peqgold Tissue DNA Mini Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Tissue DNA Mini Kit (Classic-Line & Safety-Line) V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 BINDEKAPAZITÄT 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD TISSUE DNA MINI ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 A. DNA-Isolierung aus Gewebeproben 6 B. DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen (max. 5 x 10 6 Zellen) 8 C. DNA-Isolierung aus paraffinierten Gewebeproben 9 D. DNA-Isolierung aus Mäuseschwänzen 12 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA 14 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA 14 BESTELLINFORMATIONEN 15 TROUBLESHOOTING TIPS 15 CONTENT INTRODUCTION 17 PRINCIPLE 17 KIT COMPONENTS 18 STORAGE AND STABILITY 18 BINDING CAPACITY 18 BEFORE STARTING 19 DANGEROUS COMPONENTS 20 PEQGOLD TISSUE DNA MINI KIT PROTOCOLS 22 A. DNA isolation from tissue 22 B. DNA isolation from eukaryotic cells (max. 5 x 10 6 cells) 23 C. DNA isolation from paraffin embedded tissue 25 D. DNA isolation from mouse tail snips 27 CONCENTRATING THE DNA 29 QUANTITATION AND STORAGE OF DNA 30 ORDERING INFORMATION 30 TROUBLESHOOTING TIPS 31 APPENDIX 32

4 EINLEITUNG Die peqgold Tissue DNA Mini Kits bieten eine schnelle und einfache Methode, um bis zu 30 µg genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen, frischen, gefrorenen oder paraffineingebetteten Geweben oder Mäuseschwänzen zu isolieren. Mit geringem Arbeitsaufwand gestatten sie die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei je Präparation bis zu 5 x 10 6 Zellen, 40 mg Gewebe oder 0.8 cm große Mäuseschwanzstücke eingesetzt werden können. Sollten getrocknete Blutproben aufgearbeitet werden, empfehlen wir Ihnen die Verwendung des peqgold Blood DNA Mini Kits (Bestell-Nr.: / ). Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden, wie Fällungen mit Isopropanol oder Ethanol oder zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen. Für Blutproben empfehlen wir die Verwendung der peqgold Blood DNA Kits, die im Hinblick auf eine effiziente Hämolyse und Hämoglobinentfernung optimiert wurden und dadurch höhere Erträge qualitativ hochwertigerer DNA ermöglichen. Genomische DNA, die mit den peqgold Tissue DNA Mini Kits isoliert wurde, kann direkt für alle Arten von Folgeexperimenten, wie PCR, Southern Blotting oder Restriktionsverdaus, weiterverwendet werden. peqgold Tissue DNA Mini Kits werden wahlweise mit Safety-Line oder mit Classic-Line Säulen geliefert (Safety-Line, Best.-Nr xx oder Classic-Line, Best.-Nr xx). Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das Handling. FUNKTIONSPRINZIP Die peqgold Tissue DNA Mini Kits kombinieren die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 30 µg genomischer DNA mit Moleküllängen bis 60 kbp. Die aufzuarbeitenden Proben werden homogenisiert, unter denaturierenden Bedingungen lysiert und danach auf eine PerfectBind DNA Column geladen, in der die DNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris, Proteine und sonstige Kontaminationen können hier durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige DNA wird abschließend in Elution Buffer oder sterilem, deionisiertem Wasser eluiert. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 1

5 KITBESTANDTEILE peqgold Tissue DNA Mini Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Safety Line Bestellnummer Classic Line Bestandteile PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes DNA Lysis Buffer T 2 ml 24 ml 90 ml DNA Binding Buffer 1.5 ml 12 ml 45 ml DNA Wash Buffer 4 ml 40 ml 3 x 40 ml Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) 2 x 1.5 ml 25 ml 90 ml Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg RNase A (20 mg/ml) 80 µl 800 µl 2 x 1.6 ml 10 mm TE Buffer 1.5 ml 10 ml ml 30 ml + 6 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung von lyophilisierter und gelöster Proteinase K sollte bei 20 C erfolgen. RNase A sollte bei 4 C gelagert werden, alle anderen Komponenten der peqgold Tissue DNA Mini Kits bei Raumtemperatur. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben diese Komponenten der Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im DNA Binding Buffer bilden, sollten durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. BINDEKAPAZITÄT Die Bindekapazität der PerfectBind DNA Columns beträgt rund 30 µg DNA. Es sollten nicht mehr als die angegebenen Mengen an Ausgangsmaterial eingesetzt werden. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 2

