3.5.3 Übertragung von DNA nach Amycolatopsis sp. HR167

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1 Übertragung von DNA nach Die Zellwand der Grampositiven Bakterien stellt bei der DNAÜbertragung eine größere Barriere dar, so daß eine Übertragung von DNA nicht so einfach möglich ist. Für Grampositive Organismen muß deshalb für diesen Zweck eine geeignete Methode ausgewählt werden. Hier bietet sich zum einen die ProtoplastenTechnik an, bei der die äußere Zellwand Grampositiver Bakterien (der Mureinsacculus) enzymatisch entfernt wird, bevor die DNAÜbertragung erfolgt. Eine andere Methode, die auch von LAL et al. (1998) verwandt wurde, ist die Elektroporation. Auch eine spezielle Konjugationsmethode nach VOEYKOVA et al. (1998) wurde auf die Anwendbarkeit zur Übertragung von FremdDNA nach getestet, ebenso wie die von MADON und HÜTTER (1991) für mediterranei LBG A3136 entwickelte Methode Elektroporation von und mediterranei DSM (modifiziert nach LAL et al. 1998) Die Elektroporation, bei der durch kurze Stromstöße die Durchlässigkeit der Zellwand für DNA kurzzeitig erhöht wird, wurde bei einer Vielzahl Grampositiver Organismen zur Übertragung von DNA angewendet (KALSCHEUER et al. 1999; LAL et al. 1998). Die Elektroporation von wurde nach einer für mediterranei DSM entwickelten Methode (LAL et al. 1998) durchgeführt (s ). Das zu übertragende Plasmid prl60 wurde zuvor aus E. coli XL1Blue isoliert (s ) und in einer Konzentration von 0,15,0 µg/µl DNA zur Elektroporation eingesetzt. Die Zellen von und mediterranei DSM 40773, welcher als PositivKontrolle diente, wurden wie unter beschrieben angezogen und in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet. Die Elektroporation erfolgte bei einer elektrischen Feldstärke von 7,5 kv/cm (Kapazität 25 µf; Widerstand 600 Ω.). Zeitkonstanten von 3,6 5,6 ms wurden erreicht. Direkt nach der

2 153 Elektroporation wurde 400 µl LBMedium (s ) zu der Mycelsuspension hinzugefügt. Im Anschluß wurden je 100 µl des Ansatzes auf GYMPlatten (s ) ausplattiert. Die Selektion erfolgte mittels Erythromycin wie unter beschrieben. Die gewachsenen Kolonien wurden auf den Erhalt des Plasmids hin untersucht. Die Isolierung der PlasmidDNA erfolgte nach einer modifizierten Methode der alkalischen Lysis nach BIRNBOIM und DOLY (1979) (s ). Hierbei konnte nur in den Erythromycinresistenten Kolonien von mediterranei DSM das Plasmid plr60nachgewiesen werden, nicht hingegen in. Da dieses darauf hindeutete, daß es sich bei den positiven Klonen von sp. HR167 um spontan Erythromycinresistente Mutanten (vergleiche 3.5.1) handelte, sollte zur Bestätigung der Test auf αamylaseaktivität (s ) durchgeführt werden. αamylasenachweistest auf GYMPlatten mit 1% (w/v) Stärke Zum Nachweis der vom Plasmid prl60 vermittelten αamylaseaktivität wurden positive Elektroporanden von mediterranei DSM (prl60) und vermeintlich positive Klone von auf GYM Platten mit Stärke (1 % [w/v]) und Erythromycin (200 µg/ml) ausgestrichen. Die gut bewachsenen Platten wurden nach zwei Tagen Inkubation kurz mit Lugol`scher Lösung (J 2 KJ) überschichtet (s ). Stärkehaltige Bereiche der Platten wurden auf diese Weise tief violett gefärbt, wobei sich StärkeAbbau durch einen deutlichen Freßhof um die Zellen zu erkennen gab. Um die rekombinanten mediterranei DSM (prl60) zeigten sich deutliche Freßhöfe, wohingegen die getesteten Klone keinen Stärkeabbau zeigten (s. Abb. 3.33). Es wurde demnach keine αamylase exprimiert. Dieses stellt einen weiteren Hinweis dar, daß das Plasmid prl60 nicht nach übertragen bzw. nicht stabil in dem Stamm repliziert wurde.

