Regulation of Immune Responses in the Central Nervous System: Roles of Major Histocompatibility Complex II Molecules and Dendritic Cells

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1 Diss. ETH No Regulation of Immune Responses in the Central Nervous System: Roles of Major Histocompatibility Complex II Molecules and Dendritic Cells A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by TOBIAS SUTER Dipl. Natw. ETH born July 6 th, 1970 citizen of Freienwil/AG Examiners: Prof. M.E. Schwab, examiner Prof. A. Oxenius, co-examiner Prof. A. Fontana, co-examiner 2003

2 1 1. Zusammenfassung Die Rolle und das Vorkommen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) im normalen und entzündeten zentralen Nervensystem (ZNS) wurden angesichts der Bedeutung von dendritischen Zellen (DC) als Initiatoren und Regulatoren der Immunantwort untersucht. Neu wurde dabei die Technik der Promoter- und somit auch Zell-spezifischen Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II (MHCII) Expressionsanalyse angewandt. Der Klasse II Transaktivator (CIITA) ist der Hauptregulator der MHCII Genexpression. Seine eigene Expression ist durch verschiedene Promotoren gesteuert, welche zu drei verschiedenen, zum Teil Zelltypspezifischen CIITA Transkripten führen (Waldburger et al., 2000). Als ZNS- Entzündungsmodell wurde die murine Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) gewählt. EAE ist ein Modell für immunologische, demyelisierende Krankheiten beim Menschen wie z.b. Multiple Sklerose (MS) (Gold et al., 2000; Hohlfeld and Wekerle, 2001). Im Gegegensatz zu infektiösen ZNS- Krankheitsmodellen, entwickelt sich EAE weniger heftig und endet normalerweise nicht tödlich, was es ermöglicht, das Vorkommen, die Charakteristika und die Rolle der APC zu verschiedenen Zeitpunkten des Entzündungsereignisses zu untersuchen. DC sind im Maus-ZNS praktisch nicht vorhanden. Eine sehr schwache immunohistochemische Färbung von DC-Markern (CD11c, CD205) kann im Plexus Choroideus gefunden werden. Dieses Beobachtung wird unterstützt durch das gleichzeitige Fehlen von MHCII im ZNS Parenchyma sowie allen drei Formen der Maus-CIITA Transkripte im gesamten Hirn-Gewebe. In EAE-immunisierten Mäusen können DC kurz vor dem Einsetzen der klinischen Symptome histologisch detektiert werden. Dies geht einher mit einer starken Induktion der Transkription der CIITA- Form I (DC- und Makrophagen-spezifisch), sowie der Form IV (Interferon (IFN)-γinduziert), nicht aber der Form III (B-Zell-spezifisch) im ZNS. Die Analyse von in vitro kultivierten Maus-Microglia hat gezeigt, dass die in vivo gefundene CIITA-Form I vermutlich nicht von diesen lokalen Gewebsmakrophagen stammt. Letztere produzieren aber die CIITA-Form IV, dies jedoch nur, ähnlich wie Astrozyten, nach Stimulation mit IFN-γ. Die grosse Menge an IFN-γ-induziertem CIITA ist plausibel, da EAE eine T Helferzell-Typ 1-initiierte Krankheit mit entsprechend starker IFN-γ- Produktion ist. Während des Verlaufs dieser Dissertation erwies sich, dass die Regulation von MHCII durch die verschiedenen CIITA-Formen komplexer und vielfältiger ist als ursprünglich mit Zelllinien definiert (Mühlethaler et al., 1997). Beispielsweise zeigte sich, dass die IFN-γ-Induzierbarkeit von CIITA nicht auf Promoter IV beschränkt ist. In Mäusen, denen der CIITA Promotor IV fehlt (piv-ko Mäuse), ist die MHCII- Induktion durch IFN-γ nur in nicht-haematopoietischen Zellen verhindert, z.b. in Astrozyten, Fibroblasten und Epithelzellen, während MHCII in Makrophagen über die CIITA-Form I, welche ein Interferon-Antwort-Element im Promotor trägt, induzierbar bleibt. Obwohl eine starke MHCII-Expression auf in vitro stimulierten Microglia erreicht werden kann, werden in neugeborenen piv-ko Mäusen nach