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung der Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit.! Der DNA Binding Buffer enthält ein chaotropes Salz. Bei seiner Verwendung sollten deshalb Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im DNA Binding Buffer zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! Die im Kit enthaltenen Mengen an DNA Binding Buffer sind für die Isolierung von DNA aus Gewebeproben ausgelegt. Sie reichen nicht für die regelmäßige DNA- Isolierung aus Mäuseschwänzen, können hierfür jedoch separat nachbestellt werden.! DNA Wash Buffer wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: ml DNA Wash Buffer mit 6 ml 100 % EtOH mischen. 40 ml DNA Wash Buffer mit 60 ml 100 % EtOH mischen. 3 x 40 ml DNA Wash Buffer mit 3 x 60 ml 100 % EtOH mischen.! Verdünnter DNA Wash Buffer sollte bei Raumtemperatur gelagert oder vor seiner Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden.! Proteinase K wird als Pulver geliefert und muss vor ihrer ersten Verwendung durch Vortexen in TE Buffer gelöst werden: mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer lösen. 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer lösen. 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer lösen.! Gelöste Proteinase K sollte à 25 µl, 50 µl oder 100 µl aliquotiert, bei 20 C gelagert und bei Bedarf frisch aufgetaut werden.! Alle Zentrifugationsschritte bei C ausführen. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 3

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Tissue DNA Mini Kit Bestandteile Signalwort / Symbole PerfectBind DNA Columns - 2 ml Collection Tubes - DNA Lysis Buffer T DNA Binding Buffer - (not necessary) DANGER Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze sodium dodecyl, sulphate, CAS: propan-2-ol %, CAS: (not necessary) H225, H319, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Wash Buffer Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) Proteinase K - -. DANGER Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P311 RNase A (20 mg/ml) DANGER Nuclease, ribo- 20 mg/ml, CAS: H317, H334, P261S, P280sh, P , P , P , P , P mm TE Buffer peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 4

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H315 Verursacht Hautreizungen. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. H319 Verursacht schwere Augenreizung. H334 Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder Atembeschwerden verursachen. H335 H336 P101 P102 P103 P210 P261 P261S P280 P280sh P285 P302+P352 Kann die Atemwege reizen. Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol vermeiden. Einatmen von Staub vermeiden Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. Schutzhandschuhe/Augenschutz tragen. Bei unzureichender Lüftung Atemschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P309+P311 P333+P313 P342+P311 P363 P405 P501 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei Exposition oder Unwohlsein: Giftinformationszentrum, Arzt oder anrufen. Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen. Bei Symptomen der Atemwege: GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt/ anrufen. Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 5

9 PEQGOLD TISSUE DNA MINI ISOLIERUNGSPROTOKOLLE A. DNA-Isolierung aus Gewebeproben Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Homogenisierung und Lyse Bis zu 40 mg Gewebe (ca. 3 bis 4 mm 3 ) in kleine Stücke schneiden und in ein 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen, oder Probe mittels Pipettenspitze an der Innenseite des Reaktionsgefäßes zerdrücken. Grundsätzlich kann bei der Durchführung des peqgold Tissue DNA Mini Isolierungsprotokolles auf das mechanische Homogenisieren des Ausgangsmaterials verzichtet werden. Ein Pulverisieren unter flüssigem Stickstoff führt jedoch in kürzerer Inkubationszeit zu einer besseren Lyse. Die Proben sollten in einem Mörser gefroren und mit einem Pistill zermahlen werden. Nach dem Verdampfen des flüssigen Stickstoffs wird das pulverisierte Gewebe in 400 µl DNA Lysis Buffer T aufgenommen und die Präparation fortgesetzt, wie im folgenden beschrieben. Flüssiger Stickstoff kann schwerste Verletzungen hervorrufen. Bei entsprechenden Arbeiten sollten deshalb immer Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden. 400 µl DNA Lysis Buffer T und 20 µl Proteinase K, sowie 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und für 10 sec vortexen. Probe für mindestens 1 h bei 50 C unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren, z.b. mittels Thermoschüttler. Die Inkubationsdauer hängt von der Art und Menge des aufzuarbeitenden Gewebes ab und beträgt in der Regel weniger als 3 h. Die Lysezeit kann auch verlängert werden, sollte aber nicht mehr fortgesetzt werden, wenn das Ausgangsmaterial komplett lysiert ist. Dies könnte zur Degradation der genomischen DNA führen! Sollte kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, Probe während der Inkubationszeit 3 4 Mal für 10 sec vortexen. Lyseansatz für 30 sec bei x g* zentrifugieren, um unlösliche Debris zu pelletieren. Den Überstand vorsichtig in ein neues 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen, ohne Teile des unlöslichen Debrispellets zu verschleppen. 2. Laden und Binden 200 µl DNA Binding Buffer je eingesetzten 400 µl DNA Lysis Buffer T zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mit dem Lysat mischen. Nach der Zugabe von DNA Binding Buffer kann es zur Bildung eines Präzipitats kommen, das jedoch keine nachteiligen Auswirkungen auf die DNA-Isolierung hat. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 6

