Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft

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1 Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Untersuchungen zum molekularbiologischen Nachweis von tierischen Bestandteilen in Futtermitteln (Abschlussbericht) Themen-Nr / 2004 Das Thüringer Ministerium für Landwirtschaft, Naturschutz und Umwelt

2 Besuchen Sie uns auch im Internet: Impressum Herausgeber: Autor: Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Naumburger Str. 98, Jena Tel.: (03641) 683-0, Fax: (03641) Abteilung Untersuchungswesen Dr. rer. nat. Sabine Domey Januar Nachdruck auch auszugsweise nur mit Quellenangabe gestattet. -

3 Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung 2 2 Allgemeine Vorbetrachtung 3 3 Material und Methoden 4 4 Ergebnisse und Diskussion Methodenetablierung / -optimierung Vergleich zwischen gendiagnostischer und mikroskopischer 7 Methode hinichtlich Aussagefähigkeit und Aussagegenauigkeit sowie Einschätzung der Möglichkeiten und Grenzen der gendiagnostischen Methode als amtliches Untersuchungsverfahren 4.3 Kostenvergleich zwischen mikroskopischer und 11 molekularbiologischer Methode 5 Schlussfolgerungen 11 6 Zusammenfassung 11 7 Literatur 12 1

4 1 Einleitung Aufgrund des verstärkten Auftretens von BSE Ende der neunziger Jahre in Großbritannien und der ersten Fälle im Jahr 2000 auch in Deutschland und einigen anderen europäischen Ländern (ANONYM, 2001a) besteht seit dem 1. Dezember 2000 ein generelles Tiermehlverfütterungsverbot. Danach ist das Verfüttern proteinhaltiger Erzeugnisse und von Fetten aus Gewebe warmblütiger Landtiere und von Fischen sowie Mischfuttermitteln, die diese Einzelfuttermittel enthalten, an Nutztiere verboten... ausgenommen solche, die nicht zur Gewinnung von Lebensmitteln bestimmt sind (ANONYM, 2001b). Eine Ausnahme bilden proteinhaltige Erzeugnisse und Fette aus Fischen für Fische. Dieses Verbot wurde 2003 durch die Verordnung über tierische Nebenerzeugnisse dahingehend aufgeweicht, dass Fischmehl nach sicherer Aufbereitung an Schweine und Geflügel unter bestimmten Voraussetzungen 1 verfüttert werden darf (ANO- NYM, 2003a). Gegenwärtig wird seitens der EU diskutiert, Fischmehl wieder für Wiederkäuer (Rinder, Schafe, Ziegen) zuzulassen (ANONYM, 2004a, ANONYM, 2004b). Unter Beachtung des Kanibalismus-Verbots dürften Geflügelproteine wieder an Schweine verfüttert werden und Schweineproteine an Geflügel (ANO- NYM, 2003b). Voraussetzung dafür sind gesicherte Nachweise, die es gestatten, Eiweiße verschiedener Tierarten sicher zu unterscheiden (ANONYM, 2003c). Eine Möglichkeit dabei könnte der molekularbiologische Nachweis tierischer DNA bieten. Weil diese Methode die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung der DNA nutzt, sind bereits Spuren tierischer DNA detektierbar. Mit der derzeit amtlichen mikroskopischen Methode, die morphologische Strukturen wie kelfasern und andere Fleischpartikel, Knorpel, Knochen, Horn, Haare, Borsten, Blut, Federn, Eierschalen, Gräten, Schuppen zur Bestimmung tierischer Bestandteile in Futtermitteln nachweist (Futtermittel-Probenahme- und Analysenverordnung, 2004), kann nur sehr begrenzt eine Aussage zur vorliegenden Tierart getroffen werden. Diese Methode gilt aber zz. als einzig validierte Methode zur Untersuchung von Futtermitteln auf das Vorhandensein tierischer Proteine, einschließlich der Proteine, die nach dem Standard 133 C/3 bar/20 behandelt wurden (Richtlinie 2003/126/EG vom 23. Dezember 2003). Sie