3 154 Abb. 3.33: αamylasenachweis durch Bildung von Freßhöfen in Verbindung mit dem Farbnachweis von Stärke mit Lugol`scher Lösung (J 2 KJ) Der Farbnachweis erfolgte auf GYMPlatten mit Stärke (1 % [w/v]). Auf dem oberen Plattenbereich wurde mediterranei (prl60) ausgestrichen, auf dem unteren Bereich. Nach zweitägiger Inkubation bei 30 C wurde die Platte kurzzeitig mit Lugol`scherLösung überschichtet, um stärkehaltige Bereiche schwarzviolett anzufärben. Da Erythromycin aufgrund von auftretenden Spontanresistenzen nicht zur Selektion von rekombinanten geeignet war, erfolgte in weiteren Versuchen die Selektion positiver Elektroporanden von sp. HR167 durch Zugabe von Kanamycin (1 000 µg/ml; Endkonzentration pro Platte ca. 100 µg/ml) zum soft Agar (s ). Zunächst konnten mit dieser Methode keine positiven Elektroporanden von erhalten werden. Modifikation der Elektroporation nach Ergebnissen der Transformation Bei der Optimierung der direkten Transformation (modifiziert nach MADON und HÜTTER 1991, s ) wurde deutlich, daß die Wachstumsphase der eingesetzten Zellen bei der Übertragung von DNA nach eine entscheidende Rolle spielt, ebenso die Quelle der eingesetzten PlasmidDNA. Daher

4 155 wurde die Elektroporation unter Bedingungen wiederholt, welche den für die direkte Transformation (s ) ermittelten optimalen Parametern entsprachen. Hierfür wurden 50 ml einer 17 h bzw. 20 h alten, bei 40 ºC angezogenen TSB Kultur verwendet. Die Ernte und Vorbehandlung der Zellen erfolgte wie unter beschrieben. Im Anschluß an den letzten Waschschritt wurde das Pellet in 10 % [v/v] Glycerin resuspendiert, das Volumen wurde so gewählt, daß die Mycelsuspension eine optische Dicht von OD 400nm = 50 aufwies. Je 400 µl der Suspension wurden mit 0,15 µg prle6plasmiddna versetzt, welche zuvor mittels "PlasmixTALENTKit" (s ) aus E. coli ET12567 isoliert wurde. Nach erfolgter Elektroporation (s ) wurde direkt 400 µl S27MMedium zu dem Elektroporationsansatz gegeben. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden je 50 µl der Ansätze mit S27M soft Agar (3 ml) auf S27MAgarplatten gebracht. Die Überschichtung mit Kanamycinhaltigem (1 000 µg/ml) S27M soft Agar erfolgte nach 15 h Inkubation bei 30 C. Die Platten wurden anschließend für 8 Tage bei 37 C weiter inkubiert. Insgesamt konnten nur sehr wenige Kanamycinresistente Elektroporanden von erhalten werden, in denen sich jedoch ausnahmslos das Plasmid prle6 nachweisen ließ. Pro Platte waren maximal 2 CFU gewachsen, berechnet man daraus die Transformationsrate, so ergibt sich ein Wert von etwa 2 x 10 2 CFU pro µg eingesetzter PlasmidDNA Konjugationsexperiment zwischen und E. coli S171 Die Konjugation zwischen und den E. coli S171 Stämmen erfolgte nach VOEYKOVA et al. (1998) (s ), welche eine erfolgreiche Konjugation zwischen E. coli S171 und einer Reihe Grampositiver Bakterien, z.b. der Genera Streptomyces, Rhodococcus und Nocardia beschrieb. Daher sollte der Stamm unter Anwendung dieser Methode genetisch manipuliert werden.