10 Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die Säule laden. Säule im Tube für 2 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und PerfectBind DNA Column wieder in das Collection Tube einsetzen. Bei Ansätzen > 750 µl Säule mehrmals beladen. Durchfluss und Collection Tube verwerfen. 3. Waschen I 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol) auf die Säule pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 4. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben. Collection Tube verwerfen. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube geben und durch Zentrifugieren für 2 min bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein frisches 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und 200 µl Elution Buffer auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Tube für 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 min bei x g* zentrifugieren. Wenn nötig Elution mit weiteren 200 µl Elution Buffer wiederholen. Eine Inkubation der Säule bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder die Verwendung von auf 70 C vorgewärmtem Elution Buffer kann den Elutionsertrag geringfügig erhöhen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag noch etwas verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Für die Präparation genomischer DNA sollten maximal 40 mg Gewebe je PerfectBind DNA Column eingesetzt werden, da sonst die Sättigungsgrenze der Säule erreicht wird. Bei Verwendung mehrerer PerfectBind DNA Columns können jedoch problemlos auch größere Gewebemengen aufgearbeitet werden. Hierzu müssen lediglich die Volumina der eingesetzten Puffer und Lösungen heraufgesetzt werden. Bei 80 mg Gewebe wären beispielsweise 800 µl DNA Lysis Buffer T und 40 µl Proteinase K zu verwenden. Es ist zu beachten, dass auch die Mengen des im folgenden eingesetzten DNA Binding Buffers angepasst werden müssen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 7

11 B. DNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen (max. 5 x 10 6 Zellen) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Homogenisierung und Lyse Suspensions-Zellen Zellen in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß mittels Zentrifugation für 5 bis 10 min bei x g* pelletieren. Überstand verwerfen. 400 µl DNA Lysis Buffer T und 20 µl Proteinase K, sowie 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und für 10 sec vortexen. Probe für min bei 50 C unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren, z.b. mittels Thermoschüttler. Sollte kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, Probe während der Inkubationszeit 3 4 Mal für 10 sec vortexen. Monolayer-Zellen Gewebekulturzellen, die in Monolayern wachsen, werden direkt in der Flasche oder Schale lysiert. Dazu Kulturmedium absaugen und 400 µl DNA Lysis Buffer T und 20 µl Proteinase K, sowie 15 µl RNase A (20 mg/ml) je T75-Flasche oder 10-cm-Schale zugeben. (Für größere Kulturgefäße das Volumen entsprechend erhöhen.) Puffer dabei gleichmäßig über die ganze Oberfläche verteilen, um eine möglichst vollständige Ablösung der Zellen zu gewährleisten. Lysat einige Male mit einer Pipette auf- und abziehen und danach in ein 5 ml Zentrifugenröhrchen überführen. Für 10 sec vortexen. Probe für min bei 50 C unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren, z.b. mittels Schüttel- Wasserbad. Sollte kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, Probe während der Inkubationszeit 3 4 Mal für 10 sec vortexen. 2. Laden und Binden 200 µl DNA Binding Buffer je eingesetzten 400 µl DNA Lysis Buffer T zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mit dem Lysat mischen. Nach der Zugabe von DNA Binding Buffer kann es zur Bildung eines Präzipitats kommen, das jedoch keine nachteiligen Auswirkungen auf die DNA-Isolierung hat. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die Säule laden. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und PerfectBind DNA Column wieder in das Collection Tube einsetzen. Bei Ansätzen > 750 µl Säule mehrmals beladen. Durchfluss und Collection Tube verwerfen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 8

12 3. Waschen I 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol) auf die Säule pipettieren. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 4. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben. Collection Tube verwerfen. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube geben und durch Zentrifugieren für 2 min bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein frisches 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und µl Elution Buffer auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Tube für 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 min bei x g* zentrifugieren. Wenn nötig Elution mit weiteren µl Elution Buffer wiederholen. Eine Inkubation der Säule bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder die Verwendung von auf 70 C vorgewärmtem Elution Buffer kann den Elutionsertrag geringfügig erhöhen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag noch etwas verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Für die Präparation genomischer DNA sollten maximal 5 x 10 6 Zellen je PerfectBind DNA Column eingesetzt werden, da sonst die Sättigungsgrenze der Säule erreicht wird. Bei Verwendung mehrerer PerfectBind DNA Columns können jedoch problemlos auch größere Zellzahlen aufgearbeitet werden. Hierzu muss lediglich das Volumen der eingesetzten Puffer und Lösungen heraufgesetzt werden. C. DNA-Isolierung aus paraffinierten Gewebeproben Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Oktan oder Xylen! 100 % Ethanol! Sterile Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 9