gestattet im Wesentlichen eine Zuordnung tierischer Bestandteile zu warmblütigen Landtieren und Fisch. Unter Umständen ist eine weitere Differenzierung in Säugetier, Fisch und Geflügel vor allem anhand der unterschiedlichen Knochenstruktur bzw. besonderer Strukturen wie Federn, Schuppen etc. möglich. Ist keine weitere Identifizierung der Landtierbestandteile möglich, muss stets das potentielle Vorliegen von Säugetierknochen in Betracht gezogen werden. Innerhalb einzelner Tierklassen kann nicht weiter differenziert werden. Das ist besonders für die Klasse der Säugetiere ein Manko, da hier vor allem die Unterscheidung zwischen Wiederkäuern und Nicht-Wiederkäuern von Bedeutung ist. Ziel nachstehend aufgeführter Untersuchungen war es deshalb, die molekularbiologische Methode in der TLL zu etablieren und sie hinsichtlich Aussagefähigkeit, Kos- 1 - es handelt sich um einen EU-Mitgliedstaat mit geringem BSE-Risiko - die Produktion von Futtermitteln für Wiederkäuer ist klar abgetrennt - eine Zulassung ist von der zuständigen Behörde erteilt worden 2

5 ten und Eignung als amtliches Untersuchungsverfahren mit der mikroskopischen Methode zu vergleichen. Dabei galt es zunächst, verschiedene DNA-Extraktionsmethoden bzw. kommerziell verfügbare DNA-Extraktionskits auf ihre Eignung zu prüfen, möglichst viel und reine (amplifizierbare) DNA zu liefern. Anhand von Futtermittelproben aus der amtlichen Futtermittelverkehrskontrolle, die zuvor mikroskopisch untersucht worden waren, sollten verschiedene Primerpaare bezüglich ihrer Detektierbarkeit tierischer DNA getestet werden und entsprechend geeignete Methoden für den Nachweis von Rind, Schwein, Huhn und Pute validiert werden. 2 Allgemeine Vorbetrachtung Die molekularbiologische Methode basiert auf dem Nachweis tierspezifischer DNA- Sequenzen unter Nutzung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Bei diesem Prozess wird ein bestimmter Genabschnitt unter Mitwirkung eines Enzyms (Polymerase) exponentiell vervielfältigt (amplifiziert), sodass am Ende der PCR mehrere Milliarden Kopien des entsprechenden DNA-Moleküls vorliegen. Der jeweils zu vervielfältigende Genabschnitt wird mit Hilfe eines Forward- und eines Reverse-Primers (einzelsträngige DNA-Stücke) beiderseitig markiert, die an den jeweiligen komplementären DNA-Einzelsträngen nach Denaturierung der DNA (1. Schritt der PCR) binden können. Nach der PCR werden die PCR-Produkte (Amplifikate) gelelektrophoretisch aufgetrennt und ihre Größe durch Vergleich eines mitgeführten DNA- Größenstandards bestimmt. Anhand der DNA-Fragmentgröße (Basenpaarlänge) und im Vergleich zu mitgeführten Positivkontrollen (DNA verschiedener Tierarten) ist eine Identifizierung möglich. Universeller Nachweis tierischer DNA mit den Primerpaaren H15149M/HM9 und K12-2/K13 bzw. L14753/H15149ad positiv: Hinweis auf tierische DNA negativ: kein Hinweis auf tierische DNA Nachweis des Myostatingens positiv: Hinweis auf DNA von Säugetieren und/oder Geflügel negativ: kein Hinweis auf DNA von Säugetieren oder/und Geflügelarten; ggf. liegt aber DNA von Fischen vor Nachweis mit tierartspezifischen Primerpaaren Restriktionslängenpolymorphismus/RFLP-Analyse Restriktionsspaltung der mit den Primerpaaren H15149M/HM9 und/oder K12-2/K13 und/oder L14753/H15149ad erhaltenen Amplifikate mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen; Ausschluss bzw. Hinweis auf DNA einzelner Tierarten Abbildung 1: Bestimmung tierischer DNA in Futtermitteln nach VDLUFA-Verbandsmethode (2002), variiert möglicher Untersuchungsablauf Für den allgemeinen Nachweis tierischer DNA nutzt man das ubiquitär im Tierreich vorkommende mitochondriale Cytochrom b-gen. Dessen Nachweis wird durch den Einsatz der in Abbildung 1 aufgeführten Primerpaare H15149M/HM9, K12-2/K-13 (VDLUFA-Verbandsmethode, 2002) und L14753/H15149ad (ASU nach 35 LMBG, 3

