Mikrobiologische Kriterien für Fleisch und Fleischerzeugnisse

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1 Mikrobiologische Kriterien für Fleisch und Fleischerzeugnisse Nulltoleranz bei Salmonellen? Bedeutung der produktspezifischen Merkmale für die Risikobewertung Salmonellen-Risiko versus Nulltoleranz? Dr. Andreas Hartmann Kompetenz-Zentrum Analytik Rheda-Wiedenbrück phone: ++49 (0) fax: ++49 (0)

2 Rechtliche Grundlagen Kompetenz-Zentrum Analytik Rheda-Wiedenbrück phone: ++49 (0) fax: ++49 (0)

3 VO (EG) 178/2002 VO (EG) 178/2002 [Basisverordnung] Stand: Art. 14 Anforderungen an die Lebensmittelsicherheit (1) Lebensmittel, die nicht sicher sind, dürfen nicht in Verkehr gebracht werden. (2) Lebensmittel gelten als nicht sicher, wenn davon auszugehen ist, dass sie a) gesundheitsschädlich sind, b) für den Verzehr durch den Menschen ungeeignet sind.

4 VO (EG) 178/2002 Art. 14 (3) Bei der Entscheidung der Frage, ob ein Lebensmittel sicher ist oder nicht, sind zu berücksichtigen: a) die normalen Bedingungen seiner Verwendung durch den Verbraucher und auf allen Produktions-, Verarbeitungs- und Vertriebsstufen sowie b) die dem Verbraucher vermittelten Informationen einschließlich der Angaben auf dem Etikett oder sonstige ihm normalerweise zugängliche Informationen über die Vermeidung bestimmter die Gesundheit beeinträchtigender Wirkungen eines bestimmten Lebensmittels oder einer bestimmten Lebensmittelkategorie. (4) Bei der Entscheidung der Frage, ob ein Lebensmittel gesundheitsschädlich ist, sind zu berücksichtigen c) die besondere gesundheitliche Empfindlichkeit einer bestimmten Verbrauchergruppe, falls das Lebensmittel für diese Gruppe von Verbrauchern bestimmt ist.

5 Mikrobiologische Kriterien Rechtlich verbindliche mikrobiologische Grenzwerte vor 2005: - Richtlinie 89/437/EWG: für Eiprodukte - Richtlinie 91/492/EWG: für Muscheln - Richtlinie 91/493/EWG: für Fischereierzeignisse - Entscheidung 93/51/EWG: für gekochte Krebs- und Weichtiere - Richtlinie 92/46/EWG: für Milch und Milcherzeugnisse - Richtlinie 94/65/EG: für Hackfleisch und Fleischzubereitungen - teilweise widersprüchlich, keine einheitlichen Probenahmepläne, Grenzwerte oder Untersuchungsmethoden

6 Mikrobiologische Kriterien Richtwerte: The International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF) Scientific Committee on Veterinary Measures relating to Public Health

7 Mikrobiologische Kriterien VO (EG) 2073/2005 Verordnung über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel Anhang I Mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel Angabe der LM-Kategorie und der relevanten Verarbeitungsstufe Einheitlicher Probenahmeplan und Grenzwerte ggf. Korrekturmaßnahmen klar definierte Mikroorganismen / MO-Gruppen / Substanzen und Untersuchungsmethoden offene Gestaltung, risikobasiert: (26) Die in der vorliegenden Verordnung festgelegten mikrobiologischen Kriterien sollten abänderbar bleiben und ggf. überprüft bzw. ergänzt werden, damit die Entwicklungen in den Bereichen der Lebensmittelsicherheit und -mikrobiologie berücksichtigt werden können.

8 Mikrobiologische Kriterien VO (EG) 2073/2005

9 Mikrobiologische Kriterien VO (EG) 2073/2005 Mikroorganismen bzw. Toxine, die als Lebensmittelsicherkeitkriterium geführt werden: Fleisch- und Fleischprodukte: Listeria monocytogenes -> 100 KbE/g Salmonella spp. -> Nulltoleranz Spezielle Nahrungsmittel: Enterobacter sakazakii (Säuglingsanfangsnahrung) E.coli (Muscheln) Staphylokokken (Enterotoxine) Käse-, Milch- und Molkepulver Histamin (Fischereierzeugnisse)

10 Salmonella Salmonella

11 Salmonella Salmonellen sind kurze, stäbchenförmige, begeißelte, Gram-negative Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae Entdeckung des Typhus-Erregers durch R. Koch und K.J. Ebert 1885 Vergabe des Gattungsnamens Salmonella nach Daniel Elmer Salmon CVUA Stuttgart 1889 Nachweis von Salmonellen als Enteritis- Erreger 1934 Seroptypisierungen nach O und H Antigenen (KAUFMANN WHITE Schema) Daniel Elmer Salmon

12 Salmonella Derzeitige Nomenklatur: Die Gattung Salmonella umfasst zwei Arten: S. bongori und S. enterica S. enterica umfasst 6 Unterarten (Subspecies, ssp.): S. enterica ssp. enterica ssp. salamae ssp. arizonae ssp. diarizonae ssp. houtenae ssp. Indica Insgesamt mehr als Serovare Salmonella enterica ssp. enterica Serovar 1,4,12: i: 1,2 S. Typhimurium