13 1. Paraffin Entfernung Bis zu 40 mg Gewebe (ca. 3 bis 4 mm 3 ) in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen überführen und enthaltenes Paraffin durch sorgfältiges Vortexen in 1 ml Oktan oder Xylen entfernen. Die Probe muss transparent werden! Anschließend bei maximaler Geschwindigkeit für 5 min zentrifugieren. Der Überstand muss mittels Pipette vollständig entfernt werden. Dabei vorsichtig arbeiten, um das Pellet nicht zu zerstören oder zu verwerfen. Die Paraffin-Entfernung muss solange wiederholt werden, bis kein Paraffin mehr in der Probe enthalten ist! 2. Waschen des Gewebepellets Gewebepellet mit 1 ml absolutem Ethanol durch Vortexen waschen, um Reste des Oktans oder Xylens zu entfernen. Danach für 3 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Ethanolüberstand vollständig mit der Pipette abnehmen, ohne das Gewebepellet zu zerstören. Waschen des Gewebepellets mit 1 ml Ethanol wiederholen. Gewebepellet abschließend für 15 min bei 37 C trocknen. 3. Lysieren des Gewebepellets Pellet in 400 µl DNA Lysis Buffer T und 20 µl Proteinase K aufnehmen und für 10 sec durch Vortexen sorgfältig resuspendieren. Gesamten Ansatz bei 50 C in einem Thermoschüttler inkubieren. Die Inkubationsdauer hängt von der Art und Menge des aufzuarbeitenden Gewebes ab und beträgt in der Regel 30 min. Während der Inkubationszeit Thermomixer auf 95 C vorheizen. In einigen Fällen kann eine gegenüber der Lyse von frischem Gewebe verlängerte Inkubationszeit in DNA Lysis Buffer T mit Proteinase K Lösung erforderlich sein. Sollte kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, Probe während der Inkubationszeit 3 4 Mal für 10 sec vortexen. Lyseansatz im ausreichend vorgeheizten Thermomixer bei 95 C für 1 h inkubieren. Der Ansatz darf erst bei Erreichen von 95 C in den Thermomixer gestellt werden! 4. Laden und Binden 200 µl DNA Binding Buffer je eingesetzten 400 µl DNA Lysis Buffer T zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mit dem Lysat mischen. Nach der Zugabe von DNA Binding Buffer kann es zur Bildung eines Präzipitats kommen, das jedoch keine nachteiligen Auswirkungen auf die DNA-Isolierung hat. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 10

14 Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die Säule laden. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und PerfectBind DNA Column wieder in das Collection Tube einsetzen. Bei Ansätzen > 750 µl Säule mehrmals beladen. Durchfluss und Collection Tube verwerfen. 5. Waschen I 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol) auf die Säule pipettieren. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 6. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 5 beschrieben. Collection Tube verwerfen. 7. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube geben und durch Zentrifugieren für 2 min bei x g* vollständig trocknen. 8. Elution PerfectBind DNA Column in ein frisches 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und µl Elution Buffer auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Tube für 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 min bei x g* zentrifugieren. Wenn nötig Elution mit weiteren µl Elution Buffer wiederholen. Eine Inkubation der Säule bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder die Verwendung von auf 70 C vorgewärmtem Elution Buffer kann den Elutionsertrag geringfügig erhöhen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag noch etwas verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Für die Präparation genomischer DNA sollten maximal 40 mg Gewebe je PerfectBind DNA Column eingesetzt werden, da sonst die Sättigungsgrenze der Säule erreicht wird. Bei Verwendung mehrerer Säulen können jedoch problemlos auch größere Gewebemengen aufgearbeitet werden. Hierzu müssen lediglich die Volumina der eingesetzten Puffer und Lösungen heraufgesetzt werden. Bei 80 mg Gewebe wären beispielsweise 800 µl DNA Lysis Buffer T und 40 µl Proteinase K zu verwenden. Es ist zu beachten, dass auch die Mengen des im folgenden eingesetzten DNA Binding Buffers angepasst werden müssen. Der Ertrag und die Qualität der gewonnenen DNA sind von der Größe und dem Alter des eingesetzten Probenmaterials abhängig. Aus Geweben, die mit Paraformaldehyd fixiert wurden, können prinzipiell nur degradierte DNAs und RNAs gewonnen werden. Obwohl der Grad der Degradierung stark von dem jeweils verwendeten Fixativ abhängt, liegt die Länge der isolierten DNAs in der Regel unter 500 bp, die jedoch mit den peqgold Tissue DNA Kits ohne weiteres extrahiert werden können. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 11

15 D. DNA-Isolierung aus Mäuseschwänzen Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! 100 % Ethanol! Sterile Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Homogenisierung und Lyse Maximal cm Mausschwanz bzw. 0.4 cm Rattenschwanz in ein 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen und evtl. zusätzlich an der Gefäßinnenseite mittels einer Pipettenspitze zerdrücken. Die verwendeten Mäuse sollten nicht älter als 6 Wochen sein, weil sonst die Lyse schwieriger wird, was zu suboptimalen DNA-Ausbeuten führt. Nach Möglichkeit sollten die Biopsien von 2 bis 4 Wochen alten Mäusen genommen und bis zur Aufarbeitung bei 70 C gelagert werden. Die Wunde sollte fachgerecht versorgt und die Maus durch eine adäquate Marke gekennzeichnet werden. 400 µl DNA Lysis Buffer T und 20 µl Proteinase K sowie 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben. Ansatz für 10 sec durch Vortexen sorgfältig mischen und für 2 3 h bei 50 C in einem Thermoschüttler inkubieren. Die Lysezeit kann auch verlängert werden, sollte aber nicht mehr fortgesetzt werden, wenn das Ausgangsmaterial komplett lysiert ist! Sollte kontinuierliches Schütteln nicht möglich sein, Probe während der Inkubationszeit 3 4 Mal für 10 sec vortexen. Eine vollständige Lyse der Mäuseschwänze ist für hohe Erträge nicht nötig, sondern kann u.u. zur Degradation der genomischen DNA führen! Lyseansatz für 30 sec bei x g* zentrifugieren, um unlösliche Debris zu pelletieren. Den Überstand vorsichtig in ein neues 1.5 ml Zentrifugenröhrchen überführen, ohne Teile des unlöslichen Debrispellets zu verschleppen. 2. Laden und Binden 400 µl DNA Binding Buffer je 400 µl eingesetztem DNA Lysis Buffer T zugeben und durch Pipettieren sorgfältig mischen. Nach der Zugabe von DNA Binding Buffer kann es zur Bildung eines Präzipitats kommen, das jedoch keine nachteiligen Auswirkungen auf die DNA-Isolierung hat. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 12