6 2002) ermöglicht, wobei letzteres insbesondere für den Nachweis von Fisch geeignet ist. Pflanzliche DNA wird nicht erfasst. Da das Cytochrom b-gen konservierte und variable Sequenzbereiche enthält, ist sowohl der allgemeine Nachweis tierischer DNA (konservierter Bereich) als auch der tierartspezifische Nachweis (variabler Bereich) durch Restriktionslängenpolymorphismus/RFLP-Analyse (enzymatischer Restriktionsverdau) möglich. Fallen die Tests mit den o. g. Primerpaaren positiv aus, kann durch den anschließenden Nachweis des Myostatingens auf das Vorhandensein von Säugetier-DNA bzw. DNA von Vögeln spezifiziert werden (vgl. Abb. 1). Ist dieser Nachweis negativ, handelt es sich nicht um DNA der beiden Tierklassen. Gegebenenfalls liegt aber DNA von Fischen vor. Zum gesonderten Nachweis verschiedener Fischarten ist das DNA-Amplifikat aus der mit dem Primerpaar L14753/H15149ad vollführten PCR enzymatisch in weitere DNA-Fragmente zu schneiden (Restriktionsverdau). Dadurch ergibt sich ein für die entsprechende Fischart charakteristisches DNA- Bandenmuster, das dem des mitgeführten DNA-Standards derselben Fischart gleicht. Auf diese Art lassen sich auch andere Tierarten vor allem der Säugetiere und Vögel identifizieren, wenn die RFLP-Analyse mit Amplifikaten, die aus der PCR mit den Primerpaaren H15149M/HM9 bzw. K12-2/K13 stammen, praktiziert wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Tierarten durchaus das gleiche Bandenmuster aufweisen können. Um dennoch eine klare Aussage treffen zu können, sind solche Untersuchungen immer parallel mit mehreren Enzymen, die unterschiedlich schneiden, durchzuführen. Das ist sehr kosten- und zeitintensiv. Deshalb ist für den speziellen Nachweis der Tierart die Verwendung tierartspezifischer Primer - soweit bekannt - vorzuziehen, mit denen (möglichst) nur diese Tierart detektier werden kann. Diese Methode hat außerdem den Vorteil, dass noch kleinere DNA-Mengen identifiziert werden können als mit der RFLP-Analyse. In der VDLU- FA-Verbandsmethode sind tierartspezifische Primerpaare für Rind, Schwein, Huhn und Pute genannt. Es gibt aber auch kommerzielle Kits, die spezifische Primer für diese vier Tierarten enthalten. 3 Material und Methoden Voraussetzung für den Nachweis tierischer DNA ist ihre Isolierung in ausreichender Menge und möglichst reiner Form. Um das gewährleisten zu können, wurden sechs verschiedene kommerzielle DNA-Extraktionskits bzw. DNA-Extraktionsmethoden in Bezug auf ihre Eignung miteinander verglichen. Für den Vergleich wurden folgende Kits herangezogen und nach der jeweiligen Vorschrift verfahren: - DNeasy Plant Mini-Kit (Firma QIAGEN) - QIAamp DNA Stool-Kit (Firma QIAGEN) - DNeasy Tissue-Kit (Firma QIAGEN) - NucleoSpin Plant-Kit (Firma Macherey/Nagel) - NucleoSpin Food-Kit (Firma Macherey/Nagel) - SureFood-PREP Animal X-Kit (Firma CONGEN). Die Validierung der Nachweismethoden tierischer DNA erfolgte vorrangig auf Basis der VDLUFA-Verbandsmethode (2002) unter Nutzung der dort aufgeführten Primer und Restriktionsenzyme. Zur Detektion von Fisch-DNA wurde die entsprechende 35-Methode des LMBG etabliert. Die Tierartendifferenzierung von Rind, Schwein, 4