5 156 Bei dem für diese Versuche ausgewählten E. coli S171 handelt es sich um einen klassischen DonorStamm (SIMON et al. 1983), welcher die tragene des Plasmids RP4 im Chromosom integriert hat. Konjugative Plasmide zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Transferfunktion (tragen) sowie eines Transfer Replikationsursprungs (orit) und einer Region (mob), die für Mobilisierungsproteine kodiert, aus. Konjugationsexperiment zwischen und E. coli S171 (popacos) Bei dem Vektor popacos (s. Abb. 3.34) handelt es sich um einen mobilisierbaren Vektor mit breitem Wirtsspektrum (KALSCHEUER; pers. Mitteilung). Dieser Vektor trägt ein KanamycinResistenzgen und beinhaltet einige singuläre Schnittstellen, die für Klonierungszwecke verwendbar sind. Er fungiert als Shuttle Vektor zwischen E. coli und dem Grampositiven Organismus Rhodococcus opacus PD630, in dem er stabil repliziert wird. Mob HindIII MCS* popacos 9244 bp rep pnc903 cos MCS* EcoRI XbaI Abb. 3.34: Schematische Darstellung des Vektors popacos Der Vektor popacos (KALSCHEUER, pers. Mitteilung) ist ein mobilisierbarer broad host range Vektor der stabil in Rhodococcus opacus PD630 repliziert. Er ist ein Derivat des Vektors pbbr1mcs2cos und trägt ein Kanamycinresistenzgen ().

6 157 Die Konjugation zwischen und E. coli S171 (popacos) erfolgte wie unter beschrieben. Als Donorstamm wurde E. coli S171 (popacos) über Nacht in LBMedium angezogen. Die Zellen wurden geerntet und zweimal mit LBMedium gewaschen, bevor sie im Verhältnis 2:1 mit dem Rezipienten gemischt und auf GYMPlatten aufgebracht wurden. Als Rezipient diente eine Sporensuspension von (s ). Nach 15 h Inkubation bei 30 C erfolgte die Selektion durch Überschichtung der Platten mit einer Lösung aus Nalidixinsäure und Kanamycin. Eine andere Form der Selektion wurde durch Abschwemmen der GYMPlatten nach zwei Tagen Inkubation und anschließender Ausplattierung auf H16MineralmediumPlatten mit einem Zusatz von 100 µg/ml Kanamycin vorgenommen. Mit beiden Selektionsmethoden waren keine positiven Transkonjuganten zu erzielen. Konjugationsexperiment zwischen und E. coli S171 (pvk ) Weiterhin sollte versucht werden, das Plasmid pvk , welches ein 20 kbp großes Fragment der genomischen DNA enthält (vergl. 3.4), durch Konjugation nach zu übertragen. Bei diesem Konjugationsexperiment wurde eine homologe Integration von FremdDNA in das Empfängergenom von beabsichtigt. Die Selektion erfolgte auf Tetracyclin bzw. Kanamycinhaltigem Medium. Die Resistenzgene hierfür würden bei einer homologen Integration des gesamten Hybridplasmids pvk mit übertragen. Ausgehend von einer Sporensuspension (s ) von sp. HR167 und einer Zellsuspension von E. coli S171 (pvk ) wurde die Konjugation nach der Methode von VOEYKOVA et al. (s ) durchgeführt. Ein 2:1 Gemisch von Donor und RezipientenStamm wurde auf GYMPlatten aufgetropft. Nach eintägiger Inkubation bei 30 C wurden die Platten mit 1 ml H16Mineralmedium abgeschwemmt und auf H16MMPlatten mit 0,5 % (w/v) Glukonat und 25 µg/ml Tetracyclin bzw. 100 µg/ml Kanamycin ausplattiert und bei 37 C inkubiert. Es konnten durch diesen Versuch keine positiven Transkonjuganten erhalten werden.