16 Eine PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und gesamten Ansatz einschließlich aller Präzipitate auf die Säule laden. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und PerfectBind DNA Column wieder in das Collection Tube einsetzen. Bei Ansätzen > 750 µl Säule mehrmals beladen. Durchfluss und Collection Tube verwerfen. 3. Waschen I 650 µl des komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol) auf die Säule pipettieren. Säule im Tube für 1 min bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube wiederverwenden. 4. Waschen II Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben. Collection Tube verwerfen 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein 2 ml Collection Tube geben und durch Zentrifugieren für 2 min bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein frisches 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und 200 µl Elution Buffer auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Tube für 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 min bei x g* zentrifugieren. Wenn nötig Elution mit weiteren 200 µl Elution Buffer wiederholen. Eine Inkubation der Säule bei 70 C anstatt bei Raumtemperatur oder die Verwendung von auf 70 C vorgewärmtem Elution Buffer kann den Elutionsertrag geringfügig erhöhen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag noch etwas verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Für die Präparation genomischer DNA sollte maximal 0.8 cm Mäuseschwanz je PerfectBind DNA Column eingesetzt werden, da sonst die Sättigungsgrenze der Säule erreicht wird. Bei Verwendung mehrerer PerfectBind DNA Columns können jedoch problemlos auch größere Gewebemengen aufgearbeitet werden. Für die Präparation größerer Mengen an Mäuseschwanzgewebe müssen lediglich die Volumina der eingesetzten Puffer und Lösungen heraufgesetzt werden. Bei 1.6 cm Mäuseschwanz wären beispielsweise 800 µl DNA Lysis Buffer T und 40 µl Proteinase K zu verwenden. Es ist zu beachten, dass auch die Mengen des im folgenden eingesetzten DNA Binding Buffers angepasst werden müssen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 13

17 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA Genomische DNA, die mit den peqgold Tissue DNA Mini Kits aufgereinigt wurde, kann bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu zunächst NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz durch Vortexen sorgfältig mischen und für 10 min bei 20 C inkubieren. Danach für 15 min bei x g* zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol zugeben und für 2 min bei x g* zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für 2 min lufttrocknen und DNA in 20 µl sterilem, deionisierten Wasser oder Elution Buffer lösen. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit den peqgold Tissue DNA Mini Kits erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 1.9 entspricht deshalb genomischer DNA einer Reinheit von 85 % bis 95 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten DNA-Proben bestimmt werden. Genomische DNA, die mit den peqgold Tissue DNA Mini Kits aufgereinigt wurde, kann in Elution Buffer, 10 mm Tris-HCl (ph 9.0) oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei 20 C aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum Scheren der DNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 14

18 BESTELLINFORMATIONEN für die Isolierung genomischer DNA aus Zellen, frischen und in Paraffin eingebetteten Geweben und Mäuseschwänzen: peqgold Tissue DNA Mini Kit Reinigungen (Classic Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Tissue DNA Mini Kit Reinigungen (Safety Line) Reinigungen Reinigungen TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Säule verstopft Unvollständige Lyse Inkubationszeit mit DNA Lysis Buffer T und Proteinase K Lösung verlängern. Korrektes Volumen DNA Binding Buffer zugeben und Inkubationszeit bei 70 C um 10 min verlängern. Niedriger DNA- Ertrag Keine DNA im Eluat Zu große Probenmenge Lysat zu viskos Schlechte Elution Unzureichendes Waschen Säule verstopft Schlechte Zelllyse in DNA Lysis Buffer T Unvollständige Zelllyse durch unzureichendes Mischen in DNA Binding Buffer DNA Wash Buffer nicht mit absolutem Ethanol verdünnt. DNA Lysis Buffer T-, Proteinase K- und DNA Binding Buffer-Volumen an die Probenmenge anpassen und Lysat auf mehrere Säulen verteilen. Lysat mit 10 mm Tris-HCl, ph 8.0 verdünnen und auf mehrere Säulen verteilen. Elution wiederholen oder Elutionsvolumen erhöhen. Säule vor der Elution für 5 min bei 70 C inkubieren. DNA Wash Buffer wird als Konzentrat geliefert und muss mit 1.5 Volumen absolutem Ethanol verdünnt werden. Siehe oben Gewebestücke vor der Lyse in kleine Stücke schneiden und Inkubation in DNA Lysis Buffer T bei 50 C verlängern. Nach der Zugabe des viskosen DNA Binding Buffers und vor dem Laden sofort und sorgfältiger mischen. DNA Wash Buffer-Konzentrat muss mit 1.5 Volumen absolutem Ethanol verdünnt werden. peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 15

