Untersuchung zur Assoziation der hepatischen Lipase an Lipoproteine in Abhängigkeit des Apo E- Genotyps

Transkript

1 Abteilung für Molekulare Zellbiologie Institut für Medizinische Biochemie und Molekularbiologie Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Prof. Dr. rer. Physiol. Dr. h.c. Ulrike Beisiegel Martinistr. 52, Hamburg Untersuchung zur Assoziation der hepatischen Lipase an Lipoproteine in Abhängigkeit des Apo E- Genotyps Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereiches Medizin der Universität Hamburg Vorgelegt von Mahtab Bazargan aus Teheran Hamburg 2002

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Der Lipoproteinstoffwechsel Die Funktion der Apolipoproteine Der Apo E- Polymorphismus Die Lipasen Die Lipoproteinlipase (LPL) Die Hepatische Lipase (HL) Zielsetzung Material und Methoden Material Chemikalien und Materialien Puffer Geräte Biologisches Material Antikörper Methoden Gelfiltration Bestimmung der Konzentration von Triglyzeriden und Cholesterin Slot Blot und Immundetektion Elektronenmikroskopie HL und LPL Aktivitätsassay Patientenkollektiv Probenaufbreitung Statistik

3 3. Ergebnisse Probanden Auftrennung des Plasmas Verteilung von Cholesterin in den Fraktionen Verteilung der HL, LPL und Apo E auf die Lipoproteinfraktionen Vergleich zwischen Plasmafiltration und Plasmazentrifugation Elektronenmikroskopische Darstellung von Lipoproteinen und HL Aktivitätsbestimmung von LPL und HL der Apo E- Genotypen Diskussion Einfluss von Heparin auf die HL Auswirkung der Probenbehandlung auf die HL- Intensität FPLC als die Methode der Wahl zur Auftrennung von Lipoproteinen Zuordnung der Lipoproteinklassen zu Elutionsfraktionen Auswirkung der Nachweismethode auf die HL- Detektion Verteilung der HL auf Lipoproteine Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungen

4 1. Einleitung Der seit Jahren zu beobachtende stetige Anstieg der Sterbefälle durch Krankheiten des Herzkreislaufsystems geht vor allem auf eine Zunahme der sogenannten koronaren Herzkrankheiten (KHK), insbesondere des Herzinfarktes, zurück. Durch Langzeitstudien konnte ein Zusammenhang zwischen der Manifestation der arteriosklerotischen Herz- Kreislauf- Erkrankung und dem Vorliegen bestimmter Risikofaktoren gesichert werden. Die Hyper- und Dyslipoproteinämie ist als Risikofaktor erster Ordnung für die KHK schon lange bekannt. Die Beziehung zwischen erhöhtem Cholesterin im Serum und dem Risiko einer KHK ist so eindeutig gesichert, daß man zumindest für das LDL- Cholesterin von einer kausalen Beziehung sprechen muß (Steinberg 1989). Da eine Hypercholesterinämie nicht schmerzhaft ist, hat die Früherkennung besondere Bedeutung bei der Vorbeugung der KHK. Die Bewertung und pathobiochemische Einordnung der Lipid- Risikofaktoren erfordern vom Arzt eine fundierte Kenntnis des Lipid- und Lipoproteinstoffwechsels Der Lipoproteinstoffwechsel Lipide sind in der Ernährung des Menschen von großer Bedeutung. Als Triglyzeride stellen sie einen wichtigen Energieträger und Reservestoff dar. Phospholipide, Glykolipide und Cholesterin sind Hauptbestandteile der biologischen Membran. Cholesterin ist zugleich Ausgangsstoff für die Synthese der Gallensäuren, der Steroidhormone und des Vitamin D. Fast alle Lipide können im menschlichen Organismus selbst synthetisiert werden, nur die mehrfach ungesättigten Fettsäuren müssen als essentieller Nahrungsbestandteil zugeführt werden. Lipide sind niedermolekulare, wasserunlösliche Kohlenwasserstoffketten, die aliphatisch oder ringförmig angeordnet sein können. Die hauptsächlich im menschlichen Blut vorkommenden wasserunlöslichen Lipide sind Phospholipide, Triglyzeride, fettlösliche Vitamine und Cholesterin. Sie werden im Blut in Form von Lipoproteinen transportiert (Havel et al 1980). Diese hochmolekularen, 4

5 pseudomicellären Komplexe enthalten neben den Lipiden sogenannte Apolipoproteine, die durch ihren amphiphilen Charakter der wesentliche strukturgebende Bestandteil der Lipoproteine sind. Der lipophile Kern dieser Partikel besteht überwiegend aus Triglyzeriden und Cholesterinestern, die Hülle wird gebildet aus dem hydrophilen Bereich der Apolipoproteine und den hydrophilen Gruppen der Phospholipide und des Cholesterins. Apolipoproteine haben neben der Vermittlung von Transportprozessen von Lipiden im Organismus andere wichtige Funktionen innerhalb des Lipidstoffwechsels. Sie regulieren als Co-Faktoren die Aktivität von Enzymen, z.b. der endothelständigen Lipoproteinlipase (LPL), und dienen als Liganden für spezifische Rezeptoren, die die zelluläre Aufnahme steuern (Havel et al 1989). Im Plasmalipidstoffwechsel werden das exogene, das endogene und das reverse Cholesterintransportsystem unterschieden (Brown et al. 1986). Der exogene Stoffwechselweg beschreibt den Metabolismus der Nahrungslipide und ihren Transport vom Darm zur Leber. Nach der Resorption werden die Lipide in der Mukosa des Dünndarms mit Apolipoproteinen, vor allem Apo B-48, assoziiert und als Chylomikronen über den Ductuc thoracicus unter Umgehung der Leber in den venösen Kreislauf abgegeben. Ihr Triglyzeridanteil wird in Fett- und Muskelgewebe durch die endothelständige LPL hydrolytisch abgespalten. Das Apo C-II dient dabei als Aktivator der LPL. Die entstehenden Abbauprodukte (Chylomikronen- remnants), die reich an Cholesterinestern sind, besitzen neben dem verbleibenden Strukturprotein Apo B-48 hauptsächlich Apo E. Sie werden über einen Chylomikronen-remnants-Rezeptor in die Leberzellen aufgenommen. Der endogene Stoffwechselweg beschreibt den Metabolismus der Lipide hepatischen Ursprungs. Die Leber produziert Lipoproteine mit sehr geringer Dichte, VLDL, die Apolipoproteine Apo B-100, Apo E und Apo C enthalten. Sie werden in der Blutbahn über Lipoproteine intermediärer Dichte, IDL, zu Lipoproteinen geringer Dichte, LDL, umgebaut, wobei als Apolipoprotein im wesentlichen nur Apo B-100 erhalten bleibt. Am Abbau der IDL zu LDL ist mit großer Wahrscheinlichkeit die hepatische Lipase (HL) beteiligt (Grundy et al, 1990). Die LDL, die hauptsächlich Cholesterin transportieren, werden von allen Körperzellen über rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen. Die Leber spielt für den LDL- Abbau die größte Rolle (Dietschy et al, 1983). Durch den reversen Cholesterintransport wird Cholesterin aus der Peripherie zur 5

