Skript für Studenten der Zahnmedizin

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1 Skript für Studenten der Zahnmedizin Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. U.G. Liebert Johannisallee 30, Leipzig Tel

2 Im vorliegenden Skript Virologie werden die Möglichkeiten, eine Virusinfektion zu diagnostizieren, dargestellt. Das Skript soll begleitend zu den Vorlesungen genutzt werden. Es soll und kann ein Lehrbuch nicht ersetzen. Daher werden auch für die Vorbereitung auf die Prüfungen (Staatsexamen) werden die folgenden Lehrbücher empfohlen: Hof und Dörries: Medizinische Mikrobiologie, 4. Auflage, Thieme Verlag, 2009 Modrow, Falke, Truyen, Schätzl: Molekulare Virologie, 3. Auflage, Spektrum Verlag 2010 Doerr, Gerlich, Medizinische Virologie, 2. Auflage, Thieme Verlag, 2009 Mims, Dockrell, Goering, Roitt, Wakelin, Zukermann: Medizinische Mikrobiologie - Infektiologie, 2. Auflage, Urban & Fischer Verlag, 2006 Kayser, Böttger, Zinkernagel, Haller, Eckert, Deplazes: Medizinische Mikrobiologie, 12. Auflage; Thieme Verlag, 2010 Suerbaum, Hahn, Burchard, Kaufmann, Schulz, Medizinische Mikrobiologie und Infektiologie, 7. Auflage, Springer Verlag, 2012 In der Virusdiagnostik stehen indirekte und direkte Nachweisverfahren zur Verfügung. Der indirekte Nachweis einer Virusinfektion beruht auf der Bestimmung von spezifischen Antikörpern (Serologie), mithin der Untersuchung der immunologischen Abwehrreaktion des infizierten Organismus. Diese serologischen Untersuchungen erfolgen überwiegend im Blutserum, bei bestimmten Fragestellungen auch im Liquor. Der direkte Nachweis einer Virusinfektion kann durch molekularbiologische Methoden oder durch die Isolation von infektiösem Virus erfolgen

3 1. Teil: SEROLOGISCHE NACHWEISVERFAHREN VON VIRUSINFEKTIONEN Einführung Unter dem Begriff Serologie werden im wesentlichen Testverfahren zur Bestimmung spezifischer Antikörper gegen ein infektiöses Agens zusammengefaßt. Die Bestimmung von Antikörpern erfolgt meist im Serum von Patienten. Die Antikörperkonzentration (bzw. der Vergleich in zwei Serumproben, die im Abstand von Tagen genommen wurden) kann Rückschlüsse auf das Infektionsstadium erlauben und wird je nach Testverfahren in verschiedener Weise angegeben. a) Titer: Ein Titer ist der reziproke Wert der höchsten Serum- bzw. Probenverdünnung, bei der Antigen und Antikörper noch miteinander reagieren. Grundlage sind Verdünnungsreihen (Serum wird 1:2, 1:4, 1:8, usw. verdünnt). Ein Titer von 128 bedeutet, daß die untersuchte Probe bei einer Verdünnung von 1:128 noch ein positives Resultat erbrachte. b) Einheiten erhält man durch Bestimmung des Quotienten aus der Extinktion einer Serumprobe und der Extinktion der Kontrolle. Grundsätzlich werden dabei Standardpräparate als positive und negative Kontrollen verwendet. Das Ergebnis wird als Index oder Faktor (Vielfaches des Grenzwertes, s.u.) oder als U/ml (firmenspezifisch) bzw. IU/ml (entsprechend internationaler Übereinkunft, z.b. bezogen auf einen WHO-Standard) angegeben. Ein Grenztiter (Grenzwert) gibt den Schwellenwert an, ab dem das Ergebnis eines serologischen Nachweisverfahrens als spezifisch anzusehen ist. Eine signifikante Titerdifferenz (Anstieg oder Abfall) liegt dann vor, wenn sich zwei Proben des gleichen Patienten (im Abstand von Tagen) in mindestens 2 Titerstufen bzw. um das 4-fache der testspezifischen Einheiten unterscheiden. Kleinere Differenzen können durch die Fehlerbreite der Tests bzw. der Testdurchführung bedingt sein. Die Bildung von Antikörpern stellt eine aktive Leistung des Immunsystems des Wirtes als Antwort auf eine Infektion dar und nimmt einige Zeit in Anspruch. IgG-Antikörper können in der Regel etwa 14 Tage nach dem Infektionszeitpunkt nachgewiesen werden, IgM-Antikörper einige Tage früher. IgM-Antikörper sind besonders anfällig für falsch positive Testergebnisse. IgG-Antikörper können auch durch Transfusion, durch passive Immunisierung oder als mütterliche Leihimmunität (von der Mutter auf den Fetus) übertragen werden. Für die serologische Diagnose einer Virusinfektion steht eine Reihe von Tests zur Verfügung. Der Nachweis spezifischer Antikörper zeigt eine aktuelle (frische oder kürzlich erfolgte) oder eine in der Vergangenheit abgelaufenen Auseinandersetzung zwischen infektiösem Agens und körpereigenem Abwehrsystem an. Die Aussagekraft einer Antikörperbestimmung aus einer Einzelprobe kann eingeschränkt sein. Zum einen könnte es sich um eine länger zurückliegende Infektion handeln, und zum anderen sind Kreuzreaktionen mit antigenverwandten Viren möglich. Daher sind oft 2 Probenentnahmen im Abstand von Tagen (serologische Titerdynamik) sinnvoll. Serokonversion bzw. Titerbewegung sind dann gut einschätzbar. Grundsätzlich werden zunächst Tests eingesetzt, die global anzeigen, ob bzw. dass eine Infektion stattfindet oder abgelaufen ist (sog. Such- oder Screeningtests, z.b. ELISA)

4 Die meisten verwendeten serologischen Verfahren beruhen auf dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei ist es erforderlich, dass diese Antigen-Antikörper-Reaktion sicht- und messbar gemacht wird. Die Auswahl der Nachweistechnik ist abhängig von den Eigenschaften des Antigens (Größe, Anzahl und Struktur der antigenen Determinanten), den Eigenschaften des korrespondierenden Antikörpers (Avidität, Spezifität) und der Konzentration des zu bestimmenden Liganden. Serologische Tests werden auch zum Nachweis viraler Antigene eingesetzt, wobei diagnostische (in der Regel monoklonale) Antikörper gegen verschiedene Viren bzw. virale Antigene/Proteine verwendet werden. Das Spektrum der verfügbaren Testsysteme umfasst sogenannte Bindungstests und funktionelle Tests. Zu letzteren gehören Tests, mit denen die biologische Funktion der humoralen Immunreaktion untersucht werden (z.b. Neutralisation der Infektiösität von Viren, Hemmung der virusvermittelten Hämagglutination oder Hämolyse). 1. Typische serologische Methoden Als Indikatorsysteme zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion in serologischen Tests werden u.a. Fluorochrome, enzymatische Umsetzung eines Chromophors oder Chemilumineszenz verwendet, mit denen einer der Reaktionspartner markiert ist. Im Folgenden werden Testverfahren dargestellt, die in der medizinischen Virologie häufig zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern eingesetzt werden. Zum Nachweis von gewebe- und zellständigen viralen Antigenen in Gewebeschnitten, Zellausstrichen oder infizierten Zellkulturen werden beim direkten Immunfluoreszenztest (IFA) spezifische fluorochrommarkierte Antikörper verwendet, wobei als Fluorochrom meist Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) dient. Beim indirekten IFA erfolgt die Darstellung der viralen Antigene in einem zweistufigen Verfahren, bei dem erst der zweite Antikörper fluorochrommarkiert ist. Der Enzym-Immun-Assay (EIA, auch Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) ist ebenfalls sowohl zum Nachweis von virusspezifischen Antikörpern als auch zum Nachweis von viralem Antigen geeignet. Der Testablauf entspricht weitgehend dem IFA. Das Prinzip des indirekten EIA zum Nachweis von virusspezifischen Antikörpern besteht darin, dass die in der Probe gesuchten Antikörper an ein auf der Testplatte oder auf sogenannten Microbeads fixiertes Virusantigengemisch binden. Mit dem gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex reagiert als Nachweissystem das Enzymkonjugat. Nach der Zugabe der Substratlösung entsteht durch enzymatische Umsetzung ein Farbstoff (z.b. gelbgrün). Nichtgebundene Reaktionspartner werden durch Waschprozesse entfernt. Für einen bestimmten Konzentrationsbereich besteht eine lineare Beziehung zwischen Antikörperkonzentration und Enzymaktivität, gemessen als Extinktionswert. Analog den Antikörper-ELISAs kann man auch Antigene mit dieser Methode bestimmen. Insbesondere für den Nachweis diagnostisch relevanter Einzelantigene (nicht in Verbindung mit allen Proteinen des Erregers) sind solche ELISAs entwickelt - 4 -

