peqgold Plant RNA Kit

Transkript

1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Plant RNA Kit (Safety-Line) V0815

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3 peqgold Plant RNA Kit 1 Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D

4 INHALT EINLEITUNG 3 FUNKTIONSPRINZIP 3 KITBESTANDTEILE 4 LAGERUNG 4 WICHTIGE HINWEISE 5 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 6 PEQGOLD PLANT RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 8 A.1 Homogenisierung der Probe mittels eines kommerziell verfügbaren Homogenisators (z.b. Precellys 24) und Lyse 8 A.2 Homogenisierung der Probe mittels Mörser und Lyse 8 B. Isolierung der RNA nach Homogenisierung der Probe 9 DNA-KONTAMINATIONEN 11 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 11 RNA-QUALITÄT 11 BESTELLINFORMATIONEN 12 TROUBLESHOOTING TIPS 13 CONTENT INTRODUCTION 14 THEORY 14 KIT COMPONENTS 15 STORAGE AND STABILITY 15 BEFORE STARTING 16 DANGEROUS COMPONENTS 17 PEQGOLD PLANT RNA ISOLATION PROTOCOL 19 A.1 Homogenization of the sample by a commercially available homogenizer (e.g. Precellys 24) and lysis 19 A.2 Homogenization of the sample by a mortar and lysis 19 B. RNA isolation after homogenization 20 DNA CONTAMINATION 22 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 22 RNA QUALITY 22 ORDERING INFORMATION 23 TROUBLESHOOTING TIPS 24 APPENDIX 25 peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 2

5 EINLEITUNG Der peqgold Plant RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um Gesamtzell-RNA aus bis zu 100 mg Pflanzenmaterial unterschiedlichster Herkunft zu isolieren. In weniger als 60 Minuten gestattet er die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei jeweils bis zu 100 µg RNA isoliert werden können. Er ist daneben aber auch effizient genug, um erfolgreiche Isolierungen aus nur 10 mg oder 100 Zellen zu erlauben. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden, wie Fällungen mit LiCl oder zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen. Kontaminationen und Enzyminhibitoren werden vollständig entfernt. RNA, die mit dem peqgold Plant RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease Protection Assays und in vitro-translationen weiterverwendet werden. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Plant RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Entfernung sekundärer Metabolite, wie Polysaccharide und Phenole, und die Reinigung von bis zu 100 µg nicht-degradierter RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen aufwärts. Die aufzuarbeitenden Zellen und Gewebe werden zunächst homogenisiert und unter denaturierenden Bedingungen lysiert, wobei alle vorhandenen RNasen und sonstigen Enzyme effizient inhibiert werden. Das Lysat wird auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die darin enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris und andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und effizient entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in RNase-free Water eluiert. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 3

6 KITBESTANDTEILE peqgold Plant RNA Kit 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Bestandteile PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes x 200 RNA Lysis Buffer P 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Lysis Buffer T 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (Konz.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung des peqgold Plant RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im RNA Lysis Buffer T und RNA Lysis Buffer P bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 4

7 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglich durchführen! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T und RNA Lysis Buffer P zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung der Puffer durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: Kit Kit Kit ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen. 20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.! Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte beim Raumtemperatur gelagert werden.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei C ausgeführt werden. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 5

8 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Plant RNA Kit Bestandteile PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns 2 ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer P RNA Lysis Buffer T RNA Wash Buffer I Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze WARNING guanidinium chloride 25-50%, CAS: DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302, H315, H319, P101, P102, P103, P280, P264, P305+P351+P338, P332+P313, P403, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 6

9 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H315 H319 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P264 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P332+P313 P403 P405 P501 Verursacht Hautreizungen. Verursacht schwere Augenreizung. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Nach Handhabung gründlich waschen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei Hautreizung: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. An einem gut belüfteten Ort aufbewahren. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 7