6 Leber transportiert, wobei die sehr dichten Lipoproteine (HDL) eine Schlüsselstellung einnehmen. Leber und Dünndarm synthetisieren diskoidale HDL, die von den peripheren Zellen freies Cholesterin aufnehmen, das durch die Lecithin- Cholesterin- Acyl- Transferase (LCAT) verestert wird. Cholesterinbeladene HDL reichern Apo E an und gelangen als HDL mit Apo E zur Leber. Ein Teil des veresterten Cholesterins wird unter Vermittlung von Cholesterinester- Transfer- Proteinen auf Apo B enthaltende Lipoproteine übertragen, um über LDL in die Leber oder erneut in periphere Gewebe zu gelangen. Verschiedene Störungen des Lipoproteinstoffwechsels können zu einer Hypercholesterinämie und damit zu der Entwicklung von Atherosklerose führen. Als bekannteste ist die familiäre Hypercholesterinämie zu nennen, bei der es aufgrund des LDL- Rezeptordefektes zu einer Anhäufung dieser Lipoproteine im Blut, verbunden mit stark erhöhten Cholesterinwerten, kommt. Patienten mit der homozygoten Form dieser Hypercholesterinämie beginnen bereits in den ersten10 Lebensjahren an koronarer Herzkrankheit zu leiden Die Funktion der Apolipoproteine Apolipoproteine dienen der Stabilisierung und dem Transport von Lipidemulsionen und sind bestimmend für deren Stoffwechsel. Ohne Apolipoproteine können Lipide weder aus der Zelle sezerniert werden noch ist eine effiziente Aufnahme in Zellen bzw. Organe möglich. Darüber hinaus sind Apolipoproteine Co- Faktoren für Enzyme, die den Lipidanteil der Lipoproteine umsetzen. Apo A-I ist ein Strukturprotein der HDL und gilt als Aktivator der Lecithin- Cholesterin- Acyltransferase, die für die Bildung von Cholesterinester obligat ist. Apo A-II scheint die hepatische Lipase zu aktivieren, es bleibt jedoch zu klären, ob dieser Effekt spezifisch ist. Apo A-IV spielt im Metabolismus triglyceridreicher Lipoproteine und der HDL eine entscheidende Rolle. Apo B-100 ist das einzige Apolipoprotein der LDL. Es bindet an den B/E- Rezeptor und ist für die Sekretion von Triglyzeride und Cholesterin aus der Leber und Dünndarm verantwortlich. Apo B-48 ist für die Resorption von Lipiden und lipidlöslichen Vitamine aus der Nahrung verantwortlich. 6

7 1.3. Apo E- Polymorphismus Das Apo E ist ein Arginin- reiches Protein, das mehrere Funktionen im Stoffwechsel der Lipoproteine aufweist: Es vermittelt die Aufnahme von Chylomikronen- Remants in die Leber und ist für den Abbau von VLDL- Remants und deren Umwandlung zu LDL verantwortlich. Im Plasma findet man Apo E in mehreren Isoformen. Die drei Hauptisoformen des Apo E beim Menschen, E 2, E 3 und E 4, werden durch drei verschiedene Allele eines Genlocus kodiert. Die drei Allelen werden codominant vererbt. Damit lassen sich drei Homozygote ( E 2/2, E 3/3, E 4/4) und drei Heterozygote (E 2/3, E 4/2, E 3/4) Phänotypen unterscheiden. Die sechs Phänotypen treten unterschiedlich häufig auf ; Phänotyp Häufigkeit (%) E 3/3 60 E 3/4 22 E 2/3 12 E 4/4 3 E 2/4 2 E 2/2 1 Das Apo E 4 unterscheidet sich von dem Apo E 3 durch einen Austausch des Cystein-112 gegen Arginin, und trägt damit eine positive Ladung mehr. Beim Apo E 2 hat gegenüber dem Apo E 3 ein Austausch des Arginin-158 gegen Cystein stattgefunden, so dass eine positive Ladung weniger vorliegt (Utermann et al 1977). Dieser Austausch einer Aminosäure in der Nähe der Bindungsstelle führt zu einer deutlich verminderten Bindungsaktivität des Apo E 2 an der LDL- Rezeptor, während zwischen der Affinität des Apo E 3 und Apo E 4 kein wesentlicher Unterschied besteht (Schneider et al 1981). Der Grund der verminderten Affinität des Apo E 2 liegt vermutlich in einer veränderten Konformation der Bindungsregion (Innerrity et al 1984). Der Apo E- Polymorphismus beeinflusst sowohl den exogenen als auch den endogenen Cholesterintransport. In Vivo werden Chylomikronen- und VLDL- Remnants, die Apo E 2 enthalten, aufgrund der schlechteren Bindung von Apo E 2 7

8 an LDL- Rezeptor und Chylomikronen- Remnants verzögert abgebaut. Die Konzentration der Remnants steigt daher bei Apo E 2/2 Homozygoten im Blut an, die Konzentration der LDL ist eher niedrig, da nämlich einerseits weniger Remnants in LDL umgewandelt und andererseits durch verminderten Einstrom von Cholesterin in die Leberzelle die LDL- Rezeptoren hochreguliert werden. Aus diesem Grund wird dem Apo E 2/2 Allel ein kardioprotektiver Effekt zugeschrieben. Allerdings entwickelt ein geringer Teil der Apo E 2/2 Homozygoten eine Typ- III- Hyperlipoproteinämie nach Friedrickson, wobei der zusätzliche pathogenetische Faktor, der die Hyperlipoproteinämie Typ- III bedingt, noch nicht bekannt ist. Klinisch fällt diese Stoffwechselstörung meist erst im Erwachsenenalter auf. Neben der zum Teil massiven Erhöhung von Cholesterin und Triglyzeride im Plasma treten bei den Patienten Xanthome verschiedenen Ausprägung auf. Auffällig sind Palmarxanthome, die bei Diagnosestellung bei jedem zweiten Erkrankten festzustellen sind, und welche bis heute nicht im Zusammenhang mit anderen Erkrankungen beschrieben wurden. Die Inzidenz von peripherer Artherosklerose und Koronarsklerose ist bei diesen Patientenkollektiv hoch. Das Apo E 4/4 hat ein umgekehrten Effekt auf den Lipoproteinstoffwechsel, es ist mit hohem LDL- Cholesterin assoziiert. Obwohl in Vitro Apo E 3 und Apo E 4 die gleiche Affinität zum LDL- Rezeptor aufweisen, wird in Vivo Apo E 4 deutlich schneller abgebaut. Man nimmt an daß dies auf eine unterschiedliche Verteilung der Apo E Isoformen auf die Lipoproteinklassen zurückzuführen ist. Apo E 4 hat eine höhere Affinität für Triglyzerin- reiche Lipoproteine, während Apo E 2 bevorzugt mit HDL assoziiert wird. Zur Bestimmung des Phänotyps werden die Apo E Genotypen aufgrund ihrer unterschiedliche Nettoladung durch isoelektrische Fokussierung aufgetrennt, auf Nitrocellulose geblottet und immunologisch dargestellt. Im Plasma findet man neben genetisch determinierten Isoformen zusätzliche Banden, die dadurch entstehen, daß jede Isoform eine variable Zahl an Neuraminsäureresten trägt, zusätzliche negative Ladungen in das Molekül einführen. 8