5 worden. Kommerziell erhältlich sind z.b. Tests für das HBs- und HBe-Antigen von Hepatitis-B-Virus sowie für das p24-antigen des HIV. Zum Nachweis viraler Antigene sind an der Mikrotiterplatte entsprechende monoklonale Antikörper fixiert, die in der Untersuchungsprobe vorhandenes Antigen binden. Mit einem zweiten, enzymkonjugierten Antikörper und nachfolgender Substratreaktion wird gebundenes Antigen nachgewiesen (Antigen-capture-Assay). Durch die Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern, die mit verschiedenen Epitopen des gesuchten Antigens reagieren, sind diese Teste sehr spezifisch. Sie werden insbesondere auch zum Nachweis von IgM-Antikörpern eingesetzt. Der Westernblot (WB) ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen einzelne Proteine. Er umfasst mehrere Arbeitsgänge: eine Elektrophorese zur Trennung eines Proteingemischs (z.b. Viruslysat) in einem Polyacrylamidgel gefolgt vom Transfer der Antigene auf eine feste Phase ( blotten ). Als Trägerfolie wird z.b. Nitrozellulose verwendet. Der Antikörpernachweis im Patientenserum erfolgt nach Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen auf der in Streifen geschnittenen Nitrozellulosemembran. Diese Antigen-Antikörperkomplexe werden in einem Sandwich-Verfahren sichtbar gemacht (mittels einer enzymatischen Reaktion, vgl. EIA und IFA). Ein Vorteil des Westernblots besteht darin, dass auf der festen Matrix in immobilisierter Form das Muster der elektrophoretisch getrennten einzelnen viralen Proteine reproduziert und so die Immunreaktion gegen einzelne Virusproteine nachgewiesen wird. Der Westernblot wird in der medizinischen Virologie z.b. als Bestätigungstest bei HIV-Infektionen benutzt. In Abbildung 1 ist anhand verschiedener Westernblotstreifen der typische Infektionsverlauf einer HIV-Infektion dargestellt. Die Lage der Banden entspricht den Molekulargewichten der in Tabelle 1 aufgeführten HIV-1-Proteine. Kontrolle gp160 gp120 p66 p51 gp41 p32 p24 p18 Woche nach Infektion: Abbildung 1: HIV-Westernblot. Dargestellt ist ein repräsentativer Infektionsverlauf

6 Gen Genprodukt Funktion env gp160 Vorläufer von gp 120 und gp 41 env gp120 Oberflächenglykoprotein pol p66 Reverse Transkriptase gag p55 Vorläufer der Kernproteine pol p51 Reverse Transkriptase env gp41 Transmembranprotein pol p32 Integrase gag p24 Kapsidprotein gag p18 Matrixprotein Tabelle 1: Im Westernblot nachweisbare im Viruspartikel vorhandene HIV-1 Proteine. Als Antigene in Westernblot, Line-Immunoassays, Immundot bzw. Rekombinante Immunblotassay (RIBA) werden auch gentechnisch hergestellte Polypeptide einzelner viraler Proteine (rekombinante Antigene) direkt ohne vorherige elektrophoretische Auftrennung auf eine feste Phase (z.b. Nitrozellulosemembran) aufgebracht oder die rekombinanten Proteine werden zuvor elektrophoretisch aufgetrennt, bevor sie zum Nachweis von virusspezifischen Antikörpern in der Patientenprobe verwendet werden. Diese Tests werden kommerziell als Bestätigungstest beispielsweise für eine Hepatitis C- oder HIV-Virusinfektion, zum Nachweis einer Infektion mit Hepatitis E-Virus, Parvovirus B19, EBV, HTLV-1 und HTLV-2 und anderen Viren angeboten. Der Rötelnwesternblot ist ebenfalls als Differenzierungstest in unklaren diagnostischen Situationen zur Eingrenzung des Infektionszeitpunktes einsetzbar. Das Prinzip des Rötelnwesternblots beruht darauf, dass die Rötelnstrukturproteine E1, E2 und c sich entsprechend ihrer Molekulargewichte auftrennen lassen und durch Elektroblotting auf Nitrocellulose übertragen werden können. Auf diese Weise liegen die Antigene in voneinander separierter Form vor und durch Zugabe von Patientenseren kann man die Immunantwort hinsichtlich der einzelnen Rötelnbestandteile analysieren. Die Immunantwort von Impflingen und Infizierten im Zeitverlauf zeigt ein zeitlich gestaffeltes Auftreten von Röteln-IgG-Antikörpern gegen die einzelnen Strukturproteine. Die Analyse der Immunantwort von Impflingen und Infizierten im Zeitverlauf zeigt, dass E1- und C-Antikörper als erste nachweisbar werden, in der Regel 2 Wochen nach Impfung oder Infektion. Nach frühestens 3 Monaten kann man (unter nicht reduzierenden Bedingungen) E2-Antikörper nachweisen. Nach einem Jahr weisen alle Impflinge diese Antikörper auf. Eine spezielle, modifizierte Anwendung des EIAs stellt der Aviditätstest dar, bei dem die Bindungsstärke (Avidität) eines Serumantikörpers bestimmt wird. Es handelt sich ebenso wie beim Westernblot nicht um einen Screeningtest, sondern um ein ergänzendes Verfahren, um bei unklaren Konstellationen eine frische Infektion auszuschließen. Die Avidität von Immunglobulinen beschreibt die Reifung von Antikörpern. Grundsätzlich gilt dabei, dass je länger das Immunsystem mit einem Antigen konfrontiert ist, desto effizienter erkennen die Antikörper ihr Antigen. Die Avidität von Antikörpern ist kurz nach einer Infektion niedriger als Wochen oder Monate später

