Aus der Chirurgischen Universitäts-Klinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Abteilung für Plastische und Handchirurgie Valley TEC

Transkript

1 Aus der Chirurgischen Universitäts-Klinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Abteilung für Plastische und Handchirurgie Valley TEC Ärztlicher Direktor: Univ.-Prof. Dr. G. B. Stark SCHAFFUNG DREIDIMENSIONALER KAPILLARNETZE IN EXTRAZELLULÄREN KOLLAGENMATRICES AUS GENMODIFIZIERTEN HUMANEN ENDOTHELZELLEN INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Vorgelegt am von Artiom W. Riabikhin geboren in Moskau

2 -2- Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. H. E. Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. G. B. Stark 2. Gutachter: PD Dr. J. Norgauer Jahr der Promotion: 2000

3 -3- INHALTSVERZEICHNIS Glossar verwendeter Abkürzungen 6 1. EINLEITUNG Historischer Überblick Definition Angiogenese Angiogene Wachstumsfaktoren Morphologie der Endothelzellen im Lichtmikroskop Funktion der Endothelzellen Angiogenese als Prozeß der Proliferation Tissue Engineering Ziele MATERIAL UND METHODEN Zellkultur Zusammensetzung des Kulturmediums Beschichtung der Kulturflaschen Herkunft der Nabelschnüre Isolierung einer HUVEC-Endothelzellkultur Kultivierung von HUVEC Austestung von Matrix-Materialien auf Stabilität Hämatoxilin Eosin Färbung Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31 Antikörper Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittel CD 105 (Endoglin)-Antikörper Etablierung von 3D tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices Proliferationsmessungen von HUVEC mit rekombinanten bfgf, VEGF und EGF Auszählen von HUVEC HUVEC Proliferationsmessungen mit Thymidineinbau/ DNA-Synthese 27

4 Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Escort Transfektionsreagenz Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Fugene 6 Transfektionsreagenz ELISA-hVEGF-Immunoassay Trennkammersystem Gentechnische Methoden Puffer Plasmide Herstellung kompetenter E. coli Zellen Transformation von Plasmid DNA in E. coli Isolierung von DNA aus E. coli Phenol-Chloroform Extraktion, DNA-Mengenbestimmung DNA-Verdauung mit Restriktionsendonukleasen Agarosegelelektrophorese Ligation von DNA-Fragmenten ERGEBNISSE Präparationen HUVEC Zellkultur Färbung mit Hämalaun und Eosin Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31-Antikörper Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittels CD 105 Antikörper Austestung von Matrix-Materialien auf Stabilität Etablierung von dreidimensionalen tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices Proliferationsuntersuchung von HUVEC mit rekombinanten bfgf, VEGF und EGF in Monolayer-Kultur Proliferationsuntersuchung von HUVEC mit rekombinanten bfgf, VEGF und EGF in 3D Zellkutur in Kollagenmatrices 43

5 Liposomale Transfektion von HUVEC mit zwei hvegf-165-vektoren und Escort - und Fugene 6 -Transfektionsreagenzien Untersuchung des proliferativen Effektes der transfizierten HUVEC auf die nicht-transfizierte HUVEC im Trennkammersystem Implantation von transfizierten HUVEC in eine Kollagenmatrix und Untersuchung des proliferativen Effektes in 3D Zellkultur Implantation von transfizierten HUVEC ins Matrigel und Analyse der Bildung von kapillarähnlichen Strukturen in einer 3D HUVEC-Kulturin vitro DISKUSSION In vitro Model Präparation Kulturmedium Art des Serums Serum-Anteil Beschichtung der Kulturflaschen D-Endothelzellkultur Wachstumsfaktoren Transfektion von humanen Endothelzellen D-Kapillarkonstrukt Zusammenfassung DANKSAGUNG LITERATURVERZEICHNIS 66

6 -6- Glossar verwendeter Abkürzungen aqua deion. aqua dest. bfgf BSA Da DMEM DNA ECBM ECGM EGF ELISA et al. EtOH FBC FCS HE HSA HUVEC kda M mm MVEC PBS PDGF ph Pi PCR RT-PCR RNA aqua deionisata; deionisiertes Wasser aqua destillata; destilliertes Wasser basic Fibroblast Growth Factor Bovine Serum Albumin; Rinder-Serum-Albumin Dalton Dulbecco s Modified Eagle Medium Deoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure Endothelial Cell Basal Medium (ECBM) Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) Epidermal Growth Factor Enzyme Linked Immunosorbent Assay et alteri, und andere (Mitarbeiter) Äthanol Fetal Bovine Serum, fötales Rinderserum Fetal Calf Serum, fötales Kälberserum Hämatoxilin-Eosin Humanes Serumalbumin Human Umbilical Vein Endothelial Cells; menschliche Nabelschnur-Venen-Endothelzellen Kilo Dalton molar; Mol pro Liter millimolar Microvascular Endothelial Cells; mikrovaskuläre Endothelzellen Phosphate Buffered Saline Platelet Derived Growth Factor ph-wert, pondus hydrogenii; negativer dekadischer Logarithmus Alkali-Gehalt einer Lösung Propidium Iodid Polymerase Chain Reaction; Polymerase-Kettenreaktion Reversed Transcriptase-Polymerase Chain Reaction Ribonuclein Acid; Ribonuklein-Säure

7 -7- TAE TGF-β Upm VEGF Puffer (0,04 m Tris-Acetat, 0,001 m EDTA) Transforming Growth Factor β Umdrehungen pro Minute Vascular Endothelial Growth Factor

8 -8-1. EINLEITUNG 1.1 Historischer Überblick Mit dem Fortschritt in der Mikroskopie Mitte des 19. Jahrhunderts wurde eine Analyse der Gefäße und Kapillare ermöglicht. So ist neben der Prägung des Begriffes Endothel durch His (1805) die Beschreibung der Perizyten durch Rouget (1878) zu erwähnen. Der Begriff der Neovaskularisation oder Angiogenese wurde erstmals 1935 von Arthur Tremain Hertig erwähnt, der die Formation neuer Blutgefäße in der Plazenta beschrieb (Hertig et al., 1935). Das Phänomen der Angiogenese war Ärzten und Wissenschaftlern bereits aus Vorgängen wie Entzündung, Trauma und Tumor bekannt, doch fehlten Erkenntnisse über die Bedeutung dieses Vorganges. Allerdings ermutigte schon im 19. Jahrhundert Johannes Müller ( ), einer der Begründer der modernen Physiologie, seine Schüler, sich mit diesem Phänomen unter normalen und pathologischen Bedingungen zu beschäftigen. Es dauerte aber bis zu den 70er Jahren unseres Jahrhunderts, bis man begann, die Frage nach dem warum von Angiogenese zu untersuchen. Wesentliche Untersuchungen dazu sind mit dem Namen Judah Folkman verbunden, der einen Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Angiogenese herstellte und versuchte therapeutische Ansätze daraus zu ziehen (Folkman et al., 1971). Ein möglicher Einfluß von Wachstumsfaktoren, die vom Tumor gebildet werden, auf die Angiogenese, wurde 1939 von A.G. Ide diskutiert (Ide et al., 1939). 1.2 Definition Angiogenese Für das Verständnis der Bildung von Blutgefäßen sind zwei Begriffe von Bedeutung: Vaskulogenese und Angiogenese. Die de novo Organisation von Endothelzellen in Gefäßen in Abwesenheit eines bereits präexistenten Gefäßsystems wird als Vaskulogenese bezeichnet. Dieser Vorgang findet nur im Embryo statt. Dabei entwickelt sich ein primitiver Gefäßplexus aus dem Mesoderm mittels Differenzierung von Angioblasten (Cines et al., 1998; Risau, 1997).

