Robuste Clusterverfahren für Microarrays: Bildanalyse und Tumorklassifikation

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1 Robuste Clusterverfahren für Microarrays: Bildanalyse und Tumorklassifikation Jörg Rahnenführer Computational Biology and Applied Algorithmics Max Planck Institute for Informatics D Saarbrücken Germany Herbsttagung 2003 der AG DANK Düsseldorf,

2 Microarray - Impact Kumulative Anzahl von Veröffentlichungen in PubMed mit Stichwörtern 30. Oktober 2003: 4599! Microarray Microarray+clustering Von 10 nach 1000: Sequence analysis : Microarray :

3 Microarray - Experiment Kontrolle Tumor cdna von Kontroll- und Tumorgewebe Markierung der Proben mit grüner Farbe (532 nm) bzw. mit roter Farbe (635 nm) Kompetitive Hybridisierung

4 Microarray - Experiment Microarray slide Zielbereich Scannen des Bildes mit konfokalem Scanner Identifizierung der Spots Quantifizierung von roten und grünen Intensitäten

5 Ablauf eines Microarray-Projekts 1. Biologische Frage 2. Experimentelles Design 3. Microarray-Experiment 4. Bildanalyse 5. Normalisierung 6. Statistische Analyse 7. Biologische Verifikation and Interpretation Addressierung Auffinden der Bereiche, die zu einzelnen Spots gehören. Vordergrund und Hintergrund eines Spots heissen zusammen Zielbereich. Segmentierung Partitionierung des Zielbereichs in Vordergrund und Hintergrund. Reduktion Bestimmung zweier skalarer Werte R und G für rote und grüne Intensität sowie des Quotienten R/G für das relative Vorkommen in den zwei Geweben.

6 Bildanalyse Wie berechnet man Expressionswerte aus solch einer TIFF-Datei?

7 Bildanalyse: Problematische Spots Hohe Ungenauigkeit, bedingt durch fehlerhafte Spots und Artefakte:

8 Bildanalyse: Ursachen niedriger Qualität 1. Abnehmende Pin-Qualität Nach Spots Nach Spots 2. Regionale Effekte auf dem Microarray Farbskala Genexpressionswerte geordnet (Ränge) von blau nach gelb G H. Sueltmann DKFZ/MGA R Rb R-Rb

9 Zirkuläre Methoden (GenePix, ScanAlyze, Quantarray) Addressierung: Manuelles Anpassen eines Gitters Segmentierung: Fester Vordergrundund Hintergrundbereich

10 Verbesserungen Formerkennungs-Methoden Terry Speed Gruppe, Berkeley SPOT software in R basiert auf Seeded region growing Histogramm-Methoden Chen, Dougherty, Bittner, NIH Statistische Methode, benutzt Mann-Whitney - Test

11 Statistischer Ansatz Pixel Clustering D. Bozinov, J. Rahnenführer (2002): Unsupervised Technique for Robust Target Separation and Analysis of DNA Microarray Spots Through Adaptive Pixel Clustering, Bioinformatics 18(5): PxPAM und PxKmeans: Clustern der Pixel in der target area in zwei Gruppen, dievordergrund und Hintergrund repräsentieren. Cluster-plot (R/G) zeigt die Klassifikation in Pixel mit hoher und niedriger Intensität. Vorteile: ROBUST + ADAPTIV

12 Statistischer Ansatz - Pixel clustering Spot mit Loch im Zentrum

13 PxKmeans: Pixel clustering mit k-means 1. Konstruktion von Startwerten Wähle als Startwerte für die Gruppenmittelpunkte die beiden Zentren m 1 =(R fg,g fg ) und m 2 =(R bg,g bg ), wobei R fg, G fg bzw. R bg, G bg die höchsten bzw. niedrigsten Intensitätswerte. 2. Bestimmung eines lokalen Optimums (k-means) Alterniere bis zur Konvergenz zwischen: a) Weise jedes Objekt dem bzgl. Euklidischem Abstand nächsten der beiden Zentren zu. b) Berechne k=2 neue Zentren als Mittelwerte aller Beobachtungen, die in a) jeweils den alten Zentren zugewiesen wurden. 3. Reduktion Definiere R fg, G fg bzw. R bg, G bg durch die Werte des Zentrums mit hoher bzw. niedriger Intensität und (R fg -R bg )/(G fg -G bg ) als Schätzer der relativen Expression.