7 Übertragung von FremdDNA nach unter Verwendung von Protoplasten (HOPWOOD et al. 1995) Da anfangs weder durch Konjugation (s ) noch durch Elektroporation (s ) eine nachweisliche Übertragung von FremdDNA nach sp. HR167 erfolgte, wurden diese beiden Methoden mit der ProtoplastierungsTechnik kombiniert. Der Mureinsacculus der Grampositiven Zellen wird bei dieser Methode durch Behandlung mit Lysozym weitestgehend entfernt, so daß dieser bei der Übertragung von DNA kein Hindernis mehr darstellt. Die Protoplastierung sowie die anschließende Regenerierung der Zellen konnte für in Anlehnung an für Streptomyceten entwickelte Methoden (HOPWOOD et al. 1995) (s ) etabliert werden. Parallel dazu wurde diese Technik für mediterranei DSM als Vergleichsstamm angewandt. Die Protoplastierung wurde durch mikroskopische Kontrollen überprüft. Die Protoplasten wiesen im Gegensatz zu den in Mycelform vorliegenden stäbchenförmigen Ausgangszellen von spp. eine Kugelform auf. Durch Kontrollexperimente, bei denen Aliquots von Verdünnungsreihen in RegenerationsPuffer als auch in deionisiertem Wasser auf Regenerationsmedium ausplattiert wurden, konnte der Nachweis erbracht werden, daß ein Protoplastierungs Anteil von ca. 90 % erreicht wurde (s ). Bestimmung des Protoplastentiters und der Regenerationsrate von Zunächst mußte die Protoplastierung sowie die anschließende Regenerierung der Zellen für in Anlehnung an für Streptomyceten entwickelte Methoden (HOPWOOD et al. 1995) (s ) etabliert werden. Als Größenordnung für eine erfolgreiche Protoplastierung diente die Bestimmung des Anteils nichtprotoplastierter Zellen. Dieser Anteil wurde für in mehreren Protoplastierungsexperimenten wie unter beschrieben bestimmt.

8 159 Die Werte einer Auswahl verschiedener Experimente sind in Tabelle 3.16 wiedergegeben. Der Anteil nichtprotoplastierter Zellen lag zwischen 3 und 32 %; durchschnittlich konnte jedoch ein ProtoplastierungsAnteil von ca. 90 % erreicht werden. Für mediterranei DSM als Vergleichsstamm lag der Anteil nichtprotoplastierter Zellen bei etwa 3 %. Ein weiterer wichtiger Parameter bei erfolgreichen Protoplastierungsversuchen ist die Regenerationsrate. Diese gibt den prozentualen Anteil regenerierter Protoplasten an der gesamten Protoplastenmenge an. Die Ermittlung erfolgte wie unter geschildert. In Tabelle 3.16 sind ebenfalls die Regenerationsraten der Versuche aufgeführt. Die Raten liegen zwischen 0,002 und 0,11 %. Für den als Vergleichsstamm mitgeführten mediterranei DSM wurde eine Regenerationsraten von knapp 2 % erzielt. Tab. 3.16: Ergebnisse einiger Protoplastierungsexperimente mit sp. HR167 Zelltiter H 2 0Platte PPlatte Anteil nicht Regenerierte Regenerationrate protopl. Protoplasten [CFU/ml] [CFU/ml] [CFU/ml] Zellen [%] [CFU/ml] [%] 8 x ,5 x ,1 x ,1 1,9 x ,002 8 x ,2 x ,7 x ,4 2,5 x ,003 5,5 x ,5 x ,5 x ,5 6,0 x ,11 1 x ,4 x ,8 x ,8 5,1 x ,005 1,2 x ,4 x ,1 x ,0 7,9 x ,066 PPlatte: R3RegenerationsPlatten mit Verdünnungsreihen von Protoplasten in ProtoplastierungsPuffer H 2 OPlatte: R3RegenerationsPlatten mit Verdünnungsreihen von Protoplasten in H 2 O bidest (+ 1 % [w/v] SDS)