9 -9- Im Gegensatz dazu beschreibt der Begriff Angiogenese die kontinuierliche Entwicklung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Gefäßen (Folkman et al.,1980). Dieser Vorgang ist im Embryo in noch avaskulären Regionen zu beobachten, findet sich aber vor allem im erwachsenen Organismus in physiologischen Situationen (Cines et al., 1998). Nach Bildung eines primitiven Gefäßplexus stehen mehr Endothelzellen zur Verfügung, die neue Kapillaren formen können. Zunächst erfolgt eine proteolytische Degradierung der Extrazellulärmatrix, gefolgt von einer chemotaktischen Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Formation eines Lumens und der funktionellen Reifung des Endothels (Risau, 1997). 1.3 Angiogene Wachstumsfaktoren Angiogenese wird durch ein Vielzahl von Faktoren gesteuert. Wesentlichen Einfluß nehmen angiogene Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle 1.1), die gezielt die Endothelzell-Proliferation, -Migration und -Differenzierung beeinflussen. Fast alle bekannten angiogenen Faktoren beeinflussen einen oder mehrere Schritte der Angiogenese in vitro. Es bleibt allerdings unklar, welcher dieser Faktoren welchen Vorgang in vivo beeinflußt. Tabelle 1.1 listet die wichtigsten und stärksten angiogenen Wachstumsfaktoren auf, die bis heute bekannt sind. Außerdem kann eine Reihe anderer Wachstumsfaktoren und Zytokine die Funktion der Endothelzellen beeinflussen. Diese spielen aber eine untergeordnete Rolle in der Angiogenese. 1.4 Morphologie der Endothelzellen im Lichtmikroskop Humane Endothelzellen werden seit fast 30 Jahren erfolgreich in vitro kultiviert. Die ersten Isolationsversuche und auch die erste Publikation über Kultivierung von HUVEC wurden von E.A. Jaffe im Jahre 1972 präsentiert (Jaffe et al., 1972). Jaffe beobachtete nicht nur das Verhalten von Endothelzellen in vitro, sondern beschrieb auch ausführlich deren Morphologie (Jaffe et al., 1973). Endothelzellen sind mesodermale polare Zellen, die einen engen Zell-Zell-Kontakt suchen.

10 -10- Faktor Ursprung Ziel Funktion bfgf (II) glatte Muskelzellen Endothelzellen Proliferation, Kollagenase- Synthese Endothelzellen Fibroblasten Proliferation Glatte Muskelzellen Proliferation Perizyten Aktivierung, Chemotaxis afgf Endothelzellen Endothelzellen Proliferation, Kollagenase- Synthese glatte Muskelzellen Fibroblasten Proliferation glatte Muskelzellen Proliferation VEGF Endothelzellen Endothelzellen Proliferation, Gefäß- Hyperpermeabilität glatte Muskelzellen Makrophagen TGF-β Makrophagen Endothelzellen Synthese von Extrazellulärmatrix Ruhephase Thrombozyten glatte Muskelzellen VEGF und bfgf-produktion Fibroblasten Chemotaxis Makrophagen Chemotaxis Monozyten Chemotaxis PDGF Endothelzellen Endothelzellen Proliferation glatte Muskelzellen glatte Muskelzellen Migration, Proliferation Thrombozyten Perizyten Chemotaxis, Aktivierung Angiopoietin 1 unbekannt Endothelzellen Gefäßreifung Angiopoietin 2 unbekannt Endothelzellen Gefäß-Hyperpermeabilität Tabelle 1.1: Angiogene Wachstumsfaktoren

11 -11- Sie kleiden als einschichtige Zellage (Monolayer) die Gefäßwände der Arterien, Venen und Kapillaren aus, sorgen für einen möglichst reibungsarmen Blutfluß und vermitteln einen Stoffaustausch zwischen dem Gefäßlumen und dem umgebenden Gewebe. Es gibt unterschiedliche Populationen von Endothelzellen, die sich vor allem histochemisch durch eine unterschiedliche Enzymausstattung (v.a. Phosphatasen) Abbildung 1.2: Fotografische Abbildung der Endothelzellen 4 Tage nach Aussaat. Endothelzellen proliferieren und suchen Kontakt um eine Monolayer-Kultur zu bilden Abbildung 1.3: Fotografische Abbildung der Endothelzellen 7 Tage nach Aussaat. Die Zellen bilden einen dichten Monolayer mit pflastersteinartigem Aussehen.

12 -12- unterscheiden. Die Dicke der Zellschicht beträgt 0,1-1 µm. In vitro bilden sie auf beschichteten Gewebekulturplatten nach wenigen Tagen dichte Monolayer von pflastersteinartigem Aussehen (siehe Abbildung 1.2 und Abbildung 1.3). 1.5 Funktion der Endothelzellen Die Endothelzellen sind maßgeblich an der Hämostase (Blutgerinnung) sowie der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Sie besitzen ebenfalls eine große Bedeutung bei Entzündungsprozessen, die durch das Zusammenwirken von im Blutstrom zirkulierenden Zellen mit Rezeptoren auf der Zelloberfläche der luminalen Seite der polaren Endothelzellen beeinflußt werden (Vickart et al., 1993). In erster Linie erfüllen sie aber eine Barrierenfunktion, indem sie als semipermeable Schranke zwischen dem Gefäßlumen und dem Gewebe liegen. Zum Bereich ihrer Syntheseleistung sind die Glykoproteine wie Kollagen, Laminin, Fibronectin und von- Willebrand-Faktor zu erwähnen. Die Funktion der Rezeptoren ist erst seit kurzem beschrieben worden. Sie deutet darauf hin, daß entweder die Art der Wirkung humoraler Mediatoren beeinflußt werden kann, oder aber das Endothel generell für das Wirksamwerden vasoaktiver Substanzen erforderlich ist. Die Fähigkeit dieser Zellen zur Migration spielt eine große Rolle bei der Endothelialisierung von Gefäßprothesen sowie der Vaskularisation von Transplantaten und Tumoren. Beeindruckend ist aber auch die Berechnung, daß das Endothel eines Erwachsenen die Oberfläche von ca. 720 m 2 besitzt und insgesamt zwischen 1,5 und 2 kg wiegen dürfte (Hammersen et al., 1985). 1.6 Angiogenese als Prozeß der Proliferation Die Gefäßneubildung (Angiogenese) stellt ein Beispiel koordinierter Zellvermehrung dar (siehe Abbildung 1.4). Sie spielt eine bedeutende Rolle bei biologisch wichtigen Prozessen wie Wundheilung, Tumorwachstum, und Embryonalentwicklung. Sie tritt physiologisch während der Follikelreifung und der nachfolgenden Bildung des corpus luteum auf (Frederick et al., 1985). Im gesamten Endothelsystem, auch in dem des Erwachsenen behalten die Endothelzellen die Fähigkeit zu proliferieren und zu migrieren. So können sie nicht