9 1.4. Die Lipasen Ausgangspunkt der Fettverwertung zur Energiegewinnung ist die Hydrolyse der Triglyzeride durch die Lipasen. Die Lipoproteinlipase (LPL) bildet mit der Hepatische Lipase (HL) und der Pankreaslipase die Gruppe der neutralen Lipasen (Hide et al 1992). Die drei Lipasen haben eine ähnliche Funktion im Stoffwechsel, der Wirkort ist jedoch unterschiedlich. Während die LPL für die Hydrolyse von VLDL und Chylomikronen verantwortlich ist, katalysiert die HL die Hydrolyse von Triglyzeriden des Intermediate Density Lipoproteins (IDL) unter Bildung der Low Density Lipoproteine (LDL) und die Hydrolyse von Triglyzeriden und Phospholipiden der HDL ( Datta et al.1988). Im Vergleich zwischen LPL und HL konnte gezeigt werden, daß die beiden Enzyme Triglyzeride hydrolysieren und daß die HL darüber hinaus eine 2- bis 3-fach höhere Affinität gegenüber Phospholipiden aufweist (Deckelbaum et al. 1992). Die Pankreaslipase ist hauptsächlich involviert in die direkte Lipolyse der Nahrungsfette und wird von der Bauchspeicheldrüse sezeniert. Vergleicht man die Aminosäuresequenz innerhalb der Lipasefamilie, zeigt sich eine hohe Strukturhomologie (Hide et al. 1992). Man nimmt an, daß sie im Laufe der Evolution durch Genduplikation entstanden sind und den speziellen Anforderung angepaßt wurden Die Lipoproteinlipase (LPL) Die LPL ist eine Acylglycerol- und Phosphatidhydrolase und ein multifunktionelles Enzym und ein Schlüsselenzym des Lipoproteinstoffwechsels (Olivecrona et al. 1971). Ihre Funktion besteht in der hydrolytischen Spaltung von Triglyzeriden aus Chylomikronen und VLDL (Olivecrona et al. 1984) und der Bindungsvermittlung von Lipoproteinen an deren Rezeptoren (Beisiegel et al. 1991). Der Wirkort der LPL ist das vaskuläre Endothel, wo sie an Heparinsulfat gebunden ist. Die LPL wird in verschiedenen Geweben synthetisieren. Die mrna für LPL konnte durch in- situ- Hybridisierung in Adipozyten, Myozyten, epithelialen, intestinalen und anderen Zellen nachgewiesen werden. Die wichtigsten Syntheseorte sind Fettgewebe, Herz und Muskulatur. Die adulte Leberzelle synthetisiert im Gegensatz zur neonatalen Leberzelle keine LPL (Peinado-Onsurbe et al.1992). Das vaskuläre Endothel produziert keine LPL, so daß die LPL von ihrem Syntheseort zu ihrem Wirkungsort wandern muss (Camps et al. 1990). 9

10 Die LPL wird als inaktives Proenzym im endoplasmatischen Retikulum gebildet und im Golgiapparat glykosyliert. In ihrer aktiven Form wird die LPL als Homodimer (Iverius et al. 1976) in den interstitiellen Raum sezerniert. Von dort muss die LPL durch die Endothelzellen zu deren luminaler Seite transportiert werden. Es wird angenommen, dass das Enzym durch einen rezeptorabhängigen Prozess in die Zelle aufgenommen wird, die Endothelzelle in einem Vesikel durchwandert und zur luminalen Seite sezeniert wird ( Saxena et al. 1989). Der Proteinanteil des Enyzms besteht aus 448 Aminosäuren (Wion et al. 1987) und besitzt eine Molekularmasse von 50 kda ( Olivecrona et al. 1971). Der Kohlenhydratanteil bildet 8% der Molekularmasse (Iverius et al. 1985) und hat eine entscheidende Bedeutung für die Sekretion und katalytische Aktivität der LPL (Wang- Iverson et al. 1980). Der isoelektrische Punkt liegt bei ph 8.9 (Yang CZ et al. 1989). Das Maximum ihrer enzymatischen Aktivität liegt zwischen ph 8.0 und 8.5. Salzkonzentrationen größer als 1M Nacl inhibieren ihre katalytische Aktivität (Olivecrona et al.1971). Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass die entscheidende Region für die Lipidbindung auf dem C- terminalen Ende der LPL zu liegen scheint (Lookene et al. 1993, Williams et al. 1994). Die LPL besitzt zusätzlich zu Apo C-II (Clarke et al.1983) auch eine Heparinbindungsstelle (Yang et al.1989), mit welcher sie an Proteoglykane der Endothelzelle binden kann. Es wird angenommen, dass die Bindungsstelle durch elektrostatische Anziehungskräfte entsteht (Bengtsson-Olivecrona et al. 1985), die genaue Lokalisation der Bindungsstelle ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Bindungsstärke ist von dem Anteil der Sulfateinheiten an den Proteoglykanen und somit deren Ladungsdichte abhängig (Olivecrona et al.1987). Die Bindung der LPL an die triglyzeridreiche Lipoprpteine ist essentiell für ihre Funktion als Enzym und Rezeptorligand. Die Faktoren, die zu der Assoziation der triglyzeridreiche Lipoproteine mit der endothelständigen LPL führen, sind unzureichend bekannt. In Anlehnung an die Sequenz der Pankreaslipase, für welche die Lipidbindungsstelle bekannt ist, vermutete man zunächst, dass die Region von Asp 125 bis Gly 144 entscheiden sei (Wion et al. 1987). Bei der Aufklärung der Tertiärstruktur der Pankreaslipase zeigte sich jedoch, dass die analoge hydrophobe Region der LPL in einer Tasche im Bereich des aktiven Zentrums verborgen liegt (Winkler et al. 1990). Die Anlagerung der negativ geladenen Aminosäuren des C- terminalen Endes des 10

11 Apo CII an die positiv geladene Bindungsstelle der LPL führt zwar zu deren Aktivierung (Garfikel et al. 1987, Hide et al. 1992), trägt vermutlich jedoch nicht zur Bindung bei. Es konnte auch gezeigt werden, daß die Anreicherung von triglyzeridreiche Lipoproteine mit einem physiologisch zusammengesetzen Gemisch von Apo CII und Apo CIII die Affinität für LPL herabsetzt ( van Barlingen et al.1996). Bei Injektion von Heparin bilden sich Komplexe aus LPL und Heparin, was zur Lösung der Bindung zwischen LPL und Proteoglykanen und somit zu einer Freisetzung der Lipase in der Blutstrom führt. Eine Reihe von Arbeitsgruppen haben gezeigt, daß die Zugabe von Heparin zu einer deutlichen Verminderung der LPL- Bindung an die Zelloberflächen führt ( Cheng et al.1981, Wang-Iverson et al. 1980). In humanem Plasma ist eine niedrige basale LPL Aktivität von 0,3-1 mu/ml meßbar, die weniger als 1% der nach Injektion von Heparin gemessene Aktivität von mu/ml (Peterson et al. 1985) beträgt, von der man annimmt, dass sie das gesamte am Endothel gebundene LPL repräsentiert. Die Feststellung, daß nach der Injektion von Heparin die gesamte im Kreislauf befindliche Menge von LPL freigesetzt wird, wird dei der Bestimmung der Gesamtaktivität und Gesamtmasse der LPL zur Differenzialdiagnostik bei der Patienten mit Fettstoffwechselstörung benutzt. In dieser Arbeit diente die Tatsache, daß das Postheparinplasma wesentlich mehr LPL enthält als Präheparin- Plasma, als Kontrolle bei der Untersuchung der Assoziation von HL mit Lipoproteinen Die Hepatische Lipase (HL) Die HL ist ein lipolytisches Enzym mit einer molekularen Masse von 66 kda, dessen Hauptsyntheseort die Leber ist. Nach ihrer Sekretion wird sie durch Proteoglykane an die Oberfläche der Hepatozyten und des Endothels gebunden. Die HL wirkt als Acylglycerolhydrolase und als Phospholipase, und spaltet dabei sowohl Triglyzeride in Chylomikronen-Remnants, IDL und HDL als auch Phospholipide in HDL 2. Die HL beeinflußt möglicherweise auch den reversen Cholesteroltransport und beschleunigt den Cholesteroltransfer zu den steroidbildenden Geweben wie den Nebennieren und den Ovarien. Im Gegensatz zur LPL wird die HL durch 1 M NaCl aktiviert und benötigt für ihre Aktivität keinen Kofaktor. Außerdem besitzt die HL eine stärkere Aktivität für Phospholipide als die LPL. 11