9 160 Elektroporation (modifiziert nach LAL et al. 1998) von sp. HR167Protoplasten Bei der Elektroporation der Protoplasten von wurden verschiedene Vektoren eingesetzt. Der Vektor prl60 (s ) sowie dessen Derivat prlbamehyabc (s ) fanden Verwendung. Die Versuche erfolgten wie unter beschrieben. Eine positive Selektion mit Erythromycin war nicht möglich, da zum einen spontanresistente Klone auftraten und zum anderen das Resistenzgen in dem Derivat prlbamehyabc durch die Klonierung der EugenolhydroxylaseGene in die BamHISchnittstelle inaktiviert wurde (s. Abb. 3.29) Verdünnungen der Elektroporationsansätze wurden daher auf stärkehaltige Regenerationsplatten ausgebracht. Der Nachweis auf αamylaseaktivität (s ) fiel jedoch bei allen Kolonien negativ aus. Eine Selektion über das ebenfalls auf dem Vektor befindliche KanamycinResistenzgen blieb hier ebenfalls erfolglos. Desweiteren wurde das Hybridplasmid pvk (vergl. 3.4) in Elektroporationsexperimenten mit Protoplasten von eingesetzt. Die Selektion erfolgte auf Regenerationsplatten mit Kanamycin. Auch hier konnten keine positiven Elektroporanden erhalten werden. Parallel zu den Versuchen mit wurden Experimente mit Protoplasten von mediterranei DSM durchgeführt. Durch Elektroporation der Protoplasten von mediterranei DSM konnte weder das Plasmid prl60 noch dessen Derivat prlbamehyabc nachweislich übertragen werden. Auch ergab die hierbei mögliche Selektion auf Erythromycin Resistenz keine positiven Elektroporanden. Transformation von Protoplasten von (nach HOPWOOD et al. 1995) Die Transformationen der Protoplasten von wurden wie unter beschrieben durchgeführt. Es wurde versucht, die Plasmide prl60 und pvk mittels dieser Methode nach zu übertragen.

10 161 Jeweils 0,7 1 µg der isolierten PlasmidDNA wurde pro 100 µl Protoplastensuspension eingesetzt. Die Selektion der Transformanden erfolgte durch Überschichten mit Kanamycinhaltigem R3Medium (s ). Alternativ wurde dem Regenerationsmedium R3 1 % [w/v] Stärke zugesetzt. Auch auf diese Weise konnten weder Kanamycinresistente Transformanden erhalten werden, noch zeigten sich α Amylasepositive Klone (s ) unter den regenerierten Protoplasten. Mit dieser Methode konnte nachweislich keine FremdDNA nach übertragen werden Direkte Transformation von und mediterranei DSM (modifiziert nach MADON und HÜTTER 1991) In der Literatur wurde mehrfach eine direkte Transformation von Stämmen nach einer Vorbehandlung mit MgCl 2, CsCl und Polyethylenglykol (PEG) beschrieben. Die von MADON und HÜTTER (1991) für mediterranei LBG A3136 entwickelte Methode wurde von VRIJBLOED et al. (1995a) erfolgreich für methanolica NCIB modifiziert. Auch die Arbeitsgruppe PELZER et al. (1997) nutzte diese Methode, um mediterranei DSM 5908 zu transformieren. Da diese Methode (s ) sehr vielversprechend erschien und im Gegensatz zu den bisher für getesteten Methoden für verschiedene Stämme erfolgreich angewandt wurde, sollte versucht werden, die bisher konstruierten Vektoren sowie die Plasmide prl60 und pvk auf diese Weise nach bzw. nach mediterranei DSM zu transformieren. Die Methode der direkten Transformation modifiziert nach MADON und HÜTTER (1991), wie sie in nachfolgenden Experimenten durchgeführt wurde, ist unter beschrieben. Zusätzlich ist ein Fließschema der Versuchsdurchführung in Abbildung 3.35 zu sehen.

