Funktionelle Analyse nicht-konventioneller Signaltransduktionswege bei der Morphogenese des Modellorganismus Sordaria macrospora

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1 Funktionelle Analyse nicht-konventioneller Signaltransduktionswege bei der Morphogenese des Modellorganismus Sordaria macrospora Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik vorgelegt von Jens Kamerewerd aus Bochum Bochum April, 2008

2 Functional analysis of non-conventional signal transduction pathways during morphogenesis of the model organism Sordaria macrospora Dissertation to obtain the degree Dr. rer. nat. Submitted to the International Graduate School of Biosciences, Faculty of Biology and Biotechnology at the Ruhr-Universität Bochum, Germany Thesis performed at the department of Allgemeine und Molekulare Botanik submitted by Jens Kamerewerd from Bochum Bochum April, 2008

3 Danksagung Ich danke Herrn Prof. Dr. Ulrich Kück, meinem akademischen Lehrer und Doktorvater, für die interessante Themenstellung, das mir entgegengebrachte Vertrauen, sein stetiges Interesse an der Fortführung der Arbeit, die wertvollen wissenschaftlichen Ratschläge und die geistige und materielle Unterstützung. Herrn Prof. Dr. Ralf Erdmann danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferats. Allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Lehrstuhls für Allgemeine und Molekulare Botanik danke ich herzlich für die fortwährende wissenschaftliche wie moralische Unterstützung. Vielen Dank für die schöne Zusammenarbeit. Ein besonderes Dankeschön gilt Frau Susanne Schlewinski für die Hilfe bei der Durchführung genetischer Arbeiten, die maßgeblichen Anteil an dieser Arbeit hatten. Des Weiteren möchte ich mich bei Frau Ingeborg Godehardt für die Durchführung verschiedener molekularbiologischer Arbeiten, bei Frau Swenja Ellßel für die Isolierung von RNA und bei Frau Elke Adolph für die Autoklaven-Arbeit bedanken. Frau Eva Szczypka danke ich für die Mitarbeit bei einigen Abbildungen. Ein herzlicher Dank gilt Frau PD Dr. Minou Nowrousian für die vielen wissenschaftlichen Diskussionen und Ratschläge. Bei meinen Doktorschwestern und Doktorbrüdern möchte ich mich die schöne Zeit bedanken und besonders Dr. Birgit Hoff, Dr. Ines Engh und Dr. Danielle Janus danke ich für manchen guten Zuspruch. Ohne die immerwährende Unterstützung durch meine Familie und meine Freunde wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Vielen Dank an Euch. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 480 Molekulare Biologie komplexer Leistungen von botanischen Systemen durch die DFG gefördert.

4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I. Einführung Einleitung Konservierte Signaltransduktionswege in Pilzen Die Phosphatidylinositol 3-Kinase und die Pheromonantwort von S. cerevisiae Lichtperzeption und -verarbeitung bei Pilzen Die Rot- und Blaulichtperzeption bei Pilzen Steuerung der circadianen Rhythmic durch den WCC...12 II. Problemstellung...14 III. Material und Methoden Materialien Stämme Plasmide und Cosmide Oligonukleotide Chemikalien und Verbrauchsmaterial Enzyme Häufig verwendete Puffer und Lösungen Nährmedien Methoden Kulturbedingungen Messung des vegetativen Wachstum von S. macrospora Transformationsverfahren Isolierung von Nukleinsäuren Gelelektrophoresen Extraktion von DNA aus Agarosegelen Radioaktive Markierung von DNA Hybridisierungen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Erzeugung von Doppel- und Dreifachmutanten camp-komplementation Sequenzierung Mikroskopische Analysen Bioinformatorische Methoden Sicherheitsbestimmungen...31

5 Inhaltsverzeichnis IV. Ergebnisse Funktionelle Analyse der Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK1) bei der Morphogenese von S. macrospora Annotation des ndk1-gens aus S. macrospora Erstellung eines ndk1-deletionskonstruktes mittels Fusions-PCR Erzeugung und Verifizierung von ndk1-deletionsmutanten Phänotypische Charakterisierung des Δndk1-Stammes und einer Retransformante Molekulare Charakterisierung der ndk1-mutante und der Δndk1::ndk1-Retransformante Funktionelle Analyse der Adenylatcyclase (SAC1) bei der Morphogenese von S. macrospora Annotation des sac1-gens aus S. macrospora Herstellung eines sac1-deletionskonstruktes mittels Fusions-PCR Erzeugung und Verifizierung von sac1-deletionsmutanten Phänotypische Charakterisierung des Δsac1-Stammes Restaurierung des sac1-phänotyps durch genetische und chemische Komplementation Analyse der genetischen Interaktion von sac1 mit Genen für drei α-untereinheiten heterotrimerer G-Proteine aus S. macrospora Analyse der genetischen Interaktionen von gsa1, gsa2 und gsa3 mit ste12 bzw. pro V. Diskussion Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora Nukleosiddiphosphat-Kinasen sind hochkonservierte Enzyme, welche eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Nukleotidpools übernehmen Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora beeinflusst das vegetative Wachstum des Pilzes Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 reguliert die positiv fototrope Anlage der Fruchtkörperhälse Wird die Expression der an einer putativen Blaulichtsignalkaskade beteiligten Gene durch NDK1 reguliert? Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora Pilzliche Adenylatcyclasen sind an Signalwegen beteiligt, die für Virulenz, asexuelle sowie sexuelle Vermehrung wichtig sind Die camp-synthese durch die Adenylatcyclase SAC1 und bisher unbekannte Enzymfunktionen beeinflussen das vegetative Wachstum von S. macrospora Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora ist an der Grenzschichtwahrnehmung beteiligt Die Ascosporenkeimung von S. macrospora wird über einen bei Pilzen konservierten Signalweg reguliert...84

6 Inhaltsverzeichnis 2.5 Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora ist zusammen mit der Gα-Untereinheit GSA3 an der Regulation der Ascosporenkeimung beteiligt und beeinflusst über die Interaktion mit dem parallelen Signalweg unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 die Bildung von Fruchtkörpern Die gsa-gene sind Komponenten eines komplexen genetischen Netzwerk zur Regulation der Fruchtkörperbildung...90 VI. Zusammenfassung...93 VII. Summary...96 VIII. Referenzen...99 IX. Anhang X. Curriculum vitae XI. Erklärung...124

7 Abkürzungsverzeichnis (d)ndps (Desoxy-)Ribonukleosiddiphosphate (d)ntps (Desoxy-)Ribonukleosidtriphosphate a. dest. destilliertes Wasser Amp Ampicillin ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare camp cyclisches Adenosin-3,5 -monophosphat CPT-cAMP camp-derivat, 8-(4-Chlorophenylthio) cyclisches Adenosin-3,5 -monophosphat d Tage DB-cAMP camp-derivat, N 6,2'-O cyclisches Dibutyryladenosin-3,5-monophosphat DNA Desoxyribonukleinsäure h Stunde Hyg Hygromycin Kan Kanamycin kb Kilobasen min Minute NaOAc Natrium-Acetat Neo Neomycin PCR Polymerase-Ketternreaktion ( polymerase chain reaction ) RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute ( rounds per minute ) rrna ribosomale RNA RT Raumtemperatur sek Sekunde ü.n. über Nacht Allgemein gebräuchliche Abkürzungen und Maßeinheiten sind nicht gesondert aufgeführt. Häufig verwendete Abkürzungen von Genen und Genprodukten cr-1 gsa1 gsa2 gsa3 hph ndk1 ndk-1 pro41 sac1 ste12 vvd wc1 wc-1 Gen für die Adenylatcyclase CR-1 aus N. crassa Gen für die Gα-Untereinheit GSA1 aus S. macrospora Gen für die Gα-Untereinheit GSA2 aus S. macrospora Gen für die Gα-Untereinheit GSA3 aus S. macrospora Gen für die Hygromycin B-Phosphotransferase aus E. coli Gen für die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1aus S. macrospora Gen für die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK-1aus N. crassa Gen für das an der sexuellen Entwicklung beteiligte PRO41-Protein aus S. macrospora Gen für die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora Gen für den Transkriptionsfaktor STE12 aus S. macrospora Gen für das Vivid-Protein (VVD) aus N. crassa und S. macrospora Gen für das white collar-protein WC1 aus S. macrospora Gen für das white collar-protein WC-1 aus N. crassa

8 I. Einführung I. Einführung 1. Einleitung Jeder lebende Organismus kann nur innerhalb einer bestimmten Umgebung, seiner biologischen Nische, existieren. Die biologische Nische entspricht dabei einer nichtstatischen Umwelt, in der verschiedene, für den Organismus wichtige Parameter variieren. Für ein optimales Wachstum und eine erfolgreiche Vermehrung muss er in der Lage sein, Veränderungen in seiner Umwelt zu erkennen, um entsprechend reagieren zu können. Die Signalwege, die dabei beschritten werden, sind innerhalb der Eukaryoten in ihrer Struktur und den beteiligten Komponenten häufig hoch konserviert. Daher können viele Erkenntnisse, die durch Untersuchungen von Signaltransduktionswegen in niederen Eukaryoten wie beispielsweise der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden auch auf höhere Eukaryoten übertragen werden. Wegweisende Arbeiten mit Sterilmutanten des Ascomyceten (Schlauchpilz) S. cerevisiae ermöglichten beispielsweise Anfang der 90er Jahre einen ersten Einblick in den Aufbau und die Funktion von MAP-Kinase-Kaskaden bei Eukaryoten. Bei der sexuellen Entwicklung von S. cerevisiae erfolgt die Aktivierung einer Phosphorylierungskaskade über insgesamt vier MAP-Kinasen (Ste20p, Ste11p, Ste7p und Fus3p), wobei Ste11p, Ste7p und Fus3p über das Gerüstprotein Ste5p in räumliche Nähe zueinander gebracht werden (Zhou et al. 1993, Choi et al. 1994, Wang und Dohlman 2004, Chen und Thorner 2007). Bedingt durch diese Homologie zu höheren Eukaryoten, die einfache Kultivierbarkeit, molekularbiologische Zugänglichkeit, und eine wachsende Anzahl von Genomdaten können verschiedene Pilze als Modellorganismen zum Studium von eukaryotischen Signaltransduktionskaskaden betrachtet werden. Dazu zählen beispielsweise Hefen der Ordnung Saccharomycetales (Ascomycetes), Hyphenpilze (Zygomycetes, Ascomycetes) und Ständerpilze (Basidiomycetes). Neben der Relevanz für die Grundlagenforschung besitzt die detaillierte Analyse pilzlicher Signalkaskaden eine große ökologische, ökonomische und medizinische Bedeutung. Als Beispiele sind hier die pflanzenpathogenen Pilze zu nennen, die in der Landwirtschaft besonders in Monokulturen schwere Schäden verursachen (Übersicht bei De Lucca 2007). Im klinischen Bereich können gerade immunsupprimierte Patienten wie Krebs-, HIV- oder Transplantationspatienten von lebensbedrohlichen Pilzinfektionen betroffen sein (Fridkin und Jarvis 1996, De Lucca 2007). Die Erforschung pilzlicher Signalkaskaden 1

9 I. Einführung bietet hier einen Ansatz, neue antimykotisch wirksame Substanzen zu entwickeln. Im folgenden Abschnitt werden die von Pilzen hauptsächlich genutzten Signalwege kurz erläutert. 2. Konservierte Signaltransduktionswege in Pilzen Zwei hoch konservierte eukaryotische Signalkaskaden, der MAP-Kinase- und der camp-signalweg, besitzen eine zentrale Rolle bei der Fortpflanzung, Entwicklung und Pathogenität von Pilzen (Übersicht bei Lengeler et al. 2000, D'Souza und Heitman 2001). Eine schematische Übersicht beider Signalwege ist in der Abbildung 1 dargestellt. Beide Wege beginnen in der Regel mit der Bindung eines Liganden an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor ( G protein coupled receptor, GPCR). G-Protein-gekoppelte Rezeptoren besitzen sieben alpha-helikale Transmembran- Domänen und einen extrazellulären N-Terminus sowie einen intrazellulären C-Terminus. Sie binden mit ihren extrazellulären Anteilen Liganden, während auf intrazellulärer Seite eine Interaktion mit heterotrimeren G-Proteinen stattfindet (Oldham und Hamm 2008). Heterotrimere G-Proteine, welche aus drei hochkonservierten Untereinheiten (α, β, γ) bestehen, vermitteln nachfolgend den Reiz weiter. Die Interaktion von Ligand und Rezeptor bewirkt einen Austausch von GTP gegen das an die inaktive Gα-Untereinheit gebundene GDP. Durch diese Aktivierung kommt es zur Dissoziation der Gα-Untereinheit vom Gβγ-Dimer, wobei sowohl Gα wie auch Gβγ an der Reizweiterleitung beteiligt sein können (Übersicht bei McCudden et al. 2005, Oldham und Hamm 2008). Mitogen-aktivierte Proteinkinasen, sogenannte MAP-Kinasen, übertragen nach Aktivierung durch die G-Protein-Untereinheiten das Signal mittels Phosphorylierung zweier weiterer MAP-Kinasen (Abb. 1A). Am Ende der Kaskade werden Effektoren wie Transkriptionsfaktoren phosphoryliert, wodurch sich ihre Aktivität ändert und eine zelluläre Antwort auf den Reiz ausgelöst wird (Abb. 1A). 2

10 I. Einführung Abb. 1: Schematische Darstellung der beiden von Pilzen hauptsächlich genutzten Signalwege. Beide Signalwege beginnen mit der Reizperzeption und der Signalweiterleitung über G-Proteine: Rot dargestellt sind Moleküle des Liganden, welche extrazellulär an den G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) binden. Intrazellulär ist das aus Gα-, β- und γ-untereinheit bestehende heterotrimere G-Protein eingezeichnet, welches infolge des Reizes und dem resultierenden Austausch von GDP gegen GTP dissoziiert. Sowohl Gα als auch Gγ besitzen Membrananker (dargestellt als Appendices), weshalb sie mit dem Lipidbilayer der Plasmamembran (hellgrau) assoziiert sind. (A) MAP-Kinase-Kaskade. Gelb hinterlegt sind die MAPKKK, MAPKK und MAPK (MAP-Kinase Kinase Kinase, MAP-Kinase Kinase und MAP- Kinase), die das Phosphorylierungssignal auf den Effektor (hellrot) weiterleiten. (B) camp- Signalweg. Die Adenylatcyclase synthetisiert unter ATP-Verbrauch camp, welches die Proteinkinase A (PKA) aktiviert (gelb hinterlegt). Am Ende der Kaskade befindet sich der Effektor (hellrot), dessen Funktion durch die Phosphorylierung moduliert wird. Sowohl die Komponenten der MAP-Kinase-Kaskade wie auch die Adenylatcyclase sind an der Plasmamembran lokalisiert, was aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht berücksichtigt wurde. Der zweite konservierte Signalweg leitet den Reiz mit Hilfe von cyclischem AMP (cyclic AMP, camp) weiter, welches von der G-Protein-aktivierten Adenylatcyclase gebildet wird (Abb. 1B). Das synthetisierte camp stimuliert die Aktivität der Proteinkinase A (PKA), welche nachfolgend Effektoren phosphoryliert. 3

11 I. Einführung Der sekundäre Botenstoff camp ist ein cyclisches Nukleotid, welches durch das Enzym Adenylatcyclase aus Adenosintriphosphat (ATP) gebildet wird. Wie alle sekundären Botenstoffe dient er der Signalweiterleitung, die ein primärer Botenstoff induziert hat. Bei diesem handelt es sich in der Regel um einen extrazelluären Liganden eines Rezeptors. Der durch den Liganden aktivierte Rezeptor reguliert, beispielsweise über G-Proteine, die Aktivität der Adenylatcyclase, wodurch das externe Signal über die Bildung des sekundären Botenstoffs camp innerhalb der Zelle weiterverarbeitet werden kann (Baker und Kelly 2004). Allerdings gibt es Abweichungen von der Allgemeingültigkeit der gerade beschriebenen eukaryotischen Signaltransduktionswege. Zum Einen wurde in einer aktuellen Arbeit über S. cerevisiae von Slessareva et al. (2006) gezeigt, das auch in einem gut charakterisierten Signalweg wie der MAP-Kinase-Kaskade neue Komponenten und Interaktionen zu identifizieren sind, wie im folgenden Abschnitt 3 besprochen werden soll. Zum Anderen gibt es Signalwege, die analog zu ihrer speziellen Aufgabe besonders strukturiert sind. Als Beispiel hierfür wird nachfolgend auf die Lichtperzeption und -verarbeitung bei Pilzen eingegangen (Abschnitt 4). 3. Die Phosphatidylinositol 3-Kinase und die Pheromonantwort von S. cerevisiae Phosphatidylinositol 3-Kinasen kommen ubiquitär bei Eukaryoten vor (Michell 2008). Enzyme dieser Klasse phosphorylieren membranlokalisiertes Phosphatidylinositol und generieren so Phophatidylinositol-3-phosphat (PI(3)P), einen membranassoziierten sekundären Botenstoff. Dieser ist in der Lage, Proteine mit PI(3)P-bindenden Sequenzen, wie PX- oder FYVE-Domänen, zu rekrutieren (Gaullier et al. 2000, Vanhaesebroeck et al. 2001, Yu und Lemmon 2001, Koga et al. 2004). Proteine mit PX- oder FYVE-Domänen besitzen vielfältige Funktionen. Sie können an Signalwegen beteiligt sein, modifizieren Lipide oder dienen dem vesikulären Transport (Stenmark und Aasland 1999, Odorizzi et al. 2000, Xu et al. 2001, Worby und Dixon 2002). Untersuchungen haben gezeigt, dass Deletionen der Phosphatidylinositol 3-Kinase von S. cerevisiae Störungen beim intrazellulären Proteintransport verursachen, beispielsweise beim Transport neu synthetisierter Vakuolen-Proteine vom trans-golgi- Netzwerk über die Endosomen zu den Vakuolen (Schu et al. 1993, Burda et al. 2002). Entsprechend ihrer Funktion sind die regulatorische (Vps15p) und die katalytische Untereinheit der Phosphatidylinositol 3-Kinase (Vps34p) daher überwiegend in 4

12 I. Einführung Endosomen, dem Golgi-Apparat und in Vakuolen lokalisiert (Herman et al. 1991, Huh et al. 2003). Eine völlig neue Funktion der Phosphatidylinositol 3-Kinase bei der sexuellen Entwicklung von S. cerevisiae wurde erst kürzlich von Slessareva et al. (2006) beschrieben. Haploide Zellen von S. cerevisiae kommunizieren über sekretierte Pheromone, den a-faktor (a-zellen) bzw. den α-faktor (α-zellen), miteinander. Befinden sich zwei Zellen des a- und des α-kreuzungstyps in räumlicher Nähe, werden die Pheromone über die jeweiligen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Ste2p und Ste3p) gebunden. Die Ligandenbindung löst eine Signalkaskade über MAP-Kinasen aus (Ste20p, Ste11p, Ste7p und Fus3p), wodurch schließlich der Effektor Ste12p, ein Transkriptionsfaktor, phosphoryliert und aktiviert wird (Abb. 2, Fields und Herskowitz 1985, Zhou et al. 1993, Choi et al. 1994). Dieser wirkt positiv auf die Transkription von Genen, deren Produkte die Pheromonantwort auf zellulärer Ebene initiieren. In Vorbereitung der Fusion zweier S. cerevisiae-zellen kommt es schließlich zum Zellzyklusarrest und die Zellen zeigen ein polarisiertes Wachstum zum Kreuzungspartner (Shmoo-Bildung, Cross et al. 1988). Die MAP-Kinase-Kaskade wird im Falle der Pheromonantwort von S. cerevisiae durch das dissoziierte Gβγ-Dimer Ste4p/Ste18p aktiviert (Abb. 2), wie Whiteway et al. (1989) durch Deletionen der entsprechenden Gene zeigen konnten. Mutationen der Gα-Untereinheit Gpa1p, welche zur Freisetzung des Gβγ-Dimers führen, bewirken eine kontinuierliche Aktivierung des Pheromonsignalwegs, weshalb lange angenommen wurde, dass Gpa1p nur indirekt über die Assoziation mit dem βγ-dimer eine regulierende Funktion auf den Pheromonsignalweg ausübt (Dohlman und Thorner 2001). Erste Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Gpa1p an der Signalweiterleitung ergaben sich aus Versuchen mit Hefestämmen, welche eine konstitutiv aktive Gα-Untereinheit besitzen. Reportergenanalysen mit einem pheromoninduzierten Promotor (FUS1-LACZ, Trueheart et al. 1987, Chen und Kurjan 1997) ergaben in Stämmen mit einem konstitutiv aktivierten Gα eine signifikat erhöhte Pheromonantwort (Guo et al. 2003). Während der sexuellen Entwicklung von S. cerevisiae kommt es durch Konjugation zweier vegetativer Zellen zur Ausbildung einer diploiden Zygote. Das Protein Fus1p spielt bei der Verschmelzung der Zellen eine entscheidene Rolle; Mutationen im FUS1- Gen sorgen für eine Unterbrechung des Konjugationsvorgangs (Trueheart et al. 1987). Die Expression von FUS1 ist abhängig von dem Transkriptionsfaktor Ste12p und ist daher nur in pheromoninduzierten Zellen zu beobachten (Trueheart et al. 1987, Roberts et al. 2000). 5

13 I. Einführung Abb. 2: Signalweg in S. cerevisiae (a-kreuzungstyp) nach Bindung des α-pheromons an den GPCR Ste2p. Die klassische Signaltransduktion erfolgt über das dissozierte βγ-dimer des G-Proteins und löst eine MAP-Kinase-Signalkaskade aus, an der vier MAP-Kinasen beteiligt sind (gelb hinterlegt). Hellgrün hinterlegt ist das Gerüstprotein Ste5p, hellrot der Transkriptionsfaktor Ste12p. Die blau markierte, GTP-aktivierte Gα-Untereinheit wird auf unbekannte Weise zum Endosom transportiert und interagiert mit der katalytischen (Vps34p, rosa) und der regulatorischen Untereinheit der Phosphatidylinositol 3-Kinase (Vps15p, braun). Die Bindung von Gα bewirkt die Synthese von PI(3)P durch Vps34p, welches vermutlich FYVE/PX-Proteine rekrutiert. Diese könnten dann durch bisher unbekannte Mechanismen Einfluss auf die MAP-Kinase-Kaskade ausüben. Bei der Pheromonantwort konnte ein Teil der morphologischen und transkriptionellen Veränderungen beobachtet werden, wie sie bei Aktivierung der pheromoninduzierten MAP-Kinase-Kaskade auftreten. So konnte eine Shmoo -Morphologie beobachtete werden, allerdings kam es zu keinem Zellzyklusarrest. Aufbauend auf diesem Ergebnis analysierten Slessareva et al. (2006) in einer genomweiten Analyse rund 5000 S. cerevisiae-deletionsmutanten, bei denen je ein offener Leserahmen deletiert ist (Winzeler et al. 1999, Chasse und Dohlman 2004). Um putative Effektoren der Gα- 6

14 I. Einführung Untereinheit Gpa1p zu finden, exprimierten Slessareva et al. (2006) ein konstitutiv aktives Gα-Konstrukt in diesen Deletionsstämmen und untersuchten den Einfluss auf die Expression des Reportergens FUS1-LACZ. Zwei Mutanten, bei denen die Synthese des Reportergens ausblieb, wiesen eine Deletion der Gene für die regulatorische (Vps15p) beziehungsweise katalytische Untereinheit (Vps34p) der Phosphatidylinositol 3-Kinase auf (Slessareva et al. 2006). In weiterführenden Versuchen konnten Slessareva et al. (2006) eine Attenuation der Phosphorylierung von Fus3p in diesen Stämmen beobachten, was auf eine Interaktion der Phosphatidylinositol 3-Kinase und des MAP- Kinase-Signalwegs schließen lässt. Diese kann jedoch nur indirekt sein, da die Phosphatidylinositol 3-Kinase nicht wie die Komponenten der MAP-Kinase-Kaskade an der Plasmamembran lokalisiert ist, sondern in intrazellulären Komponenten wie Endosomen vorkommt (Huh et al. 2003). Lokalisationsstudien mittels Fluoreszenzmikroskopie ergaben tatsächlich eine Kolokalisation von Gpa1p und Vps34p in Endosomen (Slessareva et al. 2006). Bindungsstudien mittels Coimmunopräzipitation belegten Interaktionen von Vps34p und Vps15p mit Gpa1p, wobei Vps15p bevorzugt das nichtaktivierte GDP-Gpa1p bindet, während Vps34p mit GTP-Gpa1p zu interagieren scheint. Aufgrund seiner Funktion und Struktur kommt Vps15p dabei als Analogon einer Gβ-Untereinheit in Frage (Slessareva et al. 2006). Des Weiteren konnten Slessareva et al. (2006) zeigen, dass die konstitutiv aktivierte Form der Gα- Untereinheit eine signifikante Zunahme des Phospatidylinositol 3-Kinase-Produktes PI(3)P verursacht. Da das membranassoziierte PI(3)P keine freie Beweglichkeit innerhalb des Cytosols besitzt, ist die Interaktion zwischen diesem neuen, an intrazelluläre Kompartimente gebundenen Signalweg und dem klassischen, Plasmamembran-assozierten MAP-Kinase-Signalweg noch nicht aufgeklärt. Slessareva et al. (2006) ziehen PI(3)P-bindende Protein mit FYVE- oder PX-Domänen als Mittler zwischen beiden Wegen in Erwägung (Abb. 2). So konnten sie zeigen, dass das normalerweise nicht endosomal lokalisierte PX-Domänen-Protein Bem1p in Stämmen mit konstitutiv aktiviertem Gpa1p zum Endosom rekrutiert wird. Es bleibt abzuwarten, ob die durch Slessareva et al. (2006) am Hefe-System gewonnenen Erkenntnisse auch auf andere Pilze oder auch höhere Eukaryoten übertragbar sind. Jedoch ist festzuhalten, dass die G-Protein-vermittelten Signalkaskaden auch noch weitere Jahre die Forschung beschäftigen werden. In der vorliegenden Arbeit wird die Beteiligung der G-Protein-aktivierten Adenylatcyclase 7

15 I. Einführung (SAC1) an der Morphogenese des multizellulären Modellorganismus Sordaria macrospora (Ascomycetes) im Detail analysiert, um Rückschlüsse auf zugrundeliegende Signalkaskaden ziehen zu können. Ein in dieser Arbeit ebenfalls untersuchtes Protein, die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora, ist an einer Signalkaskade beteiligt, die an der Lichtperzeption von Pilzen mitwirkt. Im nächsten Abschnitt wird deshalb die Lichtperzeption und -verarbeitung bei Pilzen vorgestellt. 4. Lichtperzeption und -verarbeitung bei Pilzen Licht ist ein entscheidender Faktor für das Überleben und die Fortpflanzung vieler Organismen und somit auch für eine Vielzahl von Pilzen. So kann Licht regulierend auf die asexuelle oder sexuelle Vermehrung und den Metabolismus wirken. Des Weiteren können einige Pilze Strukturen wie Fruchtkörper fototrop ausrichten (Corrochano 2007, Herrera-Estrella und Horwitz 2007). Bisher konnten verschiedene Fotorezeptoren für so unterschiedliche Organismengruppen wie Bakterien, Archaea, Pflanzen und Tiere identifiziert und charakterisiert werden; so beispielsweise Opsine bei Eukaryoten, Archaeen und Bakterien (Sharma et al. 2006, Corrochano 2007), Cryptochrome bei Pflanzen und Tieren (Lin und Todo 2005), Phytochrome bei Pflanzen und Bakterien (van der Horst et al. 2007) und Phototropine bei Pflanzen (Liscum et al. 2003). Innerhalb des Pilzreiches konnten bisher keine Cryptochrom- oder Opsin-ähnlichen Rezeptoren näher charakterisiert werden, obwohl bereits einige homologe Sequenzen zu entsprechenden Rezeptoren in Pilzgenomen identifiziert wurden, wie zum Beispiel das putative Opsin NOP-1 aus dem Ascomyceten Neurospora crassa (Bieszke et al. 1999, Idnurm und Heitman 2005b, Purschwitz et al. 2006, Bahn et al. 2007, Corrochano 2007, Herrera-Estrella und Horwitz 2007). Besser charakterisiert ist hingegen die Rot- und Blaulichtperzeption bei Pilzen. Beide sollen in dem folgenden Kapitel näher erläutert werden (Kapitel 4.1). Da der an der Blaulichtperzeption beteiligte Signalweg zusätzlich in die Steuerung der circadianen Rhythmik involviert ist, wird im Kapitel 4.2 auch auf diese Funktion eingegangen. 8

16 I. Einführung 4.1 Die Rot- und Blaulichtperzeption bei Pilzen Für den Ascomyceten Aspergillus nidulans wurde das Phytochrom FphA beschrieben, welches dem Pilz gestattet, auf den Rotlichtanteil des Lichtes zu reagieren. A. nidulans entwickelt in Dunkelheit überwiegend sexuelle Fruchtkörper (Kleistothezien), während er im Licht hauptsächlich asexuelle Sporen (Konidien) bildet. Eine Deletion des Phytochroms FphA führt auch unter Rotlicht zu einer, wenn auch verminderten, Fruchtkörperbildung (Blumenstein et al. 2005). Allerdings ist wenig über die beteiligte Signalkaskade bekannt; es wird vermutet, dass das rotlichtinduzierte Velvet-Protein (VeA, Kato et al. 2003, Stinnett et al. 2007), ein Regulator der sexuellen Entwicklung und des Sekundärmetabolismus von A. nidulans, in der Signalkaskade unterhalb des Fotorezeptors lokalisiert sein könnte (Blumenstein et al. 2005). Auch in anderen Pilzen wurden aufgrund von Sequenzvergleichen putative Phytochrome gefunden, allerdings sind nur wenige davon bisher näher charakterisiert worden (Corrochano 2007, Herrera- Estrella und Horwitz 2007). Ein Beispiel für erste Charakterisierungsversuche sind die Deletionen von phy-1 und phy-2 aus N. crassa, welche aber keinen auffälligen Phänotyp verursachen (Froehlich et al. 2005). Ebenfalls einen Wildtyp-Phänotyp zeigt die Phytochrom (PHY1)-Mutante von Cryptococcus neoformans (Idnurm und Heitman 2005a). Sehr viel eingehender erforscht ist die Blaulichtperzeption bei Pilzen. Der Zygomycet Phycomyces blakesleeanus diente aufgrund seiner Sporangiophoren lange Zeit als Modellorganismus in der Erforschung der Lichtperzeption von Pilzen. Diese unverzweigten und spezialisierten Lufthyphen, welche an ihrer Spitze ein Sporangium tragen, dienen der Verbreitung von asexuellen Sporen und schon lange ist bekannt, dass sie positiv fototrop auf Blaulicht reagieren (Bergman et al. 1973). Neuere Untersuchungen führten zu der Entdeckung zweier Gene, welche an der zugrundeliegenden Blaulichtperzeption beteiligt sind und deren Mutationen den Fototropismus unterbinden (Idnurm et al. 2006). Beide Gene zeigen eine hohe Homologie zu der kodierenden Sequenz des WC-1- (white collar-1) Proteins aus N. crassa. Sowohl WC-1 als auch sein Interaktionspartner, das WC-2-Protein, sind an allen bekannten Lichtantworten von N. crassa beteiligt. Diese Anworten umfassen unter anderem die lichtabhängige Karotinoidsynthese und den positiven Fototropismus der Fruchtkörperhälse von N. crassa (Harding und Turner 1981, Harding und Melles 1983, 9