10 PEQGOLD PLANT RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE A.1 Homogenisierung der Probe mittels eines kommerziell verfügbaren Homogenisators (z.b. Precellys 24) und Lyse Bis zu 100 mg frisches oder gefrorenes Pflanzenmaterial in ein geeignetes Reaktionsgefäß überführen. 450 µl RNA Lysis Buffer T oder RNA Lysis Buffer P zugeben. Beachte: Die Ausbeute an RNA hängt davon ab, welcher Lysepuffer eingesetzt wird. Die RNA Isolierung aus den meisten Pflanzenproben ist unter Verwendung von RNA Lysis Buffer T möglich. Bei einigen Pflanzenproben ist aber die Extraktion der RNA nur mittels RNA Lysis Buffer P erfolgreich. Der Extraktionsprozess sollte deshalb immer zuerst mittels RNA Lysis Buffer T durchgeführt werden. Bei schlechten Ausbeuten sollte dann alternativ RNA Lysis Buffer P eingesetzt werden. Homogenisierung der Probe (Homogenisierung entsprechend der Herstellerangaben des jeweiligen Gerätes durchführen.) Die homogenisierte Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Mit Protokoll B (S. 9) fortfahren. A.2 Homogenisierung der Probe mittels Mörser und Lyse Zermörsern der Probe mittels flüssigem Stickstoff (alternativ auch mittels Seesand). Bis zu 100 mg Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Beachte: Bei Verwendung von flüssigem Stickstoff muss ein Auftauen der Probe nach dem Mörsern verhindert werden. Beim Zermahlen der Probe mittels Seesand muss der Probe der Lysepuffer zugegeben werden. Nach dem Zermahlen wird die Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt und die noch benötigte Menge an Lysepuffer zugegeben. 450 µl RNA Lysis Buffer T oder RNA Lysis Buffer P zugeben. Beachte: Die Ausbeute an RNA hängt davon ab, welcher Lysepuffer eingesetzt wird. Die RNA Isolierung aus den meisten Pflanzenproben ist unter Verwendung von RNA Lysis Buffer T möglich. Bei einigen Pflanzenproben ist aber die Extraktion der RNA nur mittels RNA Lysis Buffer P erfolgreich. Der Extraktionsprozess sollte deshalb immer mittels RNA Lysis Buffer T durchgeführt werden. Bei schlechten Ausbeuten sollte dann alternativ RNA Lysis Buffer P eingesetzt werden. Mit Protokoll B (S. 9) fortfahren. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 8

11 B. Isolierung der RNA nach Homogenisierung der Probe 1. Laden und Binden Das Reaktionsgefäß für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Sollte ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, dann während der Inkubationszeit 3 bis 4 mal für 10 Sekunden vortexen. DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und die Probe auf die DNA Removing Column überführen. 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. DNA Removing Column und Collection Tube verwerfen, Filtrat weiterverwenden. Gleiches Volumen an 70 %igem Ethanol zum Filtrat geben und sorgfältig mittels einer Pipette mischen. PerfectBind RNA Column in ein neues Collection Tube stecken. Ansatz auf die PerfectBind RNA Column überführen und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 2. Waschen I Neues Collection Tube nutzen, 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column zugeben und für 1 Minute bei x g* durch die Säule zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 3. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I- Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: /02). a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75 µl Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25 peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 9

12 b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. Säule bei Raumtemperatur (25-30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g* für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 4) weiterverwenden. 4. Waschen II 650 µl des komplettierten RNA Wash Buffer II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die Säule pipettieren. Zentrifugation für 1 Minute bei x g*. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. Waschschritt wiederholen. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Zentrifugensäule in das geleerte Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA mit 30 bis 80 µl RNase-free Water eluieren. Wasser dazu direkt auf die Matrix pipettieren, 1 Minute inkubieren und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der Säule können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 25 peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 10