12 Die Rolle der HL im Lipoproteinstoffwechsel kann in eine lipolytische und eine nicht lipolytische unterteilt werden. Studien, in denen ein funktioneller Defekt der HL in Tiermodellen induziert wurde, weisen auf eine lipolytische Rolle der HL im VLDL, IDL, HDL und Remnant- Stoffwechsel hin (Kussi et al. 1979, Goldberg et al.1982 und Sultan et al.1990). Dazu passend sind die klinischen Befunde bei HL- defizienten Patienten, die Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie sowie erhöhte VLDL- Remnants, LDL und HDL aufweisen (Breckenridge et al.1982, Carlson et al. 1986, Auwerx et al. 1990). Neuere In- Vitro- Studien weisen auf eine zusätzliche, nicht lipolytische Funktion im zellulären Lipidstoffwechsel hin. Die HL könnte als Ligand dienen, der die Interaktion von Lipoproteinen mit Zelloberflächenrezeptoren erleichtert. In Experimenten an Zellkulturen konnte gezeigt werden, daß die HL die Aufnahme von verschiedenen Lipoproteinen steigert (Krapp et al. 1996, Ji Z-S et al. 1994). Verschiedene Studien haben auf eine protektive Rolle der HL bei der Arteriosklerose hingewiesen. Es wurde gezeigt, daß die Aktivität der HL bei den Heterozygoten für Cholesterinester- Transferprotein- Defekt mit den kardiovaskulären Erkrankungen signifikant niedriger als in der Normalbevölkerung ist (Hirano et al.1995). Zugleich ist die Aktivität der HL im Postheparin- Plasma bei den Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen mit normalen Lipidwerten deutlich reduziert (Groot et al. 1991). Bei den homozygoten Patienten mit familiären Hypercholesterinämien ist der Grad der Kalzifizierung bei der Arterioskerose mit der Aktivität der HL invers korreliert (Dugi et al. 1997). Die Mutation des Promotors der HL an der Position 480 ist mit Aktivitätsabnahme der HL bei den Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert (Jansen et al 1997). Auf eine mögliche pro- atherogene Rolle der HL weist der Effekt des Enzyms auf das Plasmalipoprotein- Profil, besonders des HDL, hin. Entsprechend der Funktion der HL beim Abbau von HDL- Phospholipiden und- Triglyzeriden ist ihre Aktivität invers korreliert mit den HDL- Cholesterol- Werten (Jackson et al.1990, Blades et al 1993). Da zahlreiche epidemiologische Untersuchungen einen Zusammenhang zwischen niedrigen HDL- Werten und dem Risiko der Arteriosklerose gezeigt haben, könnte die HL auf diese Weise die Entstehung von Gefäßverkalkung fördern. 12

13 1.5. Zielsetzung dieser Arbeit HL, LPL und Apo E spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Lipoproteine. Defekte bzw. funktionelle Störungen des Apo E und der LPL resultieren in einer Akumulation von Chylomikronen oder VLDL- Remnants, was zur Entstehung von Atherosklerose führen kann. Der genetische Polymorphismus des Apo E beeinflusst ebenfalls den Fettstoffwechsel. Während Apo E 4 eine höhere Affinität für triglyzeridreiche Lipoproteine aufweist, assoziiert Apo E 2 bevorzugt mit HDL. Die Rolle der HL bei der Entstehung der Atherosklerose wird kontrovers diskutiert. Einige Studien haben auf eine protektive Rolle der HL hingewiesen. Unter anderem ist die HL- Aktivität im Postheparin- Plasma von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen mit normalen Lipidwerten deutlich reduziert. Andere Untersuchungen haben jedoch eine inverse Korrelation zwischen HL- und HDL- Konzentration gezeigt, was auf eine pro- atherogene Rolle schließen lässt. Ein Ziel dieser Arbeit war, das Plasma von Probanden mit unterschiedlicher Apo E Homozygotie auf eine mögliche Assoziation der HL an Lipoproteine in Abhängigkeit des Apo E- Genotyps zu untersuchen. Damit sollten Rückschlüsse auf den Einfluss des Apo E- Polymorphismus auf den Lipidstoffwechsel erzielt werden. Es ist denkbar, dass die HL bei den verschiedenen Apo E- Isotypen eine unterschiedliche Affinität gegenüber den Lipoproteinen vorweist. Diese Hypothese könnte eine Erklärung für das unterschiedliche Stoffwechselverhalten der verschiedenen Apo E- Isotypen geben. Zweites Ziel dieser Arbeit war, die Aktivität der HL und der LPL bei den verschiedenen Apo E- Genotypen zu bestimmen, um eine mögliche Korrelation der Abnahme der HL- Aktivität mit bestimmten Apo E- Isotypen zu finden. Eine Aktivitätsabnahme der HL bei Apo E 4 könnte die hohen Lipidwerte dieses Geotyps erklären. 13

14 2. Material und Methoden 2.1. Material Chemikalien und Materialien Aceton (Merck), BSA Rinderserumalbumin (Sigma), CNBR- aktivierte Sepharose (Pharmacia), 4-Chloro-1-Naphol 30 mg Tab. (Sigma), Diethylbarbitursäure (Merck 276), Diethylbarbitursäure Natriumsalz (Merck 6318), Dodecylsulfat NA-Salz (Meck 9), ECL- Reagenz (Amersham), Eisessig (Merck), Ethanol (Merck), Röntgenfilm (Kodak), Filmkammer (Rego), Filter 0.45µm (Minisart NML, Satorius), Filterpapier (Schleicher und Schuell), glycerol tri [ 1 14 C] Oleat ( Amersham, Arlington Heigts), Glyzerin (Merck), Heparin (Sigma H-7005), 7 ml Heparin- Lithium- Röhchen (Beckton Dickson), Methanol (Merck), Monovette 9 ml EDTA (Sarstedt), Nitrocellulose 0,45 µm (Schleicher & Schuell), Ponceau Lösung (Serva), Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia LKB, Schweden), Testkid (Firma Boehringer Mannheim), Tetrahydrolipstatin (THL, Orlistat, Hoffmann La Roche), Tris- HCL (Roth), Tween 20 (Merck), Wasserstoffperoxid 30% (Merck) Puffer PBS 2.7 mm KCL, 1.5 mm KH2PO4, 137 mm NACL, 8.1 mm NA2HPO4 Puffer A 10 mm Tris-CL, 154 mm NACL, 1.5 mm EDTA, ph 8.6 Puffer B 10 mm Tris-Cl, 140 mm NACL, 1 mm EDTA, ph Geräte Blotting- Kammer (Biorad) Elektrophoresekammer für SDS- Polyacrylamidgel (Desaga) Fast Protein Liquid Chromatograph ; FPLC (Phrmacia, Schweden) FPLC-Säule Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia, Schweden ) Kettenphotometer (Eppendorf) Laborzentrifuge Rotanda für Plasmazentrifügation (Hettich) Slot- Blot, Mehrfachfiltrationsgerät für Mikroproben (Schleicher Schuell) Sterile Filter (Sartorius) Transmissions- Elektronenmikroskop 14

