HPLC-Versuch: Stabilität von Nifedipin
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- Kornelius Martin Koch
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1 HPLC-Versuch: Stabilität von Nifedipin N 2 Vorbesprechung: Allgemeine Grundlagen HPLC (Aufbau, Zweck der Bestandteile, mobile Phase, Theorie) Nifedipin (Struktur, Abbau unter Licht und Stabilität funktioneller Gruppen allgemein (lichtinduzierte Umlagerungen), Arzneimittel mit Nifedipin, Pharmakologie) Sie sollten auch alle Begriffe in der folgenden Anleitung verstehen und sowohl wissen, worum es bei dem Versuch geht, als auch, was Sie zu tun haben. (Also bitte rechtzeitig gründlich lesen!) N H Empfohlene Literatur u.a.: Rücker, Mutschler, Steinhilber Gerhard Rücker, Michael Neugebauer, und Günter Georg Willems: Instrumentelle pharmazeutische Analytik: Lehrbuch zu spektroskopischen, chromatographischen, elektrochemischen und thermischen Analysenmethoden, September 2007 oder Januar 2001 Ernst Mutschler, Gerd Geisslinger, Heyo K. Kroemer, und Monika Schäfer- Korting: Arzneimittelwirkungen, Januar 2001 oder Mutschler, Gerd Geisslinger, Heyo K. Kroemer, und Peter Ruth: Arzneimittelwirkungen, April 2008 Dieter Steinhilber, Manfred Schubert-Zsilavecz, und Hermann J. Roth: Medizinische Chemie: Targets und Arzneistoffe, Mai 2005 Versuchsablauf: Die Anlage darf nur von Assistenten bedient werden!!! Die Probenvorbereitung erfolgt in Zweier- bzw. Dreier-Gruppen. Nehmen Sie sich für den entsprechenden Praktikumstag nichts anderes im Labor vor; es ist wichtig, dass die Probenvorbereitung spätestens 1 Stunde vor Ende des Praktikumstages abgeschlossen ist, damit die Anlage am folgenden Tag für die nächste Gruppe frei ist.
2 In diesem Versuch wird die Stabilität von Nifedipin unter Lichteinwirkung mittels HPLC untersucht. Dazu wird eine Nifedipinlösungen für eine bestimmte Zeit dem Tageslicht ausgesetzt und anschließend dunkel gelagert. Mit den HPLC-Messungen können Sie den Abbau des Nifedipins verfolgen. Damit nicht alle Gruppen genau die gleichen Ergebnisse erhalten, wird der Versuch mit zwei verschiedenen Zeitschemata durchgeführt. Wichtig für die rganisation ist, dass Sie sich 45 Minuten bevor Sie die Messung starten wollen bei den Assistenten melden, damit die HPLC-Anlage gespült und äquilibiert wird. Und bedenken Sie, dass die Messung spätestens 1 Stunde vor Ende des Praktikumstages gestartet werden muss. 1. Überprüfung der Anlage: Vergewissern Sie sich, dass das Abfallgefäß leer ist und noch ausreichend Fließmittel zur Verfügung steht. Es sollten mindestens 300 ml Methanol und HPLC-Wasser+10% Methanol vorhanden sein. Ist diese Menge unterschritten, melden Sie sich bitte im Assistentenzimmer. Zudem muss darauf geachtet werden, dass das Gläschen zur Hinterkolbenspülung mindesten ¾ mit Methanol (p.a.) gefüllt ist. 2. Probenvorbereitung: Herstellung der Stammlösung Sie erhalten einen 10 ml-messkolben mit ca. 1 mg Nifedipin. Die genaue Einwaage ist auf dem Kolben vermerkt. Zur Herstellung der Lösung gehen Sie in den IR-Raum und schalten nur das Rotlicht an. Nifedipin zersetzt sich in Lösung schneller als der Feststoff, allerdings nicht unter langwelligem Rotlicht. Füllen Sie den Kolben mit Methanol (p.a.) unter zur Hilfenahme einer Eppendorf-Pipette so auf, dass Sie eine Konzentration von 0,1 g/l erhalten. Schütteln Sie kräftig, bis sich das Nifedipin gelöst hat und umwickeln Sie den Kolben lichtdicht mit Alufolie.