14 Clusteralgorithmen: PAM PAM (Partitioning around medoids, Kaufman and Rousseeuw (1990)) ist ein partitionierender Algorithmus und kann als Generalisierung von k-means gesehen werden. Für eine beliebige Abstandsmatrix d versucht PAM, die Summe (über alle Objekte) der Abstände zu dem jeweils nächsten der k Zentren (Prototypen) zu minimieren. Zielfunktion: (d: Manhattan, Korrelation, usw.) BUILD phase: Konstruktion von Startwerten für die 'medoids. SWAP phase: Wiederhole bis zur Konvergenz: Betrachte alle Paare von Objekten (i,j), bei denen i medoid ist und j nicht, und mache den Tausch i j, der die Zielfunktion minimiert.

15 PxPAM: Pixel clustering mit PAM 0. Berechnung der Distanzmatrix zwischen Pixeln Berechne den Manhattan-Abstand zwischen allen Paaren von Pixeln: d ij = d(x i,x j ) = R i -R j + G i -G j. 1. Konstruktion von Startwerten (PAM Build phase) Definiere m 1 als das Objekt mit kleinstem Σ i=1..n d(x i,m 1 ) und m 2 als das Objekt, das die Zielfunktion bei gegebenem m 1 minimiert. 2. Bestimmung eines lokalen Optimums (PAM Swap phase) 3. Reduktion Definiere R fg, G fg bzw. R bg, G bg durch die Werte des medoid-pixels mit hoher bzw. niedriger Intensität und (R fg -R bg )/(G fg -G bg ) als Schätzer der relativen Expression.

16 Pixel clustering: Robustheit Spot mit großem Artefakt

17 Pixel clustering: Adaptivität Spot mit niedriger Intensität

18 Statistischer Ansatz - Pixel clustering II J. Rahnenführer, D. Bozinov (2003): Hybrid clustering for microarray image analysis combining intensity and shape features, eingereicht bei BMC Bioinformatics. Erweiterung von pixel clustering : HYBRID PxKmeans Wiederholtes Clustern: Vergrößerung des Vordergrundbereichs für Spots geringer Qualität mit nur wenigen hellen Pixeln. Abgleich mit Maske: Löschen von falsch zugeordneten Pixeln. Vorteile: Form des Spots integriert in ursprünglichen Histogramm-Ansatz, bessere Verarbeitung von Spots geringer Qualität.

19 Statistischer Ansatz - Pixel clustering II Bivalenzmaske + Löschen von falsch zugeordneten Pixeln. 1. Konstruktion einer Bivalenzmaske, die die typische Form eines Spots charakterisiert. 2. Pixel, die in Spot und Maske unterschiedlich zugeordnet sind, werden gelöscht. 3. Stability : Qualitätsmaß, basierend auf Anzahl der gelöschten Pixel. Target area für Spot mit großem Artefakt Auswahl der Pixel für Vorder- und Hintergrund

20 Bildanalyse: Literatur Rahnenführer, J. and Bozinov, D. (2003): Hybrid clustering for microarray image analysis combining intensity and shape features, eingereicht bei BMC Bioinformatics. Bozinov, D., Rahnenführer, J., Burson, C.M., Spiegelstein, O. (2002): Automated Grid Alignment for High-Throughput Analysis of Microarray Images, Proceedings of 'The 2002 International Conference on Imaging Science, Systems, and Technology' (CISST'02), Las Vegas, June Bozinov, D. and Rahnenführer, J. (2002): Unsupervised technique for robust target separation and analysis of DNA microarray spots through adaptive pixel clustering, Bioinformatics 18(5),

21 Ablauf eines Microarray-Projekts 1. Biologische Frage 2. Experimentelles Design 3. Microarray-Experiment 4. Bildanalyse 5. Normalisierung 6. Statistische Analyse 7. Biologische Verifikation und Interpretation Clusteranalyse Welche Gene agieren zusammen? Diskriminanzanalyse Klassifikation (z.b. von Tumorarten): Welche Gene sind verantwortlich für die Unterschiede zwischen Klassen? Wie konstruiert man gute Klassifizierer? Differentiell exprimierte Gene Problem des multiplen Testens: Welche Gene sind signifikant anders? Genetische Netzwerke Welche biologischen Pfade sind beteiligt?