13 -13- nur ausgefallene Zellen ersetzen, sondern auch das Innere von Gefäßprothesen auskleiden. In vivo ist der physiologische Umsatz der Endothelzellen langsam: nur eine von hundert Zellen wird pro Tag ersetzt (Voet, 1992). Bei der Ausbildung von neuen Blutgefäßen sind die Endothelzellen maßgeblich beteiligt. Neue Gefäße entstehen als Kapillaren, die von bereits bestehenden kleinen Gefäßen seitlich aussprießen, indem sie Pseudopodien ausstrecken. Die Zellen bilden als erstes einen massiven Sproß, der sich dann zu einer Röhre aushöhlt. Dieser Prozeß setzt sich fort, bis der Sproß auf eine andere Kapillare trifft, mit der er sich verbindet, um Blutzirkulation zu ermöglichen. In vitro ist das erste Anzeichen für eine Röhrenbildung das Auftreten einer Zelle mit verlängerter Vakuole, die anfangs noch völlig von Zytoplasma umschlossen wird. Benachbarte Zellen bilden ähnliche Vakuolen. Schließlich reihen die Zellen ihre Vakuolen distal aneinander und verschmelzen diese, so daß sie von Zelle zu Zelle durchgehen und einen Kapillarkanal bilden (Voet, 1992). Die Kapillare wächst durch Migration, Teilung und Lumenbildung der Endothelzellen. Abbildung 1.4: Schema Vaskulogenese und Angiogenese. 1.7 Tissue Engineering Durch vereinfachte in vitro Kulturtechniken für Zellen verschiedenster Gewebe und die Anwendung molekularbiologischer Techniken, ist es möglich geworden, in vitro

14 -14- hergestellte Zellkonstrukte zum Ersatz fehlender Gewebe oder zur Unterstützung von deren Funktion zu verwenden. Dieses Verfahren wird als Tissue Engineering bezeichnet und ist in der plastischen Chirurgie von zunehmender Bedeutung. Tissue Engineering vereinigt Prinzipien aus technischen und Ingenieursdisziplinen mit medizinischen, chemischen und molekularbiologischen Erkenntnissen mit dem Ziel biologische Ersatzmaterialien zu entwickeln, die zu einer Wiederherstellung, dem Erhalt oder der Verbesserung von Gewebefunktion führen (Langer et al., 1993). Der Ausfall oder der Verlust von Gewebe- und Organfunktionen betrifft eine große Anzahl von Patienten. Die Behandlung umfaßt Transplantationen, rekonstruktive Verfahren und die Nutzung apparativer Techniken, wie zum Beispiel Dialyse. Die Kosten dieser Verfahren sind enorm und Ergebnisse oft suboptimal. Obwohl mit diesen Verfahren viele Patienten erfolgreich therapiert werden konnten, sind sie dennoch in der Anwendung und dem Erfolg begrenzt. Grundsätzlich könnten Zellen, die eine fehlende oder defekte Organfunktion ersetzen, substituiert werden. Desweiteren konnte mittels spezifischer Proteine, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren, der Körper angeregt werden, defekte oder insuffiziente Organfunktion zu regenerieren. Durch Gentechnologie können auch gezielt für Wachstumsfaktoren kodierende Gene in kultivierten Zellen angewandt werden (Tanczos et al., 1999; Kopp et al., 1998; Andree et al., 1994) Die Dritte Säule ist die in vitro Fertigung oder Präfabrikation von Konstrukten, in denen die benötigten Zelltypen in einer Matrix ein dreidimensionales Gebilde formen. Diese Entwicklung hat in der letzten Dekade große Fortschritten gemacht, sodaß heute an nahezu allen Gewebearten Versuche zum Ersatz mittels Tissue Engineering durchgeführt werden. Gerade in der Plastischen Chirurgie gibt es viele Anwendungsmöglichkeiten des Gewebeersatzes, des Ausgleiches von Konturdeformitäten und der Wiederherstellung von Organfunktion durch Tissue Engineering. Bei der Behandlung chronischer Wunden ist die Anwendung von composite grafts, bestehend aus verschiedenen Zelltypen in einer gemeinsamen Trägermatrix zur Verbesserung der Wundheilung von Interesse. Ein funktionierendes Kapillarnetz ist für ein solches Konstrukt die wichtigste Voraussetzung. Zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten finden sich im Bereich der Lappenchirurgie, wo bei grenzwertig vaskularisierten transponierten Gewebelappen ein Kapillarkonstrukt zur Verbesserung der Angiogenese implantiert werden könnte (Stark et al., 1987; Walgenbach et al., 1995 und 1998; Jaeger et al., 1983).

15 -15- Im Bereich des Tissue Engineering ist bei einer Vielzahl dreidimensionaler Zellkonstrukte die Vaskularisation bislang ungeklärt. Ein allgemeines experimentelles in vitro Modell für die Angiogeneseforschung im Rahmen des Tissue Engineering existiert noch nicht. Auch hierbei ergeben sich Einsatzmöglichkeiten eines solchen Konstruktes. Verschiedene Ansätze werden zur Zeit untersucht, um ein dreidimensionales Endothelzellwachstum zu ermöglichen. Mehrere Voraussetzungen sind dazu notwendig. Das Konstrukt wird sich aus Zellen und einer Extrazellulärmatrix zusammensetzen. Zell-Proliferation und -Migration, Zell-Zell- und Zell- Extrazellulärmatrix-Interaktionen werden über Zytokine gesteuert (Noishiki et al., 1995). Das dreidimensionale Gerüst, die artifizielle Extrazellulärmatrix, besteht dabei aus Kollagen in Gel- oder Netzform oder Polyglykolsäure-Netzen (Mooney et al., 1996). Diese Konstrukte werden dann teils in Monokultur, teils in Ko-Kultur mit verschiedenen Zelltypen besiedelt (Zund et al., 1998; Shinoka et al., 1998). Gelingt es die Trägersubstanzen in eine tubuläre Form zu bringen, kann das Lumen mit Endothelzellen besiedelt werden - die Vorstufe zu einem in vitro geschaffenen Gefäß. Solche Konstrukte wurden bereits nach nur 7 Tagen Inkubation als ca. 2 cm langes Segment in die Pulmonalarterie eines Schafes implantiert (Shinoka et al.,1998). Vor allem im Rahmen der Tumorangiogeneseforschung wurden Studien zur Untersuchung des Verhaltens von Endothelzellen in Kollagengelen oder -netzen durchgeführt. Kultiviert man ein Aortenstückchen in einem Kollagen Typ I - Gel, so kommt es zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen, die ähnlich der Kapillaren in vivo aufgebaut sind und deren Endothelzellen einen hohen Grad an Differenzierung aufweisen (Akita et al., 1997). Allerdings konnte auch gezeigt werden, daß bei Endothelzellkultivierung in einem Kollagengitter zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen eine Stimulation mit angiogenen Wachstumsfaktoren notwendig ist, um eine andernfalls erhöhte Apoptosisrate zu vermeiden (Satake et al., 1998). Verschiedene Kollagengele sind in der Literatur beschrieben und etabliert. Dazu zählen Kollagen Typ I und Typ I/IV - Gele sowie mit angiogenen und Extrazellulärmatrix - Substanzen versetzte Gele (Matrigel ). Im Bereich der dreidimensionalen Kapillarkonstrukte sind allerdings bislang kaum Ansätze zu einer therapeutischen Nutzung beschrieben.