15 2.3. Biologisches Material 1. Lipoprotein Lipase: Prof. G Olivecerona, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, University Umea, Schweden. 2. Hepatische Lipase: s.o 3. Apo E: isoliert aus humanem Plasma, Labor Prof. U Beisiegel 2.4. Antikörper Anti HL (erster Antikörper); polykolonaler Antikörper aus Kaninchen, Verdünnung 1;1000 (Prof. Hans Will, Heinrich- Pette- Institut Hamburg). Anti ApoE (erster Antikörper); polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, Verdünnung 1: 5000 (Firma Dianova). Anti LPL (erster Antikörper); monokolonaler Antikörper aus Maus, Verdünnung 1:250 ( J.D. Brunzell Seattle, USA). GARPO (goat anti rabbit peroxidase, zweiter Antikörper); polyklonaler Ziegenantikörper gegen Kaninchen IgG, Verdünnung 1; 4000 (Firma Dianova). GAMPO (goat anti mouse peroxidase, zweiter Antikörper); monoklonaler Ziegenantikörper gegen Maus IgG, Verdünnung 1; 5000 (Firma Dianova). Protein A- Gold Antikörper; monokolonaler Antikörper gegen Maus mit 6 und 12 nm Goldmarkierung (Firma Dianova). Colloidal gold anti mouse IgG; polykolonaler Antikörper mit 10 nm Goldmarkierung (Firma Polysciences) 15

16 2.5 Methoden Gelfiltration Lipoproteine können mittels der Gelfiltration nach ihrer Größe getrennt werden. Mit Hilfe einer Präzisionpumpe, FPLC (Fast Protein Fluid Chromatograph), werden die Plasmaproben einzeln unter konstantem Druck und mit konstantem Flußvolumen zusammen mit einem Puffer über eine Gelfiltrationssäule gepumpt. Die Gelfiltrationssäule enthält ein Medium auf Agarosebasis, welches eine definierte Porengröße besitzt. Kleine Lipoproteine können in die Poren eindringen, große nicht. Folglich verteilen sich kleine lipoproteine sowohl innerhalb als auch zwischen der Poren und wandern somit relativ langsam durch das Gel, wohingegen große Lipoproteine zwischen der Poren beschränkt bleiben und die Säul schneller passieren. Somit befinden sich die große Lipoproteine in früheren Fraktionen, wogegen die kleine Lipoproteine in späteren Fraktionen vorkommen. Die gesamten Gelfiltrationsexperimente in dieser Arbeit wurden mit der FPLC durchgeführt. Die Superose 6 HR Säule wurde vor Gebrauch mit 7.5 µl Ferritin, 40 µl Albumin, 40 µl Cytochrom- C kalibriert. Die Kalibrierung dient zur genauen Einteilung der Fraktionen entsprechend der Lipoproteinfraktionen. Nach dieser Kallibrierung ist zu entnehmen, daß sich in Fraktionen VLDL, in Fraktionen LDL, und in die Fraktionen HDL befindet. Vor jedem Plasmaauftrag wurde die FPLC und die zu- bzw. abführenden Schläuche mit PBS Puffer gewaschen, bis eine Nulllinie erschien, welche die Reinheit der Säule anzeigte. Danach wurden die Plasmaproben in einen 200 µl Probenschlauch eingefüllt und die FPLC gestartet. Die Flussgeschwindigkeit betrug 0.5 ml/min, in jeder Fraktion wurde 500 µl gesammelt Bestimmung der Konzentration von Triglyzeriden und Cholesterin Bezüglich der Frage, welche Lipoproteine sich in welchen Fraktionen befinden, wurden die einzelnen Fraktionen auf ihre Triglyzerid- und Cholesterin- Konzentrationen untersucht. Diese Versuche wurden mit Hilfe eines enzymatischen Farbtests (Testkit) der Firma Boehringer Mannheim durchgeführt. Cholesterinbestimmungskit MPR2 CHOD- PAP- Methode Triglyzeridbestimmungskit MPR2 CPO- PAP- Methode 16

17 Slot- Blot und Immundetektion Für die Immundetektion wurde als immunologische Technik das Slot- Blotting- Verfahren ausgewählt. Dabei werden die zu untersuchenden Proteine auf ein Gitter aufgetragen und über Vakuum auf die an der Unterseite des Gitters befestigte Membran gesaugt, wodurch sie für die Reaktion mit dem anschließend zugegebenen spezifischen Antikörpern leichter zugänglich werden. Mit Hilfe dieser Methode können viele Proben gleichzeitig getestet und quantifiziert werden. Wir haben nach der Gelfiltration 100 µl der gewonnenen Fraktionen einzeln in die Slot- Blot- Kammern auf Nitrocellulose pipettiert. Mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe wurde die Einziehung beschleunigt. Nach der Proteindetektion mit Ponceau- Lösung wurden die Nitrocellulosen wieder mit PBS entfärbt und eine Stunde in Blocking- Puffer inkubiert. Die Detektion der LPL, HL, Apo E erfolgte mit den bereits erwähnten Antikörpern (Abschnitt 2.4). Die eingesetzten Antikörperkonzentrationen wurden antikörperspezifisch gewählt (Abschnitt 2.4). Die Inkubation erfolgte während einer Stunde bei Raumtemperatur. Die Nitrocellulosen wurden in vier Schritten auf dem Schüttler gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. (Waschvorgang: 1 min. Puffer A, 2 mal 10 min. Puffer B, 1 min Puffer A). Zur Detektion der gebundenen Anti- LPL- Antikörper wurde GAMPO, zur Detektion der gebundenen Anti-HL/Anti- Apo E GARPO als zweiter Antikörper in einer Verdünnung von 1:5000 mit 5% BSA in Puffer A für eine Stunde bei Raumtemperatur eingesetzt. Danach wurde der Waschvorgang wiederholt. Daraufhin wurde die Darstellung der Immunreaktion mittels ECL- Reagenz durchgeführt. Hierzu wurden die Nitrocellulosen mit den kurz zuvor zusammengeführten ECL- Reagenz 1 und 2 benetzt, nach einer Minute Einwirkungszeit getrocknet und dann in eine Filmkammer gelegt. In der Dunkelkammer wurde ein Film zur Bandendarstellung für 10, 30, und 60 Sekunden aufgelegt und entwickelt Elektronenmikroskopie Die mit Formvar beschichteten Kupfernetzchen wurden für 5 Minuten auf einem Tropfen ausgewählter Fraktionen nach der Gelfiltration inkubiert. Überschüssige Flüssigkeit wurde danach mit einem Filterpapier vorsichtig abgesaugt. Unspezifische Reaktionen bei der anschließenden Immunmarkierung wurden durch Inkubation der Netzchen auf einem Tropfen 1% BSA/PBS verhindert. Anschließend wurden die ersten Antikörper auf die Netzchen aufgetragen. Die Reaktion der ersten AK erfolgte 17