22 Clusteranalyse für Genexpressionsdaten Clustern von Spalten: Gruppieren ähnlicher Proben Die Genexpressionsmatrix Clustern von Zeilen: Gruppieren von Genen mit ähnlichen Trajektorien Biclustering: Gruppieren von Genen mit ähnlichen Teil-Trajektorien in einer Untermenge der Proben Literatur: Tanay, A., Sharan, R., and Shamir, R. (2002): Discovering Statistically Signifnicant Biclusters in Gene Expression Data, Bioinformatics 18, Suppl.1, Gene Proben

23 Tumorklassifikation Literaturbeispiel Golub et al.: Leukämie Datensatz, 3 Krebsklassen: 25 acute myeloid leukemia (AML), 47 acute lymphoblastic leukemia (ALL), in letzterer Gruppre 9 T-cell and 38 B-cell. Dendrogramm für 38 Trainingsdaten führt zu perfekter Trennung.

24 Vergleichsstudie Vergleichsstudie für Tumorklassifikation mit Microarrays: Vergleich von hierarchischem Clustern, k-means, PAM und SOM s Datensätze: Golub et al: Leukemia dataset, 3 cancer classes: 25 acute myeloid leukemia (AML) and 47 acute lymphoblastic leukemia (ALL), the latter 9 T-cell and 38 B-cell, Affymetrix high-density oligonucleotide chip, threshold and filtering preprocessing steps as in paper. Ross et al.: NCI60 cancer dataset, 9 cancer classes: 9 breast, 6 central nervous system, 7 colon, 8 leukemia, 8 melanoma, 9 lung, 6 ovarian, 2 prostate, 8 renal, cdna microarray, log, imputation of missing values with k-nearest-neighbor method and correlation distance.

25 Vergleichsstudie Clustervalidität Wenn die wahren Klassenzugehörigkeiten bekannt sind, kann man sie zur Validierung von Clusterergebnissen benutzen. N Beobachtungs-Tabelle n ij Anzahl der Beobachtungen dddddin Klasse i und Cluster j Rand index: Wahrscheinlichkeit, zufällig ein konsistentes Paar von Beobachtungen zu ziehen

26 Vergleichsstudie - Methode

27 Vergleichsstudie - Methode Farbe Klasse Form Cluster Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3

28 Vergleichsstudie - Methode Farbe Klasse Form Cluster Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3

29 Ergebnisse Leukämie-Daten Abstände: Euklidisch Korrelation Manhattan Algorithmen: k-means k-means 1 ooooooo SOM

30 Ergebnisse Krebs-Daten Abstände: Euklidisch Korrelation Manhattan Algorithmen: k-means k-means 1 ooooooo SOM

31 Ergebnisse Gewinner k-means Hierarch. Korrelation PAM Manhattan

32 Tumorklassifikation - Schlussfolgerungen Überlegenheit von k-means mit mehreren Durchgängen Verbesserungen möglich durch Wahl eines robusten Abstandsmaßes (z.b. PAM mit Manhattan-Abstand) Güte eines Algorithmus hängt auch vom Datensatz ab! Vorauswahl von Genen ist wichtig. Literatur Rahnenführer, J. (2002): Efficient clustering methods for tumor classification with gene expression arrays, Proceedings of '26th Annual Conference of the Gesellschaft für Klassifikation', Mannheim, July Tibshirani, R., Hastie, T., Narasimhan, B., and Chu, G. (2002): Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression, PNAS 99,

33 Internet-Quellen Guter Startpunkt für die Suche nach Microarray-Informationen: Literatur über Datenanalyse für Microarrays: NGFN Microarray Data Analysis Resource (Kurse in Praktischer DNA Microarray Analyse): Bioconductor: Open source + open development Software Project für die Analyse und das Verständnis genomischer Daten:

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