17 I. Einführung Carattoli et al. 1994). Da der zugrundeliegende molekulare Mechanismus der Blaulichtperzeption für N. crassa eingehend untersucht wurde, soll dieser im folgenden Abschnitt als Modell für homologe Systeme in anderen Pilzen beschrieben werden. Beide white collar-proteine (WC-1 und WC-2) ähneln sich in ihrer Struktur und besitzen eine C-terminal lokalisierte GATA-Zinkfinger-Domäne, welche eine DNA- Bindung an sogenannte light response elements (LRE) erlaubt (Abb. 3, Ballario et al. 1996, Linden und Macino 1997). Des Weiteren besitzen sowohl WC-1 als auch WC-2 PAS- (Per-Arnt-Sim-) Domänen, welche Protein-Protein-Interaktionen vermitteln und die Heterodimerisierung von WC-1 und WC-2 gestatten (Abb. 3, Linden und Macino 1997, Talora et al. 1999, Cheng et al. 2002). Die N-terminale der drei PAS-Domänen von WC-1 ähnelt einer speziellen Form von PAS-Domänen, genannt LOV-Domäne (light, oxygen, or voltage). Diese Domäne ist sonst Bestandteil einer Klasse pflanzlicher Photorezeptoren, den Phototropinen (Liscum et al. 2003). Im Gegensatz zu den Phototropinen, welche Flavin-Mononukleotid (FMN) als chromophore Gruppe beinhalten, bindet die WC-1 LOV-Domäne das Chromophor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD). Die LOV-Domäne von WC-1 ist essentiell für alle Blaulichtantworten von N. crassa (Cheng et al. 2002). Als Reaktion auf einen Blaulichtreiz kommt es zur Heterodimerisierung von WC-1 mit WC-2 und es entsteht der transkriptionsaktivierende white collar-komplex (WCC, Abb. 3). Abb. 3: Der white collar-komplex (WCC) von N. crassa. WC-1 und WC-2 sind hellgrau dargestellt und binden die DNA an einem light response element (LRE, dunkelgrau hinterlegt). PAS-Domänen sind orange gekennzeichnet. Grün markiert sind die Zinkfinger- Domänen von WC-1 und WC-2. Das an die oberste PAS-Domäne (LOV-Domäne) gebundene Chromophor FAD ist blau gekennzeichnet. Der Pfeil veranschaulicht die Expression der Gene al-3, frq und vvd bei Bindung des transkriptionsaktivierenden WCC. Blind endende Linien symbolisieren eine Inhibierung des WCC. Verändert nach Idnurm und Heitman (2005a). 10

18 I. Einführung Dieser bindet an die LREs in den Promotoren lichtregulierter Gene, deren Produkte beispielsweise an der Karotinoid-Biosynthese (al-3-gen), der Fotoadaptation (vvd-gen) aber auch der circadianen Rhythmik (frq-gen) beteiligt sind (Abb. 3, Carattoli et al. 1994, Froehlich et al. 2002, He und Liu 2005). Der WCC repräsentiert somit sowohl den Rezeptor für Blaulicht als auch gleichzeitig den Effektor, da er als Transkriptionsfaktor die zelluläre Antwort auf den Reiz induziert. Diese Minimalform einer Signalperzeption und -verarbeitung muss präzise reguliert werden, da ein Reiz unmittelbar zu einer zellulären Antwort führt. Dabei kommt positiven und negativen Rückkopplungsmechanismen sowohl auf transkriptioneller wie auch posttranslationeller Ebene eine besondere Bedeutung zu. Die Transkription des wc-1-gens ist unter Blaulicht verstärkt, während die Expression des wc-2-gens lichtunabhängig ist (Ballario et al. 1996, Linden und Macino 1997). Unter länger andauerndem Lichteinfluss wird WC-1 durch noch unbekannte Kinasen phosphoryliert und abgebaut, was zur Fotoadaptation durch eine transiente Inaktivierung des WCC führt (Abb. 3, Talora et al. 1999, Schwerdtfeger und Linden 2000). Generell wird angenommen, dass WC-1 der limitierende Faktor innerhalb des WCC und somit auch bestimmend für die Expression Blaulicht-regulierter Gene ist (Cheng et al. 2001, Denault et al. 2001, Franchi et al. 2005). Ein weiterer regulatorischer Faktor innerhalb der Blaulichtsignalkaskade in N. crassa stellt das Protein Vivid (VVD) dar (Heintzen et al. 2001). Die Expression des kodierenden vvd-gens wird dabei durch den WCC kontrolliert (Abb. 3, Heintzen et al. 2001). Schwerdtfeger und Linden (2003) konnte zeigen, dass Vivid vergleichbar mit WC-1 in der Lage ist, ein FAD-Chromophor zu binden und als Fotorezeptor zu agieren. Vivid-Mutanten kennzeichnet ein auffallend oranger Phänotyp, der durch eine erhöhte Karotinoid-Synthese verursacht wird. Expressionsanalysen mit lichtinduzierten Genen ergaben, dass ohne ein funktionsfähiges Vivid-Protein deren Transkription länger andauert und die Transkriptmenge erhöht ist (Heintzen et al. 2001, Shrode et al. 2001). Als Ursache hierfür konnte eine gestörte Fotoadaptation nachgewiesen werden. Die Fotoadaptation erlaubt die Wahrnehmung einer gesteigerten Lichtintensität während Dauerlichts. Durch transientes Absenken der Expression lichtinduzierter Gene bei Dauerlicht ist N. crassa in der Lage, einen neuen Lichtimpuls weiter zuverarbeiten (Baima et al. 1991). Ein Verlust der Vivid-Funktion führt hingegen zu einer Unempfindlichkeit gegenüber Lichtimpulsen im Dauerlicht (Schwerdtfeger und Linden 2003). Ein strukturell ähnliches Protein (Envoy) wurde kürzlich für den Ascomyceten Hypocrea jecorina beschrieben (Schmoll et al. 2005). Funktionsverlust verursachende 11

19 I. Einführung Mutationen von Envoy bewirken ein reduziertes Wachstum unter Dauerlicht, ein Phänotyp, welcher nicht für N. crassa beschrieben wurde. Zwischenartliche Komplementationsversuche durch Einbringen des Envoy-kodierenden Gens in eine N. crassa Vivid-Mutante blieben erfolglos. Ursächlich für die Divergenz in der Funktion der strukturell ähnlichen Proteine könnten dabei unterschiedliche Interaktionspartner sein, wie Schmoll et al. (2005) vermuten. Der WCC-Komplex ist allerdings nicht nur an der Blaulichtperzeption und -verarbeitung beteiligt, sondern ist auch integraler Bestandteil eines Komplexes, der die circadiane Rhythmik in N. crassa steuert, was im nächsten Abschnitt erläutert werden soll. 4.2 Steuerung der circadianen Rhythmic durch den WCC Der WCC-Komplex bildet zusammen mit dem Protein Frequency (FRQ) die Kernkomponente der circadianen Rhythmik von N. crassa. Diese ist besonders gut an der Ausbildung von spezialisierten Lufthyphen (Konidienträger) zu beobachten, an deren Ende sukzedan asexuelle Sporen (Makrokonidien) abgeschnürt werden (Esser 1982). In konstanter Dunkelheit bildet N. crassa ungefähr alle 22 h neue Konidienträger aus (Sargent und Briggs 1967). Verantwortlich hierfür ist der sogenannte FCC- Komplex, der aus FRQ und einer Helikase (FRH) gebildet wird. Sowohl die Expression des frq-gens als auch die synthetisierte FRQ-Proteinmenge unterliegt dabei einer komplexen Regulation durch negative Rückkopplungsmechanismen (Garceau et al. 1997). Durch diese erhält das FRQ-Protein die Funktion eines Oszillators, welcher die circadiane Rhythmik von N. crassa steuert. Auf Transkript-Ebene erfolgt dazu eine indirekte Regulation der Expression des frq-gens durch den FCC, welcher die Aktivität des WCCs über die Rekrutierung von Caseinkinasen mindert (Abb. 3, He et al. 2006). Außerdem steuern einige Kinasen, beispielsweise die Caseinkinasen CK1 und CK2, die Proteinkinasen A und C oder aber Ca 2+ -/Calmodulinkinasen durch Phosphorylierungen von FRQ, WCC oder auch WC-1 den circadianen Rhythmus (Görl et al. 2001, Yang et al. 2003, Franchi et al. 2005, He et al. 2006, Huang et al. 2007). Proteine, welche eine LOV-Domäne besitzen und über PAS-Domänen ein transkriptionsaktivierendes Heterodimer bilden, scheinen Komponenten eines hoch konservierten und bereits lang existierenden Signalwegs bei Pilzen zu sein. Mit wachsenden Sequenzinformationen werden immer mehr homologe white collar-gene entdeckt und deren Produkte charakterisiert. Dabei umfassen die Beispiele verschiedene 12

20 I. Einführung Klasse innerhalb der Eumycota wie Zygomyceten, Ascomyceten und Basidiomyceten (Purschwitz et al. 2006, Bahn et al. 2007, Corrochano 2007, Herrera-Estrella und Horwitz 2007). Die bisher beschriebenen white collar-proteine von Zygomyceten und Ascomyceten unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der DNA-bindenen Zinkfinger-Domäne von denen der Basidiomyceten. Während diese bei erstgenannten Bestandteil von WC-1- homologen Proteinen ist, so scheint sie bei Basidiomyceten immer ein Bestandteil von WC-2 zu sein (Bahn et al. 2007). Abschließend lässt sich feststellen, dass die WCC-koordinierten Signaltransduktionskaskaden einer hochkomplexen Steuerung unterliegen. Trotz einer bereits über eine Dekade laufenden intensiven Forschung sind wichtige Aspekte des WCC-Signalkomplexes aber bis heute unverstanden. Der WCC ist beispielsweise neben der bereits erwähnten positiv fototropen Ausrichtung der Fruchtkörperhälse auch für den Fototropismus in der Anlage der Fruchtkörperhälse bei N. crassa verantwortlich ( Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001). An der Ausbildung dieses Phänotyps ist auch die Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK-1) aus N. crassa beteiligt; eine Punktmutation im ndk-1-gen führt zu einer zufälligen, lichtunabhängigen Anlage der Fruchtkörperhälse (Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001). Jedoch ist bisher weitgehend unverstanden, wie die NDK-1 von N. crassa in diesen Prozess involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wird die Beteiligung des homologen Proteins NDK1 aus S. macrospora, einem nahem Verwandten von N. crassa, an der Morphogenese und vor allen Dingen an der Fruchtkörperentwicklung von S. macrospora untersucht, um Einblicke auf dessen Funktion innerhalb dieser speziellen Blaulichtantwort zu erhalten. 13

21 II. Problemstellung II. Problemstellung Ein Charakteristikum der echten Vielzeller sind Zelldifferenzierungsprozesse, welche durch endogene und/oder exogene Reize induziert werden. Signalkaskaden vermitteln diese Reize und dienen gleichzeitig der Modulation beziehungsweise Koordination der zellulären Antwort. Der einzellige Eukaryot S. cerevisiae dient, wie eingangs beschrieben (siehe Kap. I), bereits seit langer Zeit der Erforschung eukaryotischer Signalwege. Es stellt sich allerdings die Frage, ob die genutzten Mechanismen in eukaryotischen Einzellern und Vielzellern identisch sind. In diesem Zusammenhang bieten sich filamentöse Ascomyceten besonders als Modellorganismen an, da sie in der Regel vielzellige Fruchtkörper ausbilden, welche dem Schutz und der Verbreitung der meiotisch gebildeten Sporen (Ascosporen) dienen. Die pilzlichen Fruchtkörper können dabei aus mehr als einem Dutzend verschiedener Zelltypen bestehen und werden meist nur unter bestimmten, artspezifischen Bedingungen gebildet (Alexopoulos et al. 1996, Bistis et al. 2003, Pöggeler et al. 2006a). Daher ist davon auszugehen, dass die Fruchtkörperbildung einer komplexen Regulation unterliegt, wobei Signaltransduktionswege eine entscheidende Schlüsselposition einnehmen. Im Vergleich mit anderen Modellsystemen wie eukaryotischen Zellkulturen oder der Arbeit mit höheren Eukaryoten ist die Handhabung von Hyphenpilzen bezüglich der Kultivierung und der molekularbiologischen Analyse deutlich vereinfacht. In dieser Arbeit wurde zur Analyse der eukaryotischen Signaltransduktion der Ascomycet S. macrospora verwendet, welcher sich aufgrund seines Entwicklungszyklus besonders als Modellorganismus eignet. S. macrospora gehört zu den homothallischen (selbst-fertilen) Ascomyceten mit autogamer Befruchtung, wodurch rezessive Mutationen direkt zur Ausprägung kommen. Zudem vermehrt sich S. macrospora ausschließlich sexuell, weshalb bei Expressionsanalysen hinsichtlich der sexuellen Entwicklung eine Beeinflussung der Daten durch gleichzeitige asexuelle Differenzierungsprozesse ausgeschlossen werden kann. Der Entwicklungszyklus dieses Pilzes ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Ausgehend von einer keimenden Ascospore bildet sich ein reich verzweigtes Myzel aus septierten Hyphen, an denen nach zwei bis drei Tagen die weiblichen Gametangien (Ascogone) gebildet werden, welche sich nachfolgend zusammen mit umgebenden sterilen Hyphen zu Vorfruchtkörpern (Protoperithezien) entwickeln. Während der weiteren Differenzierung 14

22 II. Problemstellung der Vorfruchtkörper zu flaschenförmigen, µm großen Fruchtkörpern, den sogenannten Perithezien, entwickeln sich im Inneren bis zu 100 Meiosporangien (Asci), in denen es nach Karyogamie, Meiose und postmeiotischer Mitose zur Ausbildung von Sporenwänden um jeden der acht Kerne kommt. Sieben Tage nach Beginn des Zyklus werden die reifen, melanisierten Sporen durch eine Öffnung des Peritheziums (Ostiolum) aktiv ausgestoßen (Esser 1982). Abb. 4: Entwicklungszyklus von S. macrospora. Ausgehend von einer keimenden Ascospore entwickelt sich, im Uhrzeigersinn schematisch dargestellt, ein Myzel, an dem sich durch Differenzierungsprozesse Ascogone zu Protoperithezien und schließlich zu Perithezien entwickeln. Abbildung verändert nach Rathke. Neben den Vorzügen des kurzen und einfachen Entwicklungszyklus weisen auch die etablierten molekularbiologischen Methoden S. macrospora als Modellorganismus aus. So gibt es ein effizientes Transformations- und Selektionssystem, eine indizierte genomische DNA-Bank sowie eine cdna-bank in Two-Hybrid-Vektoren (Walz und Kück 1995, Pöggeler et al. 1997a, Pöggeler und Kück 2004). Zusätzlich gestattet die hohe Sequenzhomologie und Syntenie zum Genom des Ascomyceten N. crassa, dessen Sequenz komplett bekannt und öffentlich zugänglich ist, beispielsweise die Isolation 15

23 II. Problemstellung von S. macrospora-genen durch heterologe PCR mit N. crassa-spezifischen Oligonukleotiden (Galagan et al. 2003, Nowrousian et al. 2004). Des Weiteren können cdna-arrays von N. crassa erfolgreich mit RNA aus S. macrospora hybridisiert werden (Nowrousian et al. 2005). Für Transformationen, deren Ziel eine homologe Rekombination der eingebrachten DNA mit der betreffenden genomischen Sequenz in S. macrospora ist, steht ein neuer Rezipientenstamm ( ku70) zur Verfügung. Bei diesem werden durch das NHEJ-System ( non-homologous end joining -System) vermittelte nicht-homologe Rekombinationsereignisse unterbunden (Pöggeler und Kück 2006). Die Verknüpfung von DNA-Doppelstrangbrüchen ist ein für alle Organismen essentieller Reparaturprozess. Dazu stehen in der Regel zwei verschiedene Mechanismen zur Verfügung. Bei Vorhandensein homologer Sequenzen innerhalb der zu verknüpfenden DNA-Fragmente kann eine Reparatur zielgerichtet über homologe Rekombination erfolgen. Im Rahmen der zweiten Möglichkeit, der nichthomologen Reparatur, erfolgt jedoch eine sequenzunspezifische Ligation beider Fragmente (Pastwa und Blasiak 2003). Dieser Vorgang der nicht-homologen Verknüpfung zweier DNA-Fragmente durch NHEJ erfordert unter anderem das Vorhandensein der Proteine Ku70 und Ku80 (Walker et al. 2001). Bei Inaktivierung eines der beiden Proteine wird der NHEJ-Mechanismus unterbunden und transformierte DNA wird, entsprechend ihrer Sequenz, zielgerichtet in das Genom eingebaut (Pöggeler und Kück 2006). Besonders wichtig für die vorliegende Arbeit ist die Möglichkeit der Kreuzung verschiedener S. macrospora-stämme zur Erzeugung rekombinanter Nachkommen. Obwohl S. macrospora homothallisch ist, können verschiedene Stämme durch die Ausbildung von Hyphenanastomosen einen Kernaustausch vollziehen. Durch die Verfügbarkeit von Farbspormutationen als Marker können rekombinante Perithezien an der Kontaktfläche beider Myzelien erkannt werden. Die lineare Anordnung der acht Sporen in den Asci der rekombinanten Perithezien gestattet dann anhand der Aufspaltung der Sporenisolat-Phänotypen eine Bestimmung ihrer Genotypen (Esser und Straub 1958, Esser 1982). Interessanterweise wird die sexuelle Entwicklung von S. macrospora durch ähnliche molekulare Mechanismen reguliert wie die der heterothallischen Pilze. Bisherige Analysen bezüglich der Regulation der sexuellen Entwicklung von S. macrospora belegen, dass auch in diesem homothallischen Ascomyceten Kreuzungstyp-spezifische Gene funktionell exprimiert werden (Pöggeler et al. 1997b, Pöggeler und Kück 2000, Pöggeler et al. 2006b). 16

24 II. Problemstellung Die heterothallische Bäckerhefe S. cerevisiae enthält einen Kreuzungstyplocus, welcher je nach vorhandenen Allelen den Kreuzungstyp der haploiden Zellen (αbzw. a-typ, siehe Kap. I.3) determiniert. Die Allele kodieren für insgesamt drei Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von Genen, die der sexuellen Vermehrung dienen, in trans regulieren (Herskovitz et al. 1992). Unter anderem regulieren sie die Kreuzungstyp-abhängige Expression der Gene für die Pheromone und Pheromonrezeptoren (Bardwell 2005). Auch bei dem heterothallischen Ascomyceten N. crassa konnte ein ähnliches System identifiziert werden, wobei drei Allele (mata-1, mata-2, mata-3) den MATA-Locus und zwei Allele (mata-1, mata-2) den MATa-Locus kennzeichnen. Die Produkte von mata-1, mata-3 und mata-1 besitzen für eukaryotische Transkriptionsfaktoren typische DNA-Binde-Domänen, die HMG-Domäne oder die α-domäne (Staben und Yanofsky 1990, Grosschedl et al. 1994, Ferreira et al. 1996, Pöggeler und Kück 2000). Es konnte gezeigt werden, dass zwei Produkte der Kreuzungstyp-spezifischen Gene von S. macrospora, SMTa-1 und SMTA-1, charakteristische Domänen eukaryotischer Transkriptionsfaktoren enthalten und als Heterodimer die Transkription von Reportergenen in der Hefe aktivieren können (Jacobsen et al. 2002). Generell wird angenommen, dass die Produkte der Kreuzungstyp-Gene von Ascomyceten eine Kontrolle in der Expression von Pheromon- und Pheromonrezeptorgenen ausüben, wie es von S. cerevisiae bekannt ist (Debuchy 1999). Folgerichtig konnte auch für S. macrospora ein funktionelles Pheromon/Rezeptorsystem ähnlich der Hefe identifiziert werden (Pöggeler 2000, Mayrhofer und Pöggeler 2005, Mayrhofer et al. 2006, Pöggeler et al. 2006b). Ein zu S. macrospora homologes Pheromon/Rezeptorsystem ist bei N. crassa essentiell für die Befruchtung des Ascogons und es wird vermutet, dass das Pheromon/Rezeptorsystem sowohl bei heterothallischen als auch homothallischen Ascomyceten für die Kernerkennung in der dikaryotischen, ascogenen Hyphe benötigt wird (Coppin et al. 1997, Shiu und Glass 2000, Kim und Borkovich 2004, Kim und Borkovich 2006). Die Expression der Pheromongene ppg1 und ppg2 sowie der Pheromonrezeptorgene pre1 und pre2, deren Produkte sich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs, siehe Kap. I.2) zuordnen lassen, findet im selben Myzel statt (Pöggeler 2000, Pöggeler und Kück 2001). Um die Signalkaskaden unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 zu analysieren, wurden im Vorfeld dieser Arbeit Deletionsmutanten für drei G-Protein α-untereinheiten aus S. macrospora ( gsa1, gsa2, gsa3) erzeugt und charakterisiert. Durch die Analyse genetischer Interaktionen mit Hilfe von Doppelmutanten konnten 17

25 II. Problemstellung zwei der Gα-Untereinheiten, GSA1 und GSA2, unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 eingeordnet werden (Jansson 2007). Die Analyse genetischer Interaktionen bietet gegenüber physikalischen Methoden wie dem Hefe-Two-Hybrid-System oder der Co-Immunopräzipitation den Vorteil, dass eine funktionelle Kopplung festgestellt werden kann, ohne dass eine physikalische Interaktion vorliegen muss. Dies ist beispielsweise von Vorteil, wenn die zu untersuchenden Genprodukte in unterschiedlichen, aber funktionell verbundenen Signalwegen lokalisiert sind (Boone et al. 2007). So kommt es nur in ungefähr 1 % der Fälle zu einer Überlappung zwischen genetischen Analysen und Methoden des physikalischen Interaktionsnachweises (Tong et al. 2004). Findet jedoch eine Überschneidung zwischen physikalischer Interaktion und genetischer Wechselwirkung statt, bietet eine Kombination der beiden methodischen Ansätze eine ausgezeichnete Basis zum Verständnis der analysierten Komponenten (Kelley und Ideker 2005). In S. cerevisiae können sowohl genetische als auch physikalische Interaktionen nahezu vollständig automatisiert in Hochdurchsatzverfahren analysiert werden, wodurch immer mehr regulatorische Netzwerke und ihre Komponenten entschlüsselt werden (Drees et al. 2001, Tong et al. 2004). In eukaryotischen Organismen ist die camp-produzierende Adenylatcyclase ein bekannter Interaktionspartner der heterotrimeren G-Proteine, so auch in Pilzen (Bölker 1998, Lengeler et al. 2000, D'Souza und Heitman 2001, Versele et al. 2001). Die Beteiligung dieses Enzyms an sexuellen Entwicklungsvorgängen konnte bereits in Studien mit verschiedenen Ascomyceten und Basidiomyceten gezeigt werden (Perkins et al. 1982, Choi und Dean 1997, Lengeler et al. 2000, D'Souza und Heitman 2001, Hatanaka und Shimoda 2001, Alspaugh et al. 2002, Ivey et al. 2002, Feldbrügge et al. 2004, Jurick und Rollins 2007). Pöggeler et al. (2006b) konnten bei cross-species - Microarray-Versuchen mit N. crassa-arrays und S. macrospora-sonden feststellen, dass die Expression des Adenylatcyclase-Gens sac1 von S. macrospora vor dem Hindergrund der Deletion des Kreuzungstyp-Gens Smta-1 im Vergleich mit dem Wildtyp signifikant heraufreguliert ist. Somit kann auch für S. macrospora eine Beteiligung der Adenylatcyclase an der sexuellen Entwicklung vermutet werden. Um die Funktion der Adenylatcyclase von S. macrospora bei der sexuellen Entwicklung besser zu verstehen, sollte in dieser Arbeit das sac1-gen annotiert, zielgerichtet deletiert und die Deletionsmutante molekularbiologisch und physiologisch charakterisiert werden. Durch chemische Komplementation mittels extern zugeführtem camp sollte der Wildtyp-Phänotyp der Adenylatcyclase-Mutante restauriert werden, um den kausalen Zusammenhang zwischen den beobachteten Defekten und dem intrazelluären camp-gehalt der Mutante herzustellen. 18

26 II. Problemstellung Bei Adenylatcyclase-Deletionsmutanten kann oft noch, je nach Sensitivität der verwendeten Bestimmungsmethoden, eine Grundmenge an camp festgestellt werden. Es ist davon auszugehen, dass ein anderes Enzym diese Menge synthetisiert (Jurick und Rollins 2007). Oft scheint diese Grundaktivität jedoch nicht auszureichen und es kommt zu durch camp-mangel verursachten Phänotypen, die beispielsweise die Sporenkeimung oder aber das vegetative Wachstum des untersuchten Pilzes betreffen. Durch eine externe Zugabe von camp bzw. einem membrangängigen Derivat können diese Defekte oft, aber nicht immer, behoben werden (Kore-eda et al. 1991, Choi und Dean 1997, Rocha et al. 2001, Alspaugh et al. 2002, Doehlemann et al. 2006, Jurick und Rollins 2007, Mukherjee et al. 2007). In dieser Arbeit sollten mittels Kreuzung der sac1-mutante mit den vorliegenden Gα- Deletionsmutanten (Jansson 2007) Doppel- und Dreifachmutanten erzeugt werden, um die genetischen Interaktionen zwischen sac1 und gsa1, gsa2 bzw. gsa3 zu analysieren. Zusätzlich sollten durch Kreuzung der drei gsa-mutanten mit der kürzlich beschriebenen ste12-mutante von S. macrospora (Nolting und Pöggeler 2006) sowie mit der Mutante pro41 (Nowrousian et al. 2007) weitere genetische Interaktionen untersucht werden. Während der homologe Transkriptionsfaktor Ste12p in S. cerevisiae essentiell für die sexuellen Entwicklung ist (Hartwell 1980, Elion et al. 1991, Elion et al. 1993), weist die ste12-mutante von S. macrospora einen Defekt in der Ascosporogenese auf, wodurch nur wenige Sporen auskeimen (Nolting und Pöggeler 2006). Die sterile pro41-mutante entwickelt hingegen nur Protoperithezien (Nowrousian et al. 2007). Durch die Charakterisierung der Adenylatcyclase von S. macrospora und die Erzeugung von Doppel- bzw. Dreifachmutanten durch Kreuzung der gsa1-, gsa2- und gsa3-stämme mit sac1 und weiteren Mutanten sollten somit die an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora beteiligten Signalwege unterhalb der Gα-Untereinheiten näher charakterisiert werden. Ein weiteres im Rahmen dieser Arbeit untersuchtes Protein ist die Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK1) aus S. macrospora. Dieses Enzym kommt ubiquitär sowohl bei Pro- wie auch bei Eukaryoten vor. Neben der seit ca. 50 Jahren bekannten Haushalts -Funktion in der Synthese von (Desoxy-)Ribonukleosidtriphosphaten, (d)ntps, ausgehend von (Desoxy-)Ribonukleosiddiphosphaten, (d)ndps, und Adenosintriphosphat (ATP) häufen sich die Hinweise, die der Nukleosiddiphosphat-Kinase regulatorische Eigenschaften zuschreiben (Kimura 2003b, Kimura 2003a). Der besondere Stellenwert der Nukleosiddiphosphat-Kinase bei der Regulation von Zelldifferenzierungsprozessen wird besonderes bei humanen Krebsarten sichtbar. Die erhöhte Expression der Gene, die für die humanen Nukleosiddiphosphat- 19

27 II. Problemstellung Kinasen Nm23-H1 und Nm23-H2 kodieren, vermindert auf bis jetzt unbekannte Weise die Metastasenbildung bei Brustkrebs und anderen Krebsarten (Ouatas et al. 2003). Während unizelluläre Organismen wie E. coli oder S. cerevisiae eine singuläre Nukleosiddiphosphat-Kinase besitzen, können in multizellulären Lebewesen in der Regel mehrere Isoformen nachgewiesen werden. Der Mensch besitzt acht Isoformen, aber nur Nm23-H1 und Nm23-H2 sind für den Haupteil der Enzymaktivität verantwortlich (Ishikawa et al. 2003). Bei allen eukaryotischen Nukleosiddiphosphat- Kinasen ist die Ausbildung hexamerer Komplexe zu beobachten (Lascu et al. 2000). Mutationen im kodierenden awd-gen der Nukleosiddiphosphat-Kinase aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster führen zu larvalen Fehlbildungen, die schließlich zum Tod der Larve führen (Dearolf et al. 1988). Bei Versuchen, die Nukleosiddiphosphat-Kinase in dem filamentösen Ascomyceten Aspergillus nidulans zu deletieren, konnten keine haploiden Mutantenstämme erzeugt werden, woraus Lin et al. (2003) schließen, dass die Nukleosiddiphosphat-Kinase für A. nidulans essentiell ist. Mutationen der Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK-1) aus N. crassa sind hingegen nicht letal, sondern weisen auf eine Beteiligung dieser an der Blaulichtverarbeitung über den white collar-komplex hin (siehe Kap. I.4.2, Oda und Hasunuma 1994, Ogura et al. 1999, Ogura et al. 2001). Die entsprechende N. crassa-mutante zeigt einen gestörten Fototropismus bei der Anlage der Fruchtkörperhälse. Im Gegensatz zum Wildtyp, bei dem die Differenzierung der Fruchtkörperhälse lichtgerichtet an der Spitze des Protoperitheziums erfolgt, zeigt die Mutante eine zufällige Bildung der Hälse an jeder beliebigen Stelle der sich differenzierenden Protoperithezien (Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001). Erstaunlicherweise zeigen neuere Arbeiten mit zwei N. crassa RIP- Mutanten (repeat-induced point mutation, Selker und Garrett 1988, Galagan und Selker 2004) eine komplette Blockade in der sexuellen Entwicklung nach der Bildung der Protoperithezien (Lee et al. 2006). Eine Erklärung für die Divergenz in den Phänotypen der Funktionsverlustmutante und den RIP-Mutanten wurde von der Arbeitsgruppe Lee et al. (2006) nicht abgegeben, wodurch die Funktion der NDK-1 aus N. crassa weiterhin nicht eindeutig geklärt ist. Der RIP-Mechanismus in N. crassa dient dem Schutz vor Fremd-DNA. Durch die Anwesenheit mehrerer Kopien einer DNA-Sequenz kommt es innerhalb dieser zu C:G T:A Mutationen. Oft entsteht dabei ein verfrühtes Stopp-Kodon und die RNA wird in ein nicht-funktionelles Protein translatiert. Durch Transformation von Genkopien mit einer Länge von mindestens 400 bp und 80 % Sequenzidentität zum nativen Gen kann dieses durch Auslösen von RIP gezielt ausschaltet werden (Selker und Garrett 1988, Galagan und Selker 2004). 20