3 2 Injektion von IFN-γ nur sehr wenige ZNS-Makrophagen MHCII-positiv. Interessanterweise fehlt den piv-ko Mäusen die konstitutive MHCII-Expression auf Thymus-Epithelzellen, was zu einem defekten CD4 + T-Zell Kompartiment führt. Das hat zur Folge, dass die CD4 + T-Zellantwort, wie sie in der EAE vorkommt, ineffektiv ist. Aus diesem Grund treten klinischen Symptome in den piv-ko Mäusen erst 6 Wochen nach der Immunisierung auf, während sie normalerweise schon nach 2-3 Wochen sichbar werden. Die gleiche Verzögerung wurde auch für die Produktion von Antikörpern beobachtet. Der Phänotyp der piv-ko Mäusen lässt vermuten, dass nebst IFN-γ weitere Faktoren die Promotor IV-gesteuerte MHCII-Expression regulieren, z.b. Strukturelemente des umgebenden Gewebes. Die Initiation von EAE durch adoptiven Transfer von Myelin-Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) Peptid-aktivierten T-Zellen hatte den Effekt, dass die klinischen Symptome in piv-ko und normalen Mäusen gleichzeitig einsetzen, was zeigt, dass MHCII-Expression auf nicht-haematogenen Zellen für die Entwicklung von ZNS-Autoimmunität nicht nötig ist. Es wurde festgestellt, dass die Expression der CIITA-Form I während der DC- Reifung reguliert wird. Unreife DC haben einen hohen MHCII-Umsatz und synthetisieren viel CIITA-Form I RNA. Nach einem Kontakt mit Reifungsstimuli wird die RNA-Synthese sehr schnell und stark herabreguliert. Die grosse Menge an CIITA-Form I RNA im EAE-ZNS spricht daher für eine unreife Natur der einwandernden DC. Der unreife Phänotyp wurde auch auf der Stufe der Oberflächenexpression von DC-Reifungsmarkern bestätigt (CD40 lo, CD80 lo, CD86 neg, CD205 neg, MHCII int ). Aus dem EAE-ZNS isolierte DC unterscheiden sich jedoch funktionell völlig von unreifen oder reifen Knochenmarks- oder Milz-DC. Im Gegensatz zu den vorher genannten DC-Typen stimulieren ZNS-DC die allogene oder Antigen-spezifische T-Zell Proliferation nicht, sondern sie inhibieren die von reifen Knochenmarks-DC-stimulierte T-Zell-Proliferation. Die Inhibition ist teilweise auf einen noch nicht identifizierten, löslichen Faktor zurückzuführen. Blockierungsexperimente zeigten, dass Interleukin (IL)-10, Transformierender Wachstumsfaktor (TGF)-β und der Tumor Nekrosis Faktor-α-verwandte, Apoptoseinduzierende Ligand (TRAIL) für den inhibierenden Effekt von ZNS-DC verantwortlich sein könnten. Der inhibierende ZNS-DC Phänotyp wurde in zwei verschiedenen EAE Mausmodellen gefunden (C57Bl6/J immunisiert mit MOG Peptid 35-55, und SJL/J immunisiert mit Proteolipid Protein (PLP) Peptid ), was auf ein generelles, modellunabhängiges Phänomen hindeutet. Es ist noch nicht klar, ob die DC, welche im ZNS gefunden werden, von ZNSbeheimateten Zellen stammen, z.b. Microglia, oder ob sie, angelockt durch Entzündungssignale, ins ZNS einwandern. In vitro kultivierte Microglia beginnen in Gegenwart von Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierendem Faktor (GM- CSF) und IL-4, DC-Marker zu exprimieren. Andererseits exprimieren ex vivo isolierte ZNS-DC CD45 in ähnlich hohen Mengen wie Knochenmarkszellen, und damit deutlich mehr als Microglia. Dies und die intensive meningeale und perivaskuläre

4 3 Ansammlung von DC in EAE, spricht beides für das Konzept von ins ZNS einwandernden DC. Zusammenfassend kann man sagen, dass im normalen ZNS die MHCII- Expression und die Antigen-spezifische Stimulation von patroullierenden T-Zellen marginal sind. Die Microglia und die sehr seltenen ZNS-DC fungieren indessen als Sensoren für mögliche Gefahren. Beim Empfangen eines Gefahrensignals (pathogene Komponenten oder Entzündungssignale von anderen Zellen) regulieren sie ihren Aktivierungsstatus hinauf, was es ihnen erlaubt, spezifische T-Zellen zu restimulieren und im ZNS zurückzuhalten. Der generelle Aktionsmodus von ZNS- DC ist indessen eher immunosuppressiv, wie man in der EAE beobachten kann. Somit helfen die ZNS-DC zu verhindern, dass Autoimmunantworten gegen ZNS- Komponenten gerichtet werden und vermindern das Risiko einer überschiessenden Immunantwort gegen Pathogene, was zu schweren Schäden des ZNS führen würde. 2. Summary The role and occurrence of antigen presenting cells (APC) in the normal and inflamed central nervous system (CNS) were investigated in the light of the emerging role of dendritic cells (DC) in regulating immune responses and with the new tool of promoter- and hence cell type- specific major histocompatibility complex class II (MHCII) expression-analysis. The class II transactivator (CIITA) is a master regulator of MHCII gene expression. Its own expression is directed by different promoters, which are in part cell type-specific (Waldburger et al., 2000). As a CNS inflammation model the murine experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was chosen. EAE is a model for human immune-mediated demyelinating diseases, including Multiple Sclerosis (MS) (Gold et al., 2000; Hohlfeld and Wekerle, 2001). In contrast to infectious disease models, EAE develops less overwhelmingly and in general not fatally therefore allowing to study in a controlled way the occurrence, features and roles of APC at various stages of the inflammatory episode. DC are virtually absent from normal mouse CNS. Very weak immunohistochemical staining for DC markers (CD11c, CD205) can be found in the choroid plexus. This finding is supported by the lack of MHCII staining in the CNS parenchyma and the absence of all three forms of murine CIITA transcripts. In mice immunized for EAE, DC are detected by histology briefly before onset of clinical disease. The appearance of DC in the CNS is accompanied by a strong induction of the transcription of CIITA form I (DC- and macrophage-specific) together with form IV (interferon (IFN)-γ induced) but not form III (B cell-specific). Analysis of in vitro cultivated mouse microglia revealed that CIITA form I is not derived from these resident tissue macrophages. However they produce CIITA form IV RNA but only upon stimulation with IFN-γ similar to astrocytes. The high abundance of IFN-γ