19 Troubleshooting Tips (Fortsetzung) Problem Ursache Abhilfe Schlechtes A 260/280- Verhältnis Probleme bei Folgeanwendungen Säulenmaterial im Eluat Unvollständige Zelllyse durch unzureichendes Mischen in DNA Binding Buffer Unvollständige Zelllyse oder Proteindegradation Salzübertragung Ethanolübertragung Während der Elution nicht länger und nicht schneller zentrifugieren als angegeben. Säulenmaterial interferiert nicht mit Enzymreaktionen und kann durch Pelletieren entfernt werden. Nach der Zugabe des viskosen DNA Binding Buffers und vor dem Laden sofort und sorgfältiger mischen. Inkubation mit DNA Lysis Buffer T und Proteinase K Lösung verlängern, bis keine Gewebestücke mehr sichtbar sind. DNA Wash Buffer muss Raumtemperatur haben. Nach dem zweiten Waschen muss die Säule durch Zentrifugieren für 2 min bei x g* getrocknet werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D 16

20 INTRODUCTION The peqgold Tissue DNA Mini Kits provide a rapid and easy method for the isolation of up to 30 µg of genomic DNA from eucaryotic cells, fresh, frozen or paraffin-embedded tissue, dried blood or mouse tail snips. The kit allows simultaneous processing of single or multiple samples with up to 5 x 10 6 cells, 40 mg of tissue material or 0.8 cm of mouse tail snip. If dried blood should be processed we recommend the use of the peqgold Blood DNA Mini Kits (Order No.: / ). There is no need for extractions with organic solvents like phenol or chloroform or timeconsuming steps such as precipitation with isopropyl alcohol or ethanol. Although the kits are principally also suited for the isolation of genomic DNA from blood, Buffy Coat, serum or plasma, we recommend the use of peqgold Blood DNA Kits for these purposes. The peqgold Blood DNA Kits are optimized for an efficient hemolysis and removal of hemoglobin and therefore prove better yields and higher quality of the isolated DNA. Genomic DNA purified with peqgold Tissue DNA Mini Kits is ready for a wide range of applications such as PCR, Southern Blotting and restriction digestion. peqgold Tissue DNA Mini Kits are available with Safety-Line (Order No xx) or Classic Line (Order No xx) columns. Safety-Line columns can be closed tightly by snap-on lids to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line colums do not have lids for a more comfortable handling. PRINCIPLE peqgold Tissue DNA Mini Kits use the reversible binding properties of the PerfectBind matrix, a silica-based material, combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated buffer system allows up to 30 µg of genomic DNA with fragment sizes up to 60 kbp to bind to the matrix. Samples are first homogenized, lysed under denaturing conditions and then applied to the PerfectBind DNA columns, where the DNA is effectively bound to the silica membrane. Cellular debris, proteins and other contaminants are washed away by specific buffers. The high quality DNA is finally eluted in Elution Buffer or sterile deionized water. peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 17

21 KIT COMPONENTS peqgold Tissue DNA Mini Kits 5 Preparations 50 Preparations 200 Preparations Order No. Safety Line Order No. Classic Line Components PerfectBind DNA Columns ml Collection Tubes DNA Lysis Buffer T 2 ml 24 ml 90 ml DNA Binding Buffer 1.5 ml 12 ml 45 ml DNA Wash Buffer 4 ml 40 ml 3 x 40 ml Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) 2 x 1.5 ml 25 ml 90 ml Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg RNase A (20 mg/ml) 80 µl 800 µl 2 x 1.6 ml 10 mm TE Buffer 1.5 ml 10 ml ml 30 ml + 4 x 1.5 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY Dissolved Proteinase K should be stored at 20 C. RNase A should be stored at 4 C, all other components of the peqgold Tissue DNA Mini Kits at room temperature. These components of the kits remain stable at an ambient temperature of C for at least 12 months after the date of purchase. Precipitates can form in DNA Binding Buffer and should be dissolved by heating of the bottle at 37 C. BINDING CAPACITY Each PerfectBind DNA Column can approximately bind 30 µg of DNA. Using greater than 40 mg of tissue is not recommended. peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 18