28 II. Problemstellung Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Nukleosiddiphosphat-Kinase ein ubiquitär vorkommendes Enzym mit außergewöhnlich bedeutenden Regulationseigenschaften ist. Jedoch ist es nach wie vor eine große Herausforderung, ihre genaue Funktion innerhalb von Zelldifferenzierungsprozessen und Signalkaskaden zu analysieren und zu verstehen (Kimura 2003b). Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit angestrebt, das kodierende Gen der Nukleosiddiphosphat-Kinase von S. macrospora zielgerichtet zu deletieren. Mit Hilfe der Deletionsmutante sollte die Morphogenese der Fruchtkörper in Dunkelheit und Licht verschiedener Wellenlängen untersucht werden. Zudem wurden vergleichende Expressionsanalysen mit Wildtyp-RNA und RNA der Mutante durchgeführt, um den Einfluss der Deletion auf die Transkription der an der Blaulichtantwort beteiligten Gene zu studieren. Ziel dieser Analysen war die funktionelle Charakterisierung der Nukleosiddiphophat-Kinase innerhalb der an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora beteiligten Signalkaskaden mit Schwerpunkt auf die Blaulichtperzeption. Die gemeinsamen Arbeiten mit der Adenylatcyclase (SAC1) und der Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK1) aus S. macrospora sollten dem besseren Verständnis der an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora beteiligten Signalwege dienen. Die Analyse der komplexen Regulationsmechanismen bei der Morphogenese der Fruchtkörper dieses eukaryotischen Modellorganismus kann dabei zu einem besseren Verständnis der an Zelldifferenzierungprozessen beteiligten Signaltransduktionskaskaden in höherer Eukaryoten beitragen. 21

29 III. Material und Methoden III. Material und Methoden 1. Materialien 1.1 Stämme Escherichia coli K12 XL1-Blue MRF : (mcra)183, (mcrcb-hsdsmr-mrr)173, enda1, supe44, thi-1, reca1, gyra96, rela1, lac [F' proab, laci q Z M15, Tn10(Tet r )]; Rezipientenstamm mit Defekten in allen bekannten Restriktionssystemen für die Vermehrung von Plasmidvektoren und deren Derivaten (Jerpseth et al. 1992) Sordaria macrospora In Tabelle 1 sind die in dieser Arbeit verwendeten Stämme mit ihren relevanten Charakteristika aufgeführt. Tab. 1: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten S. macrospora Stämme. Stamm Charakteristika Referenz S48977 Wildtyp Stammsammlung * S23442 fus1-1; Farbspormutante, Wildtyp-Phänotyp Stammsammlung * S67813 r2; Farbspormutante, Wildtyp-Phänotyp Stammsammlung * S66001 ku70::nat1; Rezipientenstamm mit Defekt im NHEJ-System 1 Pöggeler und Kück (2006) J223 gsa1::hph Jansson (2007) gsa2::hph Jansson (2007) S72902 gsa3(r2)::hph Jansson (2007) S68567 ste12::hph(fus) Nolting und Pöggeler (2006) S46357 pro41-mutation Nowrousian et al. (2007) K58 ndk1::hph; Deletionsmutante der Nukleosiddiphosphat-Kinase Diese Arbeit K14 ndk1::hph, ndk1; Retransformante Diese Arbeit K23 sac1::hph; Deletionsmutante der Adenylatcyclase Diese Arbeit K18 sac1::hph, cr-1; Retransformante 2 Diese Arbeit S73097 sac1::hph/ gsa1::hph, steril Diese Arbeit T4 sac1::hph/ gsa1::hph, gsa1; Retransformante, fertil Diese Arbeit S72594 sac1::hph/ gsa2::hph Diese Arbeit J423 sac1::hph/ gsa3(r2)::hph Diese Arbeit S77487 sac1::hph/ gsa2::hph/ gsa3(r2)::hph Diese Arbeit S81063 gsa1::hph/pro41 Diese Arbeit S81167 gsa2::hph/pro41 Diese Arbeit S81284 gsa3(r2)::hph/pro41 Diese Arbeit S80762 gsa1::hph/ ste12(fus)::hph Diese Arbeit S83053 gsa2::hph/ ste12(fus)::hph Diese Arbeit * Stammsammlung des Lehrstuhls für Allgemeine und Molekulare Botanik, Ruhr-Universität Bochum 1 NHEJ: Non-homologous end joining-system, Reparatursystem für DNA-Doppelstrangbrüche 2 S. macrospora-mutante mit ektopisch integriertem Adenylatcyclase-Gen (cr-1) aus Neurospora crassa 22

30 III. Material und Methoden 1.2 Plasmide und Cosmide In Tabelle 2 sind die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Cosmide mit ihren relevanten Charakteristika aufgeführt. Tab. 2: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Cosmide. Plasmid / Cosmid Charakteristika Referenz pdrive 3,9 kb T/A-Klonierungsvektor, Amp r, Kan r Qiagen, Hilden, Deutschland, LacZ, pd-nat1 4,8 kb pdrive-derivat mit nat1-gen Kück und Hoff (2006) 6,7 kb pdrive-derivat mit 2,8 pdrive-ndk kb Insert des ndk1-gens inkl. Diese Arbeit flankierender Bereiche pd202 pdrive-derivat mit gsa1-gen inkl. flankierender Bereiche Jansson (2007) pdade 8,1 kb pdrive-derivat mit 4,2 kb Insert des 5 -Endes des sac1- Gens inkl. des flankierenden Diese Arbeit Bereiches pzhk2 4,9 kb, Kan r, Zeo r, trpc(p)::hph Kück und Pöggeler (2004) H122 F6 Cosmid plorist6xh-derivat mit 38 kb Insert genomischer N. crassa-dna inkl. cr-1-gen, Hyg r, Kan r, Neo r FGSC, Kelkar et al. (2001) 11,9 kb panscos1-cosmid mit H2 3 -Ende des sac1-gens (Pool VIB) 1 FGSC, Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, USA Osiewacz (1994), Pöggeler et al (1997) 1.3 Oligonukleotide In Tabelle 3 sind die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide aufgeführt. Die Synthese erfolgte als Auftragsarbeit durch die Firma MWG Biotech AG (Ebersberg). Tab. 3: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide. Oligonukleotid Sequenz (5 3 ) Spezifität ndk-f ATG TCC AAC CAG GAG CAG ACG S.m. ndk1 ndk-r AGG CAG CGG AGT GGT GGT TCC S.m. ndk1 hph-f AGG AGC AGG ACT GAG AAT TC hph-kassette (pzhk2) hph-r TGC AGG TCG ACT CTA GAG GA hph-kassette (pzhk2) hph-if TCC AGT CAA TGA CCG CTG TTA TG hph hph-ir TCC AAC AAT GTC CTG ACG GAC hph h3 GGG CCC GAA ACG AAC TAG AGT TCT AG hph 5 ndk1 ATT CGT TAG ATG CAT AGT GGC TCT AGA TG 5 flank. Bereich ndk1 3 ndk1 CTG ACA ACA CTG ATC TTG TGC TCG GAC TG 3 flank. Bereich ndk1 ndk1 ATC GCA ACA AGT CCA CAT CTC G 5 flank. Bereich ndk1 ndk2 ATG TTC CTC TAA TCA GTT GAC CTG G 5 flank. Bereich ndk1 ndk3 GAA TTC TCA GTC CTG CTC CTA TGA TGA TTG 5 flank. Bereich ndk1 ATG ATG GAG AAC GAG AAG +hph-überhang * ndk4 TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG CTT ACA AGA 3 flank. Bereich ndk1 ATG CCT GAC AGC ACT C +hph-überhang * ndk5 GGA CTT GCA GAG TTG TGG ATG G 3 flank. Bereich ndk1 ndk6 TAG TCT TGC GCA TTA GAC CAC TC 3 flank. Bereich ndk1 sac-f AGG CTG GTG CTT ACC TAC CG S.m. sac1 23

31 III. Material und Methoden sac-r ATT GAA CAG ATG AGA ACG ACC S.m. sac1 5 sac1 ATA ATG CTA GTT GTA CCT CTA AGA GAG TCG 5 flank. Bereich sac1 3 sac1 ACA TAC ACA GAT TCG ATC ACC ATC ACC GAT G 3 flank. Bereich sac1 sac1 ACT GCC GAC GGG AAG CTC AAT G 5 flank. Bereich sac1 sac2 ATG GCA GAT GGG AGT GGT GGT AC 5 flank. Bereich sac1 sac3 GAA TTC TCA GTC CTG CTC CTA CTA CTA GGA 5 flank. Bereich sac1 GAC CAC AGC CAT TCC ACG +hph-überhang * sac4 TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAT CAA GCT GCA 3 flank. Bereich sac1 TCA TCA TCA CCA TCT GCT C +hph-überhang * sac5 ATC CAG GAC CCA AAG ACT AAC C 3 flank. Bereich sac1 sac6 TAT ATG TAA CTG TCG CAG GTG G 3 flank. Bereich sac1 u-cr-1 TGC GGC TGA TTA TGG AGG A 5 N. crassa cr-1 sac10s ATG ATA GAA TTG AAG CGT GG 5 flank. Bereich sac1 cr-1for AGC GCA GCA ATT CAA GGG ACA GC N. crassa cr-1 cr-1rev GTT GCA AGA GCG CCA TAG GGC N. crassa cr-1 vivid nc for CCT CTC TTC TTC CAT ACG CTC TA N. crassa vvd vivid nc rev TTC GCA CTG GAA ACC CAT GCT GTA N. crassa vvd WC-1_for Nc TGT GCA TTT GTC GTC TGT GAT G N. crassa wc-1 WC-1_rev Nc AGA TCT CGA TTC CCG CTT GGC N. crassa wc-1 D5 CAC CAC CAC ACA GAG GAA AC 5 flank. Bereich ste12 Gna-1KO6RV ACT TTC CCC CAC ACT GCC CAT GA 3 flank. Bereich gsa1 Gna2-7 rev TGC AAG CTA ACT TGA AAT CTC C 3 flank. Bereich gsa2 * der Anteil hph-spezifischer Nukleotide ist durch Unterstreichung gekennzeichnet 1.4 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 2-Propanol (J.T. Baker), Agar-Agar (AppliChem), Agarose NEEO (Roth), Ammoniumacetat (Normapur), Ammoniumchlorid (J.T. Baker), Ampicillin (AppliChem), Biomalz (Dachser), Borsäure (Riedel-de Haën), Bromphenolblau (Serva), Calciumchlorid (J.T. Baker), Chloroform (VWR International), CPT-cAMP = 8-(4-Chlorophenylthio) cyclisches Adenosin-3',5'- monophosphat (Biolog), datp = Desoxyriboadenosin-5 -triphosphat (Roth), DB-cAMP = N 6,2'-O cyclisches Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat (Biolog), dctp = Desoxyribocytidin-5 -triphosphat (Roth), Dextranblau (Sigma), dgtp = Desoxyriboguanosin-5 -triphosphat (Roth), Di-Natriumhydrogenphosphat (Merck), D-Sorbitol (Acros Organics), dttp = Desoxyribotymidin-5 -triphosphat (Roth), EDTA = Ethylendiamin- N,N,N,N -Tetraessigsäure-Dinatriumsalz (Merck), Eisen(II)-chlorid (Riedel-de Haën), Ethanol (Riedel-de Haën), Ethidiumbromid (Roche), Ficoll PM 400 (Amersham Biosciences), Formaldehyd (J.T. Baker), Formamid (VWR International), Glucose (J.T. Baker), Glycerin (Riedel-de Haën), Hefeextrakt (BD), Heringssperma-DNA (Sigma), Hygromycin B (Calbiochem), IPTG = Isopropyl-1-thiol-β-D-galactosid (Roth), Isoamylalkohol = 3-Methyl-1- butanol (Riedel-de Haën), Kaliumchlorid (Riedel-de Haën), Kaliumdihydrogenphosphat (J.T. Baker), Magnesiumchlorid (J.T. Baker), Magnesiumsulfat (Riedel-de Haën), Maismehl (Mühle Levers Bochum), Maltose (Merck), Mangan(II)-chlorid (Riedel-de Haën), MOPS = 3-(N- Morpholino)propansulfonsäure (Biomol), Natriumacetat (J.T. Baker), Natriumchlorid (J.T. Baker), Natriumhydroxid (J.T. Baker), Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell, Millipore), Nourseothricin (Werner BioAgents), Nylonmembran (PerkinElmer, Genescreen), Papierfilter (Schleicher & Schuell), PEG6000 = Polyethylenglycol 6000 (Fluka), Phenol (AppliChem), PVP = Polyvinylpyrrolidon (Serva), Rinderserumalbumin (Serva), Röntgenfilme (Fuji Medical X- Ray-Film), Saccharose (J.T. Baker), Salzsäure (VWR International), SDS = Natriumdodecylsulfat (Cognis), Sephadex G50 (Amersham Biosciences), Sterilfilter 0.22 µm (Millipore), Tetracyclin (Serva), Tris = Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan (Sigma), Trypton/Pepton-Gemisch (Roth), Whatmanpapier (Schleicher & Schuell), X-Gal = 5-Brom-4-24

32 III. Material und Methoden Chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (AppliChem), Xylencyanol (Chroma), Zinksulfat (Merck) Radiochemikalien [α- 32 P]dCTP, Aktivität: 110 TBq/mmol (= 3000 Ci/mmol) (Amersham Biosciences) Alle sonstigen Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden, sofern nicht gesondert erwähnt, von den Firmen Amersham Biosciences, Biomol, Difco, Fluca, J.T. Baker, Merck, Promega, Riedel-de Haën, Roche, Roth, Serva, Sigma und VWR International bezogen. 1.5 Enzyme Alkalische Phosphatase (aus Shrimp, Roche), Glucanex 200 G (Novozymes), HotMaster Taq DNA-Polymerase (Eppendorf), Klenow-Polymerase (Promega), Restriktionsendonukleasen (Roche, Fermentas), T4-DNA-Ligase (Roche), Taq DNA-Polymerase (Eppendorf), TripleMaster Polymerasemix (Eppendorf), Ribonuklease A (Sigma), Proteinase K (Merck) 1.6 Häufig verwendete Puffer und Lösungen Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei dem eingesetzten Lösungsmittel um A. dest. Denaturierungspuffer: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl Denhardt s (1x): 0,02 % (w/v) Ficoll, 0,02 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % (w/v) Rinderserumalbumin Neutralisierungspuffer: 2 M NaCl, 1 M Tris, ph 5,5 SSPE (1x): 1 mm EDTA, 180 mm NaCl, 10 mm NaPO 4, ph 7,4 TBE (1x): 100 mm Borsäure, 2 mm EDTA, 100 mm Tris/HCl, ph 8,3 1.7 Nährmedien E. coli LB: SOC: 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, ph 7,5; bei Festmedium Zugabe von 1,5 % (w/v) Agar-Agar. Gegebenenfalls erfolgte die Zugabe von 60 µg/ml Ampicillin zur Plasmid-Selektion und 0,2 mm IPTG und 0,004 % (w/v) X-Gal zur Blau-Weiß-Selektion 2 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 10 mm MgSO 4, 20 mm Glucose, ph 7,5 S. macrospora BMM: 0,8 % (w/v) Biomalz in Maismehlextrakt (2,5 % (w/v) Maismehl in H 2 O bei 60 C ü. N., filtriert), ph 6,5 (KOH); bei Festmedium Zugabe von 1,5 % (w/v) Agar-Agar. Zur Selektion erfolgte die Zugabe von 110 U Hygromycin B oder 50 µg Nourseothricin pro ml Medium BMM-NaOAc: BMM mit 0,5 % (w/v) NaOAc, ph 6,5 (KOH); bei Festmedium Zugabe von 2 % (w/v) Agar-Agar 25

33 III. Material und Methoden CM: CMS: 1 % (w/v) Glucose, 0,2 % (w/v) Trypton, 0,2 % (w/v) Hefeextrakt, 0,15 (w/v) KH 2 PO 4, 0,05 % (w/v) KCl, 0,05 % (w/v) MgSO 4, 0,37 % (w/v) NH 4 Cl, 10 mg/l ZnSO 4, 10 mg/l Fe(II)Cl 2, 10 mg/l MnCl 2, ph 6,5 (KOH) CM mit 10,8 % (w/v) Saccharose; bei Festmedium Zugabe von 2 % (w/v) Agar-Agar SWG: 1 g/l KNO 3, 1 g/l KH 2 PO 4, 0,5 g/l MgSO 4 x 7H 2 O, 0,1 g/l NaCl, 0,1 g/l CaCl 2, 1 ml/l Chloroform, 0,1 ml/l Spurenelemente, 0,1 % (w/v) L-Arginin, 2 % (w/v) Glucose, 4% (w/v) lösliche Stärke, 0,1 mg/ml Biotin, ph 6,5 (KOH) 2. Methoden Alle nicht gesondert aufgeführten Methoden wurden nach Sambrook und Russel (2001) durchgeführt. 2.1 Kulturbedingungen E. coli Die Anzucht von E. coli-stämmen erfolgte in LB-Flüssigmedium (Schüttelkultur bei 300 rpm) oder auf LB-Festmedium bei 37 C ü.n. S. macrospora Die Kultivierung von S. macrospora erfolgte in Standkulturen für 7-14 Tage bei 27 C unter Dauerlicht in Petrischalen. Zur Stammhaltung wurde BMM-Festmedium verwendet, zur Kultivierung von Stämmen für DNA- bzw. RNA-Isolationen wurde CM-Flüssigmedium bzw. SWG-Flüssigmedium benutzt. Für Transformationsexperimente wurden Fernbachkolben mit je 150 ml CM-Medium (flüssig) angeimpft. Die Regeneration von protoplastierten S. macrospora- Zellen erfolgte auf CMS-Festmedium. Sporen von S. macrospora wurden auf BMM-NaOAc- Festmedium isoliert. Die Selektion erfolgte auf BMM-Festmedien mit Hygromycin B (110 U/ml) oder Nourseothricin (50 µg/ml). Die Kultivierung von S. macrospora unter Blaulicht mit einer Wellenlänge von 450 nm erfolgte durch die Verwendung eines blaulichtgängigen Filters (Lee Filters, Andover, England). Die Rotlichtversuche wurden unter einer Philips PF712E Dunkelkammer-Leuchte durchgeführt. 2.2 Messung des vegetativen Wachstum von S. macrospora Die Messung des vegetativen Wachstums erfolgte nach Nowrousian und Cebula (2005) durch Mehrfachbestimmungen in mit BMM-Festmedium gefüllten Rennrohren. 2.3 Transformationsverfahren Transformation von E. coli Die Transformation kompetenter E. coli-zellen erfolgte durch Elektroporation mit dem Multiporator (Eppendorf) entsprechend der Vorschrift von Dower et al. (1988). 26

34 III. Material und Methoden Transformation von S. macrospora Die Transformation von S. macrospora erfolgte verändert nach Nowrousian et al. (1999). Je nach Wachstum des zu transformierenden Stammes erfolgte die Kultivierung in drei bis sechs Fernbachkolben über drei bis sechs Tage. Das Myzel wurde durch Abnutschen geerntet, zerkleinert, von den Impfstücken befreit und mit PPP (13 mm Na 2 HPO 4, 45 mm KH 2 PO 4, 600 mm KCl, ph 6,0) gewaschen. Die enzymatische Protoplastierung der Zellen erfolgte durch eine mindestens vierstündige Inkubation in einer 20 ml Glucanex-Lösung (20 mg/ml in PPP) bei 27 C und 100 rpm. Myzelreste wurden durch eine Glasfritte (Porengröße 1, Schott) abgeschieden. Die Reinigung der Protoplastenlösung erfolgte durch zweimalige Zentrifugation für 5 min bei 3500 rpm und 4 C und die Aufnahme des Pellets in 10 ml und nachfolgend 5 ml PPP. Nach abschließender Zentrifugation (5 min bei 3500 rpm, 4 C) wurde mittels TPS (1 M Sorbit, 80 mm CaCl 2, ph 7,5) ein Titer von 10 8 Protoplasten pro ml eingestellt. Die Transformationen wurde mit 100 µl Protoplastenlösung und 5-15 µg DNA durchgeführt, wobei für Kotransformationen das selektionsvermittelnde Plasmid im Verhältnis von 1:2 mit der zu transformierenden DNA gemischt wurde. Anschließend erfolgte eine 10-minütige Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von 200 µl 25 % (w/v) PEG 6000 (in TPS) und einer Inkubation von 20 min bei RT wurden Aliquots auf zwei CMS-Platten ausplattiert. Je nach zu erwartender Wuchsrate wurden die Transformationsplatten 4 h bis ü. N. bei 27 C im Dauerlicht inkubiert. Danach wurden die Platten mit 9 ml Hygromycin B- oder Nourseothricin-haltigem Topagar überschichtet (Endkonzentration Platte: 110 U/ml Hygromycin B, 50 µg/ml Nourseothricin). Die durchgewachsenen Transformanten wurden 3-21 Tagen später von den Transformationsplatten auf Hygromycin B- oder Nourseothricin-haltiges BMM-Festmedium überimpft. 2.4 Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung von Plasmid- und Cosmid-DNA aus E. coli Die Isolierung von geringen Mengen Plasmid-DNA aus 5 ml LB-Kulturen erfolgte entsprechend Birnboim und Doly (1979) durch alkalische Lyse. Plasmid-DNA für anschließende Sequenzierungen wurde alternativ mit Hilfe des NucleoSpin Plasmid QuickPure Kit (Macherey & Nagel) nach Angaben des Herstellers erhalten. Größere Mengen Plasmid- DNA sowie low-copy Cosmide wurden mit dem NucleoBond PC500 Kit (Macherey & Nagel) beziehungsweise dem NucleoBond BAC 100 Kit (Macherey & Nagel) nach Angaben des Herstellers isoliert. Isolierung von genomischer DNA aus S. macrospora Die Isolierung der genomischen DNA aus S. macrospora erfolgte nach Lecellier und Silar (1994). Je nach Wachstum wurden eine bis drei Petrischalen angeimpft und nach dreitägiger Anzucht wurde das Myzels durch Zentrifugation geerntet. Nach Zugabe von 600 µl Lysepuffer (10 mm Tris/HCl, 1 mm EDTA, 100 mm NaCl, 2 % (w/v) SDS, ph 8,0) zum Myzel erfolgte der Aufschluss der Zellen durch sechsmaliges, abwechselndes Vortexen (1 min), Eintauchen im flüssigen Stickstoff (30 sek) und Erhitzen auf 70 C (1 min). Nach dem anschließenden Auftauen der Proben bei 70 C (5 min) wurden diese mit 1 ml Phenol versetzt, gemischt und anschließend für 15 min bei rpm und 4 C zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde nach Hinzufügen von 1 ml eines 1:1-Gemisches Phenol-Chloroform/Isoamylalkohol (24:1, v/v) zum Überstand wiederholt. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte durch Zugabe des einfachen Volumens -20 C Grad kalten Isopropanol zum Überstand und Inkubation für 20 min bei -70 C. Durch Zentrifugation (10 min, rpm, RT) wurden die Nukleinsäuren pelletiert und anschließend mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Abschließend wurde das Pellet in µl 27

35 III. Material und Methoden A. dest. gelöst. Die so gewonnene genomische DNA konnte nach RNaseA-Verdau der mitgefällten RNA für Southern-Analysen genutzt werden. PCR-Analyse erfolgte direkt mit der Nukleinsäurelösung. RNA-Isolierung aus S. macrospora Die Isolierung von RNA aus S. macrospora wurde verändert nach Sokolovsky et al. (1990) durchgeführt. Die Anzucht der Stämme erfolgte in drei bis acht Petrischalen. Dabei wurden gleich große Impfstücke von auf BMM-Festmedium kultivierten Stämmen in die Mitte der Flüssigkulturen überführt. Das Myzel wurde durch Abnutschen geerntet, direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren und durch Mörsern in flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Das pulverisierte Myzel wurde anschließend unaufgetaut in Probengefäße mit 2 ml Lysepuffer (0,6 M NaCl, 10 mm EDTA, 100 mm Tris/HCl (ph 8), 2 % (w/v) SDS) und 2 ml eines 1:1- Gemisches Phenol-Chloroform/Isoamylalkohol (1:24, v/v) überführt und 15 min geschüttelt. Der wässrige Überstand wurde nach einer 10-minütigen Zentrifugation (11000 rpm, 4 C) zwei weitere Male mit 2 ml Phenol-Chloroform/Isoamylalkohol (1:24, v/v) versetzt und zentrifugiert. Die Fällung der Nukleinsäuren erfolgte durch Zugabe von 200 µl NaOAc (ph 5,2, RT) und 4 ml Ethanol (-20 C) und anschließende Inkubation für mindestens 30 min bei -20 C. Nach Zentrifugation für 10 min bei 4 C und rpm und nachfolgendem Waschen mit 70 %-igem (v/v) Ethanol wurde die RNA in 200 µl A. dest. aufgenommen. 2.5 Gelelektrophoresen Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA Die Auftrennung von DNA erfolgte über 0,6-1,2 %-ige (w/v) Agarosegele in horizontalen Systemen. Je nach Gelelektrophoresesystem (Eurogentec i-mupid, Biorad DNA Sub Cell, GibcoBRL Horizon 11x14 bzw. Horizon 20x25) wurde 0,5 x oder 1 x TBE als Laufpuffer benutzt. Als Größenstandard wurde der Gene Ruler DNA Ladder Mix der Firma Fermentas verwendet. Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA Die Auftrennung von RNA erfolgte über 1,2 %-ige (w/v) Agarosegele mit 5 % (v/v) Formaldehyd und 1 x MOPS (1 mm EDTA, 20 mm MOPS, 5 mm Natriumacetat, ph 7,0) als Laufpuffer in horizontalen Systemen. Die RNA-Proben wurden vor dem Beladen des Gels mit RNA-Ladepuffermix (60 % (v/v) Formamid, 6 % (v/v) Formaldehyd, 20 % (v/v) MOPS (10x), 14 % (v/v) RNA-Ladepuffer (40 % (v/v) Glycerin (87 %), 50 % (v/v) Formamid, 10 % (v/v) Formaldehyd/Xylencyanol (1 % (w/v))) versetzt und 15 min bei 65 C denaturiert. 2.6 Extraktion von DNA aus Agarosegelen Die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem NucleoSpin Extract II Kit (Macherey & Nagel) nach Angaben des Herstellers. Zur Elution der DNA vom Säulenmaterial wurde A. dest. eingesetzt. 2.7 Radioaktive Markierung von DNA Für die radioaktive Markierung von DNA wurden gereinigte PCR-Fragmente oder geleluierte Restriktionsfragmente genutzt. Die Markierung erfolgte nach Feinberg und Vogelstein (1983) 28

36 III. Material und Methoden mittels Oligo primed labelling-technik (OPL) durch das Klenowfragment der DNA-Polymerase I, zufällige, hexamere Oligonukleotide und radioaktiv markiertes [α- 32 P]dCTP. Nach 3-7 h bei 37 C wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Dextranblau (200 mm EDTA, 0,2 % SDS, Bromphenolblau) gestoppt. Die markierte Sonde wurde über Gelfiltration (Sephadex G50) von nicht eingebauten [α- 32 P]dCTP getrennt und nach Denaturierung (10 min, 100 C) für Northern- und Southern-Analysen genutzt. 2.8 Hybridisierungen Southern-Hybridisierung Genomische DNA aus S. macrospora wurde mit geeigneten Restriktionsendonukleasen hydrolysiert und über Agarosegele elektrophoretisch aufgetrennt (siehe Kap. 2.4, 2.5). Der Transfer der DNA auf Nylonmembranen erfolgte verändert nach Southern (1975). Die Gele wurden zunächst für je 30 min in Denaturierungspuffer und nachfolgend Neutralisierungspuffer inkubiert. Durch einen in 20 x SSPE getränkten Kapillarblot wurde die DNA anschließend auf eine Nylonmembran überführt und durch UV-Licht im Stratalinker (Stratagene, Modus Auto ) mit der Membran quervernetzt. Die Membran wurde nachfolgend 1h bei 37 C mit Hybridisierungspuffer (0,125 ml/cm 2 Membran: 50 % (v/v) Formamid, 5 x SSPE, 0,2 % (w/v) SDS, 1 x Heringssperma-DNA (geschert, denaturiert), 5 x Denhardt s) vorbereitet. Die Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde (siehe Kap. 2.7) erfolgte durch Zugabe dieser zu dem Hybridisierungspuffer und Inkubation bei 37 C ü.n.. Nachfolgend wurden unspezifisch gebundene Sondenmoleküle durch Waschen mit Waschpuffer (5 x SSPE, 0,2 % (w/v) SDS) und steigender Temperatur (45-60 C) von der Membran entfernt. Die Membran wurde getrocknet und ein Röntgenfilm wurde in Gegenwart einer Verstärkerfolie bei -70 C 1-7 Tage exponiert. Rehybridisierungen der gleichen Membran wurden nach Entfernen der zuvor verwendeten Sonde durch kochenden Rehybridisierungspuffer (1 l, 0,1 % (w/v) SDS) durchgeführt. Northern-Hybridisierungen Northern-Analysen mit Gesamt-RNA (siehe Kap. 2.4, 2.5) wurden analog zu den Southern- Experimenten, jedoch ohne Denaturierungs-/Neutralisierungsschritt, durchgeführt. 2.9 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Standard-PCR PCR-Reaktionen zur Analyse, Zwischenklonierung oder Sondenherstellung wurden je nach Größe des zu erwartenden Amplikons beziehungsweise der gewünschten Präzision mit Taq DNA-Polymerase (Eppendorf, Fragmente 1,5 kb), HotMaster Taq DNA-Polymerase (Eppendorf, 4,5 kb) oder TripleMaster DNA-Polymerase-Mix (Eppendorf, Taq Polymerase und Proof reading Polymerase ) durchgeführt. Als Matrize dienten 5 ng Plasmid-DNA oder 200 ng genomischer DNA aus S. macrospora (vergl. 2.4). Dem Reaktionsansatz wurden je 1 µl vorwärts und rückwärts gerichtetem Primer (10 pmol), 10 mm dntps, 5 µl Reaktionspuffer (10 x) und 0,8 U Taq Polymerase, 1,5 U HotMaster Taq oder 2 U TripleMaster Polymerasemix pro 50 µl Ansatz hinzugefügt. Der Standardzyklus bestand aus einer initialen 2-minütigen Denaturierung der DNA bei 94 C, gefolgt von 35 Zyklen mit 2 min bei 94 C (Denaturierung), 20 sek bei C (Hybridisierung) und Polymerisierung bei 68 C (1 kb 1 min). Für eine vollständige Polymerisierung aller PCR-Produkte und zum Anfügen des A-Überhangs erfolgte im Anschluss eine 7-minütige terminale Elongation bei 68 C. Gegebenenfalls erfolgte eine 29