16 Ziele Im Rahmen des Tissue Engineering wird an der in vitro Konstruktion von Gewebesubstituten (composite grafts) gearbeitet. Zentraler Bestandteil vitaler Organe ist ein gut entwickeltes und durchblutetes Gefäßnetz. Von der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration des arteriell-venösen Gefäßnetzes hängt die Funktion eines jeden Organs und des Organismus insgesamt ab. Es ist kein Zufall, daß die beiden bisher erfolgreich klinisch eingesetzten Tissue Engineering Produkte (Epidermis und Knorpel) per diffusionem ernährt werden und somit nutritiv privilegiert sind. Daher spielt die Angiogenese eine wichtige Rolle in der Wundheilung und Geweberegeneration. Ziel dieser Arbeit war die Schaffung eines stabilen Kapillarnetzes aus kultivierten Endothelzellen zur Vaskularisation dreidimensionaler, in vitro kultivierter Konstrukte. Als Matrices wurden ein Kollagenschwamm (TissuVlies ) und im Vergleich dazu Kollagengel (Matrigel ) verwendet. Folgende Punkte standen dabei im Mittelpunkt des Interesses: Etablierung einer zwei- und dreidimensionalen Endothelzellkultur im eigenen Labor Austestung und Vergleich von zwei extrazellulären Kollagenmatices: TissuVlies - Kollagenschwamm und Matrigel -Kollagengel auf mechanische Stabilität und Eignung als Endothelzell-Gerüst In vitro Kultivierung und Implantation von humanen Umbilikalvenen- Endothelzellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) in dreidimensionalen Kollagenmatrices Proliferationassays von HUVEC in Monolayer- und dreidimensionaler Kultur stimuliert mit rekombinantem bfgf, VEGF und EGF. Untersuchung und Analyse des Endothelzell-Wachstums und der Ausbildung von tube-like structures im TissuVlies und Matrigel

17 -17- Zwei- und dreidimensionale liposomale transiente Transfektion von HUVEC mit zwei konstruierten hvegf-165-plasmiden und Untersuchung des proliferativen Effektes der transfizierten Zellen auf die nicht-transfizierte Zellen im Trennkammersystem und in einer dreidimensionalen Zellkultur

18 MATERIAL UND METHODEN 2.1. ZELLKULTUR Die Isolation und Kultivierung von humanen Endothelzellen wurde im Tissue Engineering Labor der Abteilung für Plastische und Handchirurgie vorgenommen. Alle Arbeiten, die Keimfreiheit verlangten, wurden in einer Laminar-Luftstrom- Werkbank durchgeführt. Sämtliche Inkubationen wurden, soweit nicht ausdrücklich davon abweichend beschrieben, im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 durchgeführt. Statt aqua dest fand Wasser Verwendung, das vor seiner Verwendung mittels einer Millipore-Anlage deionisiert worden war (aqua deion) Zusammensetzung des Kulturmediums Endothelial Cell Growth Medium (Promocell, Heidelberg, Deutschland) Endothelial Cell Basal Medium (Promocell, Heidelberg, Deutschland) 1% Fungizone (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) 5% Fetal Bovine Serum (GibcoBRL, Karlsruhe, Deutschland) 1% Penicillin/ Streptomycin Oben beschriebene kommerzielle Endothelzell-Medien wurden modifiziert und für jedes Versuchsvorhaben speziell angesetzt. Das zuzusetzende FCS war für 30 min auf 55 C erhitzt worden, um das Komplementsystem zu inaktivieren. Im Anschluß daran wurde es zu je 40 ml aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 C gelagert Beschichtung der Kulturflaschen Gelatine (DIFCO, USA) Phosphat Buffered Saline (PBS, Biochrom, Berlin, Deutschland) Zur Beschichtung wurde eine sterile 1,5%-Gelatine-Lösung (bovine Gelatine in aqua dest) zubereitet und in Kulturflaschen oder Kulturplatten abgefüllt. Es wurden ca. 6 ml

19 -19- Lösung für eine 75 cm 2 Kulturflasche und 1 ml Lösung pro Well für eine 6-Well-Platte benötigt. Danach erfolgte eine 20 min. Inkubation in einem Brutschrank bei 37 C. Anschließend wurde die so hergestellte Gelatine-Beschichtung der Kulturflaschen oder Platten mit PBS-Waschpuffer (w/w Ca 2+ / Mg 2+ ) gewaschen. Die Gelatine-Beschichtung ist für optimale Zelladhäsion und stabile Haftung der HUVEC auf den Kulturflaschenböden notwendig. Gelatine stellt im Vergleich zu Fibronektin und humanem Kollagen eine leicht anwendbare und preiswerte extrazelluläre Kollagenmatrix dar, die für Endothelzellwachstum essentiell ist Herkunft der Nabelschnüre Die verwendeten Nabelschnüre wurden von der gynäkologischen Abteilung des St. Josef Krankenhauses Freiburg (Chefarzt: PD Dr. Schmitt) zur Verfügung gestellt. Sie wurden in sterilen 100 ml-kunstoff-gefäße (Mehrzweckbecher) aufbewahrt und bis zur Präparation bei +4 C gelagert. Eine Präparation der Nabelschnur und Isolation der HUVEC fand nicht statt, wenn der Geburtstermin länger als 24 Stunden zurücklag Isolierung einer HUVEC Endothelzellkultur 75 cm² Kulturflaschen (COSTAR, Bodenheim, Deutschland) Phosphat Buffered Saline (Biochrom, Berlin, Deutschland) Dispase II (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Die Präparationsvorschrift geht in ihrer 1972 beschriebenen Form auf Jaffe et al. zurück. Im Verlauf wurden aber zusätzliche Modifikationen vorgenommen (siehe auch Jaffe et al., 1973). Sämtliche verwendeten Instrumente und Flüssigkeiten lagen steril vor. Während der Präparation in der Sicherheitswerkbank wurden mit Äthanol desinfizierte Latex-Handschuhe getragen. Die Nabelschnüre wurden mit Kompressen gereinigt. In beide Enden der Nabelschnurvene wurden Dreiwegehähne mit Schläuchen (Discofix-3 mit Luer- Lock) eingeführt und mit Kabelbändern befestigt. Mit einer 20 ml Infusionsspritze wurden die Nabelvenen mit PBS solange gespült, bis das Blut komplett entfernt war. Danach wurden die Nabelvenen mit Dispase II aufgefüllt, die Hähne der Schläuche

20 -20- verschlossen, die Nabelschnüre in Alufolie verpackt und im Brutschrank 40 min inkubiert. A B C D Abbildung 2.1: Fotografische Darstellung zwei humaner Nabelschnüre zur HUVEC Isolation (A) und zwei Schläuche, die an beiden Enden der vena umblicalis befestigt sind (B). Auf der Abbildung (C) ist ein Dispase-Injektionssystem für die schonende Isolation von Endothelzellen dargestellt. Nach der 40- minutigen Inkubation im Brutschrank wird die Dispase II mit abgelösten HUVEC aus der Nabelschnurvene evakuirt (D). Danach wurde Dispase in 50 ml Falcon-Röhrchen abgefüllt und Nabelvenen mit PBS gründlich durchgespült. Die gewonnene Suspension wurde zentrifugiert (10 min bei 1200 Upm, +4 C). Das so gewonnene Sediment wurde entnommen und im ECGM resuspendiert. Die zubereitete Zellsuspension wurde in die vorbereiteten 75 cm² Kulturflaschen in 12 ml ECGM verteilt und im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 inkubiert. Mediumwechsel erfolgten jeden 2 Tag.