7 Zur Bestimmung der Bindungsstärke von Antikörpern werden sekundäre Amine wie Harnstoff (ca. 4 M) oder Diäthylamin (35 mm) verwendet, die aufgrund ihrer Größe und Polarität eine bereits erfolgte Antigen-Antikörper-Bindung wieder lösen können. Beim Aviditätstest wird in einem EIA parallel Patientenserum mit und ohne Zugabe von Harnstoff untersucht und ein Quotient der jeweils gemessenen Extinktionen als Maß der Bindungsstärke der vorhandenen spezifischen Antikörper gebildet. Sind die Antikörper niedrigavid, wird der Antikörper teilweise vom spezifischen Antigen verdrängt. Aviditätsindices >0.5 sprechen für eine länger (mehrere Monate) zurückliegende Infektion. Der Aviditätstest wird z.b. in der Schwangerschaft zum Ausschluß einer frischen Infektion mit Röteln- oder Zytomegalievirus eingesetzt. 2. Funktionelle Teste Im Neutralisationstest (NT) wird die Fähigkeit von Antikörpern getestet, die Infektiosität eines Virus zu neutralisieren (inaktivieren). Eine standardisierte Virusmenge wird mit verschiedenen Verdünnungsstufen eines Patientenserums inkubiert, um eine quantitative Angabe über den Antikörpergehalt eines Serums machen zu können (Titer). Als Indikatorsystem setzt man geeignete suszeptible Zellen (Zellkulturen) ein, um die nicht neutralisierten Viruspartikel nachzuweisen. Im Prinzip handelt es sich beim NT um eine Endpunktverdünnungsmethode, d.h. ein Serum wird in einer geometrischen Reihe so lange verdünnt, bis keine neutralisierenden Antikörper mehr nachweisbar sind. Der Neutralisationstest wird z.b. zum Nachweis von Antikörpern gegen Enteroviren und Poliovirus eingesetzt. Agglutinationstests werden ebenfalls zum Nachweis von antiviralen Antikörpern eingesetzt. Beim Hämagglutinationshemmtest (HHT) nutzt man aus, dass einige Viren in ihrer Hülle sog. Hämagglutinine besitzen. Dabei handelt es sich um Glykoproteine, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Erythrozyten binden. (Die Rezeptoren bestehen aus N-Acetylneuraminsäureresten des Hauptglykoproteins vom Erythrozyten, dem Glycophorin.) Durch Bindung der Viruspartikel an die Zelloberfläche werden die Erythrozyten untereinander vernetzt. Dieses Phänomen wird Hämagglutination genannt. Da HHT-Titer recht gut mit dem Gehalt virusneutralisierender Antikörper korrelieren, wird der viel einfacher durchzuführende HHT nach wie vor zum Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Viren (z.b. Röteln-, Masern- und Influenzaviren) eingesetzt. Der HHT unterscheidet nicht zwischen IgG- und IgM-Antikörpern. Prinzip: Im HHT werden antivirale Antikörper nachgewiesen, die die virusbedingte Erythrozytenagglutination verhindern. Einige Viren tragen an der Oberfläche ihrer Hülle virale Proteine, die mit Rezeptoren auf der Membran von Erythrozyten reagieren und zur Hämagglutination führen. Die hämagglutinierende Wirkung entfaltet sich nicht bei Erythrozyten der natürlicherweise infizierten Wirtsspezies. Vielmehr handelt es sich insofern um ein Laborartefakt, als nur Erythrozyten bestimmter Spezies agglutiniert werden (z.b. Influenzavirus - Kükenerythrozyten, Masernvirus - Affenerythrozyten, Rötelnvirus - Kükenerythrozyten). Enthält ein Patientenserum Antikörper gegen virale Hämagglutinationsproteine, so wird eine Agglutination der Erythrozyten verhindert (Hämagglutinationshemmung)

8 Bewertung von serologischen Testen Zur Bewertung von verschiedenen serologischen Testverfahren untereinander werden die Spezifität, die Sensitivität und der Vierfelder-Korrelationskoeffizient herangezogen. Sensitivität und Spezifität von serologischen Testen geben Auskunft über die methodischen Grenzen eines Testsystems und erlauben die Vergleichbarkeit untereinander. Zur Berechnung dieser Parameter ist ein Standard-Test (Referenztest) erforderlich, gegen den ein anderer Test evaluiert wird. Grundsätzlich können unterschiedliche Testprinzipien miteinander verglichen werden (z.b. IFA und EIA). Während in aller Regel die überwiegende Zahl der Untersuchungsproben in beiden Tests identische Ergebnisse (positiv oder negativ) zeigen, werden die diskrepanten Ergebnisse als falsch positive und falsch negative jeweils bezogen auf den Referenztest bezeichnet. Falsch positiv kann bedeuten, dass der Test positiv anzeigt, obwohl keine Infektion beim Patienten vorliegt. Bei wenig spezifischen Tests ist der Anteil falsch positiver Reaktionsausfälle besonders hoch. Falsch negative Ergebnisse kommen vor, wenn die Sensitivität der Teste nicht ausreichend ist. (In diesem Falle zeigt der im Referenztest gemessene Wert ein positives Ergebnis an.) Die Sensitivität gibt an, wie (gut) ein Test positive Proben erfasst. Die Spezifität ist ein Maß dafür, ob der Test die positiven Proben korrekt erfasst. Grundsätzlich gilt für alle Testverfahren, die auf dem Prinzip der Antigen-Antikörper- Bindung beruhen, dass Sensitivität und Spezifität eines Testsystems sich gegenseitig beeinflussen. Dies hat im Wesentlichen zur Folge, dass eine höhere Testspezifität mit einer geringeren Sensitivität erkauft wird. Daher ist es bei der Bewertung von Testergebnissen wichtig zu berücksichtigen, welches Ziel der zu beurteilende Test hat: Screeningtest oder Bestätigungstest. Am Beispiel der HIV-Tests in der Blutspende wird dies leicht nachvollziehbar. Gefordert ist als Screeningtest (üblicherweise EIA bzw. ELISA) ein Verfahren mit höchstmöglicher Sensitivität. Dies ist nur auf Kosten der Spezifität realisierbar. Daher kommen zusätzlich zu den richtig positiven (bzw. reaktiven) Testergebnissen gelegentlich auch falsch positive Ergebnisse vor. Dies wird in Kauf genommen und ist auch sinnvoll, da es so gelingt, das Risiko einer nicht erkannten HIV-haltigen Blutspende sehr gering zu halten (<1: ). Um die erheblichen Folgen (z.b. für den Untersuchten, für die Blutspendeeinrichtung) auf die richtig Positiven einzugrenzen, ist daher ein Bestätigungstest für jede im Screeningtest auffällige Serumprobe vorgeschrieben. Dieser Bestätigungstest, z.b. ein Westernblot, weist eine sehr hohe Spezifität auf

9 Übungs- und Verständnisfragen: 1. Worin besteht das Grundprinzip einer EIA/ELISA-Untersuchung? 2. Schließt ein negativer serologischer Befund eine Infektion sicher aus? 3. Welche Bedeutung hat die Bestimmung von virusspezifischen Antikörpern der Klassen IgG, IgM und IgA? 4. Warum ist die Untersuchung von Serumproben im Abstand von Tagen sinnvoll? 5. Was wird mit serologischen Tests gemessen? 6. Welche Bedeutung hat die Inkubationszeit für den Infektionsnachweis mit serologischen Methoden? 7. Geben Sie die Inkubationszeiten für Viren an, die zu Atemwegsinfektionen Gastroenteritis Hepatitis Masern, Mumps, Röteln, Varizellen Herpesläsionen führen. 8. Wie ist es zu erklären, dass sich reaktive Untersuchungsergebnisse im EIA im Westernblot nicht unbedingt bestätigen lassen? 9. Kann mit Hilfe serologischer Untersuchungen zwischen akuten und chronischen Infektionen differenziert werden? Erläutern Sie dies unter Berücksichtigung der serologischen Titerdynamik. 10. Welche serologischen Testergebnisse sind geeignet, um mit einer einmaligen Serumuntersuchung definitiv eine akute Infektion zu diagnostizieren? Gilt dies für alle Viren? Für welche nicht? 11. Welche serologische Konstellation von IgG- und IgM-Testergebnissen (mütterliches und fötales Blut) legen die Diagnose einer intrauterinen Infektion mit Cytomegalievirus nahe? 12. Wie kann Immunität gemessen werden? Erläutern Sie anhand der folgenden Beispiele: Masern, Hepatitis B, Poliomyelitis? 13. Was ist das Ziel einer Schutzimpfung? 14. Was versteht man unter aktiver Impfung, passiver Impfung und Auffrischimpfung (Booster)? - 9 -