37 III. Material und Methoden Aufreinigung des PCR-Ansatzes über das NucleoSpin Extract II Kit (Macherey & Nagel) nach Angaben des Herstellers. Fusions-PCR Für das Erstellen von Deletionskonstrukten wurde ein PCR-Verfahren verändert nach Shevchuk et al. (2004) verwendet. In einem ersten Schritt wurde in drei Einzelreaktionen die hph-kassette aus dem Vektor pzhk2 (siehe Tab. 2) und die flankierenden Bereiche der zu deletierenden Gene mit genomischer S. macrospora-dna als Matrize amplifiziert. Die Amplifikation der flankierenden Bereiche wurde dabei mit je einem chimären Oligonukleotid durchgeführt, welches zusätzlich zu den flankierenden Bereichen des Gens einen 5 Überhang von 20 Nukleotiden komplementär zur hph-kassette besaß (siehe Tab. 3). Die Einzelreaktionen wurden nachfolgend über ein Kit gereinigt. In einer zweiten Teilreaktion wurden die drei gereinigten PCR-Fragmenten vereinigt und fungierten mit ihren überlappenden Enden sowohl als Matrize als auch als Primer. Dazu wurde ein äquimolares Verhältnis der PCR-Fragmenten eingestellt. Die eingesetzten Mengen betrugen je nach Deletionskonstrukt ng DNA pro Fragment. Zur Steigerung der Effizienz wurde abschließend eine nested PCR mit 3 µl des ungereinigten Produkts aus der zweiten PCR durchgeführt. Die Deletionskonstrukte wurden abschließend aus dem PCR-Ansatz gefällt und nachfolgend für die Transformation von S. macrospora genutzt Erzeugung von Doppel- und Dreifachmutanten Doppel- und Dreifachmutanten wurden durch Kreuzung verschiedener Deletionsstämme erzeugt, bei denen einer der Kreuzungspartner zusätzlich eine Farbspormutation besaß (fus1-1 bzw. r2, Esser und Straub 1958, Esser 1982). Für die Kreuzung wurden die Stämme in einer Pertischale mit BMM-Festmedium gegenübergesetzt. An der Kontaktzone beider Myzelien kam es durch Hyphenanastomosen zur Ausbildung rekombinanter Perithezien, die anhand der Aufspaltung der Farbspormarkierung innerhalb der freipräparierten Asci identifiziert werden konnten. Mittels klassischer genetischer Analyse konnten der Genotyp von Einzelsporen bestimmt und durch PCR-Analyse anschließend verifiziert werden (Esser und Straub 1958, Esser 1982) camp-komplementation Die Zugabe von in A. dest. gelöstem DB-cAMP erfolgte entweder in noch flüssiges BMM- Medium+Agar bzw. BMM-NaOAc+Agar oder durch Beträufeln des ausgehärteten Mediums. CPT-cAMP wurde in DMSO aufgenommen und wurde ebenfalls entweder in noch flüssigem BMM-Medium+Agar bzw. BMM-Na(O)Ac+Agar gelöst oder durch Beträufeln des ausgehärteten Mediums appliziert. Zusätzlich wurden Sporenkeimungs-Experimente mit CPTcAMP in flüssigem BMM-NaOAc durchgeführt. Die eingesetzten Konzentrationen betrugen sowohl für DB-cAMP als auch für CPT-cAMP 1-10 mm Sequenzierung Sequenzierungen von Plasmid-DNA wurden als Auftragsarbeiten bei der GATC Biotech AG (Konstanz) oder an der Ruhr-Universität Bochum (Fakultät für Chemie und Biochemie) durchgeführt. 30

38 III. Material und Methoden 2.13 Mikroskopische Analysen S. macrospora-stämme wurden wie von Engh et al. (2007) beschrieben auf mit BMM- Festmedium überschichteten Objekträgern in Glas-Petrischalen angezogen. Die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden mit einem Zeiss Axiophot Mikroskop in Verbindung mit der Kamera Axiocam und der Software AxioVision durchgeführt. Die Bildbearbeitung erfolgte mit dem Programm Adobe Photoshop CS Bioinformatorische Methoden Sequenzanalysen Die Auswertung von Sequenzierungschromatogrammen erfolgte mit der Software Chromas lite (Technelysium Pty Ltd, Version 2.01). DNA- und Proteinsequenzen wurden der öffentlichen Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA ( oder, bei N. crassa Sequenzen, der Datenbank des Broad Institutes, Cambridge, USA ( /annotation/genome/neurospora/home.html) entnommen. Die Suche nach Sequenzdaten ausgehend von einer gegebenen Sequenz mittels BLAST (Altschul et al. 1990) erfolgte entweder über das NCBI unter oder, für die Suche nach N. crassa-spezifischen Sequenzen, über die Seite des Broad Institutes unter Alignments Multiple Alignments wurden mittels ClustalW (Thompson et al. 1994) unter durchgeführt. Die grafische Bearbeitung der multiplen Alignments erfolgte mit dem Programm GeneDoc ( Nicholas et al. 1997). Lokale Alignments wurden durch LALIGN erstellt ( /software/lalign_form.html, Huang et al. 1990). In silico-sequenzbearbeitungen Die in silico-übersetzung von Nukleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen erfolgte mit Translate auf der Internetseite Revers komplementäre Nukleotidsequenzen wurden mit Revers Complement unter /~stothard/javascript/rev_comp.html erzeugt. In silico-klonierungen, Sequenzbearbeitungen und die Darstellungen von Vektorkarten erfolgten mit dem Programmpaket Clone Manager 7 (Scientific & Educational Software, Cary, USA) Sicherheitsbestimmungen Gentechnische Experimente der Sicherheitsstufe 1 (S1/B1) wurden nach den Richtlinien des Gentechnikgesetzes (GenTG) vom durchgeführt. 31

39 IV. Ergebnisse IV. Ergebnisse 1. Funktionelle Analyse der Nukleosiddiphosphat-Kinase (NDK1) bei der Morphogenese von S. macrospora 1.1 Annotation des ndk1-gens aus S. macrospora Für die zielgerichtete Deletion eines Gens ist die Kenntnis seiner Sequenz inklusive der flankierenden Bereiche notwendig. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde ein 3681 bp großes Fragment genomischer S. macrospora-dna isoliert und sequenziert, welches auch das ndk1-gen umfasste (I. Godehardt, pers. Mitteilung). Für eine geplante Deletion der Gensequenz wurde dieses zunächst durch den direkten Vergleich mit dem homologen Gen ndk-1 aus N. crassa annotiert. Da das Genom von S. macrospora nicht sequenziert ist, wird zu Vergleichszwecken auf Sequenzdaten des engen Verwandten N. crassa zurückgegriffen, dessen Genom vollständig sequenziert ist und mit durchschnittlich 89,5 % eine hohe Sequenzidentität zu bisher bekannten kodierenden Sequenzen aus S. macrospora aufweist (Galagan et al. 2003, Nowrousian et al. 2004). Die ndk1-gensequenz von S. macrospora besteht aus 702 bp und besitzt an den gleichen Positionen wie das N. crassa-homolog zwei ähnlich große Intronsequenzen von 172 bp beziehungsweise 71 bp Länge (siehe Anhang, Abb. A1), welche durch die Existenz konservierter Intron-Sequenzen identifiziert wurden (Pöggeler 1997). Die kodierende Sequenz für das S. macrospora NDK1-Protein hat wie die homologe Sequenz von N. crassa eine Länge von 459 bp und besitzt mit dieser eine Identität von 98 %. Die in silico-translation der kodierenden Sequenz ergibt ein 159 Aminosäuren großes NDK1-Protein mit ebenfalls 98 % Sequenzidentität zum Homolog aus N. crassa. Analysen mittels der in der BlastP-Analyse des NCBI eingebauten CD-Search -Option (conserved domain-search, Marchler-Bauer und Bryant 2004) weisen das Protein mit einem E-Wert von 2e-62 als Nukleosiddiphosphat-Kinase aus. Das Ergebnis der BlastP- Analyse zeigt eine hohe Sequenzidentität der NDK1 aus S. macrospora mit Orthologen aus Organismen aller Reiche (Daten nicht gezeigt). Die Abbildung 5 stellt ein multiples Alignment der NDK1 aus S. macrospora mit 22 homologen Proteinen aus diversen Pilzen (einzellige und filamentöse Ascomyceten bzw. Basidiomyceten), Pflanzen, Tieren und Bakterien dar. 32

40 76 IV. Ergebnisse Abb. 5: Multiples Alignment der NDK1 aus S. macrospora mit 22 homologen Proteinen aus Pilzen, Pflanzen, Tieren und Bakterien. Schwarz hinterlegt sind diejenigen Aminosäuren, welche in allen untersuchten Sequenzen identisch sind. Dunkelgrau gekennzeichnete Aminsoäuren sind in mindestens 17 Sequenzen identisch, hellgrau hervorgehoben sind Aminosäuren, die in mindestens 13 Sequenzen übereinstimmen. Das konservierte Histidin in der katalytischen Domäne der Nukleosiddiphosphat-Kinasen ist mit einem Pfeil markiert. Am Ende des Alignments sind die Aminosäureidentitäten der Sequenzen in Prozent in Bezug auf N. crassa angegeben. Verglichen wurden homologe Sequenzen aus: (i) filamentösen Ascomyceten: Neurospora crassa (N.c., XP_ ), Sordaria macrospora (S.m.), Magnaporthe grisea (M.g., MGG_ ), Fusarium graminearum (F.g., FGSG_ ), Aspergillus fumigatus (A.f., XP_ ), Aspergillus oryzae (A.o., BAE ), Aspergillus nidulans (A.n., AAL ); (ii) einzelligen Ascomyceten: Saccharomyces cerevisiae (S.c., NP_ ), Schizosaccharomyces pombe (S.p., CAB ), Candida albicans (C.a., XP_ ); (iii) Basidiomyceten: Ustilago maydis (U.m., UM ), Cryptococcus neoformans (C.n., AAW ); (iv) Pflanzen: Arabidopsis thaliana (A.t., CAB ), Oryza sativa (O.s., NP_ ), Nicotiana tabacum (N.t., AAX ), (v) Tieren: Caenorhabditis elegans (C.e., CAB ), Drosophila melanogaster (D.m., NP_ ), Mus musculus (M.m., AAH ), Rattus norvegicus (R.n., NP_ ), Pongo pygmaeus (P.p., CAH ), Homo sapiens (H.s., AAP ); (vi) Bakterien: Escherichia coli (E.c., AAC75571), Myxococcus xanthus (M.x., YP_631736). 33

41 IV. Ergebnisse Die katalytische Domäne der NDK1 aus S. macrospora besitzt das konservierten Konsensusmotiv aller bisher untersuchten Nukleosiddiphosphat-Kinasen NXXH[G/A]SD (Janin et al. 2000). Das zentrale Histidin wird bei der Phosphorylierung von (d)ndps zu (d)ntps transient durch ATP phosphoryliert (Abb. 5, Pfeil-Markierung, Lecroisey et al. 1995, Morera et al. 1995). Das ndk1-gen aus S. macrospora konnte durch in silico-analysen als kodierende Sequenz einer Nukleosiddiphosphat-Kinase identifiziert werden. 1.2 Erstellung eines ndk1-deletionskonstruktes mittels Fusions-PCR Während in S. cerevisiae bereits 40 bp lange genspezifische Sequenzen auf beiden Seiten des Selektionsmarkers ausreichen, um mittels homologer Rekombination ein Gen auszuschalten, sind für filamentöse Ascomyceten in der Regel deutlich größere flankierende Bereiche von über 1 kb nötig (Pöggeler und Kück 2006). Für die Deletion des ndk1-gens aus S. macrospora wurde mittels Fusions-PCR in einem Dreischritt- Verfahren ein Deletionskonstrukt erzeugt, dass flankierende 5 - beziehungsweise 3 - Bereiche des Gens und eine hph-kassette als Selektionsmarke beinhaltet. Das hph-gen aus E. coli vermittelt eine Resistenz gegen Hygromycin B. Dieses Aminoglycosid entfaltet seine antibiotische Wirkung sowohl gegen prokaryotische als auch eukaryotische Organismen. Bei beiden Organismengruppen bewirkt Hygromycin B eine Translationshemmung. Diese beruht bei Eukaryoten auf einer Hemmung der Translokation der am Ribosom naszierenden Polypeptidketten, während es die prokaryotische Translation durch Interaktion mit der ribosomalen 16S RNA unterbindet (Moazed und Noller 1987). Die vom hph-gen kodierte Hygromycin B-Phosphotransferase überträgt einen Phosphatrest auf das Hygromycin B, wodurch es inaktiviert wird. Das Einbringen einer hph-kassette vermittelt somit eine Resistenz gegen Hygromycin B und erlaubt eine Selektion von Transformanten. Die Fusions-PCR ermöglicht dabei eine PCR-basierte Kopplung einzelner PCR- Amplifikate. Mit Hilfe dieser Technik können in relativ kurzer Zeit ausgehend von bis zu vier kleineren sich überlappenden PCR-Fragmenten bis zu 20 kb große chimäre DNA-Fragmente amplifiziert werden (Shevchuk et al. 2004). Die zur Erzeugung der ndk1-deletionskassette genutzten Oligonukleotide sind in der Abbildung 6 eingezeichnet, welche schematisch die homologe Rekombination der konstruierten Kassette mit dem ndk1-gen aus S. macrospora darstellt. Die Amplifikation des hph- 34

42 IV. Ergebnisse Gens unter der Kontrolle des konstitutiven trpc-promotors aus A. nidulans erfolgte mit dem Vektor pzhk2 als Matrize und den Oligonukleotiden hph-r bzw. hph-f als Primer (Tab. 2 und 3, Kück und Pöggeler 2004). Abb. 6: Schematische Darstellung des Austausches des ndk1-gens gegen die hph- Deletionskassette durch homologe Rekombination. Gensequenzen werden entsprechend ihrer Orientierung durch graue Pfeile dargestellt. Die im ndk1-gen dargestellten weißen Quadrate veranschaulichen die Lage der Intronsequenzen. Graue Linien kennzeichnen die für die Deletionskassette genutzten flankierenden Bereiche des ndk1-gens. Schwarze Linien repräsentieren den genomischen Kontext der Gene. In kursiver Schrift sind diejenigen Oligonukleotide eingezeichnet, mit welchen die Konstruktion der hph-deletionskassette erfolgte. Oligonukleotide in grauer Schrift sind zur Verifizierung der homologen Rekombination eingesetzt worden. Die Oligonukleotide ndk-f und ndk-r wurden für den Nachweis des ndk1-gens mittels PCR und zur Sondenherstellung genutzt. Vertikale, gestrichelte Linien kennzeichnen Schnittstellen für die NsiI-Endonuklease, welche für die Southern-Analyse benutzt wurde und rote Linien markieren die Lage der ndk1- bzw. hphspezifischen Sonde. In zwei weiteren Einzelreaktionen wurde mit genomischer S. macrospora-dna als Matrize und den Primerkombinationen 5 ndk1 und ndk3 bzw. ndk4 und 3 ndk1 ein jeweils 0,9 kb großer 5 - bzw. 3 -flankierender Bereich von ndk1 amplifiziert. Die chimären Oligonukleotide ndk3 und ndk4 besaßen dabei neben S. macrosporaspezifischen Nukleotiden homologe Bereiche zur hph-kassette (Tab. 3, Abb. 6). Die drei aufgereinigten Amplifikate wurden nachfolgend in äquimolaren Mengen in einem gemeinsamen PCR-Ansatz eingesetzt und fungierten sowohl als Matrize als auch als Primer, da die chimären Enden beider flankierender Bereiche mit der hph-kassette hybridisieren konnten. Da die Effizienz dieser PCR sehr gering war und über Agarosegelelektrophoresen kein Amplifikat nachgewiesen werden konnte, wurde mit einem 3 µl Aliquot des PCR-Ansatzes als Matrize eine nested -PCR mit den Oligonukleotiden ndk2 und ndk5 durchgeführt (Abb. 6, Tab. 3). Neben größeren und kleineren Fragmenten unspezifischer Größe konnte durch Agarosegelelektrophorese ein Amplikon der richtigen Größe von 3 kb detektiert und eluiert werden. Durch 35

43 IV. Ergebnisse Testrestriktionen wurde die Identität der Deletionskassette bestätigt (Daten nicht gezeigt). Mit Hilfe der Fusions-PCR-Technik konnte eine für das ndk1-gen aus S. macrospora spezifische Deletionskassette erzeugt werden. 1.3 Erzeugung und Verifizierung von ndk1-deletionsmutanten Zur Deletion des ndk1-gens wurde die durch Fusions-PCR erhaltene Deletionskassette zunächst in den S. macrospora-wildtyp als Rezipienten transformiert. In 10 Transformationsexperimenten konnten insgesamt 43 Hygromycin B-resistente Transformanten erhalten werden. Zum Nachweis einer homologen Rekombination der Deletionskassette mit dem nativen ndk1-locus wurden PCR-Analysen mit genomischer DNA der Transformanten und den Primerkombinationen ndk1 und hph-ir bzw. hph-if und ndk6 durchgeführt (Tab. 3, Abb. 6). Beide Primerkombinationen ermöglichen nur bei homologer Integration der hph-kassette eine Amplifikation eines Fragmentes und dienen der Kontrolle der Integrität der 5 - wie auch der 3 - Integrationsstelle (Abb. 6). Jedoch konnte bei keiner der analysierten Transformanten ein homologes Integrationsereignis nachgewiesen werden. Nachfolgende Transformationsversuche wurden mit dem mittlerweile verfügbaren Δku70-Stamm als Rezipienten unternommen, welcher, wie bereits zuvor erwähnt, einen Defekt im NHEJ-System aufweist (siehe Kap. II und Tab. 1, Pöggeler und Kück 2006). Dabei wurden in einer Transformation vier Hygromycin B-resistente Transformanten erhalten, und es konnte für jede einzelne mittels PCR-Analyse der Austausch des ndk1-gens gegen die Deletionskassette verifiziert werden. Die Abbildung 7 zeigt die entsprechende Gelkontrolle zweier PCR- Ansätze, welche mit der genomischen DNA der Transformanten T1 und T2 und den Primerkombinationen ndk1 und hph-ir bzw. hph-if und ndk6 durchgeführt wurden. In diesem Beispiel konnte sowohl für die Transformante T1 als auch für die Transformante T2 die rekombinante 5 - bzw. 3 -Region durch Amplifikation eines 1,5 kb bzw. 2,2 kb großen DNA-Fragmentes nachgewiesen werden (Abb. 7). Aufgrund der Tatsache, dass Transformanten-Myzelien häufig sowohl transformierte als auch untransformierte Kerne enthalten, das heißt heterokaryotisch sind, wurde eine zusätzliche Kontroll-PCR mit der Primerkombination ndk1 und ndk6 durchgeführt. Mit Hilfe dieser Primer kann 36

44 IV. Ergebnisse sowohl im Wildtyp als auch in den Deletionsmutanten ein Fragment unterschiedlicher Größe amplifiziert werden, da die hph-kassette ca. 800 bp größer ist als das ndk1-gen von S. macrospora. Bei der Transformante T1 konnte eine Doppelbande festgestellt werden, welche auf ein heterokaryotisches Myzel schließen lässt (Abb. 7). Abb. 7: Nachweis der Deletion des ndk1-gens in den Transformanten T1 und T2 mittels PCR-Analyse. Der Nachweis der homologen Rekombinationsereignisse erfolgte unter Verwendung der angegebenen Oligonukleotide und anschließender Gelelektrophorese. Das (-) -Symbol steht für die Negativkontrolle, bei der den Ansätzen keine Matrize zugesetzt wurde. Δku70 kennzeichnet die Positivkontrolle, bei der als Matrize genomische DNA des Rezipientenstammes Δku70 zum Einsatz kam. In den mit Δku70Δndk1 T1 bzw. T2 bezeichneten Spuren erfolgten die PCR-Analysen mit entsprechender genomischer DNA der Transformanten. Aufgetragen wurden je 5 µl eines 50 µl PCR-Ansatzes. Das niedermolekulare Amplikon bei ca. 2,8 kb entspricht der auch in der Positivkontrolle amplifizierten ndk1-sequenz, das höhermolekulare bei ca. 3,5 kb hingegen der rekombinanten hph-sequenz (Abb. 7). Die PCR mit DNA der Transformante T2 führt hingegen ausschließlich zur Amplifikation des höhermolekularen, rekombinanten Fragmentes. Die Transformante T2 war somit homokaryotisch und wurde für die weiteren Versuche verwendet. Da diese Transformante zusätzlich zur Deletion des ndk1-gens noch die ku70-mutation besaß, wurde sie mit dem Stamm fus1-1 gekreuzt, um Einzelsporisolate herzustellen, die nur noch die ndk1-mutation besitzen. Der Stamm fus1-1 entspricht, abgesehen von einer Farbspormutation, dem Wildtyp (Tab. 1). Aus den rekombinanten Perithezien wurden anschließend Einzelsporen isoliert. Das Hygromycin B-resistente Einzelsporisolat K58 mit schwarzer Sporenfarbe war bezüglich des Antibiotikums Nourseothricin sensitiv (Tab. 1). Da die ku70-mutation mit der Resistenz gegen Nourseothricin gekoppelt ist, handelt es sich dementsprechend bei dem Einzelsporisolat K58 um eine ndk1- Deletionsmutante mit Wildtyp-Hintergrund. Dieses Einzelsporisolat wurde für die weiteren Analysen ausgewählt und wird nachfolgend mit Δndk1 bezeichnet. Zur 37

45 IV. Ergebnisse weiteren Charakterisierung des Genotyps der Δndk1-Mutante wurden Southern- Analysen durchgeführt. Wie der Abbildung 8A zu entnehmen ist, konnte durch Detektion mit einer ndk1-spezifischen Sonde für den Wildtyp ein Signal in der erwarteten Größe von 2,1 kb erhalten werden. Dieses spricht für ein einzelnes ndk1- Homolog in S. macrospora entsprechend der Situation in den bisher analysierten filamentösen Ascomyceten N. crassa und A. nidulans (Ogura et al. 1999, Lin et al. 2003). Erwartungsgemäß konnte im Δndk1-Stamm kein Signal gezeigt werden (Abb. 8A). Zur Überprüfung, ob es bei der Transformation der Deletionskassette neben der homologen Integration zu weiteren ektopischen Integrationen gekommen ist, wurde zusätzlich eine Southern-Analyse mit einer hph-spezifischen Sonde durchgeführt (Abb. 8B). Dabei konnte für die Δndk1-Mutante ein distinktes Signal bei ca. 2,8 kb festgestellt werden, welches spezifisch für die homologe Integration der Kassette ist. Weitere Signale konnten nicht detektiert werden. Abb. 8: Autoradiogramm einer Southern-Analyse mit genomischer DNA des Wildtyps und des Δndk1-Stammes unter Verwendung einer ndk1- bzw. hph-spezifischen Sonde. 40 µg genomischer DNA des Wildtyps (wt) bzw. der ndk1-mutante wurden mit 20 U NsiI hydrolysiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Membran transferiert. (A) Autoradiogramm nach Hybridisierung der Membran mit einer ndk1-spezifischen Sonde und (B) nach Hybridisierung der Membran mit einer hph-spezifischen Sonde. Durch Transformation des ndk1-spezifischen Deletionskonstruktes in den NHEJdefizienten Rezipientenstamm Δku70 konnten vier Transformanten erzeugt werden, welche nach PCR-Analyse eine Deletion des ndk1-gens aufwiesen. Durch Kreuzungen mit dem Wildtyp konnten Einzelsporisolate mit dem Genotyp Δndk1 erzeugt werden. Die Überprüfung des Einzelsporisolates K58 durch Southern- 38

46 IV. Ergebnisse Analysen bestätigten die Deletion des ndk1-gens in dieser Mutante. Weitere ektopische Integrationen der hph-kassette konnten ausgeschlossen werden. 1.4 Phänotypische Charakterisierung des Δndk1-Stammes und einer Retransformante Die Deletion des ndk1-gens verursacht eine starke Reduktion des vegetativen Wachstums der Mutante. In der Abbildung 9A sind parallele Anzuchten des Wildtyps und der Δndk1-Mutante auf BMM-Festmedium nach 12 Tagen Wachstum gezeigt. Während das Myzel des Wildtyps auf BMM-Festmedium bereits nach zwei bis drei Tagen den Rand der Petrischale berührt, erreicht die Mutante diesen erst nach deutlich mehr als 12 Tagen. Dabei konnte immer ein ungleichmäßiges, radiäres Wachstum der Mutante beobachtet werden (Abb. 9A). Eine mikroskopische Untersuchung der Perithezien ergab, dass analog zu einer Nukleosiddiphosphat-Kinase-Punktmutante aus N. crassa (Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001) die Anlage der Fruchtkörperhälse bei der S. macrospora-mutante zufällig und nicht fototrop erfolgte. Wie in Abbildung 9B für den Wildtyp zu erkennen ist, werden die Fruchtkörperhälse unter Auflicht generell an der lichtzugewandten Spitze des Peritheziums gebildet. Die Hälse erscheinen dabei dunkler gefärbt als der Rest des Fruchtkörpers, welcher von hellen Hyphen umgeben ist. Die im Vergleich mit dem Wildtyp gedrungen erscheinenden Fruchtkörper von Δndk1 weisen hingegen eine zufällige Anlage der Fruchtkörperhälse auf. Hierdurch erscheint es, als lägen sie seitlich auf dem Festmedium (Abb. 9B). Im Vergleich mit dem Wildtyp kann zudem gehäuft eine Bildung von zwei Hälsen an einem Perithezium beobachtet werden, was in dem Ausschnitt der Abbildung 9 B (Pfeil-Markierung) exemplarisch zu sehen ist. Um zu überprüfen, ob die Anlage der Fruchtkörperhälse in S. macrospora ebenfalls wie für N. crassa beschrieben auf der Perzeption von Blaulicht beruht (Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001), wurde der Wildtyp von S. macrospora in Dunkelheit, unter Blaulicht oder unter Rotlicht kultiviert. Der in Dunkelheit angezogene Wildtypstamm von S. macrospora zeigte bezüglich der Entwicklung der Fruchtkörper einen mit der Δndk1-Mutante vergleichbaren Phänotyp mit ungerichtet ausgebildeten Fruchtkörperhälsen. Dieser Phänotyp konnte auch bei Rotlicht-Anzuchten festgestellt werden. 39

47 IV. Ergebnisse Der Wildtyp von S. macrospora bildet sowohl bei konstantem Licht als auch in konstanter Dunkelheit Perithezien aus. Bei anderen Ascomyceten steuert das Licht hingegen die Ausbildung der Fruchtkörper. So erfolgt die Fruchtkörperbildung von A. nidulans überwiegend in Dunkelheit, während durch Rotlicht die asexuelle Vermehrung mittels Konidiosporen induziert wird (siehe Kapitel I.4.1). Für Pyronema confluens wurde hingegen beschrieben, dass zur Entwicklung seiner Fruchtkörper Licht, jedoch kein Rotlicht, notwendig ist (Wilson 1952, Nowrousian und Kück 2006). Unter Blaulicht hingegen erfolgte die Anlage der Fruchtkörperhälse analog zum Weißlicht positiv fototrop in Richtung des Lichtreizes (Daten nicht gezeigt). Abb. 9: Phänotyp des S. macrospora-wildtyps (wt) und der Mutante Δndk1. (A) Die Kultivierung des Wildtyps und der Deletionsmutante Δndk1 erfolgte in Petrischalenkulturen für 12 Tage auf BMM-Festmedium. Die ca. 0,2-0,5 mm großen Perithezien sind als schwarze Punkte erkennbar. (B) Mikroskopische Aufsicht auf die Perithezien des Wildtyps und der Mutante nach Anzucht auf BMM-Festmedium unter Auflicht (12 d). Zwei rote Pfeile deuten auf ein Perithezium der Mutante mit zwei Fruchtkörperhälsen. Die eingezeichneten Maßstabsbalken entsprechen 200 µm. Um den kausalen Zusammenhang zwischen der Deletion des ndk1-gens und dem beobachteten Phänotyp zu verifizieren, wurde eine Komplementation der Δndk1Mutante angestrebt. Dazu wurde mit Hilfe der Primerkombination ndk1 und ndk6 sowie 40