21 Kultivierung von HUVEC Trypsin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Trypan Blue (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Bei 70-90% Konfluenz der Zellen wurde die Passage durchgeführt. Das Medium wurde aus den Kulturflaschen angesaugt und die Kultur einmal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden der Zellkultur 2 ml auf 37 C aufgewärmtes Trypsin zugesetzt. Nachdem sich die Zellen abzurunden begannen, wurde das Trypsin abgesaugt. Intermittierendes Abklopfen, sogenannter "shake-off", sorgte für das Ablösen der Zellen vom beschichteten Flaschenboden, mit ECGM wurden die Zellen abgespült und zentrifugiert (10 min bei 1200 Upm). Das Sediment wurde in 2 ml ECGM resuspendiert und in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Dazu wurden 50 µl der Zellsuspension mit 50 µl 0,4% Trypanblau gut gemischt. Die Zellzahl pro ml wurde nach der Formel: Anzahl der Zellen in 4 Quadraten der Neubauer-Zählkammer x 2,5 x 2 x 1000 berechnet. Anschließend wurden die Zellen ( Zellen pro cm² ausrechnen) in Kulturflaschen ausgesät und im Brutschrank gelagert Austestung von Matrix-Materialen auf Stabilität Zwei verschiedene Kollagenmatrices wurden zur Etablierung einer dreidimensionalen Endothelzellkultur verwendet. Als erstes wurden beide Matrices auf die Stabilität getestet. TissuVlies (Baxter-Immuno, Heidelberg, Deutschland) besteht aus nativem bovinem Kollagen I. TissuVlies enthält pro cm³ 5,6 mg Kollagen. Es wird zur Blutstillung in der Chirurgie angewendet. Außerdem ist TissuVlies als Träger-Matrix von verschiedenen Zelltypen verwendet worden. Matrigel besteht aus einem Basalmembranen-Extrakt der Engelbreth-Holm-Swarm- Tumorzellen (EHS) und verwandelt sich in ein Gel bei Raumtemperatur. Die wichtigsten Bestandteile des Matrigels sind Laminin, Kollagen Typ IV, Entaktin und Heparan-Sulfat-Proteoglykan. Matrigel wird als spezielles Kulturmaterial für Endothelzellkulturen kommerziell angeboten und enthält außerdem vom Hersteller nicht publizierte Komponenten.

22 -22- Es wurde ein wachstumsfaktorenreduziertes Matrigel benutzt, damit die Auswirkungen von bfgf und VEGF auf die HUVEC in einer dreidimensionalen Matrix untersucht werden können (Gehalt von bfgf im wachstumsfaktorenreduziertem Matrigel : 0-0,1 pg/ml; VEGF ist nicht vorhanden). TissuVlies wurde in gleiche Stücke geschnitten, sodaß der Well-Boden komplett bedeckt war und auf dem Boden der Wells einer 24-Well-Platte mit Gelatine-Gel fixiert. Nicht verdünntes Matrigel (ca. 500 µl) wurde in jedes Well der 24-Well-Platte gegeben. Nach 10 min Inkubation bei 37 C verwandelte sich die Lösung in ein Gel. Anschließend wurden die Wells mit den Proben mit ECGM aufgefüllt und im Brutschrank für 21 Tage inkubiert. Im Laufe des Versuches wurden die getesteten Matrizen jeden zweiten Tag aus den Wells entnommen und visuell mit Hilfe eines Lichtmikroskopes auf strukturelle Veränderungen untersucht. Nach der Inkubation wurden die Proben aus den Wells endgültig entnommen und histologisch aufgearbeitet Hämatoxilin-Eosin Färbung Die Hämatoxilin-Eosin-Färbemethode läßt die den blauen Farbstoff Hämatoxilin (oder Hämalaun, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) aufnehmenden Zellkerne deutlich gegen das mit Eosin rötlich gegengefärbte Zytoplasma hervortreten. Die Färbung wurde in Glasküvetten nach folgendem Protokoll vorgenommen: - Aqua deion.; 3-maliges Spülen - Hämalaun Mayer 1%-Lösung; Färben für 7 min - Leitungswasser, fließend; Spülen für 15 min - Eosin; Gegenfärben für 1 min - C 2 H 5 OH 70% ; Fixieren für 30 sec - C 2 H 5 OH 80% ; Fixieren für 30 sec - C 2 H 5 OH 95% ; Fixieren für zweimal 2 min - C 2 H 5 OH abs. ; Fixieren für zweimal 2 min - Xylol; Fixieren für zweimal 5-10 min

23 -23- Danach folgte das Eindecken mit Glycergel (DAKO, Dänemark) und SuperFrost- Deckgläsern Immunohistochemischer Nachweis von humanen Endothelzellen mittels CD 31-Antikörper Peroxidase Blocking Reagent (DAKO, Hamburg, Deutschland) Ziegen-Serum (DAKO, Hamburg, Deutschland, Goat Serum,Normal) CD 31-Antikörper (DAKO, Hamburg, Deutschland) EnVision+ (DAKO, Hamburg, Deutschland, Goat-Anti-Mouse) DAB (DAKO, Hamburg, Deutschland, Liquid DAB+ Chromogen System) AEC (DAKO, Hamburg, Deutschland, AEC+ Chromogen System) Glycergel (DAKO, Hamburg, Deutschland) Die CD 31-Antikörper werden durch eine starke Reaktion mit formalin-resistenten Epitopen auf der Endothelzell-Oberfläche in normalen und malignen Gewebetypen charakterisiert. Dieses Antikörper wurde offiziell als ein spezifischer humaner Endothelzellmarker auf dem Fifth International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens in Boston (1993) anerkannt. Die Färbungen wurden an Paraffin- und Kryoschnitten vorgenommen. Um die Paraffinschnitte zu fixieren, wurden diese mit einer 4% Formalin-Lösung über 24 Stunden bei +4 C behandelt. Danach wurden diese automatisiert (HistoKinnete, Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) über 14 Stunden bearbeitet und anschließend im Paraffin eingebettet und geschnitten. Danach wurden die Schnitte mit einer Methanol-Äthanol-Reihe entparaffiniert. Bei Verwendung von kryopräservierten Präparaten wurden 3-5 µm dicke Schnitte von einem schockgefrorenen Gewebeblock mit dem Kryotom (Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) angefertigt. Um das Gefriermedium zu lösen, wurden die Objektträger für 10 min in Azeton eingelegt. Der weitere Färbungsvorgang wurde für beide Fixierungsarten gleich durchgeführt. Die Histologien wurden einmal mit PBS gewaschen und mit Peroxidase Blocking Reagent 10 min inkubiert. Nach jedem Vorgang wurden die Objektträger sorgfältig abgetupft, um die Vermischung verschiedener Färbungskomponente zu vermeiden. Anschließend wurden die Schnitte mit PBS zwei mal gewaschen und mit 10% Ziegen-Serum-Lösung (in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach

24 -24- diesem Vorgang wurden die Proben nicht mit PBS gewaschen sondern gleich mit Erst-Antikörper-Lösung (CD 31) für 30 min inkubiert. Zubereitung der CD 31-Erst- Antikörper-Lösung: 900 µl (1% BSA-Lösung in PBS) µl (CD 31-Antikörper) = 1000µl (CD 31-Erst-Antikörper-Lösung, pro Schnitt ungefähr 100 µl). Alternativ kann das Präparat mit der Erst-Antikörper Lösung über die Nacht bei +4 C im Kühlschrank inkubiert werden. Es wurde eine "Negativ"- und "Positiv"-Kontrolle angelegt. Als "Positiv"-Kontrolle wurde ein Schnitt normaler humanen Haut verwendet und als "Negativ"-Kontrolle diente ein beliebiger Schnitt aus der Reihe, die zur Färbung vorbereitet wurde. Die beiden Kontrollen wurden einem normalen Färbungsvorgang unterworfen, nur die "Negativ"-Kontrolle wurde anstatt CD31-Lösung mit der BSA-Lösung bearbeitet. Die beiden Kontrollen dienten zur Bestätigung der Färbungsergebnissen und deren Effizienz. Nach der Inkubation mit CD 31-Antikörper wurden die Proben dreimal mit PBS gewaschen und gründlich abgetupft. Danach wurden die Schnitte mit einer Zweitantikörper-Lösung (+EnVision, DAKO) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3 mal mit PBS gewaschen. Zur Färbung der markierten Zellen wurde eine DAB- oder AEC-Chromogen-Lösung vorbereitet. Die Chromogene sind sehr lichtempfindlich und sollten deshalb in einer Dunkelkammer auf die Schnitte aufgegeben und durchschnittlich für 5 min inkubiert werden. Anschließend wurden die Histologien einmal mit aqua destillata gewaschen und mit Hämalaun (Hintergrundfärbung, ca. 3 min Inkubation) gefärbt. Die Schnitte sollten nicht austrocknen, bevor sie mit Glycergel eingedeckelt wurden Immunohistochemischer Nachweis von proliferierenden humanen Endothelzellen mittels CD 105 (Endoglin) Antikörper CD 105-Antikörper, Endoglin (DAKO, Hamburg, Deutschland) Die Färbung erfolgte nach einem identischen Färbeprotokoll wie im Kapitel CD 105-Antikörper beziehungsweise Endoglin markieren spezifisch nur die proliferierenden humane Endothelzellen im Gewebe (Cheitetz et al., 1992; Bellon et al., 1993).

25 -25- Endoglin ist ein transmembranes Type I Protein, das sehr stark von humanen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird. Steigerung der Endoglinexpression wurde in Tumorgefäßnetzen und proliferierenden Zellen nachgewiesen (Burrows et al., 1995; Matsuzaki et al., 1987) Etablierung von 3D tubulären Strukturen in extrazellulären Matrices TissuVlies (Baxter-Immuno, Heidelberg, Deutschland) Matrigel (Becton- Dickinson, Heidelberg, Deutschland) 0,4 µm Membraneneinsätze für 24-Well-Platten (Falcon, Heidelberg, Deutschland) 24-Well-Platten (Falcon, Heidelberg, Deutschland) Für die Implantation der HUVEC in TissuVlies wurden 24-Well-Platten verwendet. TissuVlies wurde in gleiche Stücke steril so geschnitten, daß der Boden von 0,4 µm Membraneneinsätzen (siehe Abbildung 2.3) komplett bedeckt war. Die Oberfläche von TissuVlies wurde mit einer Kanüle mehrmals perforiert, damit sich die Zellen gleichmäßig im Schwamminneren verteilen konnten. Die HUVEC-Zellen wurden abtrypsiniert und abgezählt. Es wurden , , , , Zellen (in Triplex-System: 3 Proben/ Ansatz) auf die perforierte Oberfläche der TissuVlies -Stücke in 200 µl ECGM ausplattiert und für 15 min im Brutschrank bei 37 C inkubiert damit die Zellen von dem Kollagen-Schwamm aufgesaugt werden können. In ein Well wurden zur Kontrolle keine Zellen gegeben. Nach dieser Inkubation wurden in jedes Well 600 µl von ECGM gegeben. Die Proben dieses Konstruktes wurden am Tag 1, 2, 5, 7 und 14 entnommen, geschnitten und gefärbt. Zur Implantation von HUVEC in Matrigel wurden 24-Well-Platten verwendet. Zunächst wurden in jeden Membraneneinsatz 200 µl von nicht verdünntem Matrigel gegeben und im Brutschrank bei 37 C 10 min inkubiert. Die Zellen wurden vorbereitet und nachdem das Gel verfestigt war auf die Oberfläche Matrigel in 200 µl ECGM ausplattiert. Danach wurden die Platten 1 Stunde im Brutschrank inkubiert. Nach der Inkubation wurden in jeden Einsatz noch 200 µl Matrigel gegeben (sogenanntes "Sandwich"-Modell). Die Bildung von tubulären Strukturen wurde mit der Hilfe der Lichtmikroskopie verfolgt. Die Proben wurden am Tag 1, 2, 5, 7 und 14 entnommen, fixiert, geschnitten und gefärbt.

26 -26- Für die histologische Untersuchung wurde Matrigel erst 24 Stunden nach Explantation aus dem Well im 4 % Formalin-Lösung bei +4 C fixiert und dann mit Flüssig-Stickstoff tiefgefroren. Paraffin-Schnitte gelangen nur bei TissuVlies, Matrigel dagegen löste sich in der HistoKinette (Fa. Leica, Nussloch, Deutschland) auf und war daher nicht schneidbar Proliferationsmessungen von HUVEC mit rekombinanten bfgf, VEGF und EGF rhfgf (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) rhvegf (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) rhegf (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Es wurden 6-Well-Platten verwendet und mit 1,5% Gelatin-Lösung beschichtet. Die HUVEC wurden durch Inkubation mit Trypsin abgelöst, ausgezählt und Zellen pro Well in 6-Well-Platten ausplattiert. Über 24 Stunden wurden die Zellen in ECBM (wachstumsfaktorenfrei) verarmt, damit diese besser auf die Wachstumsfaktoren- Stimulation reagieren. Zur Ausbildung von VEGF-Rezeptoren wurde ein Teil der HUVEC über 4 Passagen mit rekombinantem bfgf (1,0 ng/ml) vorstimuliert. Die Wachstumsfaktoren-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen (0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20 ng/ml) wurden in ECBM vorbereitet und nach 24 Stunden auf die Zellen in Triplex-System gegeben. Parallel wurde eine Kontrolle für jede Konzentrationsgruppen angelegt, wobei die HUVEC mit ECBM ohne Wachstumsfaktoren inkubiert wurden. Das ECBM mit Wachstumsfaktoren mußte jeden zweiten Tag gewechselt werden, bis die Zellen 80-90% Konfluenz erreichten. Danach wurden die Zellen aus den 6- Well-Platten abtrypsiniert, ausgezählt und mit der Kontrolle verglichen Auszählen der HUVEC Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch Trypsin abgelöst. Die gewonnene Zellsuspension wurde gut in ECBM resuspendiert und 100 µl wurden auspipettiert. Für jedes Well wurde ein spezielles Becher mit 10 ml isotonischen Lösung vorbereitet und 100 µl von der Zellsuspension wurde dazu gegeben. Ausgezählt