11 162 Zellen der frühen stationären bzw. stationären Phase; Anzucht in Komplexmedium (TSB) Ernte (4 500 Upm; 15 min; RT) 3 x Waschen des Mycels mit TEPuffer Resuspension in TEPuffer Transformationsansatz: Aliquot (100 µl) der Mycelsuspension OD 400nm = 4050, MgCl 2 (Endkonzentration 5 mm), CsCl (Endkonzentration 0,625 mm), KälberthymusDNAStammlösung (7,5 µg/ansatz), PlasmidDNA (0,020,5 µg) PEG (32,5 35 % [w/v]) Inkubation bei 37 C für 40 min Waschschritte zur Entfernung des CsCl Inkubation bei 0 C für 10 min Zellen mit temperierter (42 C) R2LAgaroseLösung versetzen, auf gut getrocknete S27MAgarPlatten ausbringen 1620 h Inkubation bei 30 C Selektion: Überschichten der Platten mit Antibiotikahaltigem soft Agar und Inkubation bei 37 C für 510 Tage Abb. 3.35: Fließschema zur Methode der direkten Transformation von modifiziert nach MADON und HÜTTER (1991)

12 163 Bei den ersten Versuchen zur Etablierung dieses neuen Systems für und dem zur Kontrolle mitgeführten mediterranei DSM wurden verschiedene Plasmide eingesetzt und die entsprechenden Selektionsmethoden angewendet. Die Plasmide wurden hierfür aus den entsprechenden E. coli XL1Blue Klonen isoliert. Die Experimente wurden wie unter beschrieben unter Verwendung folgender Parameter durchgeführt: Das eingesetzte PEG der Fa. NBS Biologicals (Nachfolger der Fa. Koch Light) wurde in einer Endkonzentration von 32,5 % [w/v] im Transformationsmix verwendet. Die Endkonzentration von MgCl 2 betrug 5 mm und die von CsCl 0,625 M. Je 2 µl einer KälberthymusDNAStammlösung (7,5 µg/µl) wurden pro 400 µl Transformationsmix zugegeben. Die verwendete DNAMenge pro Ansatz betrug ca. 0,5 µg. Das Mycel beider Stämme wurde nach 45 h Inkubation in TSB Medium bei 30 C geerntet. Unter diesen Bedingungen wurden die Plasmide prl60, prlbamehyabc, prlbampskehyab, pvk , psp2k1, psp2b9, psp2h8, psp2e1 und psp2b8 zur Transformation nach und gegebenenfalls nach mediterranei DSM eingesetzt. Die Plasmide wurden zunächst aus E. coli XL1Blue isoliert, später auch aus E. coli ET Die Selektion erfolgte durch geeignete, durch die jeweiligen Plasmide vermittelte AntibiotikaResistenz, erworbene αamylaseaktivität bzw. EugenolToleranz. Die Selektion auf Eugenol wurde durch Applikation von µl Eugenol auf ein Filterpapier im Deckel der S27MPlatte vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.17 zusammengefaßt, die durchgeführten Kontrollen ohne AntibiotikaZusatz oder ohne DNAZusatz sind nicht dargestellt.