48 IV. Ergebnisse Abb. 10: PCR-Analyse zur Verifizierung einer Δndk1::ndk1- Retransformante. Die PCR-Reaktionen wurden ohne Matrize (-) und mit genomischer DNA des Wildtyps (wt), der Δndk1-Mutante (Δndk1) und Retransformante K14 (Δndk1::ndk1 K14) durchgeführt. Als Primer dienten die Oligonukleotide ndk-f und ndk-r (siehe Abb. 6). Aufgetragen wurden je 5 µl eines 50 µl-pcr- Ansatzes. genomischer Wildtyp-DNA ein 2,8 kb großes Fragment amplifiziert. Dieses beinhaltet neben dem ndk1-gen jeweils ca. 1 kb große 5 bzw. 3 -flankierende Bereiche, um putativ cis-wirkende, transkriptionsfördernde Sequenzen zu erhalten. Dieses Fragment wurde anschließend in den Vektor pdrive kloniert und sequenziert (Tab. 2). Nach Verifizierung der Sequenz wurde das rekombinante Plasmid pdrive-ndk in den Δndk1-Stamm K58 transformiert. Die Selektion von Transformanten erfolgte durch Kotransformation mit dem Plasmid pd-nat1, welches Resistenz gegen das Antibiotikum Nourseothricin vermittelt (Tab. 2, Kück und Hoff 2006). Bei der Nourseothricin-resistenten Transformante K14 (Tab. 1) konnte durch PCR-Analyse mit den Primern ndk-f und ndk-r (Tab. 3, Abb. 6) eine Integration des ndk1-gens in das Genom durch den Nachweis des ndk1-spezifischen 0,7 kb-amplikons gezeigt werden (Abb. 10). Durch Kreuzung mit der Farbspormutante fus1-1 wurden nachfolgend Nourseothricinsensitive Einzelsporisolate der Retransformante K14 erzeugt, um einen Einfluss des integrierten Vektors pd-nat1 auf den Phänotyp auszuschließen. Für die Einzelsporisolate wurde anschließend ebenfalls eine intakte Kopie des ndk1-gens mittels PCR nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die Einzelsporisolate zeigten ein über das Wildtyp-Niveau hinaus restauriertes vegetatives Wachstum, wie die Wuchsbestimmung eines ausgewählten Retransformanten-Isolates mittels Rennrohrtest im Vergleich mit der Deletionsmutante und dem Wildtyp belegt (Abb. 11). Nach einem Messzeitraum von sieben Tagen kann für das Myzel der Deletionsmutante Δndk1 eine Wuchsstrecke von ca. 1,5 cm festgestellt werden. Der Wildtyp ist im gleichen Zeitraum ca. 13 cm gewachsen, während die Retransformante auf einer Strecke von ca. 20,5 cm Myzel gebildet hat. Demnach erreicht Δndk1 nur etwas mehr als 10 % des Myzelwachstums des Wildtyps, die Retransformante erfährt jedoch eine Wachstumssteigerung gegenüber dem Wildtyp um fast 60 %. Die ermittelten Standardabweichungen waren insgesamt vernachlässigbar gering. Wie mikroskopische 41

49 IV. Ergebnisse Beobachtungen der Mutante zeigen, bildet diese dünnere Hyphen aus, an denen in kürzeren Abständen als beim Wildtyp Verzweigungen angelegt werden (Daten nicht gezeigt). Abb. 11: Bestimmung der vegetativen Wachstumsrate des Wildtyps (wt), der ndk1- Deletionsmutante (Δndk1) und der Δndk1::ndk1-Retransformante. Die Bestimmung der Wuchsstrecke erfolgte in jeweils drei Doppelbestimmungen pro Stamm. Pro Tag wurde zu einer definierten Zeit eine Messung vorgenommen. Auf der x-achse sind die Messpunkte in Tagen (d) eingezeichnet, auf der y-achse ist die ermittelte Wuchsstrecke in cm abzulesen. Für jeden Messwert ist die Standardabweichung über vertikale, blind endende Linien angegeben. Die Zuordnung der analysierten Stämme zu den Graphen ist der Legende zu entnehmen. Die Retransformante ähnelt dagegen, bezogen auf den Myzelphänotyp, sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch dem Wildtyp (Daten nicht gezeigt). Allerdings konnte für die Retransformante keine Restauration bezüglich der Anlage der Perithezienhälse unter Lichteinwirkung beobachtet werden. Auch die phänotypische Analyse zweier weiterer, in einer unabhängigen Transformation mit pdrive-ndk und pd-nat1 erzeugter Retransformanten zeigte im Vergleich mit dem Δndk1-42

50 IV. Ergebnisse Rezipientenstamm ein gesteigertes vegetatives Wachstum, ohne eine Wiederherstellung des Perithezienphänotyps ähnlich dem des Wildtyps aufzuweisen (Daten nicht gezeigt). Die Δndk1-Deletionsmutante besitzt im Vergleich mit dem S. macrospora-wildtyp ein stark reduziertes vegetatives Wachstum. Die Perithezien der Mutante weisen zusätzlich einen Verlust des positiven Fototropismus bei der Anlage der Fruchtkörperhälse auf. Sie gleichen damit den vom Wildtyp in Dunkelheit gebildeten Perithezien. Die Komplementation der Deletionsmutante durch Einbringen einer Wildytp-Kopie des ndk1-gens führte zur Restauration des Myzelwachstums in drei Retransformanten über das Niveau des Wildtyps hinaus. Jedoch konnte bei keiner der Retransformanten eine Reversion des Perithezienphänotyps festgestellt werden. 1.5 Molekulare Charakterisierung der ndk1-mutante und der Δndk1::ndk1- Retransformante Da die Deletion des ndk1-gens zu einem reduzierten Myzel-Wachstum des Stammes im Vergleich mit dem Wildtyp führte und die Komplementation dieser Mutante mit einer Wildtypkopie des ndk1-gens eine Überkompensation bewirkte, wurde durch Southern- Analyse die Integration des Vektors pdrive-ndk in das Genom der Retransformante ndk1::ndk1 K14 untersucht, um die Anzahl der integrierten ndk1-kopien zu bestimmen. Dabei wurde nach Hybridisierung mit einer ndk1-spezifischen Sonde bei einer singulären und vollständigen ektopischen Integration des Vektors pdrive-ndk ein Signal in Höhe von 5,8 kb erwartet. Wie die Abbildung 12 zeigt, konnten in der Spur, in welcher AccI-hydrolysierte DNA der Transformante aufgetragen wurde, eine Vielzahl von Signalen beobachtet werden. Ein Signal auf der Höhe von etwas unter 6 kb entspricht dabei dem vollständig integrierten Vektor pdrive-ndk (Abb. 12, Pfeil- Markierung). Jedoch können sechs weitere Signale in der Größe von ca. 3 kb, 4,7 kb, 6,5 kb, 7,8 kb, 10 kb und eines über 10 kb detektiert werden. Dieses Ergebnis lässt auf die Integration zahlreicher unvollständiger Plasmidkopien schließen. 43

51 IV. Ergebnisse Abb. 12: Autoradiogramm einer Southern-Analyse der Δndk1::ndk1- Retransformante K14. Jeweils 40 µg genomischer DNA des Wildtyps (wt), des Deletionsstammes (Δndk1) und der Retransformante (Δndk1::ndk1 K14) wurde mit 20 U AccI hydrolysiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf einer Membran fixiert. Als Sonde wurde ein radioaktiv markiertes ndk1-amplikon eingesetzt. Ein Pfeil kennzeichnet das bei einer vollständigen Integration des Vektors erwartete Signal. Das Signal auf der Höhe von ca. 6,5 kb besitzt zudem eine größere Intensität als die anderen Signale und lässt Rückschlüsse auf die Existenz mehrerer ndk1-spezifischer Fragmente dieser Größe zu. Bei der als Positivkontrolle eingesetzten DNA des Wildtyps ist ein Signal auf Höhe der erwarteten Größe von 2,1 kb zu erkennen, während keine Hybridisierung der ndk1-sonde mit der genomischen DNA des Deletionsstammes beobachtet werden kann. Da die in dieser Arbeit verwendete Sonde mit einer Größe von 688 bp fast die gesamte Länge des 702 bp großen ndk1-gens abdeckt, ist bei der Vielzahl der Signale von mehreren intakten ndk1-kopien in der Retransformante auszugehen. Um diese Hypothese zu verifizieren und den potentiellen Einfluss der ndk1-kopienzahl auf die Expression des ndk1-gens zu überprüfen, wurde eine Northern-Analyse mit Gesamt-RNA der Retransformante durchgeführt. Das Ergebnis dieser Northern-Analyse mit einer ndk1-spezifischen Sonde ist in Abb. 13 dargestellt. Eine nachweisbare Expression des ca. 0,7 kb großen ndk1-transkripts konnte für den Wildtyp nur nach drei Tagen Wachstum beobachtet werden. Zum selben Zeitpunkt ist in der Retransformante eine geringfügig erhöhte Transkriptmenge feststellbar. Im Gegensatz zum Wildtyp erfolgte aber auch an den Tagen vier bis sieben die Synthese einer vergleichbaren Menge des ndk1-transkriptes (Abb. 13, Δndk1::ndk1 K14, 3d-7d). 44

52 IV. Ergebnisse Abb. 13: Vergleichende Northern-Analyse mit Gesamt-RNA aus dem Wildtyp und der Retransformante K14. Die Ernte der Myzelien des Wildtyps (wt) und der Retransformante (Δndk1::ndk1 K14) erfolgte nach einem Wachstum von drei bis sieben Tagen (d). Zum Vergleich der eingesetzten RNA-Mengen (15 µg) ist in der unteren Spur die Ethidiumbromidgefärbte rrna des zugrunde liegenden Agarosegels angefügt. Die Hybridisierung erfolgte mit einer radioaktiv markierten ndk1-sonde. Diese Ergebnisse unterstreichen die Annahme, dass bei der Retransformante K14 eine Integration mehrerer intakter ndk1-genkopien in das Genom erfolgte. Diese bewirken offensichtlich über einen Dosiseffekt die leicht erhöhte, im Gegensatz zum Wildtyp konstitutive Expression von ndk1 in der Retransformante. Dieses erklärt unter Umständen das schnellere vegetative Wachstum der Retransformante im Vergleich mit dem Wildtyp. Um den Einfluss der ndk1-gendeletion im Δndk1-Stamm und die konstitutive Überexpression des ndk1-transkripts in der Retransformante auf die Expression lichtabhängiger Gene zu untersuchen, wurden vergleichende Northern-Analysen beider Stämme mit dem Wildtyp vorgenommen. Dazu wurde durch heterologe PCR mit Oligonukleotiden entsprechend der jeweiligen N. crassa-sequenzen (Tab. 3) und mit genomischer DNA aus S. macrospora eine wc1- bzw. eine vvd-spezifische Sonde hergestellt. Die Identität der Sonden wurde durch Sequenzierung und in silico-analyse der Sequenzen bestätigt (Daten nicht gezeigt). Das Gen wc1 kodiert für den putativen Blaulichtrezeptor WC1 aus S. macrospora, während der putative Blaulichtregulator Vivid aus S. macrospora vom vvd-gen kodiert wird (siehe Kap. I.4.1). Während mit der wc1-spezifischen Sonde keine Signale detektiert werden konnten, wurden mit der vvdspezifischen Sonde distinkte Signale erhalten, wie der Abbildung 14 zu entnehmen ist. 45

53 IV. Ergebnisse Abb. 14: Vergleichende Northern-Analysen mit Gesamt-RNA aus dem Wildtyp, der Retransformante K14 und dem Δndk1-Stamm unter Verwendung einer vvd-spezifischen Sonde. Die Ernte der Myzelien des Wildtyps (wt) und der Retransformante (Δndk1::ndk1 K14) erfolgte nach einem Wachstum von drei bis sieben Tagen (d). Eine ausreichende Menge Myzel der Deletionsmutante Δndk1 konnte erst nach sechs bzw. sieben Tagen Anzucht geerntet werden. Zum Vergleich der eingesetzten RNA-Mengen (15 µg) ist in der unteren Spur die Ethidiumbromid-gefärbte rrna des zugrunde liegenden Agarosegels angefügt. Für den Wildtyp konnte nur ein schwaches Signal nach drei Tagen Anzucht beobachtet werden, in älteren Kulturen war mittels Northern-Analyse kein Transkript festzustellen. Allerdings ist in den entsprechenden Spuren auch eine geringere Menge Gesamt-RNA aufgetragen worden, wie anhand der rrna-kontrolle ersichtlich ist (Abb 14, wt, 4d-7d). Die Retransformante K14 exprimiert kontinuierlich eine sehr geringe Menge des vvd- Transkriptes. Deutlich stärkere Signale sind hingegen bei der sechs bzw. sieben Tage dauernden Anzucht des Δndk1-Stammes zu beobachten. Dabei entspricht die aufgetragene Menge an Gesamt-RNA in etwa der Menge des Wildtyps nach drei Tagen Anzucht und der Menge der Retransformante nach drei bis sechs Tagen Anzucht (Abb. 14, rrna-kontrolle). Somit kann für die ndk1-mutante unter Berücksichtigung der aufgetragenen RNA-Mengen von einer Überexpression des vvd-transkriptes im Vergleich mit dem Wildtyp und der Retransformante ausgegangen werden. Die Δndk::ndk1-Retransformante weist wahrscheinlich mehrere intakte Kopien des ndk1-gens auf. Diese bewirken vermutlich durch einen Dosis-Effekt eine im Vergleich mit dem Wildtyp gesteigerte und konstitutive Expression des ndk1-gens. Erste Untersuchungen zur funktionellen Interaktion des ndk1-genprodukts mit Komponenten des Blaulichtsignalweges mittels Northern-Analyse zeigen, dass vor dem Hintergrund einer ndk1-deletion die Expression des vvd-gens erhöht ist. 46

54 IV. Ergebnisse 2. Funktionelle Analyse der Adenylatcyclase (SAC1) bei der Morphogenese von S. macrospora 2.1 Annotation des sac1-gens aus S. macrospora Im Vorfeld dieser Arbeit konnte ein Cosmid-Klon (H2, siehe Tab. 2) aus der indizierten S. macrospora Genbank (Pöggeler et al. 1997) isoliert werden, welcher ein putatives Gen für eine Adenylatcyclase enthielt (I. Godehardt, pers. Mitteilung). Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Sequenzierung dieses Cosmid-Klons begonnen. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass der Cosmid-Klon unvollständig war, da Vergleiche mit der homologen cr-1-gensequenz der Adenylatcyclase aus N. crassa auf ein fehlendes 5 -Ende der Sequenz hinwiesen. Durch PCR mit einem heterologen, cr-1- spezifischen Primer (u-cr-1, Tab. 3) und einem für die bereits bekannte Sequenz aus S. macrospora spezifischem Primer (sac10s, Tab. 3) konnte ein ca. 4,2 kb großes Amplikon aus genomischer DNA von S. macrospora erzeugt werden, welches in pdrive kloniert wurde. Das rekombinante Plasmid pdade (Tab. 2) wurde teilweise sequenziert, wodurch ca. 1,2 kb des 5 - flankierenden Bereichs und der Anfang des putativen Adenylatcyclase-Gens ermittelt werden konnten. Insgesamt wurden durch die Sequenzierungen fast 12 kb Sequenzdaten erfasst. Ein Vergleich dieser Sequenz mit der 7893 bp großen Gensequenz der Adenylatcyclase aus N. crassa führte zur Identifikation des 8100 bp großen Leserahmens der Adenylatcyclase aus S. macrospora. Das Gen erhielt den Namen sac1 (Sordaria Adenylatcyclase 1). Durch Analyse konservierter Intronsequenzen (Pöggeler 1997) und Vergleich mit dem homologen N. crassa-gen konnten drei intronische Bereiche identifiziert werden. Diese besitzen eine Größe von 290 bp, 806 bp sowie 65 bp und befinden sich an den gleichen Positionen wie die Intronsequenzen im cr-1-gen aus N. crassa (siehe Anhang, Abb. A2). Die kodierende Sequenz weist somit eine Größe von 6939 bp auf und besitzt mit der 6903 bp großen kodierenden Sequenz aus N. crassa eine Sequenzidentität von 90 %. Die in silico-translation ergibt ein Protein aus 2312 Aminosäuren, welches eine Aminosäureidentität von 92 % zu dem 2300 Aminosäuren großen CR-1-Protein aus N. crassa zeigt. Untersuchungen mittels der in die BlastP- Analyse des NCBI eingebauten CD-Search -Option ergeben die vier für pilzliche 47

55 IV. Ergebnisse Adenylatcyclasen typischen Domänen (Baker und Kelly 2004). Diese umfassen eine N- terminal lokalisierte RA-Domäne (Ras association domain, E-Wert 4e-30), gefolgt von einer Leucin-reichen Region unbekannter Funktion (E-Wert 5e-16), eine Serin/Threonin-Phosphatase-Domäne (Typ PP2C, E-Wert 5e-57) und die C-terminale katalytische Domäne einer Adenylat- bzw. Guanylatcyclase (E-Wert 6e-33). Eine grafische Darstellung der Lokalisation der Leucin-reichen Region, der Phosphatase- Domäne und der katalytischen Domäne ist in einem Alignment der SAC1-Sequenz mit dem CR-1-Homolog aus N. crassa im Anhang in Abbildung 3 dargestellt. Die Unterscheidung zwischen Adenylat- oder Guanylatcyclase kann durch zwei konservierte Aminosäuren in der C-terminalen katalytischen Domäne getroffen werden. An Aminosäure-Position 1945 weist das SAC1-Protein ein für Adenylatcyclasen der Klasse III typisches Lysin auf, während an Position 2025 ein konserviertes Asparatat zu finden ist. Zwei weitere konservierte Aminosäuren, die sowohl für die Funktion von Adenylat- als auch Guanylatcyclasen essentiell sind, treten im SAC1-Protein an Position 2032 (Asparagin) und 2036 (Arginin) auf (Abb. A3, Pfeil-Markierungen, Baker und Kelly 2004). Nukleotidcyclasen werden in insgesamt 6 Klassen aufgeteilt (Cotta et al. 1998, Sismeiro et al. 1998, Tellez-Sosa et al. 2002). Klasse III-Nukleotidcyclasen sind sowohl bei Pro- wie Eukaryoten zu finden, während alle anderen Klassen ausschließlich prokaryotische Adenylatcyclasen beinhalten. Die pilzlichen Klasse III- Adenylatcyclasen besitzen im Gegensatz zu denen aus Säugetieren keine Transmembrandomänen (Baker und Kelly 2004). Eine BlastP-Analyse mit dem SAC1-Protein ergab zudem eine Vielzahl homologer Adenylatcyclasen aus Pilzen verschiedener Klassen wie Ascomyceten und Basidiomyceten (Daten nicht gezeigt). Damit wird ebenfalls bestätigt, dass es sich bei SAC1 aus S. macrospora höchstwahrscheinlich um eine Adenylatcyclase handelt. Durch die Sequenzierung des Cosmid-Klons H2 aus der S. macrospora-genbank und des rekombinanten Plasmids pdade konnten insgesamt 12 kb Sequenzdaten erhalten werden, welche ein putatives Gen für eine Adenylatcyclase aus S. macrospora beinhalten. Mittels in silico-analysen konnte die Identität des sac1- Gens aus S. marospora verifiziert werden. 48

56 IV. Ergebnisse 2.2 Herstellung eines sac1-deletionskonstruktes mittels Fusions-PCR Analog zur Vorgehensweise bei der Erzeugung des ndk1-deletionskonstruktes (siehe Kap. IV.1.2) wurde ein sac1-spezifisches Deletionskonstrukt mittels Fusions-PCR erstellt. Die zur Erzeugung der sac1-deletionskassette genutzten Oligonukleotide sind in der Abbildung 15 eingezeichnet, welche schematisch die homologe Rekombination der hph-resistenzkassette mit dem sac1-gen aus S. macrospora darstellt. Abb. 15: Schematische Darstellung des Austausches des sac1-gens gegen die hph- Deletionskassette durch homologe Rekombination. Gensequenzen werden entsprechend ihrer Orientierung durch graue Pfeile dargestellt. Die im sac1-gen dargestellten weißen Quadrate veranschaulichen die Lage von Intron-Sequenzen. Graue Linien kennzeichnen die für die Deletionskassette genutzten flankierende Bereiche des sac1-gens. Schwarze Linien repräsentieren den genomischen Kontext der Gene. In kursiver Schrift sind diejenigen Oligonukleotide eingezeichnet, mit welchen die Konstruktion der hph-deletionskassette erfolgte. Oligonukleotide in grauer Schrift sind zur Verifizierung der homologen Rekombination eingesetzt worden. Die Oligonukleotide sac-f und sac-r wurden für den Nachweis des sac1-gens mittels PCR und zur Sondenherstellung genutzt. Vertikale, gestrichelte Linien kennzeichnen Schnittstellen für die NruI-Endonuklease, welche für die Southern- Analyse benutzt wurde und rote Linien markieren die Lage der sac1- bzw. hph-spezifischen Sonde. Die Amplifikation der hph-kassette erfolgte mit dem Vektor pzhk2 (Kück und Pöggeler 2004) als Matrize und den Oligonukleotiden hph-r bzw. hph-f als Primer (Tab. 2, 3, Abb. 15). Die je 1,2 kb großen flankierenden Bereiche des sac1-gens wurden mittels PCR mit den Primerkombinationen 5 sac1 und sac3 bzw. 3 sac1 und sac4 unter Verwendung genomischer S. macrospora-dna als Matrize gewonnen (Tab. 3). Nach Fusions-PCR der drei Einzelamplifikate erfolgte mit 3 µl des PCR-Ansatzes eine nested -PCR unter Verwendung der Primer sac1 und sac6 (Tab. 3, Abb. 15). 49

57 IV. Ergebnisse Die Identität des erhaltenen 3,8 kb großen sac1-deletionskonstruktes wurde durch eine Testrestriktion mit EcoRI verifiziert, wobei die Kassette in vier Fragmente der Größen 1437 bp, 1165 bp, 909 bp und 316 bp hydrolysiert wurde (Daten nicht gezeigt). Durch Fusions-PCR konnte erfolgreich eine sac1-spezifische Deletionskassette erstellt werden. 2.3 Erzeugung und Verifizierung von sac1-deletionsmutanten Die Transformation des sac1-deletionskonstruktes erfolgte in den Rezipientenstamm Δku70 (siehe Kap. II und Tab. 1, Pöggeler und Kück 2006). In einem Transformations- Ansatz konnten insgesamt acht Hygromycin-resistente Transformanten erhalten werden, von denen sechs nachfolgend mittels PCR auf eine homologe Integration der Deletionskassette in den nativen sac1-locus untersucht wurden. Analog zur Vorgehensweise bei der Verifizierung der ndk1-deletion (siehe Kap. IV.1.3) wurde mit den Primerkombinationen sac1 und hph-ir bzw. hph-if und sac6 die DNA der Transformanten auf die Integrität der 5 - bzw 3 -Rekombinationsstelle überprüft (Abb. 15, Tab. 3). Die Abbildung 16 zeigt die Gelkontrolle der PCR-Ansätze der Transformanten Δku70Δsac1 T4-T6. Abb. 16: Nachweis der Deletion des sac1-gens in den Transformanten T4, T5 und T6 mittels PCR-Analyse. Der Nachweis der homologen Rekombinationsereignisse erfolgte mittels PCR unter Verwendung der angegebenen Oligonukleotide und anschließender Gelelektrophorese. Das (-) -Symbol steht für die Negativkontrolle, bei der den Ansätzen keine Matrize zugesetzt wurde. Δku70 kennzeichnet die Positivkontrolle, bei der als Matrize genomische DNA des Rezipientenstammes Δku70 zum Einsatz kam. In den mit Δku70Δsac1 T4, T5 bzw. T6 bezeichneten Spuren erfolgten die PCR-Analysen mit entsprechender DNA der Transformanten. Aufgetragen wurden je 5 µl eines 50 µl-pcr-ansatzes. 50

58 IV. Ergebnisse Für die Transformanten Δku70Δsac1 T4, T5 beziehungsweise T6 konnte eine homologe Rekombination der hph-kassette sowohl für das 5 - als auch das 3 -Ende durch Amplifikation eines 1,7 kb bzw. 2,3 kb großen DNA-Fragmentes nachgewiesen werden (Abb. 16). Entsprechend den Erwartungen konnten diese Fragmente nicht bei der PCR- Analyse der Negativkontrolle (-) und mit der DNA des Rezipientenstamm Δku70 amplifiziert werden. Ob Heterokaryen vorlagen, wurde mit den sac1-spezifischen Oligonukleotiden sac-f und sac-r überprüft (Abb. 15, Tab 3). In der Transformante T6 konnte ein Fragment mit einer Größe von 3,0 kb amplifiziert werden, welches auch beim Rezipientenstamm ku70 zu beobachten ist. Folglich handelt es sich bei der Transformante T6 um ein Heterokaryon (Abb. 16). Insgesamt waren von den sechs untersuchten Transformanten drei homokaryotisch und drei heterokaryotisch. Um die ku70-deletion zu beseitigen, wurde die für weitere Untersuchungen ausgewählte, homokaryotische Transformante Δku70Δsac1 T4 mit dem Stamm fus1-1 gekreuzt. Das Hygromycin B-resistente, aber Nourseothricin-sensitive Einzelsporisolat K23 mit schwarzer Sporenfarbe wurde für die weitergehenden Versuche genutzt und wird nachfolgend als Δsac1 bezeichnet (Tab. 1). Für die weitere genotypische Charakterisierung des Δsac1-Stammes wurden Southern- Analysen mit einer sac1- und einer hph-spezifischen Sonde durchgeführt. Wie der Abbildung 17A zu entnehmen ist, konnten in der genomischen DNA der sac1- Deletionsmutante keine sac1-spezifischen Fragmente nachgewiesen werden, was die Deletion verifiziert. Für den Wildtyp wurde ein spezifisches Signal in der erwarteten Größe von ca. 3 kb detektiert, wodurch bestätigt wird, dass sac1 das einzige Gen für eine Adenylatcyclase in S. macrospora ist. Die Hybridisierung mit einer hphspezifischen Sonde ergab für Δsac1 ein einziges distinktes Signal in der bei einem homologen Rekombinationsereignis erwarteten Größe von ca. 4 kb, was darauf schließen lässt, dass die sac1-deletionkassette in nur einer Kopienzahl homolog in das Genom der Transformante integriert worden ist (Abb. 17B). 51

59 IV. Ergebnisse Abb. 17: Autoradiogramme von Southern-Analysen mit genomischer DNA des Wildtyps und des Δsac1-Stammes unter Verwendung einer sac1- und hph-spezifischen Sonde. 40 µg genomischer DNA des Wildtyps (wt) bzw. der sac1-mutante wurden mit 20 U NruI hydrolysiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Membran transferiert. (A) Autoradiogramm nach Hybridisierung der Membran mit einer sac1-spezifischen Sonde und (B) nach Hybridisierung der Membran mit einer hph-spezifischen Sonde. Durch Transformation des sac1-spezifischen Deletionskonstruktes in den Reziepientenstamm ku70 konnten acht Hygromycin B-resistente Transformanten erzeugt werden. Eine PCR-Analyse von sechs dieser Transformanten belegte, dass in allen das native sac1-gen durch die hph-kassette ersetzt wurde. Durch Kreuzung der homokaryotischen Transformante T4 mit dem Stamm fus1-1 wurde das Einzelsporisolat K23 mit dem Genotyp sac1 erzeugt. Die Überprüfung dieses Einzelsporisolates durch Southern-Analyse mit einer sac1-spezifischen Sonde bestätigte die Deletion des sac1-gens in dieser Mutante. Weitere ektopische Integrationen der Deletionskassette konnten mittels Southern-Analyse ausgeschlossen werden. 2.4 Phänotypische Charakterisierung des Δsac1-Stammes Ein auffälliges Merkmal bei der makroskopischen Betrachtung der sac1-mutante sind die Perithezien. Die vom sac1-stamm gebildeten Perithezien sind ca. 30 % kleiner als die des Wildtyps, wie aus der Abbildung 18 A hervorgeht. Normalerweise werden die Perithezien von S. macrospora an der Grenzschicht zwischen Luft und Festmedium angelegt. 52

60 IV. Ergebnisse Abb. 18: Phänotyp von sac1 im Vergleich zum Wildtyp. (A) Aufsicht auf die Perithezien des Wildtyps (wt) und der sac1-mutante nach neun Tagen Anzucht auf BMM-Festmedium. Ein roter Pfeil deutet auf ein Perithezium, welches innerhalb des Festmediums gebildet wurde. Die eingezeichneten Maßstabsbalken entsprechen 1 mm. (B) Mikroskopische Seitenansicht von Perithezien des Wildtyps (wt) und der sac1-mutante, gezeigt ist der Übergang zwischen Festmedium und Luft. Die Kultivierung der Stämme erfolgte für neun Tage auf BMM- Festmedium. Die Maßstabsbalken entsprechen 200 µm. (C) Mikroskopische Analyse der Sporenkeimung beim Wildtyp (wt) und bei sac1. Die Inkubationszeit der Sporen auf dem Keimungsmedium BMM-NaOAc betrug 5 h. Die eingezeichneten Maßstabsbalken entsprechen 50 µm. Eine Vielzahl der Perithezien der sac1-mutante differenziert sich hingegen eingeschlossen im Medium. Dieses wird vor allem in der mikroskopischen Seitenansicht auf Perithezien der sac1-mutante deutlich, wie exemplarisch in Abbildung 18 B dargestellt ist. Die sac1-deletion verursacht zudem eine Verminderung der Keimungsrate der Ascosporen. Die mikroskopische Untersuchung von auf Keimungsmedium verbrachten sac1-ascosporen ergab, dass nur ca. 30 % dieser Sporen auskeimen, während für den Wildtyp Werte von 80 bis 100 % ermittelt werden konnten. In der Abbildung 18 C sind exemplarisch isolierte Ascosporen des Wildtyps und der sac1-mutante zu sehen, die sich im Keimungsstadium befinden. Obwohl die 53