10 2. Teil: NUKLEINSÄURETECHNIKEN ZUM NACHWEIS VON VIRUSINFEKTIONEN Direkter Virusnachweis durch Nukleinsäurenachweistechniken 1. Polymerasekettenreaktion = Polymerase Chain Reaction (PCR) Die PCR ist das häufigste diagnostische Hilfsmittel für den direkten Erregernachweis. Das Prinzip beruht auf der millionenfachen Vermehrung erregerspezifischer Gensequenzen in Körperflüssigkeiten oder Geweben. Die wichtigsten Reagenzien sind außer der Matrizensequenz, die amplifiziert werden soll, Primer, Taq- Polymerase und Nukleotide. Die Primer sind ca Basen lange synthetische Oligonukleotide, die komplementär zu der gesuchten Zielsequenz (Target, Matrize) und somit spezifisch für den entsprechenden Genabschnitt sind. Die Taq-Polymerase ist eine temperaturstabile DNA-Polymerase (aus dem Bakterium Thermophilus aquaticus), das durch Einbau von Nukleotiden (ATP, CTP, GTP und TTP) einzelsträngige DNA in eine doppelsträngige überführt. Eine PCR verläuft in drei sich zyklisch wiederholenden Teilschritten: Aufschmelzen doppelsträngiger DNA in lineare, einzelsträngige DNA (Denaturierung) bei 95 C Anlagerung der Primer (Annealing), wobei sich dietemperatur nach dem Schmelzpunkt (T Smp ) und der Sequenz der Primer richtet (45-70 C) Synthese des komplementären Stranges durch die Polymerase (Elongation) bei 72 C (Temperaturoptimum der Taq-Polymerase). Je höher die Annealingtemperatur ist, desto höher ist die Spezifität und desto niedriger die Sensitivität. Die Primer müssen hinsichtlich ihrer Spezifität für das zu amplifizierende Gen gegen eine Datenbank getestet sein. Der Abstand zwischen den Primersequenzen beträgt meist Basen, kann aber auch deutlich länger ( 1000 Nukleotide, long PCR) oder sehr kurz sein ( Nukleotide, z.b. für Taqman s.u.). Die Länge des Amplifikates ist entsprechend. Der Nachweis dieses Amplifikates erfolgt häufig über Elektrophorese in einem Agarosegel. Dabei werden die DNA-Fragmente mit Ethidiumbromid gefärbt und durch UV- Licht sichtbar gemacht. Die Länge des Amplifikates kann durch den Vergleich der Bande im Gel mit einem Längenstandard geschätzt werden. Da die Zahl der Amplifikate mit jedem Zyklus zunimmt, korreliert auch die Dicke der Bande mit der Zykluszahl. Die PCR zeichnet sich durch eine sehr hohe Sensitivität aus. Dies birgt aber das Risiko einer erhöhten Störanfälligkeit (Kontamination, falschpositive Resultate) und beim Einsatz in der Diagnostik klinisch nicht bewertbarer oder nicht relevanter Befunde. PCR-Ergebnisse sollten daher grundsätzlich auf Plausibilität überprüft werden, und ihre Bewertung sollte nur unter Berücksichtigung der Klinik und anderer diagnostischer Befunde erfolgen. Von besonderer Wichtigkeit ist daher, in einer PCR ausreichende und geeignete Kontrollen mitzuführen. Wenn die DNA aus zellhaltigem Material gewonnen wird, können als interne Kontrolle für die PCR sogenannte house keeping Gene wie β-interferon oder GAPDH mit amplifiziert werden. Der

11 Nachweis des entsprechenden PCR-Produktes schließt die Anwesenheit inhibierender Faktoren aus. Positive Standardproben sowie Einsatz von destilliertem Wasser an Stelle der Targetsequenz (als negative Kontrolle) sind unverzichtbar für eine PCR. Bei positivem Reaktionsausfall (eine Bande entsprechend der theoretisch zu erwartenden Länge ist im Gel sichtbar) muss die Erregerspezifität nachgewiesen werden. Die Erregerspezifität kann beispielsweise durch Restriktionsanalyse (Restriktionsmapping), Hybridisierung mit markierten Gensonden oder Sequenzierung des Amplifikates nachgewiesen werden. Beim Restriktionsmapping wird das PCR-Amplifikat einem Restriktionsverdau unterworfen. Je nachdem, ob und gegebenenfalls wie häufig die vom Restriktionsenzym erkannte Sequenz vorkommt, entstehen dabei Fragmente unterschiedlicher Länge. Deren Summe entspricht der Länge des Ausgangsproduktes. Diese Fragmente werden in einer Elektrophorese aufgetrennt und nach Zugabe von Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar. Schneidet man mit dem gleichen Enzym die DNA zweier verwandter, aber nicht identischer Viren, ergeben sich aufgrund der Sequenzunterschiede unterschiedliche Restriktionsmuster, die diagnostisch eingesetzt werden können (Restriktionslängenpolymorphismus, RFLP). Bei der Sondenhybridisierung wird eine zur Target-DNA komplementäre Nukleotidsequenz markiert und kann zum Nachweis der Target-Nukleinsäure verwendet erden. Diese Gensondenhybridisierung kann in Flüssigkeiten und auch direkt in Zellen durchgeführt werden. Voraussetzung ist, dass die Nukleinsäure frei liegt, d.h. nicht von Proteinen oder anderen Zellbestandteilen blockiert ist. Als in-situ-hybridisierung wird die Gensondenhybridisierung in intakten Zellen oder Gewebe eingesetzt und erlaubt so die Lokalisation der Infektion. In Kombination mit einer PCR wird die Gensondenhybridisierung im sog. Echtzeit- PCR-Verfahren eingesetzt. Die Sequenzierung von PCR-Produkten ist eine Möglichkeit, das erhaltene Amplifikat zu identifizieren und somit auch seine Spezifität zu sichern. Eine weitere Anwendung ist die Genotypisierung von Virusisolaten. Diese Fragestellung steht vornehmlich bei Resistenzuntersuchungen und molekularepidemiologischen Untersuchungen im Vordergrund. Als diagnostische Standardmethode der medizinischen Virologie wird die PCR je nach Fragestellung in einer Reihe von Varianten eingesetzt (z.b. RT-PCR, nested PCR). Zur Überwachung einer antiviralen Therapie (HIV, HCV, HBV, CMV, etc.) und zum Monitoring von Transplantationen (solide Organe, Knochenmark) ist die Bestimmung der Viruslast erforderlich. Dafür wird in der Regel eine quantitative PCR eingesetzt. Als Methode der Wahl hat sich die sogenannte Echtzeit (real-time) PCR mit Taqman- oder LightCycler-(FRET)-Technologie durchgesetzt. Die Quantifizierung der PCR-Produkte durch real time PCR beruht auf dem Prinzip der Sondenhybridisierung. In diesen Verfahren wird zyklusgenau mittels optischer Messung die Menge der entstandenen Amplifikate, an die markierte Proben hybridisiert haben, gemessen. Als Nachweissystem dient ein Fluoreszenzsignal. Dieses Signal kann nur entstehen, wenn bestimmte Voraussetzungen erfüllt sind. Bei der FRET-Technologie wird ein Sondenpaar verwendet. Beide Sonden tragen unterschiedliche Markierungen, wobei die eine Sonde am 3 -Ende und die andere Sonde am 5 -Ende markiert ist. Während der Annealingphase müssen beide Sonden