13 164 Tab. 3.17: Ergebnisse erster Versuche zur direkten Transformation von und mediterranei DSM mit unterschiedlichen Vektoren und Selektionsmethoden Transformierter Stamm A. mediterranei DSM A. mediterranei DSM A. mediterranei DSM A. mediterranei DSM Plasmid Herkunft des Plasmids Selektionsmethode prl60 E. coli XL1Blue Erm, Erm + Stärke Transformationsrate [CFU/µgDNA] 6 x ,3 x 10 3 prlbamehyabc E. coli XL1Blue Eugenol prl60 E. coli XL1Blue Erm, Erm + Stärke prl60 E. coli ET12567 Erm, Erm + Stärke prl60 E. coli XL1Blue Erm + Stärke 4,4 x 10 2 Spontanresistenzen () 3,6 x 10 2 prlbamehyabc E. coli XL1Blue Eugenol prlbampskehyab E. coli XL1Blue Amp Eugenol pvk E. coli XL1Blue Tc psp2k1 E. coli XL1Blue Cm psp2b9 E. coli XL1Blue Cm psp2h8 E. coli XL1Blue Cm psp2e1 E. coli XL1Blue Cm 1,1 x 10 0 psp2b8 E. coli XL1Blue Cm psp2k1 E. coli ET12567 Cm psp2b9 E. coli ET12567 Cm psp2h8 E. coli ET12567 Cm psp2e1 E. coli ET12567 Cm + + 7,4 x 10 1 psp2b8 E. coli ET12567 Cm prl60 E. coli ET ,4 x 10 1 A. : ; Erm: Erythromycin; Amp: Ampicillin; Tc: Tetracyclin; : Kanamycin; +: wenige Transformanden erhalten, Stärke: Zusatz von 1 % (w/v) Stärke im Overlayer ; Test auf αamylaseexpression erfolgte nach 34 Tagen ; Eugenol: Applikation von µl Eugenol auf ein Filterpapier im Deckel der Platte

14 165 Die erhaltenen Antibiotikaresistenten Transformanden wurden stichprobenartig mittels Plasmidisolierung (s ) auf erfolgte DNAÜbertragung hin überprüft. Gegebenenfalls wurden die Transformanden auch auf αamylaseexpression getestet (s ). Es wurden Erythromycinresistente Klone von mediterranei DSM sowohl mit aus E. coli XL1Blue als auch mit aus E. coli ET12567 isolierter prl60dna erhalten. Bei Selektion auf Chloramphenicol das entsprechende Resistenzgen ist auf dem psp2anteil verschiedener Vektorkonstrukte lokalisiert konnten keine Transformanden gewonnen werden. Die erste erfolgreich durchgeführte Transformation von sp. HR167 wurde mit dem Plasmid psp2b1 aus E. coli ET12567 bei Selektion auf Kanamycin erzielt. Hier konnten drei resistente Transformanden erhalten werden. Plasmidisolierungen aus diesen Klonen bestätigten die erfolgreiche Etablierung von FremdDNA in. Eine weitere Bestätigung der Übertragung von DNA konnte durch Nachweis der αamylaseaktivität in einem der drei Klone erzielt werden. Eine Freßhofbildung um den Impfstrich des rekombinanten Stamms (psp2b13) konnte nach Anfärbung der stärkehaltigen Agar Platte mit Lugol`scherLösung eindeutig nachgewiesen werden (s ). Die aus den drei Klonen isolierten Plasmide wiesen allerdings unterschiedliche Größen auf, was auch die Tatsache erklärte, daß nicht für alle 3 Klone αamylaseaktivität nachweisbar war. Auch mit den aus E. coli ET12567 isolierten Plasmiden psp2h1 und psp2e1 konnten positive, Kanamycinresistente Transformanden von erhalten werden. Die isolierten Plasmide wiesen auch hier unterschiedliche Größen auf. In schien es zu Deletionen oder Umorientierungen in den Plasmiden zu kommen. Das kleinste isolierte Plasmid aus einem sp. HR167 (psp2e1)klon war ca. 6 kbp groß, was der Größe des prl60anteils des Konstruktes psp2e1 entsprach. Bei Transformationen, die mit Plasmiden aus E. coli XL1Blue durchgeführt wurden, konnten im Vergleich mit aus E. coli ET12567 isolierter DNA keine bzw. nur sehr wenige (1CFU/µg psp2e1 DNA) Transformanden erhalten werden.

