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Kerstin Jaeger
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1 Zellkultur

2 Zellkultur Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem Nährmedium außerhalb des Organismus Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können (Permanente Zelllinien) Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur) Primärkultur = eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde

3 Zelllinien Zelllinie Herkunft Spezies Gewebe Morphologie HEK-293 human embryonic Mensch Niere Epithel Kidney HeLa Henrietta Lacks Mensch Zervixkarzinom Epithel CHO Chinese hamster Hamster Ovarien Epithel ovary Sf-9 Spodoptera Insekt Ovar Epithel frugiperda (Nachtfalter) bend.3 brain endothelial Maus Gehirn/Cortex Endothel

4 Zelllinien HEK-293 Zellen HeLa-Zellen Adhärente CHO-Zellen Sf-9-Zellen

5 Zellkulturlabor und Einrichtung

6 Zellkulturmedien Zusammensetzung von Standardmedien: anorganische Salze Aminosäuren Kohlenhydrate Vitamine Peptide und Proteine Lipide und Fettsäuren Spurenelemente

7 Medienzusätze L-Glutamin Natriumpyruvat Nichtessentielle Aminosäuren Natriumbicarbonat Phenolrot Serum/ fetales Kälberserum

8 Zellkulturmethoden zum Nachweis von Virusinfektionen Als obligat intrazelluläre Erreger können Viren nur in Zell oder Organkulturen (sowie in Versuchstieren) angezüchtet werden! Konsequenzen einer viralen Infektion für die Wirtszelle hängen von Vermehrungstrategie (Replikationsstrategie) des Virus ab

9 Konsequenzen Latente Persistenz episomaler Genome (HSV) Zelltod (Nekrose, Apoptose) (Poliovirus) Immortalisierung durch Deregulierung des Zellzyklus (Papillomviren)

10 Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik Methode Erreger Erreger- Material bestandteil Virus- fast alle Viren infektiöse Abstrich, isolation Partikel Biopsie, Liquor, Urin PCR alle Viren Genabschnitte Serum, Plasma, Vollblut, Liquor, Biopsien, Urin, Abstriche, etc. Antigen- Respiratorische virale Antigene zellhaltiges Material nachweis Viren (z.b. Abstriche) (Immunfluoreszenz)

11 Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik Methode Erreger Erregerbestandteil Material IFA Respirations- einzelne Struktur- Exfolierte Zellen in trakt-viren proteine Abstrichen,Sekreten, Rachenspühlwasser ELISA HBV, HCV, HIV z.b. HBs-Antigen, Serum HBe-Antigen, p24-antigen Elektronen- Gastroenteritis-, Viruspartikel Stuhlprobe mikroskopie Herpes- und Bläscheninhalt Poxviren

12 Goldstandard - Virusanzucht Virusisolation = aufwendiges Verfahren hoher Zeitaufwand hohe apparativer und raumtechnischer Aufwand einige Viren nur sehr schwer und unter eingeschränkten Bedingungen anzüchtbar (HBV, Parvovirus B19, best. Adenoviren) einige können gar nicht in Zellen kultiviert werden (HCV, Papillomviren, Noroviren)

13 Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen Wirt Virus Primäre Zellkulturen Affennierenzellen Kaninchen-Nierenzellen (RK 13) Humane embryonale Nierenzellen (HEK) Influenza-, Parainfluenza-, Enteroviren HSV Adenoviren, Enteroviren Diploide Zellkulturen Humane Fibroblaten (MRC-5 oder WI-38) CMV, VZV, HSV, Rhinoviren, einige Enteroviren, Adenoviren, RSV

14 Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen Wirt Virus Permanente Zelllinien Hep 2 (humanes Epidermoid- RSV, Adenovirus, HSV, karzinom des Larynx) Masernvirus, einige Parainfluenza und Enteroviren A549 (humanes Lungenkarzinom) HSV, Adenoviren, Enteroviren MDCK (Hundenierenzellen) Influenzaviren LLC-MK2 (Rhesusaffen-Nierenzellen) Parainfluenza Rhabdomyosarkom (RD) Echoviren Verozellen (African green monkey Coxsackie-, Masern, Mumpsviren kidney) HeLa (humanes Zervixkarzinom) Adenoviren