12 so an die DNA (Target oder Amplifikat) binden, dass der Abstand zwischen den beiden Sonden maximal 5 Nukleotide beträgt. Die Sonde mit der Markierung am 3 - Ende wird durch Licht spezifischer Wellenlänge (λ=488nm) angeregt, während der Marker an der anderen Sonde nicht angeregt wird. Haben beide Sonden auf der Zielsequenz gebunden, regt das Emissionslicht der einen Sonde das Markermolekül an der benachbarten Sonde an (Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, FRET). Die daraufhin von der 5 -markierten Sonde emittierte Fluoreszenz (λ= nm) wird vom Gerät gemessen. Der Energietransfer kann nur bei gebundenen Sonden erfolgen, nicht bei Sonden, die in Lösung vorliegen. Während der Extensionsphase werden die Sonden vom Target verdrängt und stehen für eine erneute Hybridisierung im nächsten Zyklus zur Verfügung. Im Verlauf der PCR nimmt mit Zunahme des Amplifikates auch die Sondenhybridisierung zu. Daraus resultiert ein Ansteigen der durch die Sondenbindung verursachten Fluoreszenzausbeute, die Zunahme des PCR-Produktes kann dadurch indirekt von Zyklus zu Zyklus verfolgt werden. Durch den Vergleich einer unbekannten Probe mit definierten Standards bekannten DNA-Gehaltes kann die Zahl der Genomäquivalente ermittelt werden. Die exponentielle Amplifikation eines spezifischen Fragmentes läuft allerdings nicht beliebig weiter, nach Zyklen ist aufgrund einer sinkenden Effizienz nur noch eine lineare Zunahme zu beobachten. Was in erster Linie auf die sinkende Aktivität der Taq-Polymerase zurückzuführen ist. Ihre Konzentration reicht in den hohen Zyklenzahlen nicht mehr zur Amplifikation aller Targetmoleküle aus. Bei welcher Zykluszahl das Plateau erreicht wird, hängt außerdem von der Ausgangskonzentration der zu amplifizierenden DNA ab

13 Übungs- und Verständnisfragen: 1. Beschreiben Sie das Prinzip der PCR! 2. Was sind die Vorteile und die Risiken der PCR? 3. Wann ist eine PCR-Untersuchung sinnvoll? Geben Sie Beispiele an! 4. Nennen Sie den Unterschied zwischen qualitativer und quantitativer PCR! 5. Wie kann eine Mutation molekularbiologisch nachgewiesen werden? 6. Welche Formen der Mutation gibt es? 7. Worin besteht der Vorteil einer PCR im Vergleich zu serologischen Methoden und zur Virusisolation? 8. Welche Faktoren können ein PCR-Ergebnis negativ beeinflussen? 9. Worin bestehen Unterschiede bezüglich der Testprinzipien zwischen einer insitu-hybridisierungsreaktion und einer PCR? 10. Für welchen Patientenkreis können persistierende Viren zum Problem werden? 11. Bei welchen Virusinfektionen wird die PCR zum Therapiemonitoring eingesetzt? 12. Welche klinischen Konsequenzen sind durch das Auftreten einer Mutation möglich? 13. Wann sollte eine PCR-Untersuchung quantitativ erfolgen? 14. Schließt ein negativer PCR-Befund eine gerade ablaufende Infektion mit Sicherheit aus? 15. Welche Rolle spielt die Auswahl des Untersuchungsmaterials? 16. Welche diagnostische Aussage läßt ein positiver PCR-Befund zu? 17. Welche klinische Bedeutung hat eine positive PCR-Reaktion (HIV, HBV, HSV, EBV, RSV, Influenzaviren)?

14 3. Teil: ZELLKULTURMETHODEN ZUM NACHWEIS VON VIRUSINFEKTIONEN Als obligat intrazelluläre Erreger können Viren nur in Zell- oder Organkulturen (sowie in Versuchstieren) angezüchtet werden. Die Infektion erfolgt dabei über spezifische Rezeptoren. Die resultierende Virus-Zell-Interaktion ist aufgrund der durch die Viren bewirkten Umprogrammierung des zellulären Syntheseapparates lytisch (zellzerstörend) oder nicht-lytisch. Im Fall einer chronischen (persistierenden) oder transformierenden Infektion sind die Zellen gewissermaßen einer doppelten Belastung ausgesetzt, da sie neben dem eigenen Stoffwechsel (Anabolismus zur Selbsterhaltung) auch die Virussynthese bewältigen müssen. In solchen persistierend infizierten Zellen bleibt der zelluläre Vitalstoffwechsel aufrechterhalten, während sog. Luxusfunktionen, wie beispielsweise Hormonproduktion, beeinträchtigt sein können. Bei virusinduzierter Transformation werden beispielsweise die Regelmechanismen der Kontaktinhibition außer Kraft gesetzt, mit denen normalerweise das Zellwachstum kontrolliert wird. Zu den direkten Schädigungen der infizierten Zelle kommen indirekte (sekundäre) Schädigungen hinzu, die meist den Gesamtorganismus betreffen. Einige dieser Sekundärschäden sind immunologisch bedingt und können zur Immunpathogenese einer Infektion beitragen oder zu Autoimmunreaktionen und Autoimmunerkrankungen führen. Zu den sekundären Effekten einer Virusinfektion gehört auch die Freisetzung pyrogener Stoffe wie IL-1 und TNF-, sowie die Induktion von Lymphokinen, Chemokinen und Zytokinen, wobei im Genom einiger Viren kodierende Sequenzen für Proteine mit entsprechender Homologie und Wirkung vorhanden sind. Die Konsequenzen einer viralen Infektion für die Wirtszelle hängen entscheidend von der Vermehrungsstrategie (Replikationsstrategie) des Virus ab. Das Spektrum reicht von der latenten (zunächst folgenlosen) Persistenz episomaler Genome (wie bei HSV) bis zum Zelltod (Nekrose, Apoptose) innerhalb weniger Stunden nach Infektion (Poliovirus) oder zur Immortalisierung der Zelle durch Deregulierung des Zellzyklus (Papillomviren). In jedem Fall haben Viren Möglichkeiten entwickelt, den kompletten Syntheseapparat der Zelle (Nukleinsäureund Proteinsynthese) so zu beeinflussen, dass vorzugsweise virale Produkte hergestellt werden. Dieser Prozeß wird auch als host-shut-off bezeichnet. Die zugrundeliegenden Mechanismen beruhen auf intrazellulären Ereignissen: 1. Interaktion mit dem Transkriptionsapparat: Blockade der zellulären Transkription durch RNA-Viren mit der Konsequenz, dass keine neuen zellulären mrna-moleküle mehr gebildet werden, wodurch die Nukleotide der viralen RNA-Synthese zur Verfügung stehen. Bei DNA-Viren kennt man verschiedene Interaktionen. Eine sehr erfolgreiche besteht im Einbringen von Virusproteinen, die mit zellulären Transkriptionsfaktoren interagieren und so die Transkription viraler DNA präferentiell ermöglichen