15 166 Im Gegensatz zu mediterranei DSM scheint der Methylierungsgrad der eingesetzten PlasmidDNA für die Transformationseffizienz von von entscheidender Bedeutung zu sein. Auftreten von Deletionen bei der Transformation von sp. HR167 mit dem Plasmid prl60 Untersuchungen der Kanamycinresistenten (prl60) Transformanden auf αamylaseaktivität zeigten, daß nur ca. 50 % der erhaltenen Klone in der Lage waren, Stärke abzubauen. Entsprechende Restriktionsanalysen zeigten (Abb. 3.36), daß alle Plasmide der untersuchten αamylasenegativen Klone deutliche Deletionen aufwiesen, welche an unterschiedlichen Stellen im Plasmid zu erfolgen schienen. Auch ein αamylasepositiver Klon mit einer verkleinerten Version des Plasmids prl60 wurde gefunden (Klon 323; s. Abb. 3.36). Ein 6 kbp großes Fragment war jedoch noch bei allen untersuchten Klonen vorhanden.

16 167 Stamm 323 Stamm 322 Stamm 324 Stamm 320 Stamm 325 Stamm 321 Stamm 326 sp. HR167 (Wildtyp) A B Abb. 3.36: Detektion von αamylaseaktivität in verschiedenen rekombinanten Stämmen von Aus der Übertragung von prl60 resultierende Transformanden wurden auf GYMPlatten mit Stärke (1 % [w/v]) angezogen. Nach zweitägiger Inkubation wurden die Platten kurzzeitig mit Lugol`scher Lösung überschichtet, αamylase exprimierende Stämme zeichnen sich durch den ungefärbten Hof um die Kolonien aus (A). Plasmide der korrespondierenden Transformanden wurden isoliert und mit EcoRI verdaut (B): Spur 1 und 9: Standard, PstI verdaute LambdaPhagenDNA Spur 10: EcoRI verdaute PlasmidDNA aus E. coli ET12567 (prl60) Spur 28: EcoRI verdaute PlasmidDNA aus rekombinanten Stämmen von ; Stamm 39 (Spur 2); Stamm 311 (Spur 3); Stamm 320 (Spur 4); Stamm 321 (Spur 5); Stamm 322 (Spur 6); Stamm 3 23 (Spur 7); Stamm 324 (Spur 8) +: αamylase positiv

17 168 Transformation des Plasmids prle6 nach Da das Plasmid prle6 (s ) als Modellvektor für die Optimierungsversuche der Transformation von eingesetzt werden sollte, mußte zuvor gezeigt werden, daß dieses Konstrukt in autonom und stabil repliziert, d.h. daß keine weiteren Deletionen erfolgten. Das Plasmid prle6 wurde zunächst aus E. coli ET12567 und E. coli XL1Blue isoliert und anschließend in Transformationsexperimenten (s ; Parameter wie oben beschrieben) mit eingesetzt. Mit der PlasmidDNA aus E. coli XL1Blue wurden keine Transformanden erhalten, mit dem entsprechenden Plasmid aus E. coli ET12567 konnten dagegen 0,9 x 10 3 bzw. 1,0 x 10 3 Transformanden pro µg eingesetzter PlasmidDNA erzielt werden. Alle kontrollierten Transformanden enthielten ein ca. 6 kbp großes, mit EcoRI linearisierbares Plasmid. Es konnte also davon ausgegangen werden, daß zum einen alle für eine autonome Replikation in notwendigen Informationen auf dem 6 kbp großen EcoRIFragment des Vektors prl60 enthalten waren. Weiterhin schienen keine nachweisbare Deletionen des Plasmids prle6 zu erfolgen. Somit erwies sich dieses Plasmid als Modellvektor für die Optimierungsversuche der direkten Transformation (modifiziert nach MADON und HÜTTER 1991) von als gut geeignet.