5 4 induced CIITA is plausible since EAE is a T helper type 1 cell-initiated disease with its association of strong IFN-γ production. During the course of the thesis, the regulation of MHCII by the various CIITA forms was found to be more complex and versatile than initially defined with cell lines (Mühlethaler et al., 1997). For instance, IFN-γ inducibility of CIITA was found not to be restricted to promoter IV. In CIITA promoter IV-deficient (piv-ko) mice MHCII-induction by IFN-γ is abolished only in non-haematopoietic cells, e.g. astrocytes, fibroblasts and epithelial cells, while MHCII remains inducible in macrophages via CIITA I which was shown to bear a IFN response element in the promoter. However, although strong MHCII expression may be achieved on in vitro stimulated microglial cells, in vivo only very few CNS macrophages are MHCIIpositive after IFN-γ injection into newborn piv-ko mice. Most interestingly, piv-ko mice lack constitutive MHCII expression on thymic epithelial cells leading to a defective CD4 + T cell compartment. As a consequence, CD4 + T cell responses as occurring in EAE are ineffective: clinical disease in piv-ko ensues only at 6 weeks after immunization in contrast to 2-3 weeks in normal mice. The same time delay was observed for the formation of antibodies. The findings in piv-ko mice speak for additional regulators of MHCII expression directed by promoter IV, e.g. structural elements of the surrounding tissue. Initiating EAE by adoptive transfer of myelinoligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide-activated T cells resulted in simultaneous onset of disease in piv-ko mice and normal littermates indicating that MHCII expression on non-haematogenic cells is not required for CNS autoimmunity. The expression of CIITA form I in DC was found to be maturationally regulated. Immature DC with high MHCII turnover synthesize a lot of CIITA form I RNA while the synthesis is rapidly shut down upon encounter of maturation stimuli. The high amount of CIITA form I RNA in the EAE-CNS therefore speaks in favour of the invading DC being immature. The immature phenotype was observed also at the level of cell surface expression of DC maturation markers (CD40 lo, CD80 lo, CD86 neg, CD205 neg, MHCII int ). Functionally however, DC isolated from the EAE-CNS proved to be completely different from immature or mature bone marrow-derived DC (BM- DC) or splenic DC. In contrast to the aforementioned DC types CNS-DC did not stimulate allogenic or antigen-specific T cell proliferation at all but inhibited T cell stimulation by mature BM-DC. The inhibition was found to rely partly on a yet unidentified soluble factor. Blocking experiments indicated that Interleukin (IL)-10, transforming growth factor (TGF)-β and tumor necrosis factor-α related apoptosisinducing ligand (TRAIL) might play a role in the inhibitory effect of CNS-DC. The inhibitory CNS-DC phenotype was found in two different murine EAE models (C57Bl6/J immunized with MOG peptide 35-55, and SJL/J immunized with proteolipid protein (PLP) peptide ) which points to a model-independent general phenomenon. Whether DC found within the CNS origin from CNS-resident cells e.g. microglia or whether they invade the CNS upon attraction by inflammatory signals is not yet clear. In vitro-cultivated microglia start expressing DC-markers in presence of

6 5 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and IL-4. On the other hand, the fact that ex vivo-isolated CNS-DC express CD45 at the high levels of BMderived cells as compared to the intermediate levels of microglia, and the intense meningeal and perivascular accumulation of DC in EAE favour the concept of CNSinvading DC. In conclusion, in the normal CNS MHCII expression is marginal and so is the antigen-specific stimulation of patrolling T cells. However, microglia and the very rare DC act as sensors for potential threats. Upon reception of a danger signal (pathogen components, or inflammatory signals from other cells) they upregulate their activation status allowing specific T cells to be restimulated and retained within the CNS. The general mode of action of CNS-DC however is likely rather immunosuppressive as seen in EAE. Thereby they help to prevent autoimmune responses directed to CNS-components and overwhelming immune responses against pathogens leading to severe CNS damage.