15 2. Interaktion mit der zellulären RNA-Prozessierung: Beeinflussung der posttranskriptionellen Prozessierung von zellulärer RNA (z.b. Blockade des Kernexportes durch HSV-Proteine). 3. Interaktion mit dem Translationsapparat: zelluläre mrnas haben am 5 -Ende eine cap - Struktur für die Bindung an Ribosomen. Enteroviren haben stattdessen sog. IRES (internal ribosomal entry sites), die es ermöglichen ohne cap-struktur die Translation zu initiieren. Während der Replikation von Enteroviren wird durch ein virales Protein die proteolytische Spaltung des zellulären Proteins induziert, das für die Bindung der capmrna an Ribosomen notwendig ist. Dadurch wird die Translation ungecapter (viraler) RNA bevorzugt und im Endeffekt die zelluläre Proteinsynthese komplett abgeschaltet. 4. Interaktion mit der DNA-Synthese, wobei gegenläufige Prozesse zum Tragen kommen. Einerseits kann unkontrollierte Zellproliferation induziert werden, wenn davon die Replikation des viralen Genoms abhängig ist (insbesondere bei onkogenen Viren wie Papillom-, Polyom und bestimmten Herpesviren), andererseits kann die zelluläre DNA- Synthese reduziert werden, um vom intrazellulären Pool der DNA-Bausteine mehr für die virale DNA-Synthese zur Verfügung zu haben. 5. Modifikation zellulärer Proteine: z.b. virale Proteine mit Proteinkinaseaktivität (bei viralen Onkogenen) oder virale Proteasen der Myxo- und Retroviren, die auch zelluläre Proteine spalten. Diese intrazellulären Vorgänge werden in einem begrenzten Spektrum an morphologischen Veränderungen der Wirts-Zielzellen sichtbar, die als zytopathogene oder zytopathische Effekte (CPE) bezeichnet werden. Dazu gehören im Rahmen der zytolytischen Virus-Wirt-Interaktion, bei der die zellulären Erhaltungsfunktionen beeinträchtigt sind, Nekrose und Apoptose, intrazelluläre para-kristalline (aus Virusproteinen bestehende) Einschlusskörperchen, mit toxischer Wirkung auf die Wirtszelle, sowie die Ausbildung von Synzytien, mehrkernigen Riesenzellen, die durch virusproteinvermittelte Zellfusion, z.b. F-Protein von Masernvirus oder gp41 von HIV entstehen. Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik In der medizinischen Virologie wird neben anderen direkten Nachweisverfahren die Virusisolation verwendet. Die Virusisolation ist ein aufwändiges Verfahren. Sie stellt hohe apparative und raumtechnische Anforderungen und erfordert geschultes hochqualifiziertes Personal. Bis aussagekräftige Ergebnisse vorliegen kann relativ viel Zeit vergehen, die oft insbesondere, wenn die klinisch tätigen Kollegen therapeutische Hinweise aus dem Ergebnis einer virologischen Untersuchung erwarten nicht zur Verfügung steht bzw. nicht akzeptiert wird. Zudem sind einige Viren nur sehr schwer oder unter sehr eingeschränkten Bedingungen anzüchtbar (z.b. Hepatitis B-Virus, Parvovirus B19, bestimmte Adenoviren), andere können derzeit noch gar nicht in einem in vitro-system kultiviert werden (Hepatits C-Virus, Papillomviren). Daher werden zunehmend Nachweismethoden für viralen Proteine oder Nukleinsäure als Ersatz für den Nachweis eines replikationsfähigen Virus herangezogen. Die dafür verwendeten Methoden (z.b. PCR, in-situ-hybridisierung, Immunfluoreszenz und EIA zum Antigennachweis, vgl. Tabelle 1) geben in der Regel schnellere Informationen zum potentiell für ein klinisches Symptom oder eine Erkrankung verantwortlichen Agens. Allerdings haben die molekularen Methoden Grenzen

16 Zum einen wird lediglich Nukleinsäure, nicht ein vermehrungsfähiges Viruspartikel nachgewiesen. Damit ist die Unterscheidung einer aktiven von einer latenten Infektion häufig nicht möglich und es ist kein direkter Rückschluss auf die Infektiosität des betroffenen Patienten möglich. Zum anderen ist bei persistierenden (insbesondere bei latenten) Infektionen der Nachweis von viralem Genom in bestimmten Geweben diagnostisch nicht sicher verwertbar (beispielsweise hat der Nachweis von CMV- oder EBV-Gensequenzen in zirkulierenden Leukozyten des Bluts per se keinen Krankheitswert; und Polyomaviren kommen im Urin z.b. bei Schwangerschaft physiologischerweise vor). Methode Erreger (Beispiele) Erregerbestandteil Material Virusisolation fast alle Viren* infektiöse Viruspartikel Abstrich, Biopsie, Liquor, Urin Polymerase-Ketten- Reaktion (PCR) Herpesviren, HIV, Hepatitisviren Genabschnitte aus kodierenden oder nichtkodierenden (IE- oder NSP-Gene) Sequenzbereichen Körperflüssigkeiten, Gewebe In-situ-Hybridisierung (ISH) HPV 1/3 des Genoms Abstrich, Biopsie Immunfluoreszenz (IFA) RSV F-Protein (generell Einzelproteine) Exfolierte Zellen in Rachenspülwasser Enzym-Immun-Assay (EIA) HBV, HIV HBs- und/oder HBe- Antigen, HIV-p24-Antigen Serum Elektronenmikroskopie Rotaviren Virion Stuhlprobe Tabelle 1. Methodenspektrum zum direkten Nachweis viraler Erreger und das dafür geeignete Untersuchungsmaterial Abkürzungen: HBV = Hepatitis B Virus, HPV = Humanes Papillomvirus; RSV = Respiratory-Syncytial- Virus; IE-Gene = immediate early-gene, SP-Gene = Gene, die für virale Strukturproteine kodieren *Nichtkultivierbare Viren sind z.b. HBV, HCV, Papillomviren Einige Viren weisen diagnostisch verwertbare ultrastrukturelle Charakteristika auf. Die direkte Darstellung von Viren mit dem Elektronenmikroskop erfolgt im wesentlichen durch Negativkontrastierung oder durch Dünnschnitte. Die elektronenmikroskopischen Verfahren sind für die Darstellung neuer Viren unverzichtbar. Zellkultur Zellen können entweder als adhärente (stationäre) oder als Suspensionskulturen gezüchtet werden. Die adhärenten Zellkulturen wachsen als sogenannte Monolayer (einschichtige Zellrasen). Da die permanenten Zelllinien (s.u.) in der Regel transformiert sind, können sie mehrschichtig wachsen oder sie stellen das Wachstum