7 Huhn und Pute erfolgte zur Absicherung der Ergebnisse zunächst zusätzlich mit den Primern aus dem CIBUS-Kit (2001). 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Methodenetablierung / -optimierung Der Vergleich von fünf kommerziellen DNA-Extraktionskits zeigte in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Futtermittel eine unterschiedliche Eignung der Kits (Tab. 1). Während DNA aus reinem Tierkörpermehl von Fleischknochen am besten mit dem DNeasy Tissue-Kit der Firma QIAGEN extrahiert werden konnte, lieferte der NucleoSpin Plant-Kit von Macherey/Nagel für Milchleistungsfutter (Mischfutter) die sauberste und am meisten amplifizierbare DNA. Nukleinsäure aus Futtermitteln mit hohem Molkepulveranteil bzw. aus reinem Molkepulver war nur mit dem SureFood-PREP Animal X-Kit der Firma CONGEN extrahierbar, nicht aber mit dem NucleoSpin Plant-Kit von Macherey/Nagel. Tabelle 1: DNA- Extraktionskit NucleoSpin Food Kit (Macherey/ Nagel) NucleoSpin Plant Kit (Macherey/ Nagel) DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) DNeasy Tissue Kit (QIAGEN) QIAamp DNA Stool Kit (QIAGEN) SureFood-PREP Animal X-Kit Vergleich der Extrahierbarkeit tierischer DNA aus Futtermitteln mit verschiedenen kommerziellen Kits Tiermehl Fleischknochen Fischmehl A 260 /A 280 Futtermittel (pflanzlich, ohne Molkeanteil, mit tierischen Bestandteilen) Futtermittel mit hohem Molkeanteil bzw. Magermilch-/ Buttermilchpulver 5 allgemeiner tierischer Nachweis mit Primerpaar H15149M/HM9 Tiermehl Fleischknochen Fischmehl Futtermittel (pflanzlich, ohne Molkeanteil, mit tierischen Bestandteilen) Futtermittel mit hohem Molkeanteil bzw. Magermilch-/ Buttermilchpulver 1,5 1,8 1,0 n. b (+) n. b. 1,2 1,8 1,3-1,9 keine DNA- Extraktion mögl. ++(+) +++ keine DNA- Extraktion mögl. 1,6 1,7 1,8 n. b. +(+) ++(+) n. b. 1,5 1,7 1,6 n. b (+) n. b. 1,7 1,9 1,9 n. b. + ++(+) n. b. n. b. 1,6 1,9 1,3 2,1 n. b. n. b. +++ (CONGEN) A 260 /A 280 gibt den Quotienten zwischen den Extinktionswerten der DNA-Extraktionslösung an, die bei 260 nm und 280 nm gemessen wurden und ist Ausdruck für die Ausbeute und Reinheit der DNA; n. b.... nicht bestimmt; (+). + ++, visuelle Einschätzung der DNA-Menge (wenig... viel) anhand der Stärke der DNA-Bande (PCR-Produkt) auf dem Gel nach gelelektrophoretischer Auftrennung Für den sicheren Tierartennachweis von Säugetier-/Vogel-DNA (Nachweis des Myostatingens) sowie von Rind, Schwein, Huhn und Pute musste die VDLUFA- Verbandsmethode verschiedenartig variiert werden, da die pure Übernahme der

8 Prozedur zu keinen zweifelsfreien Ergebnissen führte (neben der gesuchten Tierart wurde je nach verwendetem Primerpaar ein mehr oder weniger breites Spektrum weiterer Tierarten detektiert). Es erfolgten Veränderungen in der Konzentration einzelner Bestandteile des PCR-Mastermixes (Primer, Polymerase, DMSO-Zusatz, MgCL 2, Oligonukleotide) sowie Veränderungen der PCR-Reaktionsbedingungen (veränderte Annealing-Temperatur, Reduzierung der Zyklenanzahl). Die Abbildungen 2a-5b dokumentieren die Eignung der Nachweissysteme für entscheidende Tierarten. Abbildung 2a und b: Nachweis von Rind mit Primerpaar bospde-f/bospde-r nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate, DNA-Bande bei 104 bp im Vergleich zum DNA-Größenstandard, andere Tierarten und Negativkontrollen (Wasser, Mais) zeigen Abbildung 3a und b: Nachweis von Schwein mit Primerpaar SW01/SW02 nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate, DNA-Bande bei 108 bp im Vergleich zum DNA- Größenstandard, andere Tierarten und Negativkontrollen (Wasser, Mais) zeigen keine Bande Abbildung 4a und b: Nachweis von Huhn mit Primerpaar gal-f/gal-r nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate, DNA-Bande bei 171 bp im Vergleich zum DNA-Größenstandard, andere Tierarten und Negativkontrollen (Wasser, Mais) zeigen keine Bande 6