27 -27- wurde mit dem CultureCounter. Alternativ wurde eine Neubauer-Zell-Zählkammer verwendet (siehe Kapitel 2.1.5) HUVEC Proliferationsmessungen mit 3 H-Thymidineinbau/DNA-Synthese 48-Well-Platten (COSTAR, Bodenheim, Deutschland) Thymidinstammlösung (14,4 mg/20 ml (3mM), Lösung steril filtrieren und Aliquote. einfrieren) 3 H-Thymidin (1mCi/ml, verdünnt mit sterilem PBS auf 0,025 mci/ml) ß-Counter (Beckman, Deutschland) In 48-Well-Platten wurden Zellen pro Well in ECGM ausplattiert, diese adhärierten über Nacht und begannen zu proliferieren. Am nächsten Tag wurde das ECGM gegen ECBM ausgetauscht um die Zellen zu verarmen (im ECBM ohne Wachstumsfaktoren und nur mit 2% FCS-Zusatz kultiviert), die Zellen wurden 24 Stunden im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und die Wachstumsfaktoren-Lösungen auf die Zellen gegeben und 18 Stunden inkubiert. Danach wurden 10 µl 3 H-Thymidinlösung (0,025 mci/ml) in jedes Well gegeben und 6 Stunden im Brutschrank inkubiert. Waschschritte mit je 0,25 ml: PBS (möglichst schnell), MeOH zweimal je 5 min, TCA zweimal je 10 min, H 2 O einmal. Nach dem Waschvorgang wurden 0,25 ml 0,3 M NaOH in jedes Well geben und 5 min inkubiert. Dann wurden 2,5 ml ECO Plus in jedes Szintillationsgefäß gegeben und mit Überständen aus den Wells gut vermischt. Die Gefäße wurden gut geschüttelt und 5 min inkubiert, danach im ß-Zähler gemessen Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Escort Transfektionsreagenz Escort Transfection Reagent (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) Es wurden Zellen pro Well im ECGM ausplattiert und über 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Eine Escort -DNA-Mischung (für eine drei Proben pro Ansatz HUVEC-Transfektion) wurde angesetzt: 1 vol DNA zu 2 vol Escort + DMEM (ohne Zusätze) = 250 µl/well. Die Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurden 2 ml ECGM dazugeben und mit der Pipette gemischt. Während

28 -28- der Inkubationszeit wurden die HUVEC für die Transfektion vorbereitet. Das Medium wurde aus den Wells entfernt und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Die Escort -DNA-Mischung wurde auf die Zellen gegeben (0,7 ml/well bei 6-Well- Platten) und im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 (niedriger Gehalt von CO 2 < 2% verbessert die Transfektionseffiziens) 5-6 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Transfektionsmischung abgesaugt und die Platten wurden mit ECGM einmal gewaschen. Anschließend wurden 2 ml ECBM pro Well (6-Well-Platten) gegeben und im Brutschrank inkubiert. Jeden Tag wurden die Überstände abgenommen (komplett 2 ml) und mit frischem ECBM (ohne Wachstumfaktoren und < 2% Serumgehalt) ersetzt. Zur Implantation von transfizierten Endothelzellen in die dreidimensionalen Matrizen wurde eine spezielle Methode der Transfektion in der Suspension entwickelt. Die Zusammensetzung der Transfektionsmischung ist die gleiche wie bei dem Standard- Transfektionsverfahren, die Zellen wurden aber vorher nicht in die Well-Platten ausplattiert, sondern zur Transfektions-Mischung hinzugegeben. Die gewonnene Suspension wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend in die ausgewählte Matrix injiziert Liposomale transiente Transfektion von HUVEC mittels Fugene 6 Transfektionsreagenz Fugene 6 (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) Es wurden Zellen pro Well (6-Well-Platten) im ECGM ausplattiert und über 24 Stunden im Brutschrank inkubiert. Es mußten zwei Typen von Lösungen vorbereitet werden (L1 und L2). Lösung 1: Proportion DNA zu Fugene 6 war mindestens 1:2, das heißt 1 vol DNA mit 2 vol Fungene 6 wurden tropfenweise, ohne den Rand des Tubes zu berühren gut vermischt und 5 min bei Raumtemperatur mit ECBM (ohne Serum- und Wachstumsfaktoren-Zusatz) inkubiert. Zur gleichen Zeit wurde auch Lösung 2 vorbereitet, die nur aus DNA bestand. Danach wurden die beiden Lösungen gut vermischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Vor dem Transfektionsvorgang wurde das ECGM abgesaugt und frisches ECBM 2 ml pro Well gegeben. Nach der Inkubation wurde die Transfektionslösung

29 -29- (L1+L2) auf die Zellen (100 µl pro 35 mm Well) gegeben. Die Überstände (komplett 2 ml) wurden jeden Tag abgenommen und mit frischem ECBM ersetzt ELISA - hvegf- Immunoassay Quantikine-Kit human VEGF (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Assay Diluent RD1J (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Assay Diluent RD1W (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Wash Buffer (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) VEGF Conjugate (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) Stop Solution (R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland) ELISA-Reader Das VEGF-Immunnoassay wurde mit Hilfe des Quantikine-Kit durchgeführt. Alle Kit- Bestandteile mußten bei +4 C gelagert werden. Vor dem Beginn der Arbeit wurden alle Reagezien auf Raumtemperatur aufgewärmt. Alle Proben und Standards wurden doppelt angelegt werden. Die Folie wurde von der Reagenzplatte entfernt. Es wurden 50 µl von Assay Diluent RD1J zu jeder Probe und Standard gegeben. Assay Diluent RD1J verfügt über starke Präzipitationseigenschaften. Deshalb wurde das Reagenz in den Wells gut gemischt. Dann wurden in jedes Well 200 µl von der Standart-Lösung oder der Proben gegeben. Die Reagenzplatte wurde mit Folie zugeklebt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Wells aspiriert und dreimal mit Wasch-Puffer (400 µl) gewaschen. Für bequemeren Wachsvorgang wurden multi-channel-pipetten benutzt. Komplette Absaugung von den Reagenzien aus jedem Well garantiert die Präzision der Ergebnisse. Nach dem letzten Waschvorgang wurde der Wasch-Puffer sorgfältig aus den Wells aspiriert und die Platte auf einem sauberen Tuch abgeklopft, damit die Reste der Flüßigkeit aus den Wells entfernt werden könnten. Danach wurden jedem Well 200 µl VEGF-Konjugat zugesetzt. Die Platte wurde mit einer neuen Folie zugeklebt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Waschschritte (wie oben beschrieben) wurden wiederholt. Nach der Inkubationszeit wurden in jedes Well 200 µl von der Substrat-Lösung gegeben und 20 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden pro Well 50 µl der Stop Solution gegeben und gut vermischt. Die Ergebnisse wurden in einem ELISE-Reader innerhalb von 30 min. (450 µm-filter) abgelesen.

30 Trennkammersystem Das Trennkammersystem-Model dient zur Untersuchung der Wirkung transfizierter Zellen, auf nicht-transfizierte Zellen. Dabei werden die transfizierten Zellen auf einem semipermeablen Membraneinsatz (0,1 µm) kultiviert. Nicht-transfizierte Zellen sind auf dem Well-Boden ausplattiert. (siehe Abbildung 2.3). Das exprimierte Protein kann somit durch die semipermeable Membran treten. Ein möglicher stimulierender Effekt auf die nicht-transfizierten Zellen kann dann quantifiziert werden. Als die nicht-transfizierten Zellen eine 80-90%ige Konfluenz erreicht hatten, wurden sie abtrypsiniert und ausgezählt. A B C D E F Abbildung 2.3: Schematische Darstellung des Trennkammersystems: A) Membranseinsatz; B) Endothelial Cell Basal Medium (ohne Wachstumsfaktorenn); C) hvegf-165-transfizierte HUVEC; D) 0,1 µm Membrane; E) Nicht-transfizierte HUVEC; F) Well.