13 Salmonella Vorkommen: Darmtrakt warm- und kaltblütiger Tiere, Wasser (Typhus), Umwelt Wachstumsparameter: Temperatur: 7(2) C bis 45(54) C (Optimum: 37 C; Abtötung: > 70 C) ph Wert: ph 4,1 9,0 (Optimum: 7,2; Abtötung: < 4,0) aw Wert: > 0,93 NaCl Gehalt: < 4% NaNO 2 : < 350 mg/kg Überlebensfähigkeit: Wasser : mehrere Wochen Volleipulver: bis zu 13 Jahren Schokolade: bis zu 1,5 Jahren Speiseeis, tiefgefroren: bis zu 7 Jahren gekühlte Butter: > 15 Wochen Mayonnaise (ph 4,0): bis zu 10 Tage Rohwurst: Tage bis Wochen Quelle: Baumgart et al.

14 Salmonella Einteilung der Salmonellen nach der Wirtsadaptation: Typhus-Paratyphus Gruppe (fast nur noch in Entwicklungsländern): S. Typhi (Typhus abdominalis): nur beim Menschen S. Paratyphi A, B, C (Paratyphus): latent auch bei Schlachttieren Gastroenteritis-Gruppe (klassische Zoonose Erreger): S. Enteritidis S. Typhimurium S. Hadar S. Virchow S. Infantis und weitere Serovare Wirt-adaptierte Serovare: S. Abortusovis (Schaf, Ziege), S. Abortusequi (Pferd) S. Dublin (Rind) S. Gallinarum (Huhn, Pute) S. Choleraesuis (Schwein)

15 Salmonella Gastroenteritis: Selbstlimitierender Brech-Durchfall, teilweise mit Fieber, teilweise auch symptomlos Inkubationszeit: 12-36h Minimale infekiöse Dosis: (Kinder ) Keime; stark abhängig von der LM- Matrix Therapie: eine antimikrobielle Therapie ist nur bei schweren Verlaufsformen oder einer besonderen Empfindlichkeit des Patienten nach vorheriger Resistenzbestimmung des Erregers zu erwägen Pathogenität: Entscheidend für die Pathogenität ist nicht das Serovar, sondern die Anwesenheit bestimmter Pathogenitätsfaktoren (Salmonella Pathogenicity Islands, SPI-1/2) Quelle: RKI Diese ermöglichen dem Bakterium die - Magen-Darm-Passage - Besiedlung des Dünndarms - Auslösung einer Entzündung des Darm-Epitheliums - Invasion von M-Zellen der Peyer Plaques - Multiplikation in Makrophagen (Vakuole)

16 Salmonella Ahmer & Gunn, 2011

17 Salmonella Analytik Klassisch kultureller Nachweis vs. PCR

18 Analytik Kultureller Nachweis von Salmonella

19 Analytik Lebensmittel-Probe Homogenisieren in 9 Vol. BPW Nachweisverfahren gem. ISO 6579 Vorläufiges Zählverfahren in Anlehnung an ISO Voranreicherung h bei 37 C Wiederbelebung (1 h RT) Hauptanreicherung (RVS & MKTTn bzw. MSRV) 24 h bei 42 bzw. 37 C Ausplattieren auf Selektivnährböden

20 Analytik Ausplattieren auf Selektivnährböden (XLD, Brilliance Salmonella) Auszählen und Bestätigung verdächtiger Kolonien Biochemische Bestätigung ggf. Serotypisierung

21 Analytik Untersuchungsdauer: >4 Tage Mögliche Ursachen falsch-negativer Nachweise unzureichende Wiederbelebung bei sub-lethal geschädigten Salmonellen vbnc (viable but non-culturable) Zustand problematische Begleitflora atypische Salmonellen (Lactose-positiv, Caprylat-Esterase-negativ)

22 Analytik Prinzip des molekularbiologischen Salmonellen-Nachweises Anreicherung DNA-Extraktion real-time PCR Auswertung

23 Analytik Anreicherung 25g des Probenmaterials werden 1:10 verdünnt mit gepuffertem Peptonwasser und im Stomacher zerkleinert; Inkubation: ca. 18h +/- 2h bei 37 C DNA-Extraktion DNA-Extraktion über eine thermische Lyse des Bakterienpellets in Lysepuffer bei 95 C 100 C; zusätzlich ggf. mechanische Lyse Je nach Probenmatrix und anschließender PCR-Anwendung wird die DNA-Extraktion automatisiert durchgeführt Hierbei findet eine zusätzliche Aufreinigung der DNA durch mehrere Waschschritte statt

24 Analytik Durch die Verwendung spezifischer, fluoreszierender Sonden in der PCR kann die exponentielle Vervielfältigung des gesuchten DNA-Abschnitts in Echtzeit am Thermocycler verfolgt werden real-time PCR Auswertung Typische Kurven mit exponentiellen Verlauf zeigen das Vorhandensein des gesuchten DNA-Abschnitts an.