13 DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT-PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 3: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse auf mögliche Kontaminationen zulässt. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold Plant RNA Kit erzielbare A 260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. RNA, die mit dem peqgold Plant RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in RNase-free Water für mindestens ein Jahr bei 70 C aufbewahrt werden. RNA-QUALITÄT Vor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierende Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst noch die Qualität der extrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rrnas repräsentieren. Sollten diese Banden in Richtung niedermolekularer RNA-Größen schmieren, ist es während der Präparation, Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sich je nach Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann. Obwohl RNA-Moleküle < 200 Basen nur sehr ineffizient an die PerfectBind-Silikamatrix des peqgold Plant RNA Kits binden, kann auf dem Gel noch eine dritte distinkte Bande aus trnas erscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders hoch war. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 11

14 BESTELLINFORMATIONEN für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut: peqgold Plant RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Bacterial RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Viral RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Classic-Line) Reinigungen Reinigungen peqgold MicroSpin Total RNA Kit (Safety-Line) Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 12

15 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Wenig oder keine RNA im Eluat Säule verstopft Präzipitierte RNA löst sich nicht RNA bleibt auf der Säule Säule ist überladen Unvollständiger Aufschluss oder unvollständige Lyse des Pflanzenmaterials Hoher Nukleinsäure- und Polysaccharidgehalt Elution wiederholen. RNase-free Water vor dem Eluieren auf 70 C erwärmen. Säule vor dem Eluieren für 10 min mit RNasefree Water inkubieren. Säule durch längere oder höhertourige Zentrifugation besser trocknen. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Probe sorgfältiger lysieren. Zentrifugationszeit verlängern. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Nicht mehr als 50 mg bis 100 mg einsetzen. RNA-Degradation Ausgangsmaterial Proben sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und gegebenenfalls bei 70 C lagern. RNase-Kontamination Präparation zügiger und exakter nach Vorschrift durchführen. Nur RNase-freies Material verwenden und Handschuhe tragen. Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen. DNA-Kontamination Probleme bei Folgereaktionen Niedrige Absorptionsraten Physikalische Ähnlichkeit von DNA und RNA Salzübertragung während der Elution RNA in saurem Puffer oder Wasser verdünnt Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei 37 C inkubieren.) Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit 4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde. Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II bei Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde. Waschschritt mit RNA Wash Buffer II wiederholen. RNase-free Water ist sauer und kann die A 260- Werte dramatisch herabsetzen. RNA zum Vermessen in TE-Puffer verdünnen. peqgold Plant RNA Kit Art.-Nr.: PEQLAB_v0815_D 13

16 INTRODUCTION The peqgold Plant RNA Kit provides a convenient and rapid method for the isolation of total RNA from a variety of plant samples up to 100 mg. The system is efficient enough to allow isolation of total RNA from as little as 10 mg of tissue or 100 cells. peqgold Plant RNA Kits are ideal for processing multiple plant samples in less than 60 min. Each PerfectBind RNA Column has a binding capacity of about 100 µg RNA. The need for organic extractions is eliminated, making total RNA isolation fast, safe, and reliable. RNA purified using the peqgold Plant RNA Kit is ready for applications such as RT-PCR, Northern blotting, poly(a) + -RNA (mrna) purification, nuclease protection assays, and in vitro translation. THEORY The peqgold Plant RNA Kits use the reversible binding properties of the PerfectBind matrix, a new silica-based material. This is combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated high salt buffer system allows more than 100 µg of RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix. Cells or tissues are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate RNases. Samples are then applied to the PerfectBind RNA Columns to which total RNA binds, while cellular debris and other contaminants are effectively washed out. High quality RNA is finally eluted in RNase-free Water. peqgold Plant RNA Kit 14 Order No.: PEQLAB_v0815_E

17 KIT COMPONENTS peqgold Plant RNA Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Product Number Components PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes x 200 RNA Lysis Buffer P 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Lysis Buffer T 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (Conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY peqgold Plant RNA Kit components should be stored at room temperature (22 C 25 C). All components are stable for at least 12 months from the date of purchase when stored at C. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T and RNA Lysis Buffer P. Warm up to 37 C to dissolve. peqgold Plant RNA Kit 15 Order No.: PEQLAB_v0815_E

