Wasser Dekontamination Bebrütung 30 C Bebrütung 37 C Bebrütung 37 C Inspektion 1x/Woche Kinyoun-Färbung Färbung negativ Kultur verwerfen Färbung positiv HAIN-Test Sequenzierung und internetbasierte Auswertung Abb. 5: Flussdiagramm zur Veranschaulichung des Ablaufs der Laborarbeit Typisierung der Mykobakterien mittels Pulsfeldgelelektrophorese In zwei verschiedenen Wasserproben eines Patienten, die zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen worden waren, konnten Mykobakterien derselben Spezies nachgewiesen werden. Die Analyse eines Katheterabstrichs desselben Patienten ergab ebenfalls ein Mykobakterium der oben genannten Spezies. Aus diesem Grund wurde eine Typisierung der Mykobakterien mittels PFGE durchgeführt. Die PFGE ist eine molekularbiologische Methode der Bakterientypisierung, mit der die klonale Identität von Bakterienisolaten gleicher Spezies nachgewiesen werden kann.

36 Material und Methoden 30 Im speziellen Fall wurde für diese Arbeit die PFGE für M. chelonae durchgeführt. Hierzu wurden die entsprechenden Isolate in Middlebrook 7H10 Flüssigagar für 3-7 Tage bebrütet, bis ein Wachstum sichtbar war. Die Suspension wurde im Anschluss für 15 min bei 2500 U/min und erneut in 5 ml Middlebrook 7H10, welcher zusätzlich mit 1 % Triton X100 versetzt war, für 90 min bei 37 C bebrütet. Nach dem Waschen der Probe mit 5 ml CSB Puffer wurde diese in 500 µl CSB überführt, mit 500 µl 2 % Seal Plaque Agarose gemischt und in Gel-Blöckchen gegossen. Danach wurden die Blöckchen bei 8 C für 30 min gekühlt und in 50 ml tubes, die 3 ml EC Puffer enthalten und 100 µl Lysozym (200 mg/ml), überführt. Die so erhaltene Suspension wurde nun bei 37 C und leichtem Schütteln inkubiert. In der Folge wurde der Puffer mit frischem EC Puffer und 100 µl Lysozym ersetzt und die Inkubation für sechs Stunden fortgeführt. Nach dreimaligem Waschen mit 5 ml TE Puffer und 5 ml Lysepuffer wurden 100 µl Proteinkinase K (20 mg/ml) zugesetzt und die Tubes für 72 h bei 49 C in ein schüttelndes Wasserbad gesetzt (50 Rotationen/min). Anschließend wurden zusätzlich 100 µl Proteinkinase K zugesetzt und die Inkubation für weitere 72 h bei 49 C fortgesetzt. Im Anschluss wurden die Blöckchen dreimal mit Wasser bei 50 C und dann dreimal mit TE Puffer bei 50 C gewaschen. Dann wurden sie in 5 ml kaltem TE Puffer für 15 min bei 8 C abgekühlt und in 2x3 mm große Stücke geschnitten. Eines dieser Stücke wurde nun dreimal mit 1 ml Dummy-No-Salt Puffer gewaschen. Der Restriktionsaufschluss wurde mit XbaI und einer Inkubationszeit von 4 h bei 37 C erreicht. Die PFGE wurde mit einem CHEF DRIII System in 1,2 % Agarose bei 14 C, einer Spannung von 6 V/cm mit einer Pulsrate von 5-35 sec und einer Laufzeit von 25 h durchgeführt. Die Interpretation der PFGE wurde sowohl mittels der Diversity Database Software als auch visuell durchgeführt. Es wurden die Kriterien von Tenover et al. angewendet [124].

37 Ergebnisse 31 3 Ergebnisse 3.1 Patientenkollektiv und Daten zur Wasserversorgung Patientenkollektiv Insgesamt wurden 65 Patienten in 65 Haushalten in die Studie eingeschlossen. Der Altersdurchschnitt lag bei 51 Jahren, wobei die Altersspanne der Patienten von 18 bis 76 Jahren reichte. In der Studienpopulation waren 26 Frauen (40 %) und 39 Männer (60 %) Wohnsituation Im Schnitt lebten drei Personen in jedem Haushalt (Median 3), variierend zwischen allein lebenden Patienten und 11 Personen pro Haushalt. Die Mehrheit der Patienten lebte in Einfamilienhäusern (62 %). Knapp ein Drittel der Patienten besaß Haustiere, darunter vor allem Hunde und Katzen.