31 GENTECHNISCHE METHODEN Falls nicht anders angegeben, wurden die molekularbiologischen Methoden aus dem Laborhandbuch Molecular cloning (Sambrook et al., 1989) entnommen und entsprechend modifiziert. Auch die gängigen Puffer wurden nach diesem Buch hergestellt. Veränderungen sind an entsprechender Stelle aufgeführt Puffer PBS: 137mM NaCL, 2,7 mm KCL, 4,3 mm Na 2 HPO 4, 1,4 mm KH 2 PO 4, ph 7,4 TBS: 10 mm Tris ph 7,5, 150 mm NaCL TTBS: TBS + 0,05% Tween-20 (Fluka) TBE: 89 mm Tris, 89 mm Borat, 1 µm EDTA, ph 8,2 SDS-Gelelektrophoresepuffer: 250 mm Glycin, 0,1% SDS, 25 mm Tris/ HCL TAE-Laufpuffer zur Agarosegelelektrophorese: 40 mm Tris, 2 mm EDTA, auf ph 8,0, mit Essigsäure eingestellt 10x DNA-Auftragungspuffer: 10 mm Tris pf 7,8, 1 mm EDTA, 80% Glyzerin, 0,2% Bromphenolblau Proteinauftragspuffer für SDS-PAGE: 125 mm Tris, ph 6,8, 2,5% SDS, 10% Glyzerin, 0,1% Bromphenolblau Kathodenpuffer für Western Blots: 25 mm Tris ph 10,4, 40 mm ε-aminokapronsäure, 20% Methanol Plasmide pcdna/neo III - VEGF 165 CMV-Promotor-Plasmid für stabile Transfektion mit hvegf165. Selektion von Klonen ist möglich mit G- 418 Neomycin (GibcoBRL,Cat.Nr )

32 -32- pcmx - VEGF 165 CMV-Promotor-Plasmid für transiente Transfektion mit hvegf165 1 APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRS Ic ic YCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGCCNDEGL ECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQ DPQTCKCSCKNTDSRCKA RQLELNERTCRCDKPRP 165 Abbildung 2.4: hvegf-165 Sequenz aus Keck et al. Arch Biochem Biophys 344 (1): , Herstellung kompetenter E. coli Zellen Lösung I Lösung II 150 mm RbCl 2, 50 mm MnCl 2, 30 mm CoAc, 10 mm CaCl 2, 13% Glyzerol, ph 5.8, steril filtriert 10mM MOPS, 10 mm RbCl 2, 75 mm CaCl 2, 13% Glyzerol, ph 7.0, steril filtriert 500 ml Bakterienkultur wurden in LB-Medium bis zu einer OD 550nm von 0,48-0,5 vermehrt und anschließend bei +4 C für 10 min bei 2200 Upm in einem JA 10 Rotor abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 170 ml eiskalter Lösung I resuspendiert und 1-2 h auf Eis gekühlt. Anschließend wurde die Suspension wie oben beschrieben zentrifugiert und das Zellsediment in 12,5 ml eiskalter Lösung II resuspendiert. Die Zellen wurden in Aliquots zu 250 µl schockgefroren und bei 80 C gelagert.

33 Transformation von Plasmid DNA in E. coli Kompetente E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 100 µl Bakteriensuspension wurden mit 1 µl Plasmid-DNA bzw. der Hälfte eines Ligationsansatzes vermischt und für 20 min. auf Eis inkubiert. Es folgte ein Hitzeschritt von 90 Sekunden bei 42 C, 2 min. Inkubation auf Eis und 45 min, danach Mischen der Suspension bei 37 C in 1 ml LB Medium. Danach wurden die Bakterien auf ampicillinhaltigen Agarplatten (100 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37 C inkubiert Isolierung von DNA aus E. coli Lösung I Lösung II 25 mm Tris ph 8, 10 mm EDTA, 1% Glukose 0,2 M NaOH, 1% SDS 1,5 ml Bakteriensuspension einer Übernachtkultur wurden abzentrifugiert und in 100 µl kalter Lösung I resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe von 200 µl Lösung II für 5 min. Danach erfolgte die Inkubation auf Eis. Durch Zugabe von 150 µl 3 M Na-Acetat ph 5,2 und erneuter Inkubation auf Eis wurden chromosomale DNA und ein Teil der Proteine gefällt. Der Ansatz wurde 10 min. bei Upm zentrifugiert und der plasmidhaltige Überstand mit 500 µl Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die Plasmid-DNA wurde danach aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 1ml Äthanol und 10 min. Zentrifugation bei Upm gefällt. Das DNA-Pellet wurde mit 500 µl 70% Äthanol gewaschen, vakuumgetrocknet und in 50 µl aqua deion. mit 1µg RNAse resuspendiert. Für eine Plasmidisolierung in präparativem Maßstab wurden Maxiprep und Gigaprep Plasmidextraktionskits von Fa. QUIAGEN nach den Vorschriften des Herstellers verwendet Phenol-Chloroform Extraktion, DNA-Mengenbestimmung Um Proteine aus DNA-Lösungen zu entfernen, wurden diese mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) gemischt und die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die obere, wäßrige Phase wurde abgenommen und erneut mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Danach wurde die DNA mit Äthanol gefällt, mit 70% Äthanol gewaschen und vakuumgetrocknet.

34 -34- Zur Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA-Lösungen wurden diese photometrisch bei 260 nm und 280 nm vermessen. OD 260 von 1 entspricht dabei 50 µg/ml Doppelstrang-DNA, 40 µg/ml Einzelstrang-DNA oder 20 µg/ml Oligonukleotid. Der Quotient aus OD 260 und OD 280 gibt Aufschluß über Verunreinigungen durch Protein oder Phenol, die bei 280 nm stärker als DNA absorbieren. Bei reiner DNA ist der Quotient größer als 1, DNA-Verdauung mit Restriktionsendonukleasen Zum Verdau von Plasmid-DNA wurden 2 bis 10 U/µg DNA in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer eingesetzt. Die Reaktion wurde je nach Enzym 2-12 h bei Raumtemperatur oder 37 C durchgeführt und durch Auftrennung der Fragmente mittel Agarosegelelektrophorese gestoppt Agarosegelelektrophorese DNA-Restriktionsfragmente und PCR-Produkte wurden elektrophoretisch je nach DNA Größe in 0,7-1,5% -igen Agarosegelen aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte bei 10 Volt/cm Gellänge in TAE-Puffer, das Gel wurde mit Ethidiumbromid versetzt und zur Visualisierung von DNA auf einem Transilluminator mit UV-Licht (366 nm) bestrahlt. Gewünschte DNA-Fragmente wurden mit dem Gel-Extraktion-Kit (Fa. QUIAGEN) eluirt. Die Banden wurden unter UV-Licht ausgeschnitten und entsprechend den Angaben des Herstellers behandelt Ligation von DNA-Fragmenten Zur Ligierung wurde Vektor-DNA und DNA-Insert in einem molaren Verhältnis von ca. 1:4 eingesetzt. Die Ligation erfolgte bei 15 C über Nacht in einem möglichst kleinen Volumen (15-30 µl) mit dem vom Hersteller gelieferten Ligasepuffer und 1 Weiss-Einheit an T4-Ligase (Boehringer Mannheim, Deutschland). Die Ligationsansätze wurden bei 20 C gelagert oder direkt zur Transformation von E. coli verwendet.