9 Abbildung 5a und b: Nachweis von Pute mit Primerpaar tur-f1/tur-r1 nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Amplifikate, DNA-Bande bei 209 bp im Vergleich zum DNA-Größenstandard, andere Tierarten und Negativkontrollen (Wasser, Mais) zeigen keine Bande Für die Detektion von Fisch wurde die entsprechende 35-Methode des LMBG zur Identifizierung der Fischart etabliert. Zwar könnte mit Hilfe des Myostatinprimerpaares bei Negativbefund indirekt auch auf mögliches Vorhandensein von Fisch- DNA geschlossen werden, wenn zuvor das allgemeine Screening auf tierische DNA mit den Primern H15149M/HM9 bzw. K12-2/K13 positiv ausfiele. Diese Tierartenprimer detektieren allerdings vorzugsweise Säugetiere und Vögel und erfassen nicht alle Fischarten, sodass auf diese Weise mitunter gar kein Fisch gefunden werden kann. Mit dem in der 35-LMBG-Methode genannten universellen Primerpaar L144753/H15149ad und anschließendem Restriktionsschnitt lässt sich dagegen eine große Palette verschiedener Fischarten nachweisen. 4.2 Vergleich zwischen gendiagnostischer und mikroskopischer Methode hinsichtlich Aussagefähigkeit und Aussagegenauigkeit sowie Einschätzung der Möglichkeiten und Grenzen der gendiagnostischen Methode als amtliches Untersuchungsverfahren Aus der vergleichenden mikroskopischen und molekularbiologischen Testung einer Anzahl von Proben aus der amtlichen Futtermittelverkehrskontrolle in den Jahren 2002 bis 2004 (Tab. 2) ging hervor, dass einige Proben trotz Negativbefund in der Mikroskopie tierische DNA enthielten. Dabei führten die für den allgemeinen Tierartennachweis verwendeten Primerpaare z. T. zu unterschiedlichen Ergebnissen. So signalisierte das Primerpaar H15149M/HM9 (Abb. 6) weitaus häufiger die Anwesenheit tierischer DNA als das Primerpaar K12-2/K13. Allerdings handelte es sich nur in Einzelfällen um DNA von Säugetieren. Eine anschließende Spezifizierung dieser Säugetier-DNA mittels RFLP-Analyse bzw. Einsatz von Rind spezifischen Primern erbrachte in allen diesen Fällen zweifelsfrei den Nachweis von Rind-DNA (Abb. 7). Wie erklärt sich dieses widersprüchliche Ergebnis im Vergleich zur Mikroskopie, durch die keine Knochen- und/oder kelanteile von Säugetieren gefunden werden konnten? 7

10 Tabelle 2: Jahr Anzahl Proben Anzahl molekularbiologisch untersuchter Futtermittel aus der Verkehrskontrolle in den Jahren und Anteil positiv getesteter Proben nach Negativbefund in der Mikroskopie allgemeiner Nachweis tierischer DNA mit Primerpaar H15149M/HM9 (Anteil Proben) allgemeiner Nachweis tierischer DNA mit Primerpaar K12-2/K13 (Anteil Proben) DNA von Säugetier / Vögeln mit Primerpaar My-r/My-f spezifischer Nachweis* von Rind- DNA (Anteil Proben) (Anteil Proben) (8) 34,8 % n.b. (2) 8,7 % (2 ) 8,7 % (18) 40,0 % (11) 24,4 % (2) 4,4 % (2) 4,4 % (7) 53,8 % (1) 7,7 % - - (x)... Absolutzahl; *...mit Primerpaar bospde-r/bospde-f, Rindprimer aus dem CIBUS-Kit und mit RFLP-Analyse der DNA-Amplifikate aus der PCR mit den allgemeinen Tierartenprimern Abbildung 6: Nachweis tierischer DNA mit Primerpaar H15149M/ HM9 in Futtermittel-Probe 997 (TH07/96/02; Spur: 5, 6, 16, 17), Banden bei 263 bp wie Positivkontrolle mit