61 IV. Ergebnisse Inkubationszeit auf dem Keimungsmedium für die Sporen des Wildtyps und des sac1- Stammes gleich lang war, sind bei den Sporen der Mutante nur wenige Keimungsschläuche zu erkennen, während beim Wildtyp etwa die Hälfte der Sporen bereits auskeimt (Abb. 18C). Die Deletion des Adenylatcyclase-kodierenden sac1-gens in S. macrospora verursacht einen pleiotropen Phänotyp. Die Perithezien der sac1-mutante sind kleiner als die des Wildtyps und werden überwiegend im Festmedium ausgebildet. Des Weiteren ist die Keimungsrate der Ascosporen im Vergleich mit dem Wildtyp deutlich reduziert. 2.5 Restaurierung des sac1-phänotyps durch genetische und chemische Komplementation Um den beobachteten Phänotyp der Deletionsmutante in einen kausalen Zusammenhang mit der Deletion des sac1-gens zu bringen, wurden zwei verschiedene Komplementationsverfahren genutzt. Zum Einen sollte durch Einbringen einer funktionellen Kopie des Adenylatcyclase-Gens in die Deletionsmutante sac1 eine Restaurierung des Phänotyps erfolgen, zum Anderen sollte eine chemische Komplementation der sac1-mutante mittels camp den Wildtyp-Phänotyp wieder herstellen. Da für die genetische Komplementation kein Cosmid-Klon mit einem vollständigen Adenylatcyclase-Gen aus S. macrospora zur Verfügung stand und eine Amplifikation der komplette sac1-sequenz aufgrund der Größe von über 8 kb wenige Erfolgsaussichten bot, wurde ein Cosmid mit der Gensequenz der Adenylatcyclase (cr-1) aus N. crassa verwendet (Cosmid H122 F6, Tab. 2). Das Cosmid wurde mittels Kotransformation mit dem Vektor pd-nat1 (Tab. 2, Kück und Hoff 2006) in die sac1-deletionsmutante eingebracht. Bei vier von 16 Nourseothricin-resistenten Transformanten konnte mittels PCR mit den cr-1-spezifischen Oligonukleotiden cr-1for und cr-1rev die Integration des Cosmids in ihr Genom festgestellt werden (Tab. 3, Daten nicht gezeigt). Eine zufällig ausgewählte Retransformante wurde nachfolgend mit dem fus1-1-stamm gekreuzt und für ein daraus hervorgegangenes Nourseothricinsensitives Einzelsporisolat, sac1::cr-1 K18, konnte mittels PCR eine Kopie des cr-1-54

62 IV. Ergebnisse Gens weiterhin nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser PCR sind in Abbildung 19 dargestellt. Abb. 19: Agarosegel einer PCR-Analyse des Einzelsporisolats sac1::cr-1 K18. Aufgetragen sind PCR-Ansätze, die ohne Matrize (-), mit Wildtyp-DNA (wt) und mit DNA des Einzelsporisolats einer Retransformante durchgeführt wurden ( sac1::cr- 1 K18). Als Primer dienten die Oligonukleotide cr-1for und cr- 1rev. Aufgetragen wurden je 5 µl eines 50 µl-pcr-ansatzes. Die als Primer für die PCR eingesetzten Oligonukleotide cr-1for und cr-1rev sind zum cr- 1-Gen aus N. crassa spezifisch, nicht aber zum sac1-gen von S. macrospora, weshalb mit der Wildtyp-DNA aus S. macrospora als Matrize kein Amplifikat nachgewiesen werden kann (Abb. 19). Mit der DNA des Einzelsporisolats sac1::cr-1 K18 wurde hingegen ein ca. 0,9 kb großes cr-1-spezifisches Fragment amplifiziert. Eine Southern- Analyse mit einer cr-1-spezifischen Sonde ergab, dass die cr-1-sequenz einmal in das Genom der Retransformante integriert wurde (siehe Anhang, Abb. A4). Parallel zu diesem Komplementationsversuch auf genetischer Ebene wurde eine chemische Restaurierung des sac1-phänotyps versucht. Die Adenylatcyclase ist für einen Großteil der camp-synthese innerhalb einer Zelle verantwortlich (Jurick und Rollins 2007) und es konnte in Arbeiten mit pilzlichen Adenylatcyclase-Mutanten gezeigt werden, dass die Zugabe von camp zum Nährmedium in vielen Fällen die meisten phänotypischen Defekte ausgleicht (Choi und Dean 1997, Rocha et al. 2001, Alspaugh et al. 2002, Doehlemann et al. 2006, Jurick und Rollins 2007). Für den in dieser Arbeit unternommenen Versuch einer chemischen Komplementation des sac1-stammes wurden zwei verschiedene camp-analoga benutzt. Diese zeichnen sich durch ihre im Vergleich mit camp erhöhte Lipophilität aus und sind dadurch membrangängiger als das eigentliche camp. Zum einen wurde CPT-cAMP benutzt, welches bereits erfolgreich bei Arbeiten mit dem Ascomyceten Botrytis cinerea eingesetzt wurde (Braumann und Jastorff 1985, Doehlemann et al. 2006). Zum anderen wurde DB-cAMP verwendet, welches auch für Komplementationsversuche von N. crassa benutzt wurde (Terenzi et al. 1974, Terenzi et al. 1976, Rosenberg und Pall 1979, Kore-eda et al. 1991). Beide camp-analoga wurden in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt, um die phänotypischen Defekte der sac1-mutante zu 55

63 IV. Ergebnisse restaurieren. So wurde beispielsweise untersucht, welches camp-derivat bei welcher Konzentration die Perithezienbildung an der Luft-Oberflächen-Grenze wieder herstellt. Dazu wurde das Nährmedium entsprechend den Literaturangaben mit 1-10 mm des jeweiligen camp-analogons versetzt. Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen des CPT-cAMP waren hierbei erfolglos. Jedoch konnte durch Zugabe von 3,4 mm DBcAMP für eine sac1/fus-mutante die Wiederherstellung eines Wildtyp-ähnlichen Phänotyps beobachtet werden. Die für die Versuche eingesetzte sac1/fus-mutante weist zusätzlich zur sac1-deletion die fus1-1 Farbspormutation auf und entspricht ansonsten dem Phänotyp des sac1-stammes. In der sac1/fus-mutante ist die Melaninbildung gestört, was anhand des hellbraun gefärbten Myzels, der braunen Perithezien und der hellbraunen Ascosporen gut beobachtet werden kann. Der Hintergrund der Entscheidung zur Verwendung dieser Mutante war, dass melanisierte Zellwände eine deutlich geringere Durchlässigkeit besitzen (Howard et al. 1991) und somit eine Aufnahme der extern zugeführten camp-derivate zumindest eingeschränkt sein kann. Ein Vergleich der camp-supplementierten sac1/fus-mutante und der genetischen Retransformante sac1::cr-1 mit dem Wildtyp und der Deletionsmutante sac1 ist in Abbildung 20 dargestellt. Abb. 20: Phänotypen der chemisch komplementierten sac1/fus-mutante ( sac1/fus +camp) und der Retransformante sac1::cr-1 im Vergleich mit dem Wildtyp (wt) und der Deletionsmutante sac1. Mikroskopische Seitenansicht von Perithezien der genannten Stämme, gezeigt ist der Übergang zwischen Festmedium und Luft. Die Kultivierung der Stämme erfolgte für neun Tage auf BMM-Festmedium. Die Maßstabsbalken entsprechen 200 µm. 56

64 IV. Ergebnisse Die chemisch komplementierte sac1/fus-mutante entspricht bezogen auf die Größe der Perithezien dem Wildtyp-Stamm. Auch die durch Transformation mit dem Adenylatcyclase-Gen cr-1 aus N. crassa erzeugte Retransformante sac1::cr-1 gleicht dem Wildtyp und lässt sich deutlich bezüglich der Größe der Perithezien von der sac1- Mutante unterscheiden (Abb. 20). Zudem werden die Perithezien der komplementierten Stämme wieder an der Oberfläche des Festmediums ausgebildet, auch wenn die Basis der Perithezien der sac1::cr-1-retransformante weiterhin im Festmedium ausgebildet wird (Abb. 20). Durch genetische wie auch chemische Komplementation konnte somit der Perithezienphänotyp der sac1-mutante restauriert werden. Neben dem augenscheinlichen Defekt in der Perithezienentwicklung konnte ebenfalls ein reduziertes vegetatives Wachstum der sac1-mutante beobachtet werden. Um dieses zu quantifizieren und um den kausalen Zusammenhang zwischen dem eingeschränkten Wachstum und dem vermuteten camp-mangel in der sac1-mutante herzustellen, wurden Rennrohrtests mit einem fus1-1-stamm, der sac1/fus-mutante und einer camp-supplementierten sac1/fus-mutante unternommen. Die Ergebnisse des Rennrohrtests können dem Diagramm der Abbildung 21 entnommen werden. Während der Stamm fus1-1 ca. 13,5 cm in sieben Tagen wächst, konnte für die sac1/fus-mutante nur ein Wachstum von etwa 8 cm festgestellt werden. Das Myzel der camp-supplementierten sac1/fus-mutante bewächst im gleichen Zeitraum eine Strecke von etwa 10 cm. Damit erreicht die unsupplementierte Mutante nur etwa 59 % des Wachstums von fus1-1, während durch camp das Myzelwachstum auf ca. 74 % des fus1-1-niveaus gesteigert werden kann (Abb. 21). Die Zugabe von camp bewirkt somit bei der sac1-mutante eine Teilrestauration des vegetativen Wachstums. Es wurde ebenfalls versucht, den durch die sac1-mutation verursachten Defekt der Sporenkeimung mittels Zugabe der camp-derivate zu restaurieren. Dazu wurden Sporen des sac1/fus-stammes in flüssiges oder festes Keimungsmedium überführt, welches unterschiedliche Konzentrationen von DB- oder CPT-cAMP aufwies. Des Weiteren wurden Sporen aus camp-supplementierten sac1/fus-anzuchten isoliert und auf Keimungsmedium überführt. Jedoch konnte in keinem Fall eine Erhöhung der Sporenkeimungsrate beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). 57

65 IV. Ergebnisse Abb. 21: Bestimmung des vegetativen Wachstums von fus1-1, der Δsac1/fus-Mutante und der chemisch komplementierten sac1/fus-stammes ( sac1/fus+camp). Die Bestimmung der Wuchsstrecke erfolgte in jeweils zwei Dreifachbestimmungen pro Stamm. Pro Tag wurde zu einer definierten Zeit eine Messung vorgenommen. Auf der x-achse sind die Messpunkte in Tagen (d) eingezeichnet, auf der y-achse ist die ermittelte Wuchsstrecke in cm abzulesen. Für jeden Messwert ist die Standardabweichung über vertikale, blind endende Linien angegeben. Die Zuordnung der analysierten Stämme zu den Graphen ist der Legende zu entnehmen. Für die Supplementation des sac1/fus-stammes wurden 3,4 mm DB-cAMP eingesetzt. Die mit dem cr-1-gen aus N. crassa retransformierte sac1-mutante hingegen wies eine Sporenkeimungsrate entsprechend der des Wildtyps auf (Daten nicht gezeigt), wodurch gezeigt wurde, dass die Deletion des sac1-gens ursächlich für den beobachteten Sporenkeimungsdefekt war. Mittels genetischer Komplemetation durch Transformation des Adenylatcyclase- Gens cr-1 aus N. crassa und chemischer Komplementation durch Zugaben von camp konnten die bei der sac1-mutante beobachteten phänotypischen Defekte teilweise behoben werden. 58

66 IV. Ergebnisse 2.6 Analyse der genetischen Interaktion von sac1 mit Genen für drei α-untereinheiten heterotrimerer G-Proteine aus S. macrospora Im Rahmen einer vorangegangenen Dissertation am Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik wurden bereits die Gene für drei α-untereinheiten heterotrimerer G-Proteine aus S. macrospora analysiert (Jansson 2007). Gα-Untereinheiten sind bekannterweise Interaktionspartner von Adenylatcyclasen und sind zusammen mit dieser an vielen Signalkaskaden beteiligt (siehe Kap. I.2, Ivey und Hoffman 2005, McCudden et al. 2005). Um das Zusammenspiel der Adenylatcyclase SAC1 mit den Gα-Untereinheiten während der sexuellen Entwicklung von S. macrospora zu analysieren, sollte im Rahmen dieser Arbeit die genetische Interaktion der Gene der Gα- Untereinheiten mit dem sac1-gen der Adenylatcyclase untersucht werden. In der vorangegangenen Arbeit von Jansson (2007) wurden die mit gsa1, gsa2 und gsa3 bezeichneten Gene deletiert und die Phänotypen der Mutanten charakterisiert. Die drei Deletionsmutanten gsa1, gsa2 und gsa3 wiesen ein um 37 %, 29 % und 22 % reduziertes vegetatives Wachstum im Vergleich zum Wildtyp auf. Hinsichtlich der sexuellen Entwicklung der Mutanten konnten verschiedene Phänotypen beobachtet werden. Während die gsa2-mutante eine dem Wildtyp entsprechende sexuelle Differenzierung zeigte, entwickelten sich die Fruchtkörper der gsa1-mutante langsamer und in einer geringeren Anzahl. Die Deletion des gsa3-gens verursachte hingegen eine Keimungsdefizienz der Ascosporen, während die Fruchtkörper denen des Wildtyps glichen (Jansson 2007). Mit Hilfe entsprechender Doppelmutanten wurde eine Analyse der genetischen Interaktionen der gsa-gene untereinander sowie jeweils mit den Pheromonrezeptorgenen pre1 und pre2 vorgenommen (Pöggeler 2000, Mayrhofer et al. 2006). Dabei konnten alle Doppelmutanten bis auf die Doppelmutante gsa3 pre1 erzeugt werden. Aus diesen Analysen ergab sich das in Abbildung 22 dargestellte Arbeitsmodell, in dem hauptsächlich die GSA1- und, in geringerem Maße, die GSA2- Untereinheit an der Signalweiterleitung unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 an der Fruchtkörperbildung beteiligt ist (Jansson 2007). Die GSA3-Untereinheit interagiert hingegen mit einem unbekannten G-Protein-gekoppelten Rezeptor und ist in die Regulation der Ascosporen-Keimung involviert. Aufgrund der Tatsache, dass die Mutanten gsa3 und sac1 ähnliche Einschränkungen in der Sporenkeimung aufweisen, liegt die Vermutung nahe, dass sac1 epistatisch zu gsa3 ist (Abb. 22), was in 59

67 IV. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verifiziert werden sollte. Zudem wurde untersucht, ob SAC1 auch an der Signaltransduktionskaskade unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 beteiligt ist. Abb. 22: Putative Signalweiterleitung unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 und eines unidentifizierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Die Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 sind dunkelgrau als integrale Proteine mit sieben Transmembrandomänen in der Plasmamembran dargestellt. Die extrazellulären Bereiche von PRE1 und PRE2 binden schematisch die rot eingezeichneten Pheromone PPG1 und PPG2. Eine putative Farnesylierung von PPG2 ist durch einen schwarzen, gezackten Appendix gekennzeichnet. Ein bisher unidentifizierter Rezeptor ist mit einem? beschriftet. Blau dargestellt sind die drei Gα-Untereinheiten GSA1-3, von denen GSA1 und GSA3 vermutlich eine Myristoylierung aufweisen, was durch Appendizes angedeutet ist. Die Adenylatcyclase SAC1 ist gelb unterlegt, wobei ein? die hypothetische Einordnung dieser unterhalb der GSA3-Untereinheit verdeutlicht. Abbildung verändert nach Jansson (2007). Um die genetische Interaktionen zwischen sac1 und den gsa-genen analysieren zu können, wurden durch Kreuzungen zunächst die drei Doppelmutanten erzeugt. Eine Auswertung rekombinanter Asci (siehe Kap. II.2.10) führte zur Vorauswahl putativer Doppelmutanten-Einzelsporisolate. Der Genotyp dieser Einzelsporisolate wurde für jeweils beide Gendeletionen analog zur Charakterisierung der Einzelmutanten durch die PCR-Amplifikation genspezifischer, rekombinanter 5 - oder 3 -flankierender Bereiche 60

68 IV. Ergebnisse überprüft (Daten nicht gezeigt). Alle drei Doppelmutanten gsa1 sac1, gsa2 sac1 und gsa3 sac1 konnten in dieser Arbeit hergestellt werden. Zusätzlich wurde durch Kreuzung die Dreifachmutante gsa2 gsa3 sac1 erstellt und durch PCR-Analyse verifiziert. Die vier Mehrfachmutanten wurden im Folgenden hinsichtlich ihrer sexuellen Entwicklung untersucht, um weitere Rückschlüsse auf die Beteiligung der Adenylatcyclase SAC1 an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora ziehen zu können. Die Phänotypen der vier Mutanten sind im Vergleich mit dem Wildtyp und der sac1-mutante in der Abbildung 23 in Aufsicht dargestellt. Abb. 23: Phänotypische Analyse von drei gsa sac1-doppelmutanten und einer gsa2 gsa3 sac1-dreifachmutante im Vergleich mit dem Wildtyp (wt) und der sac1mutante (A) Aufsicht auf Petrischalenkulturen der Mutanten nach Anzucht für 11 Tage auf BMM-Festmedium. Die Maßstabsbalken entsprechen 1 mm. Ein roter Pfeil markiert ein Perithezium der Retransformante gsa sac1::gsa1 (B) Mikroskopische Untersuchung der Protoperithezien-Bildung der Doppelmutante gsa1 sac1 auf BMM-Festmedium. Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm. 61

69 IV. Ergebnisse Die Doppelmutante gsa1 sac1 weist einen sterilen Phänotyp auf (Abb. 23A). Es kommt zwar zur Ausbildung von Protoperithezien, wie in der Abbildung 23 B zu sehen ist, jedoch erfolgt keine weitere Differenzierung zu reifen Perithezien. Um auszuschließen, dass eine Spontanmutation für die Sterilität der gsa1 sac1-mutante verantwortlich war, erfolgte die Komplementation dieser mit einer Wildtyp-Kopie des gsa1-gens durch Transformation mit dem Vektor pd202 (Tab. 2, Jansson 2007). Dabei konnte wieder die Bildung einiger kleiner Fruchtkörper beobachtet werden, welche Sporen enthielten (Abb. 23A, roter Pfeil). Die gsa2 sac1-mutante ist hingegen fertil, ihre Perithezien gleichen in der Größe denen der sac1-mutante und sind ebenso wie diese überwiegend im Medium eingebettet (Abb. 23A). Auch die Fruchtkörper der Doppelmutante gsa3 sac1 entsprechen denen der sac1-mutante (Abb. 23A). Zusätzlich ist bei der gsa3 sac1-doppelmutante eine deutlich verminderte Keimungsrate der Ascosporen, ähnlich wie sie von Jansson (2007) für gsa3 beschrieben wurde, zu beobachten (Daten nicht gezeigt). Um die Interaktion beider Signalwege unterhalb der PRE-Rezeptoren sowie unterhalb des bisher unbekannten Rezeptors besser zu verstehen, wurde zusätzlich die Dreifachmutante gsa2 gsa3 sac1 erzeugt. Diese bildet nur noch vereinzelt Perithezien, wie der Abbildung 23 A zu entnehmen ist. Durch Kreuzungen dreier gsa-einzelmutanten mit dem in dieser Arbeit erstellten sac1-stamm konnten die Doppelmutanten gsa1 sac1, gsa2 sac1 und gsa3 sac1 erzeugt und phänotypisch charakterisiert werden. Zusätzlich wurde durch Kreuzung die Dreifachmutante gsa2 gsa3 sac1 generiert und beschrieben. 2.7 Analyse der genetischen Interaktionen von gsa1, gsa2 und gsa3 mit ste12 bzw. pro41 Um weitere mögliche Komponenten der Pheromonsignalkaskade und des GSA3-SAC1- Signalwegs zu identifizieren, wurden zusätzlich fünf Doppelmutanten durch Kreuzung von gsa1, gsa2 und gsa3 mit ste12 bzw. pro41 erzeugt (Tab. 1). Der ste12- Stamm von S. macrospora, in dem das kodierende Gen für den putativen Transkriptionsfaktor STE12 deletiert wurde, zeigt ein nur leicht eingeschränktes 62

70 IV. Ergebnisse vegetatives Wachstum von ca. 90 % im Vergleich mit dem Wildtyp und entwickelt eine im Vergleich mit diesem ähnliche Anzahl von Perithezien (Tab. 1, Nolting und Pöggeler 2006). Jedoch werden im Inneren der ste12-fruchtkörper ca. 75 % weniger Asci gebildet als beim Wildtyp. Die Zellwände der Asci und Ascosporen sind zudem fragil, und nur wenige Sporen keimen aus (Nolting und Pöggeler 2006). Die pro41- Mutante weist eine Deletion im Genom von S. macrospora auf, an deren Stelle sich normalerweise der pro41-locus befindet. Das pro41-gen kodiert für PRO41, welches ein Membranprotein des Endoplasmatischen Retikulums darstellt (Nowrousian et al. 2007). Der Verlust von PRO41 verhindert auf bisher unbekannte Weise eine Weiterdifferenzierung der Protoperithezien zu Perithezien. Durch Auswertung rekombinanter Asci (siehe Kap. III.2.10) wurden putative Doppelmutanten- Einzelsporisolate ausgewählt. Der Genotyp dieser Einzelsporisolate wurde im Falle der gsa ste12-mutanten für jeweils beide Gendeletionen durch die PCR-Amplifikation genspezifischer, rekombinanter 5 - oder 3 -flankierender Bereiche verifiziert (Daten nicht gezeigt). Da die durch klassische Mutagenese erzeugte pro41-mutation nicht mittels PCR nachweisbar ist, wurden putative pro41 gsa-doppelmutanten mit dem Wildtyp gekreuzt, um anhand der Aufspaltung der Sporenisolate aus rekombinaten Asci auf Doppelmutanten zu schließen. In dieser Arbeit konnten die Stämme gsa1 ste12 und gsa2 ste12 erzeugt werden. Wie der Abbildung 24 A zu entnehmen ist, bilden sie reife Fruchtkörper aus. Die Anzahl der Fruchtkörper ist jedoch bei der gsa1 ste12-mutante gegenüber dem Wildtyp und ste12 deutlich reduziert und entspricht damit dem Phänotyp der gsa1- Einzelmutante, während die gsa2 ste12-mutante eine dem Wildtyp ähnliche Anzahl Fruchtkörper entwickelt und somit sowohl dem gsa2 als auch dem ste12-phänotyp entspricht (Abb. 24A). Zudem weisen beide Doppelmutanten die für ste12 beschriebenen Defekte in der Ascosporogenese auf (Abb. 24B, rote Pfeile, Nolting und Pöggeler 2006), wobei die Genese der Ascosporen der gsa1 ste12-mutante im Vergleich zu ste12 und gsa2 ste12 noch schwerer eingeschränkt ist; es werden nur noch wenige vollständige Asci mit acht Sporen ausgebildet (Abb. 24B). 63

71 IV. Ergebnisse Abb. 24: Phänotypische Analyse der Doppelmutanten gsa1 ste12 und gsa2 ste12 im Vergleich mit ste12. (A) Aufsicht auf Petrischalenkulturen der Mutanten nach Anzucht für 11 Tage auf BMM-Festmedium. Die Maßstabsbalken entsprechen 1 mm. Ein roter Pfeil markiert ein Perithezium der gsa1 ste12-mutante. (B) Mikroskopische Untersuchung von Asci- Rosetten aus geöffneten Perithezien von ste12, gsa1 ste12 bzw. gsa2 ste12. Rote Pfeile markieren abberante Ascosporen. Der Maßstabsbalken entspricht 100 µm. Die ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit erzeugten Doppelmutanten pro41 gsa1, pro41 gsa2 und pro41 gsa3 bilden keine Fruchtkörper aus und gleichen der pro41- Mutante (Daten nicht gezeigt). Bei einer zusätzlichen Analyse zur Aufklärung der genetischen Interaktionen innerhalb der an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora beteiligten Signalwege wurden fünf weitere Doppelmutanten mit Deletionen der gsa-gene in Kombination mit einer ste12 bzw. pro41-mutation erzeugt, verifiziert und phänotypisch charakterisiert. 64

72 V. Diskussion V. Diskussion Für die Analyse der Funktion von Genprodukten gibt es zwei konzeptionell entgegengesetzte Vorgehensweisen. In vorwärts gerichteten genetischen Untersuchungen werden mittels klassischer Mutagenese durch ionisierende Strahlung oder chemische Mutagene Mutanten erzeugt und aufgrund von definierten molekularen, physiologischen oder phänotypischen Merkmalen selektioniert. Im Idealfall können in einem einzigen Mutageneseansatz viele Gene isoliert werden, welche für die Ausprägung des untersuchten Merkmals verantwortlich sind. Die an der sexuellen Entwicklung der Hefe S. cerevisiae beteiligte MAP-Kinase-Kaskade konnte beispielsweise primär durch die Analyse von Mutanten aufgeklärt werden, welche einen sterilen Phänotyp aufweisen (Zhou et al. 1993, Choi et al. 1994, Wang und Dohlman 2004, Chen und Thorner 2007). Ähnliche Analysen wurden bereits für S. macrospora durchgeführt und führten zur Identifikation einiger an der Fruchtkörperentwicklung beteiligter Komponenten (Masloff et al. 1999, Nowrousian et al. 1999, Pöggeler und Kück 2004, Kück 2005, Engh et al. 2007, Nowrousian et al. 2007, Rech 2007). Bei revers genetisch angelegten Versuchen wird hingegen gezielt ein Gen von Interesse ausgeschaltet, um dann den daraus resultierenden Phänotyp zu untersuchen. Diese Methode hat gegenüber der vorwärts gerichteten Analyse den Vorteil, dass kein unbekanntes Gen charakterisiert werden muss. Auf diese Weise konnten für S. macrospora bereits einige Deletionsmutanten erzeugt werden, bei denen gezielt Komponenten ausgeschaltet wurden, deren Homologe an der sexuellen Entwicklung von S. cerevisiae oder N. crassa beteiligt sind (Mayrhofer und Pöggeler 2005, Mayrhofer et al. 2006, Nolting und Pöggeler 2006b, Nolting und Pöggeler 2006a, Pöggeler et al. 2006b, Jansson 2007). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde durch die Erzeugung von Deletionsmutanten untersucht, welchen Einfluss die kodierenden Gene der Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 und der Adenylatcyclase SAC1 auf die sexuelle Entwicklung von S. macrospora haben. Die Nukleosiddiphosphat-Kinase ist ein hoch konserviertes Enzym, dessen regulatorische Eigenschaften erst innerhalb der letzten Jahre immer mehr in den Fokus des Interesses gerückt sind. Dabei ist bis heute die genaue Funktionsweise, gerade im Bereich der Zelldifferenzierung, noch weitgehend unverstanden (siehe Kap. II). Nukleosiddiphosphat-Kinasen können an Serinen autophosphorylieren und besitzen 65

73 V. Diskussion eine Kinaseaktivität (Lu et al. 1996, Ogura et al. 1999, Hasunuma et al. 2003). Das Enzym kann zudem beispielsweise DNA binden, DNA hydrolysieren und transkriptionsaktivierend wirken (Postel et al. 2000, Postel 2003). Außerdem ist es in der Lage, mit kleinen oder heterotrimeren G-Proteinen zu interagieren (Kimura et al. 2003). Ein seit langem bekannter Interaktionspartner von heterotrimeren G-Proteinen ist hingegen die camp-produzierende Adenylatcyclase. Sie besitzt eine zentrale Rolle bei der Fortpflanzung, Entwicklung und Pathogenität von Pilzen (Bölker 1998, Lengeler et al. 2000, D'Souza und Heitman 2001). Trotz der bekannten Funktion der Adenylatcyclase weisen die pilzlichen Signalwege, in denen sie involviert ist, oft eine strukturelle und funktionelle Heterogenität auf (Übersicht bei Lengeler et al. 2000, D'Souza und Heitman 2001). Die Analyse von Δndk1- und Δsac1-Mutanten sollte zur Aufklärung der Funktion der Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 und der Adenylatcyclase SAC1 innerhalb der Signalkaskaden beitragen, welche an der komplexen Morphogenese der Fruchtkörper von S. macrospora beteiligt sind. 1. Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora 1.1 Nukleosiddiphosphat-Kinasen sind hochkonservierte Enzyme, welche eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Nukleotidpools übernehmen Die ursprünglich für Nukleosiddiphosphat-Kinasen beschriebene Funktion liegt in der Synthese von (d)ntps aus (d)ndps unter Verbrauch von ATP (Berg und Joklik 1953, Krebs und Hems 1953). Bei der zugrunde liegenden Reaktion wird die Nukleosiddiphosphat-Kinase durch das γ-phosphat des ATPs an einem konservierten Histidin phosphoryliert. Das Phosphat wird anschließend auf ein Nukleosiddiphosphat übertragen, wodurch das entsprechende Nukleosidtriphosphat entsteht (Parks und Agarwal 1973, Lecroisey et al. 1995, Morera et al. 1995). Auch in der Aminosäuresequenz der Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora ist das für die Enzyme typische Motiv NXXH[G/A]SD mit dem zentralen Histidin zu finden (Abb. 5). Da das aus ADP erzeugte ATP eine Kernkomponente des Energiehaushalts 66

74 V. Diskussion darstellt und (d)ntps an der Synthese von Nukleinsäuren, aber auch an anderen Reaktionen innerhalb der Zelle beteiligt sind, wird seit langem von einer Haushaltsfunktion der Nukleosiddiphosphat-Kinasen ausgegangen. Dafür spricht auch, dass homologe Proteine ubiquitär sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten zu finden sind. Die Primärsequenz der orthologen Proteine aus Eubakterien, Archaeen und Eukaryoten ist dabei hochkonserviert, wie für einige Organismen anhand des Alignments in der Abbildung 5 zu erkennen ist. Die Proteinsequenz der NDK1 aus S. macrospora besitzt eine Aminosäure-Identität von 38 bis 98 % mit den Nukleosiddiphosphat-Kinasen der anderen Organismen (Abb. 5). Die Sequenzidentität von 98 % des kodierenden Gens der Nukleosiddiphosphat-Kinase aus S. macrospora mit dem Ortholog des nahen Verwandten N. crassa ist größer als die im Durchschnitt für kodierende Sequenzen beider Pilze beobachtete Identität von 89,5 % (Nowrousian et al. 2004). Dieses kann als ein weiterer Hinweis auf eine hohe Konservierung der Primärstruktur der Nukleosiddiphosphat-Kinasen angesehen werden. Eine weitere für die Beschreibung von Nukleosiddiphosphat-Kinasen wichtige evolutive Entwicklung ist in der Entstehung paraloger Sequenzen durch Genduplikation zu sehen. So ist mit einem zunehmenden Differenzierungsgrad der Organismen eine wachsende Anzahl von Isoformen der Nukleosiddiphosphat-Kinasen festzustellen. Jedoch besitzen in der Regel nicht alle nachgewiesenen Isoformen die charakteristische Aktivität einer Nukleosiddiphosphat-Kinase. So konnten für den Menschen bisher acht Isoformen identifiziert werden (Lacombe et al. 2000), von denen zwei Isoformen, Nm23-H1 und Nm23-H2, für den Großteil der Aktivität verantwortlich sind (Ishikawa et al. 2003). Im Gegensatz zu den einzelligen Ascomyceten S. cerevisiae und S. pombe, welche nur eine Nukleosiddiphosphat-Kinase besitzen, weist der zelluläre Schleimpilz D. discoideum zwei Isoformen auf, von denen eine in Mitochondrien lokalisiert ist (Tab. 4, Troll et al. 1993). Bei diesem Pseudoplasmodien-bildenden Einzeller kann also die bereits erwähnte Tendenz zum Erwerb paraloger Genkopien beobachtet werden (Ishikawa et al. 2003). Erstaunlicherweise besitzen die bisher untersuchten evolutiv weiterentwickelten filamentösen Ascomyceten A. nidulans und N. crassa nur eine Kopie eines Nukleosiddiphosphat-Kinase-Gens (Ogura et al. 1999, Lin et al. 2003). Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch für S. macrospora durch Southern-Analyse nur ein Gen nachgewiesen werden (Abb. 8 A). Die Tabelle 4 stellt eine Übersicht über einige Organismen dar, für die Nukleosiddiphosphat-Kinasen beschrieben worden sind. 67