38 Ergebnisse Entnahmeorte und Wasserversorgung Die meisten der Patienten wohnten auf der Nord-Süd-Achse zwischen den Gebieten nördlich von Ulm und dem Bodensee. Abb. 6: Kartenausschnitt Süddeutschland (Schema modifiziert, Rote Punkte: Orte der Probenentnahmen, Ziffer: Anzahl der Patienten im jeweiligen Ort 18 der 65 (28 %) Haushalte produzierten ihr Warmwasser in Zentralheizungen und sieben (11 %) in Durchlauferhitzer. Die Mehrheit der Patienten jedoch erhielt ihr Warmwasser durch Heißwasserboiler (40/65, 62 %).

39 Ergebnisse 33 Dabei belief sich die durchschnittliche Vorlauftemperatur des Warmwassers auf 57,9 C (Median 60 C). Die niedrigste Wassertemperatur war hierbei 40 C, die höchste 80 C. Bei 14 der 65 besuchten Haushalten konnten wir keine Vorlauftemperaturen ermitteln. Das Trinkwasser der in die Studie einbezogenen Haushalte entstammte unterschiedlichen Aufbereitungsanlagen. Diese bezogen ihr Wasser entweder aus Grundwasser, Oberflächenwasser (Bodenseewasser) oder aus der Landeswasserversorgung. Die Landeswasserversorgung beinhaltet Wasser aus Grundwasservorkommen (45 %), Quellwasser (17 %), Flusswasser (34 %) und 4 % Wasser fremden Ursprungs. Es wird der Bereich nördlich von Ulm mit diesem Wasser versorgt. Zur Veranschaulichung ist in Abb. 7 die Wasserversorgung der Studienhaushalte grafisch dargestellt. Landeswasser (n=11) 17% Oberflächenwasser (n=7) 11% Grundwasser (n=47) 72% Abb. 7: Prozentuale Häufigkeit der Wasserversorgungstypen an der Gesamtversorgung n = Anzahl der erhobenen Proben der jeweiligen Qualität

40 Ergebnisse Grunderkrankungen im Patientenkollektiv Die einbezogenen Patienten hatten unterschiedliche Grunderkrankungen. Der Übersicht wegen wurden sie einigen Obergruppen zugeordnet. Unter den malignen Lymphomen sind zusammengefasst: Hodgkin-Lymphom, Non-Hodgkin-Lymphom und chronisch lymphatische Leukämie. Die chronisch myeloproliferativen Erkrankungen umfassen die chronisch myeloische Leukämie und das myelodysplastische Syndrom. Die Gruppe der Akuten Myeloischen Leukämien beinhalten auch die sekundären Formen. Die restlichen Erkrankungen (Burkitt Lymphom, malignes Histiozytom) wurden unter,,andere zusammengefasst. Abb. 8 zeigt die Grunderkrankungen und ihre Häufigkeiten im Patientenkollektiv. 30 Absolute Häufigkeit AML ALL Maligne Lymphome Chron. Myel. Erkr. Anämien Sarkome Andere Abb. 8: Grunderkrankungen der in die Studie während des Erfassungszeitraumes eingeschlossene Patienten; AML: akute myeloische Leukämie, ALL: akute lymphatische Leukämie, Chron. Myel. Erkr.: chronische myeloische Erkrankungen

41 Ergebnisse Medikamentöse Antibiotikaprophylaxe Die Mehrzahl der Patienten bekam eine prophylaktische Antibiotikatherapie. 49 der 65 Patienten (75 %) wurden mit Levofloxacin behandelt. 22 der in die Studie eingeschlossenen Patienten erhielten Cotrimoxazol (34 %) als Prophylaxe. 22 % der Patienten (n=14) erhielten beide zuvor genannten Antibiotika. Acht Patienten (12 %) kamen ohne Prophylaxe aus Stationäre Wiederaufnahmen Während des Studienzeitraumes von Dezember 2006 bis Dezember 2007 gab es unter den 65 Patienten insgesamt zehn außerplanmäßige stationäre Aufnahmen auf die hämatologischen Stationen der Universitätsklinik Ulm. Die Entnahmezeitpunkte der Proben lagen zwischen null und 24 Tagen vor den stationären Aufnahmen oder Entlassungen, wobei null heißt, dass die Probenentnahme während des Krankenhausaufenthaltes des betreffenden Patienten stattfand. Sechs Aufnahmen erfolgten auf Grund von Fieber primär unklarer Ätiologie. Bei zwei Patienten wurden jeweils eine Escherichia coli- und eine Enterokokken-Sepsis nachgewiesen. Die restlichen Hospitalisationen erfolgten zum einen wegen Diarrhö und zum anderen wegen des Verdachts auf Pneumonie. Eine Infektion mit Mykobakterien konnte in keinem der Fälle nachgewiesen werden. Sieben der zehn unplanmäßig stationär aufgenommenen Patienten bekamen Levofloxacin als Chemoprophylaxe, zwei sowohl Cotrimoxazol als auch Levofloxacin und einer hatte keine antibiotische Abdeckung.