22 BEFORE STARTING Please read the protocol carefully before the first use of the peqgold Tissue DNA Mini Kit and keep all required materials available before starting the preparation.! DNA Binding Buffer contains a chaotropic salt. Use gloves and protective eyeware when handling this solution.! Under low ambient temperatures, precipitates can form in DNA Binding Buffer. These precipitates are normal, but should be dissolved by heating the bottle at 37 C before use.! The amount of DNA Binding Buffer is calculated for the isolation of DNA from tissue. The buffer may not be sufficient for the DNA isolation from mouse tails but can be ordered separately.! DNA Wash Buffer is delivered as a concentrate and must be diluted with absolute ethanol before use: Mix 4 ml DNA Wash Buffer with 6 ml 100 % EtOH. Mix 40 ml DNA Wash Buffer with 60 ml 100 % EtOH. Mix 3 x 40 ml DNA Wash Buffer with 3 x 60 ml 100 % EtOH.! Diluted DNA Wash Buffer should be stored at room temperature. If stored at lower temperatures, it should be heated to room temperature before use.! Proteinase K is delivered as a powder and must be dissolved before use by thoroughly vortexing in TE Buffer: Dissolve 3 mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer. Dissolve 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer. Dissolve 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer.! Dissolved Proteinase K should be aliquoted in 25 µl, 50 µl or 100 µl, stored at 20 C and be freshly thawed before use.! All centrifugation steps have to be performed at C. peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 19

23 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Tissue DNA Mini Kit Components Signal word / symbols PerfectBind DNA Columns - 2 ml Collection Tubes - DNA Lysis Buffer T DNA Binding Buffer - (not necessary) DANGER Dangerous components H and P statements sodium dodecyl, sulphate, CAS: propan-2-ol %, CAS: (not necessary) H225, H319, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Wash Buffer Elution Buffer (10 mm Tris-HCl, ph 9.0) Proteinase K - -. DANGER Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P311 RNase A (20 mg/ml) DANGER Nuclease, ribo- 20 mg/ml, CAS: H317, H334, P261S, P280sh, P , P , P , P , P mm TE Buffer peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 20

24 H and P statements H225 H315 H317 H319 H334 H335 H336 P101 P102 P103 P210 P261 P261S P280 P280sh P285 P302+P352 P303+P361+P353 P304+P340 P305+P351+P338 P309+P311 P333+P313 P342+P311 P363 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. Causes serious eye irritation. May cause allergy or asthma symptoms or breathing difficulties if inhaled. May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Avoid breathing dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Avoid breathing dust. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. Wear protective gloves/eye protection. In case of inadequate ventilation wear respiratory protection. IF ON SKIN: Wash with plenty of water/ IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF INHALED: Remove person to fresh air and keep comfortable for breathing. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. IF exposed or concerned: Get medical advice/attention. If skin irritation or rash occurs: Get medical advice/attention. If experiencing respiratory symptoms: Call a POISON CENTER/doctor/ Wash contaminated clothing before reuse. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 21

25 PEQGOLD TISSUE DNA MINI KIT PROTOCOLS A. DNA isolation from tissue Required materials to be supplied by the user:! 100 % ethanol! Sterile pipette tips and centrifuge tubes 1. Homogenisation and Lysis Cut up to 40 mg of tissue (ca. 3 to 4 mm 3 ) in small pieces, place the sample in a 1.5 ml tube or mash the sample at the inside of the reaction tube with a pipette. Principally, a mechanical homogenization of the starting material is not required when isolating genomic DNA with the peqgold Tissue DNA Mini Kit. Nevertheless, mechanical grinding under liquid nitrogen helps for a better lysis with shorter incubation times. Freeze the samples in a mortar and grind them with a pistil. After evaporation of the liquid nitrogen, take the sample up in 400 µl DNA Lysis Buffer T and continue the preparation as described in the following steps. Please note: liquid nitrogen can cause severe injuries. Always wear gloves and protective eyeware when using it. Add 400 µl DNA Lysis Buffer T, 20 µl of Proteinase K and 15 µl RNase A (20 mg/ml) and vortex for 10 sec. Incubate the sample at least at 50 C in a Thermo-Shaker. The incubation time depends on the type and amount of tissue to be prepared and is usually less than 3 hours. Lysis time can also be extended, but should not be continued, when the raw material is completely lysed. This could lead to degradation of the genomic DNA! If no Thermo-Shaker is available, mix the sample 3 to 4 times during incubation time by vortexing for 10 sec. Centrifuge the lysed solution for 30 sec at x g* to pellet down unlysable debris. Transfer the supernatant carefully in a new 1.5 ml tube without carrying-over parts of the debris pellet. 2. Loading and Binding Add 200 µl DNA Binding Buffer per 400 µl DNA Lysis Buffer T and mix thoroughly by pipetting. After addition of the DNA Binding Buffer a precipitate can form, which however has no influence on the DNA isolation. Place a PerfectBind DNA Column in a 2 ml Collection Tube and load up to 750 µl of the preparation (inclusive all precipitates) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 2 min at x g*. Discard the flow-through. Repeat this step until the entire preparation is loaded. Discard the flow-through and the Collection Tube. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 22