75 V. Diskussion Tabelle 4: Übersicht über beschriebene Nukleosiddiphosphat-Kinasen aus Bakterien, Archaeen und Eukaryoten. Neben der Anzahl der festgestellten Isoformen und deren Lokalisation innerhalb der Zelle sind, sofern Daten vorhanden, die relevanten Phänotypen von Mutanten angegeben. Die Lokalisationen der Nukleosiddiphosphat-Kinasen werden mit cyt. für cytosolisch, mit. für mitochondrial und plast. für plastidär abgekürzt. Entsprechende Referenzen sind ebenfalls aufgeführt. Organismus Bacillus anthracis (Bacteria) Escherichia coli (Bacteria) Mycoplasmaceae (Bacteria) Myxococcus xanthus (Bacteria) Methanococcus jannaschii (Archaea) Dictyostelium discoideum (Fungi, Acrasiomycet) Saccharomyces cerevisiae (Fungi, einzelliger Ascomycet) Schizosaccharomyces pombe (Fungi, einzelliger Ascomycet) Aspergillus nidulans (Fungi, filamentöser Ascomycet) Neurospora crassa (Fungi, filamentöser Ascomycet) Arabidopsis thaliana (Viridiplantae) Avena sativa (Viridiplantae) Oryza sativa (Viridiplantae) Pisum sativum (Viridiplantae) Spinacia oleracea (Viridiplantae) Caenorhabditis elegans (Metazoa) NDK- Isoformen Mutanten-Phänotyp Referenz 1 x cyt. mutationsfördernd Zeibell et al. (2007) 1 x cyt. mutationsfördernd 0-1 x cyt. letal Miller et al. (2002), Lu et al. (1995), Hama et al. (1991) Wang (2007), Fraser et al. (1995), Himmelreich et al. (1996) Munoz-Dorado et al. (1990) 1 x cyt. - Min et al. (2000) 1 x cyt. 1 x mit. 1 x (cyt. und mit.) 1 x cyt. 1 x cyt. 1 x cyt. 3 x cyt., 1 x mit. - Wildtyp 1) Deletions-Mutante: Wildtyp 2) Dominant-rezessive Punktmutante: eingeschränkte sexuelle Entwicklung 1) Punkt-Mutante: temperaturabhängig letal 2) Deletions-Mutante: letal 1) Punkt-Mutante: gestörte Anlage der Fruchtkörperhälse 2) RIP-Mutanten: keine Protoperithezien Störung in der Öffnung der Kotyledonen (NDPK2-Gen) Lacombe et al. (1990), Troll et al. (1993) Amutha und Pain (2003), Fukuchi et al. (1993) Izumiya und Yamamoto (1995) Momany et al. (1999), Lin et al. (2003) Ogura et al. (1999, 2001), Lee et al. (2006) Sweetlove et al. (2001), Hasunuma et al. (2003), Choi et al. (1999) 1 x cyt. - Sommer und Song (1994) 1 x cyt. - Yano et al. (1993, 1995) 1 x cyt. - Tanaka et al. (1998) 1 x cyt., 2 x plast. - Nomura et al. (1991, 1992), Zhang et al. (1993, 1995) 1 x cyt. - Ishikawa et al. (2003) 68

76 V. Diskussion Drosophila melanogaster (Metazoa) Homo sapiens (Metazoa) Mus musculus (Metazoa) 3 x cyt. 8 x cyt. 2 x cyt. larvale Fehlbildung, letal (awd-gen) metastasenfördend (nm23-h1-gen) Wachstumsreduktion (nm23-m1-gen) Biggs et al. (1988), Adams et al. (2000), Dearolf et al. (1988), Rosengard et al. (1989) Lacombe et al. (2000), Wang et al. (1993), Chang et al. (1994) Arnaud-Dabernat et al. (2003), Steeg et al. (1988), Urano et al. (1992) Während bei N. crassa der RIP-Mechanismus die Ausbildung von Isoformen verhindert haben mag (Selker und Garrett 1988, Galagan und Selker 2004), bleibt für A. nidulans und S. macrospora offen, weshalb diese nur eine Kopie eines Nukleosiddiphosphat- Kinase-Gens besitzen. Da das Genom von A. nidulans ebenso wie das von N. crassa bereits komplett sequenziert wurde, ist es unwahrscheinlich, dass eine paraloge Sequenz bisher nicht entdeckt wurde. Obwohl die Nukleosiddiphosphat-Kinase offensichtlich eine Haushaltsfunktion bezüglich der Synthese von (d)ntps einnimmt, ist die Mutation oder Deletion ihres kodierenden Gens in der Regel nicht letal (Tab. 4). Interessanterweise besitzen alle Vertreter der rudimentären bakteriellen Gattung Mycoplasma keine Nukleosiddiphosphat-Kinase, was auf einen sekundären Verlust einer ursprünglich vorhandenen Sequenz zurückzuführen ist (Ishikawa et al. 2003). In diesem Fall wird angenommen, dass Nukleosidmonophosphat-Kinasen für die Synthese der (d)ntps verantwortlich sind (Wang 2007). Auch die Deletion des Nukleosiddiphosphat-Kinase- Gens bei den einzelligen Ascomyceten S. cerevisiae und S. pombe ergibt keine phänotypischen Auffälligkeiten. Hier ist davon auszugehen, dass ebenfalls andere Enzyme den Grundbedarf an (d)ntps decken, zumal in beiden Fällen eine Enzymrestaktivität von 10 % bzw. 20 % zu beobachten ist (Fukuchi et al. 1993, Izumiya und Yamamoto 1995). Die Deletion des singulären Nukleosiddiphosphat-Kinase-Gens von E. coli verursacht keine augenscheinliche Veränderung des Phänotyps (Hama et al. 1991). Die Mutante besitzt eine Enzymrestaktivität von %, welche auf eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die Adenylatkinase, zurückzuführen ist (Lu und Inouye 1996). Allerdings zeigt die Deletionsmutante eine erhöhte Mutationsneigung, was auf eine Störung des Gleichgewichts zwischen den einzelnen (d)ntps 69

77 V. Diskussion zurückgeführt wird (Miller et al. 2002). Ein ähnlicher Phänotyp konnte von Zeibell et al. (2007) auch für B. anthracis beobachtet werden. Die in diesem Kapitel beschriebene hohe strukturelle und funktionelle Konservierung von Nukleosiddiphosphat-Kinasen ist typisch für ein Enzym mit Haushaltsfunktion. Die in Tabelle 4 aufgelisteten Mutanten weisen jedoch eine große phänotypische Varianz auf, was möglicherweise auf alternative Funktionen der Nukleosiddiphosphat-Kinasen zurückgeführt werden kann. Die zugrundeliegenden Mechanismen werden in den nachfolgenden Kapiteln anhand der Analyse der ndk1-mutante aus S. macrospora diskutiert. 1.2 Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora beeinflusst das vegetative Wachstum des Pilzes In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Deletion des ndk1-gens auf die Morphogenese von S. macrospora untersucht. Bemerkenswerterweise verursacht die Deletion des Gens eine drastische Reduktion des vegetativen Wachstums der Mutante auf ein Niveau von ca. 10 % des Wildtyps (Abb. 11). Untersuchungen mit RIP- Mutanten aus N. crassa führen zu ähnlichen Ergebnissen. Obwohl die N. crassa- Mutanten ndk-1 RIP-1 bzw. ndk-1 RIP % Enzymrestaktivität einer Nukleosiddiphosphat-Kinase aufweisen, erreicht ihr vegetatives Wachstum nur 17 % des Wildtyp- Wachstums (Lee et al. 2006). Ähnlich zu der in dieser Arbeit erstellten S. macrospora- Mutante werden dünnere Hyphen ausgebildet, die sich stark verzweigen. Die Reduktion des vegetativen Wachstums der ndk1-mutante von S. macrospora konnte durch ektopische Integration des ndk1-gen unter der Kontrolle nativer putativ cistranskriptionsaktivierender 5 - und 3 -Bereiche restauriert werden (Abb. 11). Die beobachtete Überkompensation des vegetativen Wachstums der Retransformante kann dabei auf mehrere integrierte Kopien des ndk1-gens zurückgeführt werden, die mittels der in Abbildung 12 dargestellten Southern-Analyse nachgewiesen werden konnten. Dementsprechend wurde durch Northern-Analysen in der Retransformante eine erhöhte Expression des ndk1-transkripts im Vergleich zum Wildtyp festgestellt (Abb. 13). Das über das Wildtyp-Niveau hinaus restaurierte Wachstum der Retransformante könnte den Umkehrschluss zulassen, dass fehlendes ATP als Energiespeicher oder eine Behinderung der Polynukleotidsynthese aufgrund fehlender (d)ntps ursächlich für die 70

78 V. Diskussion Reduktion des vegetativen Wachstums sein könnten. Jedoch zeigt eine Punktmutante der Nukleosiddiphosphat-Kinase aus A. nidulans mit 20 % Enzymrestaktivität in der Phosphorylierung von (d)ndps keine großen Einschränkungen bezüglich ihres vegetativen Wachstums, worauf Aufnahmen der Mutanten von Momany et al. (1999) und Lin et al. (2003) hindeuten. Es ist daher eher anzunehmen, dass der vegetative Phänotyp der RIP-Mutanten von N. crassa und der Deletionsmutante von S. macrospora durch den Verlust einer anderen Enzymaktivität der Nukleosiddiphosphat-Kinasen verursacht wird. Nukleosiddiphosphat-Kinasen können an Serinen autophosphorylieren und besitzen zusätzlich eine Kinaseaktivität bezüglich anderer Proteine (Lu et al. 1996, Ogura et al. 1999, Hasunuma et al. 2003). Während diese Aktivitäten in der Punktmutante von A. nidulans offensichtlich weiterhin erhalten bleiben, sind sie in der RIP-Mutante ndk-1 Rip-1 von N. crassa, welche kein ndk-1- Transkript mehr aufweist, und in der ndk1-deletionsmutante von S. macrospora möglicherweise nicht mehr verfügbar (Lee et al. 2006). Für die Annahme, dass diese zusätzlichen Enzymaktivitäten der Nukleosiddiphosphat-Kinase einen entscheidenden Einfluss auf grundlegende Zellprozesse bei filamentösen Ascomyceten besitzen, spricht ebenfalls, dass bei Deletionsversuchen in A. nidulans bisher keine Mutanten erzeugt werden konnten. Lin et al. (2003) gehen deshalb davon aus, dass die Nukleosiddiphosphat-Kinase für A. nidulans essentiell ist. Da die Deletionsmutanten der einzelligen Ascomyceten S. cerevisiae und S. pombe einen Wildtyp-Phänotyp aufweisen, ist anzunehmen, dass die Nukleosiddiphosphat-Kinase bei den mehrzelligen filamentösen Ascomyceten zusätzliche Funktionen übernimmt, beispielsweise in der Regulation der Zelldifferenzierung. Nach der Betrachtung des Einflusses der NDK1 auf das vegetative Wachstum von S. macrospora werden im nun folgenden Kapitel die Folgen der ndk1-deletion hinsichtlich der sexuellen Entwicklung von S. macrospora diskutiert. 1.3 Die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 reguliert die positiv fototrope Anlage der Fruchtkörperhälse Neben Defekten im vegetativen Wachstum zeigen Nukleosiddiphosphat-Mutanten verschiedener Ascomyceten auch Veränderungen in der sexuellen Entwicklung. Dies wird besonders durch den weiblich sterilen Phänotyp der beiden ndk-1 RIP -Mutanten von 71

79 V. Diskussion N. crassa deutlich; es ist keine Protoperithezienbildung zu beobachten. Von Ogura et al. (2001) wurde ermittelt, dass sowohl die Kinase-Aktivität als auch die Fähigkeit zur Autophosphorylierung in der Punktmutante ndk-1 P72H drastisch reduziert ist, jedoch die Funktion der (d)ntp-synthese vollständig beibehalten wird. Da diese Mutante im Gegensatz zu den RIP-Mutanten Fruchtkörper entwickelt, kann die Annahme getroffen werden, dass die Hauptfunktion der Nukleosiddiphosphat-Kinase, die Synthese von (d)ntps, ausreichend für die Bildung reifer Fruchtkörper in N. crassa ist. Von Izumiya und Yamamoto (1995) ist ein dominant-rezessives Allel der Nukleosiddiphosphat-Kinase beschrieben worden, welches die sexuelle Entwicklung von S. pombe beeinträchtigt. Das vom mutierten Allel kodierte Enzym ist in der Synthese der (d)ntps gestört. Auf bisher ungeklärte Art und Weise bewirkt die Kombination des mutierten Allels und eines Wildtyp-Allels eine verminderte Kreuzungseffizienz und Sporenbildungsrate (Izumiya und Yamamoto 1995). Bemerkenswerterweise verursacht die Deletion des ndk1-gens aus S. macrospora im Gegensatz zu den RIP-Mutanten des nahen Verwandten N. crassa keinen sterilen Phänotyp. Entsprechend des verzögerten vegetativen Wachstums der ndk1-mutante erfolgt die Fruchtkörperbildung zwar etwas später als im Wildtyp, jedoch werden letztendlich fertile Perithezien ausgebildet (Abb. 9B). Da die RIP-Mutante ndk-1 RIP-1 aus N. crassa kein ndk-1-transkript aufweist und somit einer Gendeletion gleichgestellt werden kann (Lee et al. 2006), weisen die Fertilität der ndk1-deletionsmutante aus S. macrospora und die Sterilität dieser RIP-Mutanten aus N. crassa auf eine unterschiedliche Regulation der Fruchtkörperbildung durch die Nukleosiddiphosphat- Kinasen beider Organismen hin. Wie bereits zuvor erwähnt, ist eine Punktmutante von N. crassa, ndk-1 P72H mit einem Austausch von Prolin gegen Histidin an Position 72, jedoch fertil. Allerdings weist sie einen Defekt in der Ausbildung des Fruchtkörperhalses auf (Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001). Auch die unter Dauerlicht angezogene Δndk1-Mutante von S. macrospora weist einen solchen Phänotyp auf. Beide Mutanten bilden den Perithezienhals nicht, wie bei den entsprechenden Wildtypen zu beobachten ist, an der lichtzugewandten Seite aus, sondern zufällig (Abb. 9B, Oda und Hasunuma 1997, Ogura et al. 2001). Aufgrund der Tatsache, dass die Punktmutante aus N. crassa weiterhin die charakteristische Enyzmaktivität einer Nukleosiddiphosphat-Kinase besitzt, gehen Ogura et al. (2001) davon aus, dass dieser Phänotyp von den zusätzlichen Enzymaktivitäten der NDK-1, der Autophosphorylierung- und der Kinasefunktion, 72

80 V. Diskussion abhängt. Daher kann angenommen werden, dass diese zusätzlichen Funktionen der Nukleosiddiphosphat-Kinase auch für den Phänotyp der S. macrospora-mutante ndk1 verantwortlich sind. Die Regulation der Fruchtkörperdifferenzierung durch die NDK1 von S. macrospora scheint dabei, wie für ein multifunktionelles Enzym nicht ungewöhnlich, in keinem direkten Zusammenhang mit ihrem Einfluss auf das vegetative Wachstum zu stehen. Unabhängig voneinander erzeugte ndk1::ndk1- Retransformanten zeigten jeweils die Restauration des vegetativen Wachstums, jedoch konnte in keinem Fall die Wiederherstellung des Fototropismus in der Anlage der Fruchtkörperhälse beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Es wird daher spekuliert, ob die Bildung der Fruchtkörperhälse einer sehr stringenten Regulation durch die NDK1 unterliegt. Eine Überexpression des ndk1-gens, wie sie für die Retransformante ndk1::ndk1 K14 gezeigt werden konnte (Abb. 13), würde wahrscheinlich eine erhöhte NDK1-Synthese verursachen, was wiederum zu einer Erhöhung ihrer verschiedenen Enzymaktivitäten führen würde. Diese läge dann gegebenenfalls außerhalb des zur Restauration des Phänotyps erforderten wirksamen Bereichs. Da die Integration des ndk1-gens in die ndk1-mutante ektopisch erfolgte, können zudem auch Lokalisationseffekte nicht ausgeschlossen werden. Beispielsweise könnten Silenceroder Enhancersequenzen in der Umgebung des nativen ndk1-locus an der Regulation der Transkription des ndk1-gens im Wildtyp beteiligt sein. Die N. crassa-punktmutante konnte hingegen durch Transformation sowohl genomischer ndk-1-dna als auch entsprechender cdna-sequenzen unter einem konstitutiven trpc-promotor bezüglich des Perithezien-Phänotyps restauriert werden (Ogura et al. 2001). Dies ist wiederum ein Indiz für eine unterschiedliche Regulation des beobachteten Perithezien-Fototropismus durch die Nukleosiddiphosphat-Kinasen beider Organismen. Um zu untersuchen, welche Wellenlänge des Lichts die Ausbildung der Perithezienhälse in S. macrospora steuert, wurde der S. macrospora Wildtyp unter Rotund Blaulicht angezogen. Die Rotlichtversuche wurden durchgeführt, da Pilze funktionelle Phytochrome besitzen, wie das Beispiel FphA aus A. nidulans belegt (siehe Kap. I.4.1, Blumenstein et al. 2005). Für eine Isoform der Nukleosiddiphosphat-Kinase von A. thaliana, NDPK2, konnte eine physikalische Interaktion mit dem Rotlicht- Rezeptor Phytochrom A beobachtet werden (Choi et al. 1999). Des Weiteren ist bekannt, dass NDPK2 an rotlichtinduzierten morphologischen Veränderungen der Pflanze beteiligt ist. Eine entsprechende NDPK2-Insertionsmutante weist einige 73

81 V. Diskussion phänotypische Merkmale der Phytochrom A-Mutante auf, wie z.b. eine Störung in der Öffnung der Kotyledonen (Tab. 4, Choi et al. 1999). Dieses lässt auf eine Beteiligung der Nukleosiddiphosphat-Kinase innerhalb einer Rotlicht-induzierten Signalkaskade schließen. Auch für P. sativum und O. sativa wurde beschrieben, dass die Nukleosiddiphosphat-Kinase unter Rotlicht phosphoryliert wird (Hamada et al. 1996, Tanaka et al. 1998, Hamada et al. 1999). Interessanterweise konnte für P. sativum zusätzlich eine Blaulicht-abhängige Phosphorylierung der Kinase beobachtet werden (Ito et al. 1995). Eine ebenfalls Blaulicht-abhängige Phosphorylierung der NDK-1 aus N. crassa konnte durch Analysen mit radioaktiv markiertem [γ 32 P]-ATP gezeigt werden (Oda und Hasunuma 1994, Ogura et al. 1999). Die phänotypische Analyse des unter Rotlicht kultivierten Wildtyps von S. macrospora ergab, dass die Perithezien denen der ndk1-mutante glichen. Erst unter Blaulicht wurden die Perithezienhälse des Wildtyps positiv fototrop ausgebildet (Daten nicht gezeigt). Es kann daher angenommen werden, dass die ndk1-mutante von S. macrospora ebenso wie die Punktmutante von N. crassa in der Blaulichtperzeption bzw. -verarbeitung gestört ist. Um dieser Hypothese nachzugehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit vergleichende Northern-Analysen mit Gesamt-RNA des Wildtyps, der ndk1-mutante und der ndk1::ndk1-retransformante durchgeführt. Dabei kamen Sonden für Transkripte zum Einsatz, deren Produkte an einer putativen Blaulicht- Signalkaskade von S. macrospora beteiligt sein könnten. 1.4 Wird die Expression der an einer putativen Blaulichtsignalkaskade beteiligten Gene durch NDK1 reguliert? Die Blaulichtsignalkaskade von N. crassa ist besonders gut untersucht und es existiert eine Reihe von Mutanten, die verschiedene Defekte in der Blaulichtantwort aufweisen. Interessanterweise wurde eine sod-1-mutante beschrieben, welche denselben Perithezienphänotyp wie die Punktmutante ndk-1 P72H aus N. crassa und die in dieser Arbeit erstellte Δndk1-Mutante aus S. macrospora besitzt. Auch die Deletion des kodierenden Gens der SOD-1 Superoxiddismutase von N. crassa führt zur lichtunabhängigen Ausbildung der Perithezienhälse (Yoshida und Hasunuma 2004). Es wird vermutet, dass dieses Enzym, welches Superoxid in Wasserstoffperoxid überführt, über die Erzeugung von Gradienten reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) die Anlage der 74

82 V. Diskussion Perithezienhälse steuert. In der sod1-mutante konnte mittels RT-PCR unter Blaulichteinfluss eine signifikant erhöhte Expression des wc-1-gens im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Untersuchungen der genetischen Interaktionen mittels einer Δsod-1Δwc-1-Doppelmutante bestätigten die Annahme, das SOD-1 in einer Signalkaskade unterhalb von WC-1 lokalisiert ist (Yoshida und Hasunuma 2004). Da die Blaulicht-abhängige Phosphorylierung der NDK-1 nicht in Proteinfraktionen von wc-1 und wc-2-mutanten beobachtet werden konnte, jedoch eine Vermischung der Fraktionen beider Mutanten die Phosphorylierung der NDK-1 wiederherstellte, wurde früh angenommen, dass auch die Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK-1 aus N. crassa an der Blaulichtsignalkaskade unterhalb des Photorezeptors WC-1 beteiligt ist (siehe Kap. I.4, Oda und Hasunuma 1994). Die Analyse der genetischen Interaktion zwischen ndk-1 und wc-1 bestätigte diese Annahme (Oda und Hasunuma 1997). Um eine Beteiligung von NDK1 aus S. macrospora an einer Signalkaskade unterhalb eines putativen WC1-Homologs nachzuweisen, wurde in einer ersten Northern-Analyse versucht, mittels einer homologen Sonde die wc1-transkriptmenge in der Δndk1- Mutante zu determinieren. Jedoch konnten keine signifikanten Signale beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Als Ursache ist ein generell niedriges Transkriptionsniveau von wc1 anzunehmen. Bei Northern-Analysen mit Fusarium fujikuroi Gesamt-RNA konnten von Estrada und Avalos (2008) nur sehr schwache Signale des wc1-orthologs wcoa für den Wildtyp festgestellt werden. Deshalb empfiehlt sich für zukünftige Analysen die Untersuchung der wc1-transkriptmenge beispielsweise ausgehend von isolierter mrna, wodurch bereits einigen Arbeitsgruppen der qualitative Nachweis von wc1-homologen gelang (He und Liu 2005, Idnurm und Heitman 2005). Auch Realtime-PCR-Experimente zur genauen Quantifizierung des wc1-transkriptes in der Δndk1-Mutante von S. macrospora würden sich anbieten. Da die wc-1-expression bei N. crassa einer transkriptionellen Kontrolle, beispielsweise durch Blaulicht, unterliegt und WC-1 eine entscheidende Rolle bei der Expression Blaulicht-regulierter Gene besitzt (Ballario et al. 1996, Cheng et al. 2001, Denault et al. 2001, Franchi et al. 2005), kann durch die Expressionsstudien in S. macrospora gegebenenfalls ein kausaler Zusammenhang zwischen dem putativen Blaulichtrezeptor WC1 und der Nukleosiddiphosphat-Kinase NDK1 aus S. macrospora hergestellt werden. 75

83 V. Diskussion Ein anderes, für die Expressionanalysen interessantes Gen, vvd, kodiert für einen weiteren möglichen Blaulichtrezeptor aus S. macrospora. Von den N. crassa-proteinen SOD-1 und dem Vivid-Protein VVD wird vermutet, dass sie in parallelen Signalwegen an der Blaulicht-induzierten Karotinoid-Synthese von N. crassa beteiligt sind (siehe Kapitel I.4.1, Yoshida und Hasunuma 2004). Aufgrund einer N. crassa Δsod-1ndk- 1 P72H -Doppelmutante, bei der die fototrope Halsbildung der Fruchtkörper noch stärker eingeschränkt ist als bei den Einzelmutanten, gehen Yoshida und Hasunuma (2004) davon aus, dass SOD-1 und NDK-1 in parallelen Signalwegen unterhalb von WC-1 agieren, also die Möglichkeit besteht, dass NDK-1 und VVD innerhalb eines Signalweges lokalisiert sind. Um eine mögliche funktionelle Verbindung zwischen einem Vivid-Homolog aus S. macrospora und NDK1 herzustellen, wurde eine Northern-Analyse mit einer homologen vvd-sonde und Gesamt-RNA sowohl des Wildtyps, als auch der Retransformante Δndk1::ndk1 K14 und der Δndk1-Mutante durchgeführt. Die vvd-sonde wurde im Rahmen dieser Arbeit durch heterologe PCR mit N. crassa-spezifischen Oligonukleotiden und genomischer DNA aus S. macrospora als Matrize erzeugt (Tab. 3). Die Identität der Sonde wurde nachfolgend durch Sequenzierung und in silico-analyse verifiziert. Dabei wies die vvd-sequenz die höchste Homologie mit der orthologen Sequenz aus N. crassa auf und kodiert somit nach Vivid aus N. crassa und Envoy aus H. jecorina für das dritte bekannte Protein seiner Art (Daten nicht gezeigt). Das entsprechende Autoradiogramm der Northern-Analyse unter Verwendung der vvd- Sonde, dargestellt in der Abbildung 14, lässt eine Überexpression von vvd in der Δndk1-Mutante im Vergleich zum Wildtyp und der Retransformante vermuten. Der Blaulichtrezeptor Vivid (siehe Kapitel I.4.1, Heintzen et al. 2001, Schwerdtfeger und Linden 2003) ist für die transiente Expression lichtinduzierter Gene im Rahmen der Fotoadaptation zuständig (Perkins et al. 1997, Heintzen et al. 2001, Schwerdtfeger und Linden 2001, Shrode et al. 2001, Yoshida und Hasunuma 2004). Auch die lichtinduzierte Karotinoidbildung wird über Vivid sowohl auf transkriptioneller wie auch posttranskriptioneller Ebene negativ reguliert, weshalb vvd-mutanten durch Karotinoide intensiv orange gefärbt sind (Perkins et al. 1997, Heintzen et al. 2001, Schwerdtfeger und Linden 2003, Yoshida und Hasunuma 2004). Bemerkenswerterweise ist für die ndk-1-rip-mutanten aus N. crassa zu beobachten, dass nur etwa die Hälfte der Karotinoid-Menge im Vergleich zum Wildtyp gebildet 76

84 V. Diskussion wird (Lee et al. 2006). In Übereinstimmung mit der beobachteten vvd-überexpression in der Δndk1-Mutante von S. macrospora (Abb. 14) könnte in diesem Fall die Synthese der Karotinoide durch ein Überangebot des Repressors Vivid vermindert worden sein, auch wenn Lee at al. (2006) für N. crassa keine entsprechenden Untersuchungen vorgenommen haben. Hervorzuheben ist, dass sowohl NDK-1 als auch Vivid aus N. crassa cytosolische Proteine sind (Schwerdtfeger und Linden 2003, Yoshida und Hasunuma 2006), was eine direkte Interaktion zwischen beiden Proteine ermöglichen würde. Eine Wiederholung der Northern-Analyse und weiterführende Versuche, beispielsweise mittels Realtime-PCR könnten im Anschluss an diese Arbeit zur Festigung der Hypothese beitragen, dass in S. macrospora die NDK1 an der Regulation der Expression von vvd beteiligt ist. Eine weitere Verifizierung einer funktionellen Interaktion beider Proteine, Vivid und NDK1, bei der Blaulicht-abhängigen Anlage der Fruchtkörperhälse könnte auf genetischer Ebene durch die Erzeugung und Analyse entsprechender Doppelmutanten erfolgen oder durch Nachweis einer physikalischen Interaktion beispielsweise mittels des Hefe-Two-Hybrid-Systems. 2. Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora 2.1 Pilzliche Adenylatcyclasen sind an Signalwegen beteiligt, die für Virulenz, asexuelle sowie sexuelle Vermehrung wichtig sind Die Adenylatcyclasen gehören zu den Nukleotidcyclasen der Klasse III, welche sowohl bei Prokaryoten wie auch Eukaryoten vorkommen. Nukleotidcyclasen der Klasse III sind in der Sequenz und Struktur ihrer katalytischen Domäne hoch konserviert. Die Konservierung beruht auf der universellen Enyzmaktivität sowohl der Adenylat- wie auch der Guanylatcyclasen, nämlich der Synthese von camp bzw. cgmp ausgehend von den Purinen ATP und GTP als Substrat. Die restliche Topologie der Enzyme ist jedoch, entsprechend ihrer physiologischen Funktionen und/oder bedingt durch evolutive Entwicklungen, relativ heterogen (Baker und Kelly 2004). So sind bisher neun Isoformen von Adenylatcyclasen in Säugern charakterisiert worden, welche unterschiedliche Funktionen und/oder Gewebespezifitäten besitzen. Im Gegensatz zu den Säugern, deren Adenylatcyclasen Heterodimere mit zwei unterschiedlichen 77