25 Analytik Kontrollen zur Absicherung der molekularbiologischen Analytik negative und positive Kontrollen für die DNA-Extraktion negative und positive Kontrollen für PCR interne Amplifikationskontrollen (läuft in einem Reaktionsgefäß mit der eigentlichen Nachweisreaktion ab, zeigt mögliche Inhibition durch Matrixeffekte an) ggf. Verifizierung PCR-positiver Ergebnisse durch kulturellen Nachweis. Sind Salmonellen kultivierbar? (auch tote Keime werden detektiert)

26 Analytik Vorteile der molekularbiologischen Untersuchung Zeitfaktor Ergebnisse in weniger als 24h Durch optimierte Anreicherung und DNA-Extraktion ist bei rohem Fleisch (ungewürzt, unprozessiert!) ein Ergebnis in weniger als 12h zu ermitteln Bei negativen Befunden ist die Analyse abgeschlossen, positive PCR-Befunde können kulturell verifiziert werden Im Vergleich: Kultureller Nachweis von Salmonellen [ASU L (ISO 6579)] Ergebnisse liegen in 4 bis 6 Tagen vor (Voranreicherung, selektive Anreicherung, biochemische Bestätigung)

27 Analytik Vorteile der molekularbiologischen Untersuchung Spezifität Hohe Spezifität durch Verwendung spezifischer Primer und Sonden Sensitivität Die PCR-Methode ist ebenso sensitiv wie das kulturelle Verfahren ( 64 LFGB), Nach Anreicherung liegen ausreichend Salmonellen für einen sicheren real-time PCR-Nachweis vor Validierte Verfahren Verwendung von kommerziell erhältlichen real-time PCR-Kits, Durchführung der Analytik nach offiziell validierten Protokollen (AFNOR/ AOAC/ NordVal)

28 Nulltoleranz Nulltoleranz bei Salmonellen?

29 Nulltoleranz Quelle: EFSA, 2012

30 Nulltoleranz Anzahl der gemeldeten lebensmittelbedingten Ausbrüche mit hoher Evidenz pro Erreger in den Jahren 2007 bis 2011 (BfR, 2012)

33 Nulltoleranz Quelle: BfR, 2012

34 Nulltoleranz Tierbestände: Verordnung (EG) Nr. 2160/2003 Zweck: Bekämpfung von Salmonellen und bestimmten anderen durch Lebensmittel übertragbaren Zoonoseerregern Ziel: Senkung der Prävalenz von Zoonosen und Zoonosenerregern innerhalb der Gemeinschaft Umsetzung: nationale Bekämpfungsprogramme

38 Nulltoleranz VERORDNUNG (EG) Nr. 852/2004 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 29. April 2004 über Lebensmittelhygiene VERORDNUNG (EG) NR. 853/2004 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 29. April 2004 mit spezifischen Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs

39 Nulltoleranz Dem RKI gemeldete Fälle von Salmonellose 2001 bis 2010 (gem. IfSG) Quelle: RKI, 2011

45 Nulltoleranz VERORDNUNG (EU) Nr. 1086/2011

46 Nulltoleranz Zusammenfassung: Eine totale Eliminierung von Salmonellen ist in bestimmten Lebensmitteln auf absehbare Zeit nicht zu erreichen Für diese Lebensmittel sind geeignete Monitoringsysteme zur chargenspezifischen Freigabe bzw. Sperrung unerlässlich Risikoorientierte Ansätze mit quantitativen Verfahren analog anderer Pathogene wie Listeria monocytogenes wären zu diskutieren

47 Institut Dr. Erdmann GmbH Akkreditiertes Prüflabor nach DIN EN ISO Kernkompetenzen Fleisch und Fleischerzeugnisse Feinkost und Convenience-Produkte Rückstands- und Pathogenanalytik Obst/Gemüse Heimtiernahrung, Futtermittel und Tier-Spezialnahrung Fisch und Fischerzeugnisse weitere Schwerpunkte Eier Molkereiprodukte Fette, Margarine Süßwaren

48 Institut Dr. Erdmann GmbH Wir beschäftigen heute über 100 Mitarbeiter, darunter 15 wissenschaftliche Kräfte. Mitarbeiter aus folgenden Berufen bilden das Institut Dr. Erdmann-Team: Tierärzte Biochemiker staatl. geprüfte Lebensmittelchemiker Diplomingenieure, Fachrichtung Lebensmitteltechnologie Dipl. Oecotrophologen Diplom Biologen Diplom Agraringenieure Lebensmitteltechnische Assistenten Biologisch-Technische-Assistenten Chemisch-Technische-Assistenten Milchwirtschaftliche Laboranten DLG-Sensorik-Sachverständige

49 Institut Dr. Erdmann GmbH Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Kompetenz-Zentrum Analytik Amselweg 12 Rheda-Wiedenbrück phone: ++49 (0) fax: ++49 (0) Institut Dr. Erdmann Zertifizierungsstelle Amselweg 12 Rheda-Wiedenbrück phone: ++49 (0) fax: ++49 (0) Logistik-Zentren Leipzig Crailsheim Rheda Laborgebäude Rheda-Wiedenbrück