17 ein und lösen sich schließlich aus dem Zellverband. Welchen Weg eine Zelllinie einschlägt, hängt an der Expression eines Glykoproteins in der Zellmembran, dem Kontaktinhibin, das normalerweise nach Bindung an seinen Rezeptor eine Signalkette für die Hemmung der Zellteilung anregt. Man unterscheidet: 1. Primärzellkulturen: Dabei handelt es sich um Zellkulturen aus frischem Organmaterial (z.b. RK (rabbit kidney)-zellen zur Anzucht von Herpesviren u.a.). Primärzellkulturen sind aufwendig herzustellen. Ihre Lebensdauer ist begrenzt. Meist gelingt es nicht, sie über mehr als Passagen zu züchten (kultivieren). 2. Diploide Zellen (semipermanente Zelllinien) können für bis zu 100 Passagen kultiviert werden. Danach altern sie rasch und überleben weitere Passagen nicht mehr. Beispiele für diploide Zellkulturen sind humane Fibroblasten, die sich zum Nachweis und zur Isolation von Herpesviren, Enteroviren oder Adenoviren eignen. 3. Permanente Zelllinien können durch Subkultivierung (auch Passage genannt) über lange Zeit vermehrt werden. Eine Zellpopulation wird im Allgemeinen als permanente Zelllinie bezeichnet, wenn sie mindestens 70mal erfolgreich subkultiviert wurde. Permanente Zelllinien stammen oft von Tumorgewebe ab oder sind durch onkogene Viren bzw. deren Gensequenzen transformiert. Deshalb weisen sie Eigenschaften von Tumorzellen auf, z.b. eingeschränkte Kontaktinhibition, Immortalisierung, Bildung wachstumsstabilisierender Faktoren inklusive entsprechender Rezeptoren in eigener Regie, teilweiser oder vollständiger Verlust der Steuerbarkeit der Zellproliferation von außen (autonomes Wachstum). Als obligate Zellparasiten können Viren ohne Nutzung zellulärer Stoffwechselleistungen nicht überleben bzw. sich vermehren. Häufig werden die Zellen durch den aufgezwungenen Stoffwechsel geschädigt. Anzeichen dafür ist der sogenannte zytopathische Effekt (CPE), die Zellen werden mikroskopisch sichtbar verändert und/oder gehen zugrunde. Der CPE kann verschiedene Formen annehmen: Rundzellige, traubenförmige Zelldegeneration Rundzellige, diffuse Degeneration Polymorphzellige, diffuse Zelldegeneration Mehrkernige Riesenzellen und Synzytien sowie vakuolige (schaumzellartige) Zellveränderung Die Zellveränderungen sind nicht virusspezifisch und lediglich ein Hinweis auf die Infektion mit Viren. Aus dem CPE kann nicht eindeutig auf die Identität des verursachenden Virus geschlossen werden. Die Identifizierung der Viren erfolgt über Immunfluoreszenz oder Immunperoxidasetechniken unter Verwendung von virusspezifischen meist monoklonalen Antikörpern. Einige Viren rufen einen zytopathischen Effekt bereits nach 24 Stunden hervor, bei den meisten dauert es Tage bis Wochen

18 In den Tabellen 2 und 3 sind beispielhaft in Zellkultur isolierbare humanmedizinisch relevante Viren und deren charakteristischer CPE zusammengefasst. Wirt Primäre Zellkulturen Affennierenzellen Kaninchen-Nierenzellen (RK) Humane embryonale Nierenzellen (HEK) Virus Influenza-, Parainfluenza-, Enteroviren Herpes Simplex Virus Adenoviren, Enteroviren Diploide Zellkulturen Humane Fibroblasten (MRC-5 oder WI-38) CMV, VZV, HSV, Rhinoviren, einige Enteroviren, Adenoviren, RSV Permanente Zelllinien Hep2 (humanes Epidermoidkarzinom des Larynx) A549 (Humanes Lungenkarzinom) MDCK (Hundenierenzellen) LLC-MK2 (Rhesusaffen-Nierenzellen) Rhabdomyosarkom (RD) Verozellen (African green monkey kidney) HeLa (humanes Zervixkarzinom) RSV, Adenoviren, HSV, Masernvirus, einige Parainfluenzaviren, einige Enteroviren HSV, Adenoviren, Enteroviren Influenzaviren Parainfluenzaviren Echoviren Coxsackie-, Masern-, Mumpsviren Adenoviren Tabelle 2: Häufig für die Virusisolation verwendete Zellkulturen Abkürzungen: CMV = Zytomegalievirus; VZV = Varizellen-Zoster-Virus; HSV = Herpes- Simplex-Virus; RSV = Respiratory-Syncytial-Viru Virus Zelllinie Effekt Enteroviren (Polio-, Echo-, Coxsackieviren) HeLa-Zellen rundzellige, diffuse Zelldegeneration Herpesviren (HSV, CMV, VZV) Adenoviren Paramyxoviren (Masern- u. Mumpsvirus) Fibroblasten HeLa-Zellen (Fibroblasten) Vero-Zellen, (Lymphozyten) Aufblähung der Zellen, intranukleäre Einschlüsse traubenförmige abgerundete Zellen, intranukleäre Einschlüsse mehrkernige Riesenzellen (Syncytien) HIV CD4 + -Lymphozyten mehrkernige Riesenzellen (Syncytien) RSV Hep2-Zellen mehrkernige Riesenzellen (Syncytien) Tabelle 3: Morphologische Veränderungen, die in Zellkulturen durch humanpathogene Viren hervorgerufen werden. Weitere Viren, die routinemäßig isoliert werden können sind Influenza- auf MDCK-Zellen und Parainfluenzaviren auf Hep2- sowie LLC-MK2-Zellen

19 Methodische Grundlagen der Zellkultur Die Zellen werden in sterile Gewebekulturflaschen ausgesät und unter optimalen Bedingungen (mit 5% CO 2 begaster Brutschrank) kultiviert. Um das natürliche Milieu der Zellen weitgehend zu erreichen, werden den Medien spezielle Zusätze beigefügt: fetales oder neonatales Kälberserum (2-5%) u.a. als Quelle für Spurenelemente, Hormone, etc. Antibiotika zur Vermeidung bakterieller Kontaminationen, gebräuchlich sind Penicillin G (100 IE/ml) und Streptomycin (100 µg/ml), ggfs. auch Gentamycin Um die Arbeiten unter sterilen Bedingungen durchführen zu können, braucht man aufwändige Geräte (spezielle Werkbänke mit laminarem Luftstrom und viren- und bakteriendichten Abluftfiltern, Autoklaven zum Sterilisieren von Reagenzien und für die Abfalldekontamination) sowie sterile Kulturgefäße (z.b. aus Glas oder Plastik). Der für eine Virusisolation erforderliche Zeitbedarf variiert erheblich und kann mehrere Wochen betragen. Außer den Adaptationsprozessen an die Wachstumsbedingungen unter Laborbedingungen spielt die unterschiedlich lange Eklipse von Viren eine wesentliche Rolle. Unter Eklipse versteht man den Zeitraum zwischen dem Verlust der Virushülle bzw. des Kapsids bei der Penetration der Wirtszellmembran bis zum Auftreten neuer infektiöser (reifer) Viruspartikel außerhalb der Zelle. Störfaktoren der Zellkultur: Die Kontamination von Gewebekulturen durch Mykoplasmen stellt eines der Hauptprobleme dar, wenn mit Zellkulturen gearbeitet wird, da sie Bakterienfilter (Porengröße 0,22 µm) passieren. Mykoplasmen können Veränderungen in infizierten Zellen verursachen, ohne zunächst morphologisch faßbar zu sein. Es kommt zu einer Verlangsamung des Zellwachstums und einer auffälligen Resistenz für die Infizierbarkeit mit Viren von ursprünglich permissiven Zellen. Mykoplasmen sind gegen die üblicherweise verwendeten Antibiotika resistent (sensibel z.b. gegen Ciprofloxacin = Gyrasehemmer). Eine Möglichkeit zum Nachweis von Mykoplasmen besteht mit DAPI, einem Fluoreszenzfarbstoff, der selektiv an DNA bindet und starke Komplexe mit hoher Spezifität ausbildet. Bei einer Mykoplasmen-kontaminierten Zellkultur findet man extrazelluläre, in der Regel perlschnurartig an den Zellmembranen aufgereihte fluoreszierende Punkte uniformer Größe ( nm) und gelegentlich intrazelluläre (extranukleäre) Fluoreszenz. Pilzinfektionen (besonders Hefen, Candida spp.), übertragen durch Luft insbesondere in der trockenen Jahreszeit, und gramnegative Bakterien, meist aus Probenmaterial von Patienten, sind weitere Kontaminationsrisiken, die eine erfolgreiche Virusisolation behindern. Generell machen unsteriles Arbeiten, unzureichend sterilisierte Pipetten und Gewebekulturflaschen etc. eine zuverlässige Zellkulturarbeit und damit eine verwertbare Aussage von Virusisolationsversuchen unmöglich. Virustitration und Plaque-Assay Dafür, dass eine Viruskrankheit entsteht, ist nicht nur die Anwesenheit des Erregers allein verantwortlich, sondern auch seine Quantität. Bei der quantitativen Bestimmung des Virusgehaltes einer Suspension werden gleichmäßig in Zehnerpotenzen abgestufte Verdünnungen auf eine festgelegte Zahl von empfänglichen Zellen verimpft. Die kleinste Virusmenge, die eine Infektion in Zellen hervorrufen kann, wird infectious unit (IU) oder plaque forming unit (PFU) genannt. Beim Plaquetest wird ausgenutzt, dass die Virusinfektion diskrete Veränderungen in einem Zellrasen hervorruft. Nach einigen Tagen entstehen durch das Absterben der infizierten Zellen Löcher im Zellrasen (sogenannte Plaques), die besser sichtbar sind, wenn mit einem Vitalfarbstoff die lebenden (nicht