85 V. Diskussion katalytischen Domänen bilden und über Transmembrandomänen in die Plasmamembran integriert sind, handelt es sich bei den pilzlichen Adenylatcyclasen um singuläre cytosolische Proteine, die Homodimere ausbilden (Baker und Kelly 2004). Die in dieser Arbeit durchgeführte Sequenzierung und Annotation des sac1-gens aus S. macrospora ergab einen offenen Leserahmen von 8100 bp, welcher drei Intronsequenzen enthielt. Die kodierende Sequenz von 6939 bp Länge weist mit 90 % Sequenzidentität zur kodierenden Sequenz aus N. crassa einen bei Sequenzvergleichen zwischen beiden Organismen normalerweise beobachteten Konservierungsgrad auf (Nowrousian et al. 2004). Das aus der Sequenz abgeleitete Protein SAC1 aus S. macrospora besteht aus 2312 Aminosäuren und besitzt eine Sequenzidentität von 92 % mit dem CR-1-Protein aus N. crassa, wodurch die Identifizierung einer Adenylatcyclase aus S. macrospora angenommen werden konnte (siehe Anhang, Abb. A3). Durch weitere in silico- Analysen wurde diese Annahme verifiziert. So konnten vier für pilzliche Adenylatcyclasen typische Domänen identifiziert werden, deren Funktion jedoch, abgesehen von der katalytischen Domäne, bisher weitgehend unverstanden ist (siehe Anhang, Abb. A3). Erst seit Kurzem ist bekannt, dass das Motiv DXNLN, welches auch im S. macrospora-protein nahe dem N-Terminus lokalisiert ist, eine putative Bindestelle für α-untereinheiten heterotrimerer G-Proteine darstellt (Abb. A3, Ivey und Hoffman 2005). Innerhalb der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora sind vier hochkonservierte Aminosäuren lokalisiert. Während das an der Aminosäure-Position 1945 befindliche Lysin und das Aspartat an Position 2025 speziell der Bindung des Substrats ATP dienen, sind für die Synthese der cyclischen Nukleotide bei Adenylatcyclasen bzw. Guanylatcyclasen ein Asparagin (Position 2032) und ein Arginin (Position 2036) essentiell (Abb. A3, Tucker et al. 1998, Baker und Kelly 2004). Eine Übersicht über bisher beschriebene Adenylatcyclasen aus Pilzen ist in der Tabelle 5 dargestellt. Bemerkenswert ist, dass bisher nur jeweils eine Adenylatcyclase bei Pilzen charakterisiert werden konnte und Mutationen oder Deletionen oft unterschiedliche Phänotypen verursachen (Tab. 5). 78

86 V. Diskussion Tabelle 5: Übersicht über pilzliche Adenylatcyclasen. Die Phänotypen von Mutanten und die entsprechenden Referenzen sind angegeben. Alle beschriebenen Adenylatcyclasen sind cytosolische Proteine. Die Abkürzung veg. steht für vegetativ, während sex. die Abkürzung für sexuell ist. Organismus Mutanten-Phänotyp Referenz Candida albicans konstitutiv hefeartiges Wachstum, Rocha et al. (2001) (einzelliger Ascomycet) reduzierter veg. Wuchs, avirulent Saccharomyces cerevisiae Matsumoto et al. (1982), letal, G (einzelliger Ascomycet) 1 -Arrest in der Mitose Kataoka et al. (1985) Sporenkeimung auf Minimalmedium Hatanaka und Shimoda Schizosaccharomyces pombe inhibiert, Induktion sex. Zellfusionen (2001), (einzelliger Ascomycet) auch auf Vollmedium Maeda et al. (1990) Aspergillus fumigatus (filamentöser Ascomycet) Aspergillus nidulans (filamentöser Ascomycet) Botrytis cinerea (filamentöser Ascomycet) Magnaporthe grisea (filamentöser Ascomycet) Neurospora crassa (filamentöser Ascomycet) Sclerotinia sclerotiorum (filamentöser Ascomycet) Trichoderma virens (filamentöser Ascomycet) Cryptococcus neoformans (Basidiomycet) verminderte Konidienbildung, reduzierter veg. Wuchs, verminderte Virulenz verminderte Konidienbildung, reduzierter veg. Wuchs verminderte Konidienkeimung, reduzierter veg. Wuchs, verminderte Virulenz keine Perithezienbildung, reduzierter veg. Wuchs, avirulent verzögerte Perithezien-/Ascosporenentwicklung, verfrühte Konidienbildung, reduzierter veg. Wuchs, gesteigerte Thermotoleranz, verkürzte Lufthyphen, Konidienbildung unter Luftabschluss keine Apothezienbildung 1, reduzierter vegetativer Wuchs, verminderte Virulenz reduzierter veg. Wuchs auf Festmedium, teilweise Wuchs im Festmedium keine sex. Zellfusionen, konstitutiv hefeartiges Wachstum, keine Kapselbildung, keine Melanisierung, avirulent Ustilago maydis konstitutiv filamentöses Wachstum, (Basidiomycet) avirulent 1 Apothezien: zu den Perithezien homologe, offene Fruchtkörper Liebmann et al. (2003) Fillinger et al. (2002) Doehlemann et al. (2006), Klimpel et al. (2002) Choi und Dean (1997) Terenzi et al. (1974, 1976), Kore-eda et al. (1991), Ivey et al. (2002), Kays et al. (2000) Jurick und Rollins (2007) Mukherjee et al. (2007) Alspaugh et al. (2002) Gold et al. (1994) Während für S. cerevisiae die Deletion der Adenylatcyclase durch einen Arrest der Mitose in der G 1 -Phase letal ist, ist die Adenylatcyclase für alle anderen bisher untersuchten Pilze nicht essentiell. Es wird angenommen, dass auch andere Enzyme geringe Mengen an camp synthetisieren können, wie Jurick et al. (2007) beschreiben. Jurick et al. (2007) vermuten, dass zum Beispiel eine Guanylatcyclase aufgrund ihrer ähnlichen katalytischen Domäne die Funktion der Adenylatcyclase teilweise kompensieren könnte. Dieses ist jedoch eher unwahrscheinlich, da für Pilze bisher keine Guanylatcyclasen beschrieben wurden (Baker und Kelly 2004, Schaap 2005). 79

87 V. Diskussion Tatsächlich konnten mittels hochsensitiver ELISA-Tests für S. sclerotiorum und B. cinerea geringe Mengen camp nach der Deletion der Adenylatcyclasen detektiert werden (Klimpel et al. 2002, Jurick und Rollins 2007). Trotz der pleiotropen Phänotypen der in Tabelle 5 beschriebenen Adenylatcyclase-Mutanten lassen sich einige Gemeinsamkeiten erkennen. Dimorphe Pilze, welche abhängig von bestimmten Faktoren sowohl hefeartig wie auch filamentös wachsen können, sind in der Regel nach Deletion der Adenylatcyclase auf eine Wachstumsform beschränkt. So ist für die opportunistisch humanpathogenen Pilze C. albicans und C. neoformans beschrieben worden, dass sie im hefeähnlichen Zustand verbleiben und somit nicht in der Lage sind, in die pathogene, filamentöse Wachstumsform zu wechseln, wodurch sie im Tiermodell avirulent sind (Tabelle 5, Rocha et al. 2001, Alspaugh et al. 2002). Ursächlich für den Defekt ist bei C. neoformans die Inhibierung der Zellfusion, wodurch die Bildung eines infektiösen, dikaryotischen Myzels unterbunden wird. Zusätzlich unterbleibt auch die Ausbildung der Kapsel und die Synthese von Melanin, wobei es sich um zwei wichtige Pathogenitätsfaktoren handelt (Alspaugh et al. 2002). Für C. albicans wird vermutet, dass eine durch Glucose oder Aminosäuren ausgelöste Signalkaskade durch den Verlust der Adenylatcyclase unterbrochen wird und deshalb die Differenzierung der Hefezellen zu Hyphen ausbleibt (Miwa et al. 2004, Maidan et al. 2005). Erstaunlicherweise bildet die Adenylatcyclase-Deletionsmutante des pflanzenpathogenen Pilzes U. maydis ausschließlich Hyphen aus, welches im Normalfall die infektiöse Form bei Befall von Mais darstellt. Jedoch ist auch diese Mutante in planta nicht infektiös (Tab. 5, Gold et al. 1994). Ein weiterer, häufig anzutreffender Phänotyp bei Deletion der Adenylatcyclase von Pilzen ist eine Einschränkung in der Fortpflanzung über asexuelle Konidiosporen. Entweder kommt es zur verminderten Konidienbildung, wie für A. nidulans und A. fumigatus beschrieben wurde, oder, wie im Falle von B. cinerea, zu einer geringeren Konidienkeimungsrate (Fillinger et al. 2002, Klimpel et al. 2002, Liebmann et al. 2003). Auch sexuelle Vorgänge können bei Deletion des Adenylatcyclase-Gens betroffen sein, wie beispielsweise für N. crassa, S. sclerotiorum und M. grisea berichtet wurde. Während die N. crassa-mutante lediglich in ihrer Fruchtkörperentwicklung und der Ascosporogenese verzögert ist, unterbleibt die Fruchtkörperbildung bei den S. sclerotiorum- und M. grisea-mutanten vollständig (Choi und Dean 1997, Ivey et al. 2002, Jurick und Rollins 2007). Um die Funktion der Adenylatcyclase bei der Morphogenese von S. macrospora zu analysieren, wurde im 80

88 V. Diskussion Rahmen dieser Arbeit eine sac1-deletionsmutante erzeugt. In dem folgenden Kapitel wird zunächst der Einfluss von SAC1 auf das vegetative Wachstum von S. macrospora diskutiert, während in den nachfolgenden Kapiteln auf die Beteiligung der Adenylatcyclase an der sexuellen Entwicklung von S. macrospora eingegangen wird. 2.2 Die camp-synthese durch die Adenylatcyclase SAC1 und bisher unbekannte Enzymfunktionen beeinflussen das vegetative Wachstum von S. macrospora Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora wird, wie für Pilze generell beobachtet werden kann, von nur einem Gen kodiert. Weitere Gene, welche gegebenenfalls für zusätzliche Isoformen kodieren könnten, wurden mittels Southern-Analysen nicht detektiert, wie der Abbildung 17 entnommen werden kann. Die Deletion des kodierenden sac1-gens führt, wie bei fast allen in Tabelle 5 aufgeführten Mutanten, zu einer deutlichen Reduktion des vegetativen Wuchses. Anhand der Abbildung 21, welche das Resultat des Wachstumstests in einem Diagramm darstellt, wird deutlich, dass die Δsac1-Mutante nur etwa 59 % des Wachstums des Wildtyps erreicht. Ähnliche Werte von 68 % bzw. 60 % konnten für die Adenylatcyclase-Mutanten von A. fumigatus und M. grisea festgestellt werden (Choi und Dean 1997, Liebmann et al. 2003). Bei anderen Pilzen, wie N. crassa und T. virens, ist allerdings eine erheblich größere Einschränkung des vegetativen Wachstums zu beobachten. Diese Mutanten erreichen nur etwa 3 % bzw. 6 % des vegetativen Wachstums des Wildtyps (Kore-eda et al. 1991, Mukherjee et al. 2007). Interessanterweise zeigt die Mutante von C. neoformans ein normales vegetatives Wachstum (Alspaugh et al. 2002). Deshalb kann davon ausgegangen werden, dass die unterschiedlich starken Wachstumsdefekte bei oben genannten Pilzen nicht allein auf den Verlust von camp zurückzuführen sind. Vielmehr kann angenommen werden, dass die Adenylatcyclase neben der Synthese von camp auch andere regulatorische Funktionen übernimmt, wofür auch ihr Aufbau aus verschiedenen Domänen spricht. Dies ist möglicherweise auch die Ursache dafür, dass der Wachstumsdefekt der Δsac1-Mutante von S. macrospora über die Zuführung von camp nur teilweise restauriert werden kann. Die Wachstumsrate konnte auf 74 % des Wildtyp-Niveaus angehoben werden, wie aus der Abbildung 21 hervorgeht. Eine ähnliche Steigerung des vegetativen Wachstums durch externe Zugabe von camp konnte auch bei der Adenylatcyclase-Mutante von N. crassa festgestellt werden, wobei 81

89 V. Diskussion Kore-eda et al. (1991) eine Wachstumsrate von 17 % im Vergleich zum Wildtyp verzeichneten. Speziell für N. crassa ist die Möglichkeit auszuschließen, dass falsche camp-derivate oder -Konzentrationen ursächlich für die nur partielle Restaurierung des vegetativen Wuchs sind, da Rosenberg und Pall (1979) in einer Versuchsreihe mit vier verschiedenen camp-derivaten in unterschiedlichen Konzentrationen nie eine vollständige Restaurierung des vegetativen Phänotyps der Adenylatcyclase-Mutante beobachten konnten. Bemerkenswerterweise konnten Mukherjee et al. (2007) bei T. virens keine Verbesserung des vegetativen Wachstums beobachten, während für A. fumigatus eine komplette Restaurierung des Wachstums durch camp berichtet wurde (Liebmann et al. 2003). Die Supplementierungsversuche mit camp lassen für die meisten Adenylatcyclase-Mutante die Annahme zu, dass ein Teil der beobachteten Reduktion des vegetativen Wachstums, unabhängig vom Verlust des camps, auch auf den Verlust zusätzlicher Funktionen der Adenylatcyclase zurückzuführen ist. Dieses scheint auch für S. macrospora der Fall zu sein. In diesem Zusammenhang ist die Serin/Threonin-Phosphatase-Domäne der pilzlichen Adenylatcyclasen interessant, deren Funktion allerdings bisher nicht bekannt ist (Baker und Kelly 2004). Serine/Threonin- Phosphatasen der Klasse PP2C sind an verschiedenen Signalkaskaden beteiligt. Für die Ptc4-Phosphatase aus S. pombe wurde zudem ein Wachstumsdefekt beschrieben (Gaits und Russell 1999). Das Einbringen von Mutationen in die Serin/Threonin-Phosphatase- Domäne der Adenylatcyclase von S. macrospora oder eine Analyse mit einem spezifischen Phosphatase-Inhibitor könnten in Zukunft zu weiteren Erkenntnissen bezüglich ihrer Funktion führen. 2.3 Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora ist an der Grenzschichtwahrnehmung beteiligt Die Bildung von Fruchtkörpern erfordert eine hohe metabolische Leistung und benötigt viel Energie, weshalb die Ausbildung der Fruchtkörper nur in Abhängigkeit bestimmter Reize erfolgt (Pöggeler et al. 2006a). Für S. macrospora ist beispielsweise bekannt, dass die Fruchtkörperbildung von Biotin abhängig ist (Molowitz et al. 1976); N. crassa beginnt erst unter Stickstoffmangelbedingungen mit der Anlage der Fruchtkörper. Der Wildtyp von S. macrospora bildet Perithezien in der Regel nur unter aeroben Bedingungen aus, weshalb in Schüttelkulturen mit Flüssigmedium nur vegetatives 82

90 V. Diskussion Myzel beobachtet werden kann (Nowrousian und Kück 2006). Auf festem Untergrund entwickelt der Wildtyp von S. macrospora Perithezien an der Luft-Oberflächen-Grenze (Abb. 18), wodurch eine optimale Vermehrung durch die Ascosporen gewährleistet wird. Interessanterweise bildet die Δsac1-Mutante von S. macrospora jedoch viele Perithezien unter Luftabschluss unterhalb der Oberfläche des Festmediums aus, wobei die Perithezien im Vergleich mit dem Wildtyp eine geringere Größe besitzen (Abb. 18). Für N. crassa ist ein ähnlicher Phänotyp bei der Deletion des gna-3-gens zu beobachten. Dieses Gen kodiert für die Gα-Untereinheit GNA-3 eines heterotrimeren G-Proteins, welche in einer Signalkaskade oberhalb der Adenylatcyclase CR-1 aus N. crassa vermutet wird (Kays et al. 2000). Bei einer Adenylatcyclase-Mutante von T. virens konnten Mukherjee et al. (2007) beobachten, dass die Hyphen ebenfalls größtenteils im Festmedium wuchsen. Es liegt also die Vermutung nahe, dass alle entsprechende Mutanten in der Perzeption der Luft-Oberflächen-Grenzschicht eingeschränkt sind, zumal die Δsac1-Mutante von S. macrospora, wenn sie auf Zellophan kultiviert wird, an der Oberfläche des Festmediums Myzel und Perithezien ausbilden kann (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise ist ein Defekt in der Grenzschichtwahrnehmung auch für eine Adenylatcyclase-Mutante des pflanzenpathogenen Pilzes M. grisea bei der Bildung seines Infektionsorgans, des Appressoriums, beobachtet worden (Tab. 5). Dabei wird vermutet, dass eine hydrophobe Oberfläche mittels spezieller MPG1-Hydrophobine perzipiert und das Signal über die Gα-Untereinheit eines G-Proteins an die Adenylatcyclase weitervermittelt wird (Choi und Dean 1997). Die von Pilzen sekretierten Hydrophobine kommen in zwei Klassen vor. Vertreter der Klasse I sind bei Asco- wie Basisiomyceten zu finden, während die Klasse II- Hydrophobine nur bei Ascomyceten vorkommen. Sie sind für die Formation von pilzlichen Strukturen verantwortlich, die mit Luft in Berührung kommen, wie zum Beispiel Lufthyphen. Des Weiteren sind die für den Kontakt von Hyphen mit hydrophoben Oberflächen verantwortlich. Die Eigenschaften der Hydrophobine basieren auf ihrer amphipathischen Natur und ihrer Selbstorganisation in Filmen (Übersicht bei Wösten 2001). Jedoch konnte mittels BlastP-Analysen in silico kein Homolog zu MPG1-Hydrophobinen bei dem nah mit S. macrospora verwandten Pilz N. crassa gefunden werden, weshalb die Ursache für die beobachtete Perithezienbildung im Festmedium weiterhin einer Aufklärung bedarf. Es ist jedoch festzuhalten, dass der beobachtete Phänotyp 83

91 V. Diskussion durch die Deletion der Adenylatcyclase verursacht wird, da die genetische Komplementation der sac1-mutante mit dem orthologen cr-1-gen aus N. crassa erfolgreich war. Die Perithezien der Retransformante sac1::cr1 entsprachen in ihrer Größe in etwa denen des Wildytps und wurden wieder an der Medium-Oberfläche gebildet, wenn auch etwas eingesunken (Abb. 20). Es kann daher angenommen werden, dass sich die Adenylatcyclasen von S. macrospora und N. crassa nicht nur in ihrer Primärstruktur, sondern auch in ihrer Funktion ähneln. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der Perithezien-Phänotyp der sac1-mutante durch camp-mangel verursacht wird. Durch chemische Komplementation mittels camp konnte der Wildtyp-Phänotyp bezüglich der Perithezien einer sac1/fus-mutante restauriert werden, wie die Abbildung 20 verdeutlicht. Während die apathogenen Ascomyceten A. nidulans, N. crassa und S. macrospora in der Lage sind, bei Verlust der Adenylatcyclasefunktion weiterhin Fruchtkörper zu entwicklen, können die pflanzenpathogenen Ascomyceten S. sclerotiorum und M. grisea nach Deletion ihrer Adenylatcyclasen keine Fruchtkörper mehr ausbilden (Tab. 5, Choi und Dean 1997, Jurick und Rollins 2007). In beiden Fällen besitzt die Adenylatcyclase in Anpassung an die parasitische Lebensweise zusätzliche regulatorische Funktionen. Ähnlich wie bereits für die Appressorienbildung von M. grisea beschrieben, ist die Adenylatcyclase von S. sclerotiorum für die Ausbildung von Appressorien-ähnlichen Infektionsstrukturen essentiell (Jurick und Rollins 2007). Es ist anzunehmen, dass diese besondere Anpassung der Adenylatcyclase hinsichtlich der Pflanzeninfektion auch für die sterilen Phänotypen der M. grisea- bzw. S. sclerotiorum-mutanten verantwortlich ist. Obwohl die sac1-mutante aus S. macrospora reife Fruchtkörper ausbildet, ist ihre Fertilität aufgrund einer reduzierten Keimungsrate ihrer Ascosporen eingeschränkt. Die mögliche Ursache für diesen Phänotyp wird im nächsten Kapitel besprochen. 2.4 Die Ascosporenkeimung von S. macrospora wird über einen bei Pilzen konservierten Signalweg reguliert Die Ascosporen der sac1-mutante keimen im Vergleich mit dem Wildtyp deutlich seltener aus, wie die Abbildung 18 C veranschaulicht. Während die Wildtyp- Ascosporen eine Keimungsrate von 80 % bis 100 % aufweisen, sind es bei der sac1-84

92 V. Diskussion Mutante nur noch 30 %. Ein ähnlicher Phänotyp wurde bisher nur für die Adenylatcyclase-Mutante cyr1 aus S. pombe beschrieben, die eine Sporenkeimungsrate von etwa 30 % erreicht, wenn sie auf Minimalmedium kultiviert wird (Hatanaka und Shimoda 2001). Die Sporenkeimungsdefizienz des sac1-stammes aus S. macrospora konnte durch die Transformation des Gens für die Adenylatcyclase aus N. crassa restauriert werden (Daten nicht gezeigt). Dadurch wurde bewiesen, dass die Deletion der Adenylatcyclase ursächlich für den beobachteten Phänotyp war. Allerdings gelang dies in keinem Fall mittels chemischer Komplementation durch camp. Weder die Isolation von Sporen einer auf camp-haltigem Medium kultivierten sac1-mutante noch die Ausbringung auf mit camp-supplementiertem Keimungsmedium führten zu einer Wiederherstellung einer Wildtyp-ähnlichen Sporenkeimungsrate. Dabei wurden verschiedene Medien und unterschiedliche Konzentrationen beider verwendeten camp- Analoga getestet. Es liegt die Vermutung nahe, dass die Ascosporenwand für die camp-analoga eine Diffusionsbarriere darstellt und somit kein camp in die Ascosporen gelangen kann. Interessanterweise wurden auch für die gsa3-mutante von S. macrospora und die gna-3-mutante von N. crassa eine Reduktion der Ascosporenkeimung beschrieben (Kays et al. 2000, Jansson 2007), wobei die N. crassa-mutante, wie im vorangegangenen Abschnitt besprochen, zudem einen ähnlichen Perithezienphänotyp wie die sac1-mutante aus S. macrospora aufweist. Auch die gpa2-mutante aus S. pombe zeigt einen Ascosporenkeimungsdefekt. Das gpa2-genprodukt GPA2 aus gehört ebenso wie GNA-3 aus N. crassa und GSA3 aus S. macrospora zu den pilzlichen Gα-Untereinheiten der Gruppe III, welche im Allgemeinen eine Stimulierung der Adenylatcyclase bewirken, ähnlich den homologen, mit G s bezeichneten Gα- Untereinheiten der Säugetiere (Bölker 1998). Die Gα-Untereinheit GPA2 und die Adenylatcyclase CYR1 aus S. pombe werden einem gemeinsamen Signalweg zugeordnet, welcher an der Glucoseperzeption beteiligt ist und sich durch einen transienten Anstieg des intrazellulären camp in Antwort auf Glucose auszeichnet (Maeda et al. 1990, Isshiki et al. 1992, Hatanaka und Shimoda 2001, Hoffman 2005). Da Glucose ein Signal für die Keimung der Ascosporen von S. pombe darstellt, ist davon auszugehen, dass es durch die Deletion von gpa2 oder cyr1 zur Unterbrechung der Signalkaskade und somit zu einer Inhibierung der Sporenkeimung kommt (Hatanaka und Shimoda 2001). Es ist daher zu vermuten, dass die Adenylatcyclase 85

93 V. Diskussion SAC1 aus S. macrospora an einer Signalkaskade unterhalb von GSA3 beteiligt ist, welche der Perzeption von Nährstoffen dient und als Antwort die Auskeimung der Sporen beeinflusst. Ein ähnlicher Signalweg wird auch für die Sporenkeimung von S. cerevisiae postuliert, wobei die Aktivität der Adenylatcyclase nach Glucoseperzeption über das kleine G-Protein Ras2p gesteuert wird (Herman und Rine 1997, Colombo et al. 1998, Jiang et al. 1998, Kraakman et al. 1999). Es kann spekuliert werden, ob das Ziel dieser Kaskaden die Aktivierung der neutralen Trehalase ist. Diese ist für den Abbau des Reserve-Kohlenstoffes Trehalose zuständig und wird bei S. cerevisiae von der Proteinkinase A (PKA) reguliert, welche wiederum campabhängig reguliert wird (Uno et al. 1983). Ein Kennzeichen der Sporenkeimung von S. pombe ist der schnelle Abbau von Trehalose (Inoue und Shimoda 1981). Die Deletion des kodierenden Gens der Trehalose-6-P-Synthase aus S. pombe, welche für die Synthese von Trehalose zuständig ist, verursacht einen Keimungsdefekt der Ascosporen auf glucosehaltigem Medium (Blazquez et al. 1994). Mit dem Ziel, die Beteiligung der Gα-Untereinheit GSA3 und der Adenylatcyclase SAC1 von S. macrospora an einer gemeinsamen Signalkaskade nachzuweisen und auch die Wechselwirkungen von SAC1 mit den Gα-Untereinheiten GSA1 und GSA2 zu analysieren, wurde die genetischen Interaktionen der kodierenden Gene untersucht. Dazu wurden die drei Doppelmutanten gsa1 sac1, gsa2 sac1 und gsa3 sac1 und die Dreifachmutante gsa2 gsa3 sac1 erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Die Ergebnisse der Analyse werden im nächsten Kapitel diskutiert. 2.5 Die Adenylatcyclase SAC1 aus S. macrospora ist zusammen mit der Gα- Untereinheit GSA3 an der Regulation der Ascosporenkeimung beteiligt und beeinflusst über die Interaktion mit dem parallelen Signalweg unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 die Bildung von Fruchtkörpern Die Doppelmutante gsa3 sac1 entwickelt im Vergleich mit dem Wildtyp kleinere Perithezien, welche vorwiegend im Festmedium lokalisiert sind. Der Perithezien- Phänotyp der Doppelmutante gleicht somit dem der sac1-mutante (Abb. 23A). Außerdem keimen die Sporen der gsa3 sac1-doppelmutante entsprechend der sac1- Einzelmutante ebenfalls nur selten aus (Daten nicht gezeigt). Da die gsa3-perithezien dem Wildtyp-Phänotyp entsprechen, kann die zuvor aufgrund des Defektes in der 86

94 V. Diskussion Sporenkeimung getroffene Annahme, dass sich sac1 in einem Signalweg unterhalb von gsa3 befindet, bestätigt werden. Kays et al. (2000) konnten durch Western-Analysen mit Proteinextrakten der gna-3 Mutante und cr-1-spezifischen Antikörpern zeigen, dass die α-untereinheit GNA-3 den Proteinlevel der Adenylatcyclase CR-1 aus N. crassa reguliert. Bei S. pombe wurde zudem eine physikalische Interaktion des GSA3- Orthologs GPA2 mit der Adenylatcyclase CYR1 durch Two-Hybrid- und Pull-down- Analysen festgestellt (Ivey und Hoffman 2005). Dies lässt einen konservierten Signalweg vermuten, der nun auch für S. macrospora nachgewiesen werden konnte. Dementsprechend ist in dem in Abbildung 25 dargestellten Signaltransduktionsschema die Adenylatcyclase unterhalb der Gα-Untereinheit GSA3 zu finden. Die gsa2 sac1- Mutante entspricht bezüglich der Perithezien dem Phänotyp von sac1 (Abb. 23A). Da die gsa2-mutante dem Wildtyp gleicht, kann aufgrund dieser Doppelmutante alleine keine Aussage darüber gemacht werden, ob sich GSA2 und SAC1 innerhalb eines Signalweges oder in zwei getrennten Signalwegen befinden. Jedoch kann aufgrund der Arbeit von Jansson (2007) davon ausgegangen werden, dass beide Gene an unterschiedlichen Signalwegen beteiligt sind, da auch die gsa2 gsa3-doppelmutante dem gsa3-phänotyp entspricht. Die Doppelmutante gsa1 sac1 ist zwar in der Lage Protoperithezien zu bilden, jedoch erfolgt keine weitere Differenzierung zu Perithezien (Abb. 23A,B). Da die beiden Einzelmutanten gsa1 und sac1 jeweils Fruchtkörper ausbilden, ist festzustellen, dass die zwei Gene gsa1 und sac1 zwar für sich alleine nicht essentiell für die Fruchtkörperbildung sind, jedoch beide in Kombination für die Weiterdifferenzierung der Protoperithezien nötig sind. Entsprechend der Abbildung 25 ist deshalb davon auszugehen, dass sich GSA1 und SAC1 in getrennten Signalwegen befinden. Durch die Erzeugung und phänotypische Analyse der drei Doppelmutanten gsa1 sac1, gsa2 sac1 und gsa3 sac1 konnte somit das von Jansson (2007) postulierte Modell verifiziert werden, in dem GSA1 und GSA2 in die Kaskade unterhalb der Pheromonrezeptoren involviert sind. Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit die Adenylatcyclase SAC1 ebenfalls in das Modell eingeordnet werden. Dabei ist SAC1 an einer Signalkaskade unterhalb eines bisher unidentifizierten Rezeptors beteiligt und ist epistatisch zur Gα-Untereinheit GSA3. 87

95 V. Diskussion Abb. 25: Putative Signalweiterleitung unterhalb der Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 und eines unidentifizierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Die Pheromonrezeptoren PRE1 und PRE2 sind dunkelgrau als integrale Proteine mit sieben Transmembrandomänen in der Plasmamembran dargestellt. Die extrazellulären Bereiche von PRE1 und PRE2 binden schematisch die rot eingezeichneten Pheromone PPG1 und PPG2. Eine putative Farnesylierung von PPG2 ist durch einen schwarzen, gezackten Appendix gekennzeichnet. Ein bisher unidentifizierter Rezeptor ist mit einem? beschriftet. Blau dargestellt sind die drei Gα-Untereinheiten GSA1-3, von denen GSA1 und GSA3 vermutlich eine Myristoylierung aufweisen, was durch Appendizes angedeutet ist. Die Adenylatcyclase SAC1 ist gelb unterlegt und kann aufgrund der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse unterhalb der GSA3-Untereinheit angeordnet. Ebenso konnte eine Interaktion beider Signaltransduktionswege über GSA1 und SAC1 festgestellt werden, was durch einen Pfeil zwischen beiden Wegen symbolisiert wird. Um die Interaktion beider in Abbildung 25 dargestellten Signalwege besser zu verstehen, wurde die Dreifachmutante gsa2 gsa3 sac1 erzeugt. Die bereits von Jansson (2007) erzeugte Doppelmutante gsa2 gsa3 ist in der Keimung der Ascosporen eingeschränkt, sie bildet aber eine dem Wildtyp entsprechende Anzahl an Fruchtkörpern aus. Die verbleibenden Komponenten gsa1 und sac1 aus beiden Signalwegen sind somit ausreichend für eine Perithezienentwicklung auf Wildtyp- Niveau. Wie der Abbildung 23 A zu entnehmen ist, bildet die Doppelmutante gsa2 gsa3 sac1, welcher zusätzlich noch das sac1-gen fehlt, jedoch nur noch 88