18 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using the supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! Under cool ambient conditions, crystals may form in the RNA Lysis Buffer T and RNA Lysis Buffer P. This is normal and the bottle should be warmed (37 C) to dissolve the salt before use.! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Kit Kit Kit Add 8 ml 100 % EtOH to 2 ml Wash Buffer II Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml Wash Buffer II Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml Wash Buffer II! Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature.! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold Plant RNA Kit 16 Order No.: PEQLAB_v0815_E

19 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Plant RNA Kit Components PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns 2 ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer P RNA Lysis Buffer T RNA Wash Buffer I Signal word / symbols Dangerous components H and P statements WARNING guanidinium chloride 25-50%, CAS: DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302, H315, H319, P101, P102, P103, P280, P264, P305+P351+P338, P332+P313, P403, P501 H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Plant RNA Kit 17 Order No.: PEQLAB_v0815_E

20 H and P statements H225 H302 H314 H315 H319 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P264 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P332+P313 P403 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Harmful if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. Causes skin irritation. Causes serious eye irritation. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wash thoroughly after handling. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. If skin irritation occurs: Get medical advice/attention. Store in a well-ventilated place. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Plant RNA Kit 18 Order No.: PEQLAB_v0815_E

21 PEQGOLD PLANT RNA ISOLATION PROTOCOL A.1 Homogenization of the sample by a commercially available homogenizer (e.g. Precellys 24) and lysis Apply up to 100 mg fresh or frozen plant tissue to a suitable reaction tube. Add 450 µl RNA Lysis Buffer T or RNA Lysis Buffer P. Note: The yield of RNA depends on the lysis buffer used. RNA isolation of most plant samples is possible using RNA Lysis Buffer T. Some plant samples however require RNA Lysis Buffer P for successful RNA extraction. Therefore the extraction process should always be accomplished first by using RNA Lysis Buffer T. With bad yields alternatively RNA Lysis Buffer P should be used. Homogenization of the sample (Homogenize corresponding to manufacturers instructions.) Apply sample to a 1.5 ml microfuge tube. Proceed with protocol B (page 20). A.2 Homogenization of the sample by a mortar and lysis Pestle the sample under liquid nitrogen (alternatively sea sand). Apply up to 100 mg sample to a 1.5 ml microfuge tube. Add 450 µl RNA Lysis Buffer T or RNA Lysis Buffer P. Note: The yield of RNA depends on the lysis buffer used. RNA isolation of most plant samples is possible using RNA Lysis Buffer T. Some plant samples however require RNA Lysis Buffer P for successful RNA extraction. Therefore the extraction process should always be accomplished first by using RNA Lysis Buffer T. With bad yields alternatively RNA Lysis Buffer P should be used. Proceed with protocol B (page 20). peqgold Plant RNA Kit 19 Order No.: PEQLAB_v0815_E

22 B. RNA isolation after homogenization 1. Load and bind Incubate the reaction tube for 30 minutes at room temperature with continuous shaking. If continuous shaking is not possible, vortex 3 to 4 times for 10 seconds during incubation time. Place a DNA Removing Column into a 2.0 ml Collection Tube and transfer the sample to the DNA Removing Column. Centrifuge for 2 minutes at x g*. Discard the DNA Removing Column and Collection Tube, re-use filtrate. Add the same volume of ethanol (70 %) to the filtrate and mix thoroughly through a pipette. Place a PerfectBind RNA Column to a new Collection Tube. Apply the sample to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 1 minute at x g*. Discard the flow-through liquid and the Collection Tube. 2. Wash I Take a new Collection Tube, add 500 µl RNA Wash Buffer I to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube for 1 minute at x g*. Discard the flow-throw liquid and the re-use Collection Tube. 3. DNase I Digestion (optional) Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of the DNA without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75 µl Note: 1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 25 peqgold Plant RNA Kit 20 Order No.: PEQLAB_v0815_E