Huhn-DNA (Spur: 11) Abbildung 7: RFLP-Analyse mit DNA-Amplifikat aus der PCR mit Primerpaar H15149M/HM9 und Endonuclease TaqI; übereinstimmendes Bandenmuster der Probe 997 (TH07/96/02; Spur: 5, 6 12, 13) mit DNA von Rind (Spur: 1), Länge der Spaltprodukte: 183 bp + 80 bp Ein Blick auf die Zusammensetzung der Futtermittel (Tab. 3) legte die Vermutung nahe, dass die in den genannten Proben enthaltenen Molkebestandteile die Ursache für dieses Verhalten sein könnten. Schließlich dürfen in der zur Herstellung solcher Milchprodukte verwendeten Rohmilch bis zu somatische Zellen pro ml enthalten sein. Die zur Klärung dieses Sachverhaltes angestellte molekularbiologische Untersuchung von Buttermilch- und Magermilchpulver bestätigte die Anwesenheit tierischer DNA (Abb. 8). Diese konnte eindeutig als Rind-DNA identifiziert werden (Abb. 9). 8

11 Tabelle 3: Zusammensetzung Rind-DNA enthaltener Futtermittel laut Deklaration Futtermittelprobe TH07/96/02 (FM 997) TH07/95/02 (FM 996) TH05/92/02 (FM 1161) Art des Futtermittels Ergänzungsfutter für Ferkel Ergänzungsfutter zur Herstellung von Milchaustauscher für Kälber Milchaustauschfutter für Aufzuchtkälber Zusammensetzung des Futtermittels Molkenpulver, Milchzuckerpulver, Weizenund Maisquellstärke, Pflanzenöl etc. Molkenpulver, Palmöl, Kokosfett, Emulgator 50,2 % Magermilchpulver enthaltenes Mischfutter Abbildung 8: Nachweis von tierischer DNA in Butter- und Magermilchpulver (Spur: 15-18) sowie in Futtermittelproben mit hohem Molkeanteil (Spur 1-6) mit Primerpaar H15149/ HM9, DNA-Banden bei 263 bp Abbildung 9: Spezifischer Nachweis von Rind-DNA in Butter- und Magermilchpulver (Spur: 15-18) sowie in Futtermittelproben mit hohem Molkeanteil (Spur 1-6) mit Primerpaar bospde-f/r, DNA-Banden bei 104 bp Ein speziell für den Vergleich beider Methoden ausgerichteter nationaler Ringversuch der PCR-Arbeitsgruppe des VDLUFA verdeutlicht ebenfalls Unterschiede in ihrem Erfassungspotential. Während die Negativprobe durch beide Methoden richtig detektiert werden konnte, wurden jeweils zwei Positivproben unterschiedlicher Matrices nicht gefunden (falsch negativ!), wie beispielsweise der separate Vergleich der beiden TLL-Labore (Tab. 4) zeigt. Aufgrund der schwierigen (fettigen) Matrix konnte durch die PCR-Methode Hering in beiden Konzentrationen nicht detektiert werden, war aber mikroskopisch feststellbar, wenn auch nicht eindeutig nur als Fisch. Schwein konnte durch die mikroskopische Methode nicht erfasst werden. Zum gleichen Ergebnis kamen auch alle vier anderen Labors, die sich am Ringver- 9

12 such mit beiden Methoden beteiligt hatten. Der Grund für das falsche Resultat könnte vermutlich darin liegen, dass im Falle von Schwein und Rind Innereien eingesetzt wurden, deren Strukturen durch das Autoklavieren offensichtlich stark zerstört worden waren. Da die durch die Mikroskopie ermittelten tierischen Anteile auf einer Schätzung beruhen, sind z. T. weitaus höhere Werte als eingesetzt angegeben worden. Diese Untersuchungen zeigen, dass sich beide Methoden in Bezug auf die Richtigkeit ihrer Aussage sehr gut ergänzen und keine der Methoden besonders herausgestellt werden kann. Tabelle 4: Vergleich zwischen mikroskopischer und molekularbiologischer Methode anhand der Ergebnisse aus dem Ringversuch der AG PCR-Analytik (VDLUFA) zum Nachweis tierischer Bestandteile in Futtermitteln (nur Labore der TLL) Proben 0% Rind Schwein Schaf Huhn Hering Mix 0,1% 0,5% 2% 0,1% 0,5% 0,1% 0,5% 0,1% 0,5% 0,1% 0,5% je 0,1% PCR neg pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. pos. neg. neg. pos. Mikroskopie 0% 1 Säugetierknochen <0,1 % keln <0,1 % keln ohne Befund ohne Befund <0,1 % keln 0,4% keln keln, Säugetierknochen 1,5% keln, Säugetierknochen 0,5% keln, Fisch knochen 1 Säugetierknochen keln, Fisch knochen Allerdings hat die molekularbiologische Methode den wichtigen Vorteil der genauen Tierartendifferenzierung und ist somit entsprechend der Richtlinie 2003/126/EG der Kommission vom 23. Dezember 2003 über die Analysenmethode zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln als zweite weiterführende Untersuchung im Anschluss an die mikroskopische Erstuntersuchung geeignet. Bei Feststellung tierischer Bestandteile (betrifft nur Knochenfragmente) bietet die mikroskopische und derzeit einzig validierte/amtliche Methode zum Nachweis tierischer Proteine aber über die Mindestangabe zum Vorhandensein von Bestandteilen von Landtieren (Säugetiere und Vögel) bzw. von Fischmehl ( ja/nein -Entscheidung) hinaus die Möglichkeit der Quantifizierung durch Schätzung ihres Anteils. Diese Angabe ist im Einvernehmen mit den Anforderungen der zuständigen Behörden fakultativ (Richtlinie 98/88/EG der Kommission vom 13. November 1998). Dabei sind folgende Angaben möglich: < 0,1 %; 0,1-0,5 %; 0,5-5 %; > 5 %. Die hier vergleichend betrachtete konventionelle PCR- Methode gestattet dagegen nur eine qualitative Aussage. Das molekularbiologische Nachweisverfahren kann zudem durch die Matrix des Futtermittels dahingehend eingeschränkt sein, dass - eine DNA-Extraktion so erschwert wird, dass kein Nachweis möglich ist - tierische DNA enthaltende Futtermittelzusätze wie Molkeprodukte zu falschpositiven Ergebnisse führen können. keln, Säugetierknochen Fisch knochen 10

13 Diese Probleme stellen den möglichen Einsatz der gendiagnostischen Methode als alleiniges amtliches Untersuchungsverfahren zz. in Frage. 4.3 Kostenvergleich zwischen mikroskopischer und molekularbiologischer Methode Vergleicht man nur Arbeitsaufwand und Kosten beider Methoden miteinander (Tab. 5), so wird deutlich, dass die konventionelle PCR-Methode bedeutend zeit- und kostenintensiver ist als die Mikroskopie. Unter diesem Gesichtspunkt ist die mikroskopische Untersuchung zu bevorzugen. Tabelle 5: Vergleich von Kosten und Zeitdauer der Bearbeitung zwischen mikroskopischer und konventioneller PCR-Methode Methode Zeitdauer Probenbearbeitung Kosten pro Untersuchung Mikroskopie 1 AT (20 h) 38,50 PCR-Methode (konventionell) 2 AT (für allgemeinen Nachweis tierischer DNA) + mind. 1 AT für Tierartendifferenzierung* * Angaben sind annähernde Richtwerte; AT... Arbeitstag 225 (allg. tierischer Nachweis) + je 65 für Tierartendifferenzierung* 5 Schlussfolgerungen - Je nach Zusammensetzung der Futtermittel müssen verschiedene DNA- Extraktionsmethoden bzw. -Kits angewendet werden. Für die Mehrzahl der Futtermittel ist jedoch der NucleoSpin Plant-Kit von Macherey/Nagel geeignet. Er wird deshalb im TLL-Labor standardmäßig angewendet. - Da Molkebestandteile Rind-DNA enthalten können und so zu falsch-positiven Resultaten der Futtermittelanalyse führen, ist hier die mikroskopische Untersuchung unabdingbar. In der TLL werden deshalb im Rahmen der Futtermittelverkehrskontrolle nur noch Futtermittel für Rinder ohne Molkebestandteile molekularbiologisch untersucht. - Da es kein universelles Primerpaar für den generellen Nachweis tierischer DNA gibt, sind immer mehrere Primerpaare parallel einzusetzen. - Vergleichende Untersuchungen