15 Host shut - off 1. Interaktion mit Transkriptionsapparat 2. Interaktion mit zellulärer RNA-Prozessierung 3. Interaktion mit Translationapparat 4. Interaktion mit DNA-Synthese 5. Modifikation zellulärer Proteine

16 Zytopathischer Effekt (CPE) Intrazelluläre Vorgänge werden in einem begrenzten Spektrum an morphologischen Veränderungen sichtbar

17 CPE Rundzellige, traubenförmige Zelldegeneration bei Viren, die sich vornehmlich von Zelle zu Zelle, nicht aber über das Zellkulturmedium ausbreiten Rundzellige, diffuse Degeneration uniformer Zellen, die sich über die gesamte Kultur ausbreiten Polymorphzellige, diffuse Zellgeneration mit Ausbildung von sich aus dem Gewebeverband ablösenden Zellen

18 CPE Mehrkernige Riesenzellen und Synzytien des RSV-Fusionsproteins in das bhpiv3-virus

19 CPE vakuolige (schaumzellartige) Zellveränderung kommt im Frühstadium der Ausbildung eines CPE bei zahlreichen Viren vor Zellveränderungen sind nicht virusspezifisch und lediglich ein Hinweis auf die Infektion mit Viren! Aus dem CPE kann nicht eindeutig auf die Identität des verursachenden Virus geschlossen werden

20 CPE Identifizierung: Immunfluoreszenz, Immunperoxidasetechniken Einige Viren rufen CPE bereits nach 24 h hervor, andere erst nach Tagen bis Wochen

21 Beispiel HSV auf Verozellen Lichtmikroskopische Aufnahme Immunfluoreszenz

22 Störfaktoren in der Zellkultur Kontamination durch Mykoplasmen stellt Hauptproblem dar! Zellkerne Verozellen Mykoplasmen positive Verozellen Hoechst-Färbung Mykoplasmen DNA (im Cytoplasma)

23 Mykoplasmen können Bakterienfilter (0,22 µm Porengröße) passieren kleinste Vertreter der Prokaryoten gelten als Bakterien (Klasse: Mollicutes) haben Fähigkeit der Zellwandbildung verloren ~ 40 % aller Zellkulturen sind in Deutschland mit Mykoplasmen infiziert sein Hauptkontaminationsquelle: Mensch! (Rinder)

24 Auswirkungen eines Mykoplasmenbefalls auf Zellkultur ändern Parameter des Zellstoffwechsels Auswirkung auf: Validität Reproduzierbarkeit Signifikanz von Forschungsarbeiten Auswirkungen auf Zelle: verlangsamtes Zellwachstum Verminderung der Zellproliferation starke Ansäuerung des Mediums Absterben und Auflösung der Zellen Veränderung Membranintegrität Begünstigung von Viruswachstum und Infektionsrate u.v.m.

25 Störfaktoren in der Zellkultur Bakterien stellen den weitaus größten Teil der Kontaminationen im Zellkulturlabor dar Meist auf Missachtung bzw. Vernachlässigung der sterilen Arbeitstechniken oder auf Mängel in der Gerätewartung zurückzuführen Regelmäßige Kontrolle der Kulturen!

26 Bakterien

27 Antibiotika Lagerung, Haltbarkeit, Stabilität und Konzentration beachten! in der Zellkultur häufig verwendet: Penicillin G Streptomycin (Tylosin) Gentamycin

28 Störfaktoren in der Zellkultur Pilze und Hefen Optische Identifizierung Antimycotika: Amphoterzin-B Nystatin Scanning electron micrograph of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae Fadenpilz

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