18 für eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach wurden die Netzchen gründlich auf 5 Tropfen 1% BSA/PBS gewaschen und für 30 Minuten auf einem Tropfen mit dem zweiten AK inkubiert. Die an den Zweiten AK gekoppelten Goldpartikel hatten verschiedene Durchmesser. Die Netzchen wurden anschließend gründlich auf 6 Tropfen 1% BSA/PBS und 5 Tropfen Wasser gewaschen und mit 2% Phosphorwolframsäure negativ kontrastiert. Nach dem Trocknen konnten die Proben im Transmissionselektronenmikroskop untersucht werden HL und LPL Aktivitätsassay Die lipolytische Aktivität der LPL und HL wurde nach der Methode, wie von Iverius et al für LPL beschrieben, gemessen. Die Postheparin- Plasmen wurden nach der Filtration mit 0.45 µm Filter für 60 Minuten bei 37 C mit einem Glycerol- tri- [1 14 C] Oleat- und Lecitinhaltigen Substrat inkubiert. Dann wurden die radioaktiven freien Fettsäuren extrahiert und die Aktivität gemessen. Die Lipasenaktivitäten werden in Nanomol freie Fettsäure, die pro Minute und Milliliter freigesetzt werden, angegeben (nmol/min/ml). Separate Bestimmung für die Aktivität von LPL und HL wurden mittels Hemmung der LPL- bzw. HL- Aktivität durch Inkubation der Proben mit Anti- LPL-Antikörper bzw. Anti- HL- Antikörper durchgeführt (Babirak et al. 1989). Als Standard wurde Postheparin- Plasma eines Apo E 3/3 Probanden eingesetzt Patientenkollektiv 19 Probanden (11 Frauen, 8 Männer) im Alter von 22 bis 72 Jahren, bei denen alle mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung eine Homozygotie von Apo E diagnostiziert wurde, wurden ausgewählt, um die Assoziation und Verteilung der HL und die Lipoproteine in Prä- und Postheparin- Plasma zu untersuchen. Von diesen Probanden hatten 8 Apo E 3/3, 5 Apo E 4/4 und 6 Apo E 2/2 Genotypen. Keiner der Probanden war zum Zeitpunkt der Blutentnahme in medikamentöser Behandlung. Die Auswahl der Probanden war unabhängig von den Plasmatriglyzerid- und Cholesterinkozentrarionen. 18

19 2.6.2 Probenaufbreitung Den Probanden wurde vier mal 9 ml EDTA- Blut mit folgendem Zusatz abgenommen: a) Präheparin- Plasma mit und ohne Zusatz von THL (30 ng/ml Blut) b) Postheparin- Plasma mit und ohne Zusatz von THL (30 ng/ml Blut) Prä- und Postheparin- Proben wurden in 9 ml EDTA- Röhrchen (Sarstedt) abgenommen und bei 4 o C vorgekühlt. Die Postheparin- Proben wurden 10 Minuten später als die Präheparin- Proben nach Injektion von 70 U/kg Körpergewicht Heparin gewonnen, um die gesamte am Endothel befindliche Lipase aus ihrer Bindung zu lösen. Um die lipolytische Aktivität zu inhibieren, wurde jeweils die 9 ml EDTA- Röhrchen des Prä- und Postheparin- Plasmas kurz vor der Blutentnahme 6 µl THL aus einer Stammlösung von 10 mg/nl THL in Ethanol zugeführt. THL hemmt die lipolytische Aktivität der LPL, HL, PL. Zur Plasmagewinnung wurden die Blutproben unmittelbar nach der Entnahme bei 2500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Unmittelbar nach der Zentrifugation wurden die Plasmen mit 0,45 µm filtriert, um aggregierte Lipoproteine und Fibrin aus diesem zu trennen. Die Plasmaproben wurden innerhalb von 12 Stunden analysiert. 2.8 Statistik Die Ergebnisse von quantitativen Analysen sind in Mittelwerten und Standardfehlern angegeben. Für die Bestimmung der Signifikanzniveaus wurde der Student T-Test mit zwei Endflächen für ungepaarte Stichproben mit ungleicher Varianz verwendet (Exel, Microsoft, USA). 19

20 3. Ergebnisse 3.1. Probanden Die 19 Probanden (11 Frauen, 8 Männer) zeigten unterschiedlich hohe Plasmakonzentrationen für Triglyzeride und Cholesterin. Die Triglyzeridkonzentrationen lagen im Bereich von 34 mg/dl mg/dl, die Cholesterinkonzentrationen lagen im Bereich von 121 mg/dl mg/dl. Die HL- Aktivitäten, LPL- Aktivitäten, Apo E- Genotypen und die Lipidkonzentrationen der untersuchten Probanden sind in Tabelle 1 aufgeführt. n Gesch. E-Typ LPL.Ak HL.Ak TG Chol VLDL LDL HDL 1 w (3/3) w (3/3) m (3/3) w (3/3) w (3/3) m (3/3) w (3/3) m (3/3) m (4/4) w (4/4) w (4/4) w (4/4) w (4/4) m (2/2) w (2/2) w (2/2) m (2/2) m (2/2) m (2/2) Tabelle1 Apo E- Isotypen, LPL-, HL- Aktivität und Lipidkonzentrationen der untersuchten Probanden. (n=19), LPL- Aktivität [mu/ml] (LPL.Ak), HL- Aktivität [mu/ml] ( HL.Ak), Triglyzeride [mg/dl] (TG), Cholesterin [mg/dl] ( Chol), VLDL [mg/dl], LDL [mg/dl], HDL [mg/dl]. 20

21 Abbildung 1 LPL- Aktivität 8 7 Anzahl der Probanden mu/ml HL- Aktivität 7 6 Anzahl der Probanden mu/ml Histogramm der Verteilung der HL- und LPL- Aktivität im Postheparin- Plasma aller Probanden unabhängig vom Apo E- Genotyp. 21

22 3.2. Auftrennung des Plasmas durch FPLC Lipoproteine können mittels Gelfiltration nach ihrer Größe getrennt werden. Mit Hilfe einer Präzisionpumpe werden Plasmaproben der verschiedenen Genotypen einzeln unter konstantem Druck und mit konstantem Flußvolumen zusammen mit einem Puffer über eine Gelfitrationssäule gepumpt. Die Gelfiltrationsäule enthält ein Medium auf Agarosebasis, welches eine definierte Porengröße besitzt. Kleine Lipoproteine wie die HDL können sich gut durch die Poren bewegen, verteilen sich gut im Säulenmedium und wandern relativ langsam durch das Gel. Sie finden sich in den späten Fraktionen. Große Lipoproteine wie VLDL können sich nur durch die großporigen Bereiche des Gels bewegen, haben somit kleineres Verteilungsvolumen und befinden sich in den frühen Fraktionen. Dieses System ermöglicht die Trennung von Biomolekülen mit einem Molekulargewicht zwischen 5000 und 5x10 6. Es gewährleistet eine vorsichtige Trennung der Lipoproteine unter Schonung der LPLund HL- Bindung an Lipoproteinen. Nach der Kalibrierung der Säule, wie in Material und Methoden beschrieben, wird in die Säule Plasma injiziert und nach Lipoproteinklassen aufgetrennt. Aus den einzelnen Fraktionen werden Elutionsprofile der Lipoproteine erstellt und zwischen den verschiedenen Genotypen verglichen. Um den Einfluß von Heparin auf die Elutionsprofile darzustellen, wurden sowohl Prä- als auch Postheparin- Plasma verwendet. Abbildung 2 zeigt die Elutionsprofile nach Gelfiltration von Lipoproteinen bei Prä-, und Postheparin- Plasma bei den drei Apo E- Genotypen. Die VLDL eluierten in Fraktionen und machten sich in allen Genotypen als kleinster Peak bemerkbar. Die LDL fanden sich in den Fraktionen und weisen einen höheren Peak als VLDL auf. Die HDL eluierten in den Fraktionen und zeigten sich als stärkster Peak. Die Plasmaproteine, die zum größten Teil aus Albumin bestehen, eluierten in den Fraktionen Zwischen den Genotypen zeigten sich durchaus Unterschiede in den Elutionsprofilen. Im VLDL- Bereich besaßen die Apo E 3/3 Genotypen lediglich einen minimalen Peak, die Apo E2/2 Genotypen hingegen einen deutlichen Peak. Apo E 4/4 Genotypen nehmen hinsichtlich des VLDL- Peaks eine Mittelstellung ein. Im LDL- Bereich weisen Apo E 4/4 Genotypen hingegen einen deutlicheren Peak als Apo E 2/2 und Apo E 3/3 Genotypen auf. Im HDL Bereich zeigten sich zwischen den drei Genotypen keine deutlichen Unterschiede. 22