zwischen Mikroskopie und gendiagnostischer Methode haben gezeigt, dass die gendiagnostische Methode die mikroskopische Methode als alleinige amtliche Methode zz. nicht ersetzen kann. Beide Methoden ergänzen sich in ihrer Aussagefähigkeit und sollten für Zweifelsfälle parallel angewendet werden. In der TLL werden deshalb nur noch Futtermittel molekularbiologisch untersucht, die zuvor in der Mikroskopie positiv getestet wurden. - Um nach Positivbefund in der Mikroskopie Säugetierknochen oder -muskeln eindeutig der Tierart zuordnen bzw. zwischen Wiederkäuern und den häufigsten Nagetierschädlingen unterscheiden zu können, sind künftig weitere primerspezifische Nachweissysteme für die Tierarten Maus, Ratte, Schaf und Ziege zu validieren. 6 Zusammenfassung Der Vergleich von fünf verschiedenen DNA-Extraktions-Kits zeigte eine gute Eignung des NucleoSpin Plant Kits von Macherey/Nagel für Futtermittel fast aus- 11

14 schließlich pflanzlicher Zusammensetzung. Für Futtermittel mit hohem Molkeanteil eignet sich dieser Kit nicht. Der SureFood-PREP Animal X Kit ist zu empfehlen. Futtermittel mit Molkebestandteilen können Rind-DNA enthalten und molekularbiologisch untersucht zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Für diese Futtermittel ist die mikroskopische Untersuchung unerlässlich. Die gendiagnostische Methode kann zz. die amtliche mikroskopische Methode nicht ersetzen. Beide Methoden ergänzen sich in der Ergebnisfindung. Im Gegensatz zur Mikroskopie kann die gendiagnostische Methode weiterführende Ergebnisse bei der Tierartendifferenzierung liefern. Für den allgemeinen Nachweis tierischer DNA sowie für den Nachweis von Rind, Schwein, Huhn und Pute wurden primerspezifische Nachweissysteme validiert. Weiterführend sollen auch primerspezifische Nachweismethoden für die Tierarten Schaf, Ziege, Pferd, Maus und Ratte etabliert werden. 7 Literatur ANONYM (2001a): dlz 1,2001, S.20 ANONYM (2001b): dlz 1, 2001, S. 96 ANONYM (2003a): Informationsblatt zum Einsatz von Fischmehl in landwirtschaftlichen Betrieben. Regierungspräsidium Stuttgart, Ref. 34 v ANONYM (2004a): top agrar Telegramm v ANONYM (2004b): DLG-Mitteilungen, 11 (2004), S. 5 ANONYM (2003b): DLG-Mitteilungen, 9 (2003), S. 65 ANONYM (2003c): Kraftfutter / Feed Magazine, 4 (2003), S. 85 ASU nach 35 LMBG (2002): Untersuchung von Lebensmitteln. Identifizierung der Fischart in rohen und erhitzten Erzeugnissen. L , S. 1-7 CIB-A-Kit M1-EX/20. Nachweis-Kit für tierartspezifische Rind-, Schwein-, Huhn- und Pute-DNA in extrem verarbeiteten und hocherhitzten Produkten. V 3/2001-D, S.1-5 DNeasy Tissue Kit Handbook, QIAGEN (1999) DNeasy Plant Mini-Kit, Firma QIAGEN (2000) Futtermittel-Probenahme- und Analysenverordnung (2004). In: Futtermittelverordnung vom (BGBl. I S. 1605), zuletzt aktualisiert am NucleoSpin Plant Kit, Macherey/Nagel (2002) NucleoSpin Food Kit, Macherey/Nagel (2002) QIAamp DNA Stool-Kit, Firma QIAGEN (2001) Richtlinie 2003/126/EG der Kommission vom 23. Dezember 2003 über die Analysenmethode zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln. ABl. L 339/78 v Richtlinie 98/88/EG der Kommission vom 13. November 1998 mit Leitlinien für den mikroskopischen Nachweis und die Schätzung von Bestandteilen tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln. ABl. L 318/45 vom SureFodd-PREP Animal X Kit, Congen (2001) VDLUFA-Verbandsmethode (2002): Molekularbiologischer Nachweis von tierischen Bestandteilen (PCR-Methode), Verbandsmethode v Methodenbuch III VDLUFA-Verlag, Bonn, S