20 infizierten) Zellen angefärbt werden. Die Plaques erscheinen dann bereits bei makroskopischer Betrachtung als weiße Löcher im blau (Kristallviolett) oder rot (Neutralrot) gefärbten Zellrasen. Die Anzahl der Plaques ist direkt proportional zur eingesetzten Virusmenge. Bei der Endpunktverdünnungsmethode wird der Virusgehalt einer Probe nach dem Prinzip des Alles-oder-Nichts unter Verwendung mathematischer Verfahren bestimmt. Es wird die mittlere Infektionsdosis (TCID 50 ), d.h. die Virusmenge, bei der mindestens die Hälfte der Zellen infiziert wurde und einen deutlichen CPE zeigt (TCID = tissue culture infectious dosis), abgeschätzt

21 Übungs- und Verständnisfragen: 1. Worin besteht der prinzipielle Unterschied bei der Anzucht von Viren und Bakterien? 2. Wie wird gewährleistet, dass Zellkulturen steril gehalten werden können? 3. Sind Viren lichtmikroskopisch nachweisbar? 4. Was versteht man unter Virämie? 5. Definieren Sie Viruspersistenz sowie die Begriffe chronische und latente Infektion anhand von Beispielen. 6. Skizzieren Sie die Pathogenese von Virusinfektionen an Beispielen (Poliovirus, Masernvirus, Varizelle-Zoster-Virus). 7. In welche Stadien wird Virus-Wirt-Interaktion eingeteilt? 8. Welche Möglichkeiten gibt es, Viren die keinen zytopathischen Effekt hervorrufen, trotzdem in einer Zellkultur sichtbar zu machen? 9. Ist ein zytopathischer Effekt virusspezifisch? 10. Ist es notwendig, zur Anzucht von Viren Zellkulturen aus verschiedenen Organen einzusetzen? Gibt es eine Universalzellkultur? 11. Wenn man sich hinsichtlich der morphologischen Veränderungen unsicher ist, um welches Virus es sich handelt, welche Nachweismethoden kann man heranziehen, um das potentielle Virus zu identifizieren? 12. Was ist bei Materialentnahme und Probentransport ins Labor zu beachten, wenn eine Virusisolation in Auftrag gegeben wird, damit ein optimaler Erfolg bei der Virusisolation möglich ist? 13. Bei welchen der im Folgenden aufgeführten klinischen Symptomen ist eine Virusisolation sinnvoll? Welches Material wird sinnvollerweise in erster Linie verwendet? - Gastroenteritis - Makulo-papulöses Exanthem - Atemwegsinfektionen - Intrauterine Infektionen - Perinatale Infektionen - Reaktivierte HSV-, VZV- oder CMV-Infektionen - Enzephalitis, Meningitis - Hepatitis - Unklares Fieber (FUO) - Infektiöse Mononukleose - AIDS

22 4. Teil INFEKTIONSPRÄVENTION IN DER ZAHNHEILKUNDE I. Allgemeines In der Zahnheilkunde bestehen für Patienten und in diesem Bereich Tätigen aufgrund der Besonderheiten der zahnärztlichen Behandlung verschiedene Infektionsrisiken. Diese Risiken können entscheidend verringert werden durch Anamneseerhebung Wirksame Hygienemaßnahmen Methoden der Arbeitssystematik (z.b. Grundregel der Nichtkontamination) sowie durch anerkannte Technologien In der Zahnheilkunde sind die folgenden Übertragungswege für Krankheitserreger relevant: direkter Kontakt mit Blut, Speichel oder anderen potenziell infektiösen Sekreten einschließlich Spritzer von Blut, Speichel, nasopharyngealen Sekreten auf intakter oder verletzter Haut oder Schleimhaut Indirekte Übertragung z. B. über kontaminierte Instrumente, zahntechnische Materialien, Werkzeuge oder Hände, Aerosolbildung mit kontaminiertem Wasser aus Behandlungseinheiten bzw. aus dem Mundraum des Patienten. Zu den Krankheitserregern, die in der Zahnheilkunde sowohl für Patienten als auch für das Personal potenziell von Bedeutung sind, zählen z.b. durch Blut übertragene Erreger wie: Hepatitis-B-Viren (HBV) Eine Infektion mit Hepatitis B Viren führt in ca. 1/3 der Fälle zu einer ikterischen Hepatitis. Eine akute Hepatitis- B- Infektion hat bei Erwachsenen eine gute Prognose. Die Infektion heilt in > 95% der Fälle spontan aus, bei weniger als 5% der Patienten tritt eine Chronifizierung ein. In ca. 1% der Fälle tritt ein fulminanter Verlauf mit dem Risiko eines Leberversagens auf. Durch eine frühe Therapie mit Lamivudin können bei einer fulminanten Hepatitis B vermutlich ein Leberversagen und eine Lebertransplantation vermieden werden. Prävention: Eine erfolgreiche Impfung gegen Hepatitis B-Virus stellt die effektivste Prävention gegenüber einer HBV-Infektion dar. Die Hepatitis-B-Impfung ist daher u.a. für alle Mitarbeiter medizinischer Berufe oder Angehörige infizierter Patienten eindeutig zu empfehlen. Das Standard-Impfschema umfasst intramuskuläre Impfungen zu den Zeitpunkten Monate. In Ausnahmefällen, in denen nicht genügend Zeit zur Vervollständigung des Grundschemas zur Verfügung steht, können i.m.-injektionen an den Tagen erfolgen