23 Abbildung 2 Vergleich der FPLC- Läufe bei den drei Homozygoten Apo E- Genotypen, OD bei 0,5 gemessen. Die Fraktionen sind in den Läufen eingetragen

24 3.3 Verteilung von Cholesterin auf die Fraktionen Nach der Gelfiltration wurde bei allen 19 Probanden die Cholesterin- konzentration in den Fraktionen sowohl im Prä- als auch im Postheparin- Plasma bestimmt. Diese Untersuchungen dienten zum Vergleich der Cholesterinverteilung auf die Fraktionen zwischen den verschiedenen Genotypen. Wie auf der Abbildung 3 zu sehen ist, lassen sich Unterschiede in der Cholesterinverteilung zwischen den verschiedenen Genotypen weder in Prä- noch in Postheparin- Plasma erkennen. Die Bestimmung von Cholesterin diente zusätzlich noch als Kontrolle der FPLC- Läufe. Da der überwiegende Teil von Plasma- Cholesterin durch LDL transportiert wird, ist in diesem Bereich auch die höchste Cholesterin- konzentration zu erwarten. Wie aus Abbildung 3 zu ersehen ist, liegt der Cholesterin- Peak zwischen den Fraktionen 24 bis 26, also im LDL- Bereich, so daß die FPLC- Läufe bestätigt werden konnten. 24

25 Abbildung 3a, 3b Vergleich der Elutionsprofile für Cholesterin in Prä- und Postheparin- Plasma der Apo E- Genotypen nach Gelfiltration von Lipoproteinen. VLDL; Fraktionen 15-17, LDL; Fraktionen 24-26, HDL; Fraktionen a) Cholesterinverteilung in Präheparinfraktionen mg /dl Fraktionen ApoE3/3 ApoE2/2 ApoE4/4 b) Cholesterinverteilung in Postheparinfraktionen 150 mg /dl ApoE3/3 ApoE2/2 ApoE4/ Fraktionen 25

26 3.4. Verteilung der HL, LPL und Apo E auf die Lipoproteinfraktionen Um die Verteilung der HL auf die verschiedenen Lipoproteine zu untersuchen, wurde die HL nach dem Slot- Blot- Verfahren mit spezifischen Antikörpern detektiert. Eine Reihe von Arbeitsgruppen hat schon gezeigt, daß nach der Injektion von Heparin die gesamte im Plasma befindliche LPL freigesetzt wird, d.h. eine deutliche Zunahme des LPL- Gehaltes nach Heparingabe zu beobachten ist (Shimada, K et al. 1981). Dieser Effekt wurde als Kontrolle zur korrekten Durchführung des Versuches benutzt, in denen die Verteilung der LPL auf verschiedenen Lipoproteinfraktionen sowohl vor als auch nach Heparingabe gemessen wurde. Abbildung 4 zeigt die Verteilung der zu untersuchenden Proteine (LPL, HL, Apo E) bei einem Apo E 3/3 Genotyp vor und nach Heparingabe. Die Intensität der LPL im Präheparin- Plasma ist im VLDL- Bereich (Fraktionen 15-17) schwach, im LDL- Bereich (Fraktionen 24-26) und im HDL- Bereich (Fraktion 32-34) jedoch stärker. Dies entspricht den zu erwartenden Ergebnissen und weist auf eine korrekte Versuchsdurchführung hin. Im Postheparin- Plasma ist die LPL in allen Fraktionen stärker nachweisbar. Die Verteilung des Apo E zeigt in den verschiedenen Fraktionen sowohl im Prä- als auch im Postheparin- Plasma ein sehr homogenes Muster. Es ist in allen Fraktionen gleich stark zu beobachten und zeigt nach Heparingabe weder Veränderung in der Intensität noch in der Verteilung. Die HL ist im Präheparin- Plasma im VLDL- Bereich kaum, im LDL- und HDL- Bereich stärker nachweisbar. Im Postheparin- Plasma ist nur im LDL- Bereich eine leichte Intensitätszunahme im Vergleich zum Präheparin- Plasma zu beobachten. Nach den obigen Untersuchungen ist anzunehmen, daß aufgrund mangelnder Detektion von HL im VLDL- Bereich, HL kaum in diesem Bereich bindet. Die Verteilung der Proteine zeigten bei 7 von 8 der Untersuchten Probanden mit Apo E 3/3 Genotyp ein ähnliches Muster wie beschrieben auf. Abbildung 5 zeigt die Verteilung der LPL, HL, Apo E 2/2 Genotyp vor und nach Heparingabe. Im Präheparin- Plasma ist LPL im VLDL- Bereich kaum und im LDL-, HDL- Bereich mit starker Intensität vorhanden. Wie erwartet zeigt die LPL im Postheparin- Plasma in allen Fraktionen eine Intensitätszunahme. Bei diesem Genotyp zeigt das Apo E in allen Fraktionen genau so ein homogenes Muster wie bei Apo E 3/3 Genotyp. Heparingabe reichert den Apo E- Gehalt des Plasmas nicht an. Die HL ist im VLDL- Bereich sehr schwach und in den LDL-, HDL- Bereich stärker nachweisbar. Eine unterschiedliche Detektion ist in Prä- und Postheparin- Plasma 26

27 nicht zu beobachten. Bei allen 6 untersuchten Probanden mit Apo E 2/2 war die gleiche Proteinverteilung zu beobachten. Abbildung 6 zeigt die Verteilung der LPL, HL und Apo E bei Apo E 4/4 Genotyp vor und nach Heparinisierung der Probanden. Die Verteilung der LPL im Prä- und Postheparin- Plasma war in den VLDL-, LDL- und HDL- Bereichen der Erwartung entsprechend homogen. Die Apo E- Verteilung zeigte keine Unterschiede zu den anderen homozygoten Genotypen (Apo E 2/2 und 3/3). Die HL kann weder in Pränoch in Postheparin- Plasma nachgewiesen werden. Die Detektion ist im LDL- und HDL- Bereich im Prä- und Postheparin- Plasma gleichermaßen leicht verstärkt. Die beschriebene Intensitätsverteilung trat bei allen 5 untersuchten Probanden mit Apo E 4/4 Genotyp auf. Als Ergebnis dieser Untersuchung kann zusammenfassend gesagt werden: a) Die HL- Verteilung wird überwiegend in der HDL- Fraktion gefunden, weniger in der LDL- und fast gar nicht in der VLDL- Fraktion b) Es finden sich keine Unterschiede in der Verteilung von HL zwischen den Apo E- Isoformen. c) Es wird im Gegensatz zur LPL bei der HL kein Unterschied zwischen der Verteilung im Prä- und Postheparin - Plasma gefunden. 27

28 Abbildung 4 Verteilung von HL, LPL und Apo E in den Lipoproteinenklassen zwischen Plasmafraktion 15 und 36 nach der Gelfiltration bei Apo E 3/3 Genotyp in Prä- und Postheparin- Plasma. VLDL; Fraktionen 15-17, LDL; Fraktionen und HDL; Fraktionen

29 Abbildung 5 Verteilung von HL, LPL und Apo E in den Lipoproteinenklassen zwischen Plasmafraktion 15 und 36 nach der Gelfiltration bei Apo E 2/2 Genotypen in Prä- und Postheparin- Plasma. VLDL; Fraktionen 15-17, LDL; Fraktionen und HDL; Fraktionen

30 Abbildung 6 Verteilung von HL, LPL und Apo E in den Lipoproteinenklassen zwischen Plasmafraktion 15 und 36 nach der Gelfiltration bei Apo E 4/4 Genotyp in Prä- und Postheparin- Plasma. VLDL; Fraktionen 15-17, LDL; Fraktionen und HDL; Fraktionen