3 Herstellung der Verdünnungsreihe für die Kalibriergerade Dazu entnehmen Sie der Stammlösung 5 ml Lösung, geben diese in einen 10 ml-messkolben (Braunglas), füllen diesen mit Methanol auf und schüttelt kräftig. Entnehmen Sie aus der gerade hergestellten Lösung wieder 5 ml und geben Sie diese in einen weitern leeren 10 ml Messkolben (Braunglas), füllen Sie ihn auf und schütteln Sie. Setzen Sie die Prozedur fort bis Sie vier Lösungen hergestellt haben, also vier Verdünnungsschritte. (Denken Sie an Braunglas und schütteln!) Herstellung der Probenlösungen Dazu können Sie den IR-Raum wieder verlassen und in den HPLC-Raum gehen. Dort stellen Sie die Stammlösung auf die Fensterbank und setzen die Nifedipinlösung der Sonne aus. Immer nach einer bestimmten Zeit wird der Stammlösung mit einer Spritze eine Probe von ca. 0,5 ml entnommen und in ein Braunglas-Vial gefüllt, welches anschließend gut verschlossen im dunkeln gelagert wird. Beschriften Sie die Gläschen sorgfältig. Die Proben sollen nach 0(0) (Teil der Verdünnungsreihe), 15(10), 30(20), 45(40), 60(60), 75(80), 90(100) Minuten genommen werden. Überführen Sie von jeder der 4 Lösungen von der Verdünnungsreihe etwa 0,5 ml in ein Braunglas-Vial und markieren Sie welche Lösung sich in welchem Vial befindet. Die Vials werden in das Rack wie folgt einsortiert: 1: Stammlösung (nach 0 Minuten) 2: 1. Verdünnung 3: 2. Verdünnung 4: 3. Verdünnung 5: 4. Verdünnung 6: 15 min (bzw. 10) 7: 30 min (bzw. 20) 8: 45 min (bzw. 40) 9: 60 min (bzw. 60) 10: 75 min (bzw. 80)
4 11: 90 min (bzw. 100) 12: Zusatzversuch 13: Vial mit Methanol (Wichtig! Muss immer an diesem Platz stehen, zum spülen der Nadel) Die Sortierung ist wichtig, weil die Methode genau so programmiert ist und man seine Ergebnisse am Ende eindeutig wieder findet. 3. Messung: Wenn Sie mit der Probenvorbereitung fertig sind, melden Sie sich im Assistentenzimmer. Der HPLC-Lauf kann dann gestartet werden (vom Assistenten!). Die verwendete Säule ist LiChroCART von Merck und ist gefüllt mit LiChrospher 60 RP-select B (Partikelgröße 5µm). Als mobile Phase wird eine Mischung aus Methanol und HPLC-Wasser mit 10% Methanol im Verhältnis 1:1 verwendet. (Die Mischung braucht nicht hergestellt zu werden, die Anlage besitzt einen Gradientenmischer.) Mit diesem Gemisch wird zunächst die Anlage gepurged und dann 30 Minuten bei einer Flussrate von 1 ml/min die Säule äquilibriert. Für die Trennung wird eine Flussrate von 1,2 ml/min eingestellt. Die Detektion erfolgt bei einer Wellenlänge von 235 nm. Der Lauf für die Proben der Kalibriergeraden und für die Proben dauert jeweils 30 Minuten. 4. Auswertung: Da die Messungen der Proben einige Stunden dauern, kann die Auswertung erst am nächsten Praktikumstag erfolgen. Bringen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten die Chromatogramme mit den Wertetabellen in Form von PDF- Dateien. Gebrauchen Sie für die Auswertung ein geeignetes Programm für Tabellenkalkulation Erstellen Sie eine Kalibriergerade für die verschiedenen Nifedipin- Konzentrationen (mit Gleichung und Korrelationskoeffizient).
5 4.2. Stellen Sie den Abbau von Nifedipin in einer geeigneten graphischen Form dar Formulieren Sie ein Ergebnis. Die Abgabe der Auswertung hat spätestens am zweiten Praktikumstag nach der Probenvorbereitung zu erfolgen. Geben Sie den Ausdruck ihrer Auswertung, versehen mit Namen und Datum, und die ausgedruckten Report-Files im Assistentenzimmer ab. Die Auswertung sollten Sie sicherheitshalber an diesem Tag auch in elektronischer Form auf dem USB-Stick dabeihaben. Rechnen Sie damit, dass Sie uns zeigen müssen, wie Sie die Diagramme erstellt haben. Praxisbezogener Zusatzversuch nur für dieses Semester! Nifedipinlösung ist besonders empfindlich gegenüber Licht, wird allerdings als Fertigarzneimittel angeboten. In diesem Semester soll getestet werden ob die Nifedipinlösung bei 3-Mal-täglicher Anwendung wie im Beipackzettel beschrieben stabil bleibt. Dazu nehmen Sie die Flasche 3 Mal während des Versuches aus dem Schrank und drehen diese auf. Nach einer realistischen Entnahmezeit drehen Sie sie wieder zu und lagern sie im Schrank. Beim dritten Mal geben Sie 35 Tropfen auf einen Löffel, nehmen mit einer Eppendorf-Pipette 1 ml davon auf und geben diesen in einen 100 ml- Messkolben (Braunglas oder Alufolie). Füllen Sie den Messkolben mit Methanol auf. Entnehmen Sie eine Probe von 0,5 ml und füllen diese in ein Braunglas-Vial. Die Probe wird zusammen mit den anderen vermessen und ebenfalls ausgewertet. Bestimmen Sie die Konzentration der ursprünglichen Nifedipinlösung.
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