23 b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA column. c. Incubate at room temperature (25 30 C) for 15 minutes. d. Place a PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Place the column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g* for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection Tube in the next step. Continue with step Wash II Add 650 µl RNA Wash Buffer II (completed with 4 volumes of abs. ethanol) to the column and centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly for 1 min at x g*. Discard the flow-through liquid and re-use the Collection Tube. Repeat this wash step. 5. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind RNA Column in the Collection Tube used in step 4 and centrifuge for 2 minutes at x g* to completely dry the column matrix. 6. Elution Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 30 to 80 µl RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column, incubate for 1 minute and centrifuge for 1 minute at x g* to elute RNA. A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total RNA yield, the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution. Pre-heating RNase-free Water to 70 C before adding to the spin column and incubating the spin column for 5 minutes at room temperature before centrifugation may increase yield. Instead of eluting twice, the RNA can directly be eluted in a bigger volume of RNase-free Water. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 25 peqgold Plant RNA Kit 21 Order No.: PEQLAB_v0815_E

24 DNA CONTAMINATION No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion ( /02) is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol between the washing steps (see page 14). Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. Using RNA as a template in a control PCR reaction will also allow the detection of DNA contamination. QUANTITATION AND STORAGE OF RNA Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at 260 nm and then at 280 nm. One A 260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows: RNA conc. (µg /ml) = Absorption Dilution Factor The ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. Values higher than 1.8 indicates > 90 % nucleic acid. Store RNA samples at 70 C in RNase-free Water. Under such conditions RNA prepared with the peqgold system is stable for at least one year. RNA QUALITY It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications. Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28 S and 18 S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA, then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling, or storage. Although RNA molecules less than 200 bases in length do not efficiently bind the PerfectBind matrix, a third RNA band, the trna band, may be visible when a large number of cells are used. peqgold Plant RNA Kit 22 Order No.: PEQLAB_v0815_E

25 ORDERING INFORMATION For RNA isolation from cells, tissues and blood: peqgold Plant RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Bacterial RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Viral RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Classic-Line) Preparations Preparations peqgold MicroSpin Total RNA Kit Preparations (Safety-Line) Preparations Preparations peqgold Plant RNA Kit 23 Order No.: PEQLAB_v0815_E

26 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Little or no RNA eluted RNA remains on the column Clogged column Precipitated RNA will not dissolve Degraded RNA Problem in downstream applications DNA contamination Low Abs ratios Column is overloaded Incomplete disruption or lysis of plant tissue High nucleic acid and polysaccharide content Source RNase contamination Salt carry-over during elution Co-purification of DNA RNA diluted in acidic buffer or water Repeat elution. Pre-heat RNase-free Water to 70 C prior to elution. Incubate column for 10 min with RNase-free Water prior to centrifugation. Increase centrifugation time or speed to completely dry the column. Reduce quantity of starting material. Completely disrupt sample in liquid nitrogen. Increase centrifugation time. Reduce amount of starting material. Reduce amount of starting material. Do not apply more than mg. Freeze starting material quickly in liquid nitrogen and store at -70 C without thawing. Follow protocol closely, and work quickly. Ensure not to introduce RNase during the procedure. Check buffers for RNase contamination. Ensure RNA Wash Buffer II has been diluted with 100 % ethanol as indicated on bottle. Diluted RNA Wash Buffer II must be stored at room temperature. Repeat wash with RNA Wash Buffer II. Digest with RNase-free DNase and incubation at 37 C for 5 min. RNase-free Water is acidic and can dramatically lower Abs 260 values. Use TE buffer (ph 8) to dilute RNA prior to spec analysis. peqgold Plant RNA Kit 24 Order No.: PEQLAB_v0815_E

27 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Plant RNA Kit Order No.: PEQLAB_v0815_E 25

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