31 3.5. Vergleich zwischen Plasmafiltration und Plasmazentrifugation Bei der Untersuchung der Verteilung der HL auf die Lipoproteinfraktionen, wie in Abschnitt 3.4 schon beschrieben, konnten zwischen den drei Apo E- Isoformen weder im Prä- noch im Postheparin- Plasma deutliche Intensitätsunterschiede beobachtet werden. Die HL kann im VLDL- Bereich in allen drei Apo E- Isotypen nur mit schwacher Intensität detektiert werden. Um einen Methodenfehler, welcher durch die Filtration von Plasma mit 0.45µm Filter entstanden und für die schwache Intensität verantwortlich sein könnte, ausschließen zu können, haben wir als Vergleich einen Teil des Plasmas eines Probanden mit Apo E 3/3 Genotyp einmal mit einem Filter mit der Porengröße von 0.45 µm filtriert und unter den gleichen Versuchsbedingungen den anderen Teil des Plasmas einer Zentrifugation bei 4 C und 2500 rpm für 15 Minuten unterzogen. Die Triglyzeridkonzentration des Probanden betrug 126 mg/dl, die Cholesterin- Konzentration 170 mg/dl. Beim Vergleich der FPLC- Läufe zwischen den unterschiedlich behandelten Präheparin- Plasmen ist nur eine leichte Steigerung im Bereich des VLDL- Peaks nach der Filtration gegenüber Zentrifugation zu beobachten. Zwischen Filtration und Zentrifugation sind bei den Postheparin- Plasmen keine Unterschiede zu beobachten. Auf der Abbildung 7 ist die Verteilung der LPL, HL, und Apo E nach Filtration und auf der Abbildung 8 nach Zentrifugation dargestellt. Die LPL weist nach Filtration eine leicht homogene Intensitätszunahme gegenüber Zentrifugation auf, und zwar vor und nach Heparingabe in gleicher Weise. Bei der Verteilung des Apo E kann bei der Filtration eine leichte Intensitätszunahme in Präheparin- Plasma in Fraktionen und in Fraktionen beobachtet werden. Vergleicht man dieses Ergebnis mit dem FPLC- Lauf, kann man in den Fraktionen auch einen höheren Peak in Präheparin- Plasma bei der Filtration beobachten. Die HL zeigt zwischen Filtration und Zentrifugation keine Intensitätsänderung sowohl im Prä-, als auch im Postheparin- Plasma an. Insgesamt sind die Unterschiede in den Analysen nach Filtration und Zentrifugation so gering, daß es keine Rolle spielt, wie das Plasma vor dem FPLC- Lauf behandelt wurde. Der fehlende Nachweis von HL in VLDL- Bereich ist somit nicht auf einen Artefakt durch die Filtration zurückzuführen. 31

32 Abbildung 7 Verteilung der HL in Prä- und Postheparin- Plasma bei dem Probanden Nr.8 mit Apo E 3/3 Genotyp nach der Filtration. VLDL; Fraktionen 15-17, LDL; Fraktionen24-26 und HDL; Fraktionen

33 Abbildung 8 Verteilung der HL in Prä- und Postheparin- Plasma bei dem Probanden Nr. 8 mit Apo E 3/3 Genotyp nach der Zentrifugation. 33

34 3.6 Elektronenmikroskopische Darstellung von Lipoproteinen und HL Im Slot- Blot- Verfahren konnte die HL sowohl im Prä-, als auch im Postheparin- Plasma kaum im VLDL- Bereich nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis war unabhängig von der Methode der Aufbereitung des Plasmas, d.h. ob es zuvor filtriert oder zentrifugiert wurde. Da das Slot- Blot- Verfahren eine relativ unsensitive Methode ist, die eher zur Quantifizierung größerer Mengen benutzt wird, wurden die Plasmen nach der Auftrennung einer elektronenmikroskopischen Untersuchung unterzogen. Dazu haben wir die HL in den Fraktionen 16, 24 und 32, in denen jeweils VLDL, LDL und HDL angenommen werden, mit goldbeladenen Antikörpern markiert und anschließend mit dem Transmissionselektronen- mikroskop untersucht (Abbildung 9). In Fraktion 16 befanden sich überwiegend Teilchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm. Diese entsprechen der Größe der VLDL, die in dieser Fraktion erwartet werden. In Fraktion 24 fanden sich wesentlich kleinere Partikel mit einem Durchmesser von etwa 20 nm, entsprechend der Größe der LDL. In Fraktion 32 zeigten sich überwiegend sehr kleine Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 12 nm, was mit der Größe der HDL vergleichbar ist. Unsere Annahme über die Verteilung der Lipoproteine auf die FPLC- Fraktionen wird durch diese Untersuchung bestätigt. Die HL- Markierung mit Gold zeigte, daß HL im VLDL-, LDL- und HDL- Bereich vorhanden ist. Dieses Ergebnis war in allen drei Isotypen in gleicherweise zu beobachten. Hinsichtlich der HL kann aber auch mit Hilfe dieser Methode keine Aussage gemacht werden, da die HL im VLDL-, LDL- und HDL- Bereich ähnliche Dichte zeigt, im Gegensatz von Slot- Blot- Verfahren, wo die HL eine unterschiedliche Verteilung auf VLDL-, LDL- und HDL- Bereich aufweist. 34

35 Abbildung 9 Elektronmikroskopische Darstellung von markierten HL mit Goldantikörper, VLDL in Fraktion 16 (oben), HDL in Fraktionen 32 (mitte), LDL in Fraktion 25 (unten). HL mit Pfeil markiert. VLDL ca. 50 nm HL HDL ca.12nm HL HL LDL ca.20 nm 35

36 3.7 Aktivitätsbestimmung der LPL und HL in Apo E- Genotypen Da bezüglich des Verteilungsmusters der HL zwischen den Genotypen kein Unterschied gefunden werden konnte, wurde bei allen Probanden eine Aktivitätsmessung der LPL und HL durchgeführt. Denn möglicherweise liegt den Unterschieden statt einer veränderten Verteilung der Enzyme auf die Lipoproteine eine veränderte Enzymaktivität zugrunde. Die LPL- Aktivität betrug bei Apo E 2/2 Genotypen 65,3 ± 34,8 (n=6), Apo E 3/3 57,9 ± 20,2 (n=8) und Apo E 4/4 48,2 ± 9,0 (n=5). Für die Aktivität der LPL zeigten sich zwischen den Genotypen keine signifikanten Unterschiede (Abbildung 10a) (2/2 vs. 3/3 p=0,249; 2/2 vs. 4/4 p=0,168; 3/3 vs 4/4 p=0,727). Die HL- Aktivität betrug bei Apo E 2/2 Genotypen 381,7 ± 151,2 (n=6), Apo E 3/3 225,3 ± 121,8 (n=8) und Apo E 4/4 238,2 ± 81,4 (n=5) (Abbildung 10b). Auch hier ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (2/2 vs. 3/3 p=0,738; 2/2 vs. 4/4 p=0,421; 3/3 vs. 4/4 p=0,428), jedoch zeigte sich eine Tendenz zu höheren Enzymaktivitäten bei Apo E 2/2 Genotypen. Diese erhöhte HL- Aktivität könnte ein Element sein, mit dem die geringere Prävalenz von kardiovaskulären Erkrankungen bei Individuen mit dem Apo E 2/2 Genotyp zu erklären sein könnte. Für eine definitive Aussage müßte aufgrund der großen Streuung der Werte jedoch eine wesentlich größere Anzahl von Probanden untersucht werden. 36