26 3. Washing I Add 650 µl of the diluted DNA Wash Buffer (Buffer concentrate plus 1.5 volume absolute ethanol) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through, keep the Collection Tube. 4. Washing II Repeat the washing with 650 µl DNA Wash Buffer as described in step 3. Discard the Collection Tube. 5. Drying (Important step! Do not reduce centrifugation time!) Place the PerfectBind DNA Column in a Collection Tube and dry the column completely by centrifugation for 2 min at x g*. 6. Elution Place the PerfectBind DNA Column in a new 1.5 ml tube and pipette 200 µl Elution Buffer directly onto the membrane. Incubate for 3 min at room temperature, then centrifuge for 1 min at x g*. If necessary repeat the elution step once more with additional 200 µl of the Elution Buffer. The yields can be slightly improved by incubating the column at 70 C instead of room temperature before centrifuging or by using Elution Buffer pre-heated to 70 C. The final yield can be increased together with the concentration of the DNA, if the eluate is used for a second elution. But note that the yield is about 30 % decreased compared to a second elution with a fresh aliquot of Elution Buffer. Use a maximum of 40 mg of tissue per PerfectBind DNA Column to be prepared, otherwise the column will be overloaded. If you need to isolate higher amounts of DNA, divide the lysate on more than one PerfectBind DNA Column. Adapt the volume of buffers and solutions to bigger sample volume. For example add 400 µl DNA Lysis Buffer T and 40 µl Proteinase K solution to 80 mg of tissue material. Also adapt the volumes of DNA Binding Buffer in the following steps. B. DNA isolation from eukaryotic cells (max. 5 x 10 6 cells) Required materials to be supplied by the user:! 100 % ethanol! Sterile pipette tips and centrifuge tubes * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 23

27 1. Homogenisation and Lysis Suspension cells Pellet cells by centrifugation (5 to 10 min at x g*). Discard the supernatant and resuspend the cells in 400 µl DNA Lysis Buffer T. Add 20 µl Proteinase K and 15 µl RNase A, mix thoroughly by vortexing for 10 sec and incubate at 50 C for min in a Thermo-Shaker. If no Thermo-Shaker is available, mix the sample 3 to 4 times during incubation time by vortexing for 10 sec. Monolayer cells Cell culture cells growing in monolayers are directly lysed in the culture flask or dish. Discard the culture medium and add 400 µl DNA Lysis Buffer T, 20 µl Proteinase K solution and 15 µl RNase A per T75 flask or 10 cm dish. (For bigger samples adapt volumes of buffers and solutions.) Spread the buffer evenly over the whole surface to ensure complete detaching of the cells. Mix the lysate by pipetting up and down several times. Fill the lysate in a 5 ml centrifuge tube. Vortex for 10 sec and incubate at 50 C for min in a shaking water bath. If no shaking water bath is available, mix the sample 3 to 4 times during incubation time by vortexing for 10 sec. 2. Loading and Binding Add 200 µl DNA Binding Buffer per 400 µl DNA Lysis Buffer T and mix thoroughly by pipetting. After addition of the DNA Binding Buffer a precipitate can form, which however has no influence on the DNA isolation. Place a PerfectBind DNA Column in a 2 ml Collection Tube and load up to 750 µl of the preparation (inclusive all precipitates) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through. Repeat this step until the entire preparation is loaded. Discard the flow-through and the Collection Tube. 3. Washing I Add 650 µl of the diluted DNA Wash Buffer (Buffer concentrate plus 1.5 volume absolute ethanol) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through, keep the Collection Tube. 4. Washing II Repeat the washing with 650 µl DNA Wash Buffer as described in step 3. Discard the Collection Tube. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 24

28 5. Drying (Important step! Do not reduce centrifugation time!) Place the PerfectBind DNA Column in a Collection Tube and dry the column completely by centrifugation for 2 min at x g*. 6. Elution Place the PerfectBind DNA Column in a new 1.5 ml tube and pipette µl Elution Buffer directly onto the membrane. Incubate for 3 min at room temperature, then centrifuge for 1 min at x g*. If necessary repeat the elution step once more with additional µl of the Elution Buffer. The yields can be slightly improved by incubating the column at 70 C instead of room temperature before centrifuging or by using Elution Buffer pre-heated to 70 C. The final yield can be increased together with the concentration of the DNA, if the eluate is used for a second elution. But note that the yield is about 30 % decreased compared to a second elution with a fresh aliquot of Elution Buffer. Use a maximum of 5 x 10 6 cells per PerfectBind DNA column for the preparation of genomic DNA, otherwise the PerfectBind DNA Column will be overloaded. If a higher number of cells needs to be processed, divide the lysate on more than one PerfectBind DNA Column. Adapt the volume of buffers and solutions on the bigger sample volume. C. DNA isolation from paraffin embedded tissue Required materials to be supplied by the user:! Octane or xylene! 100 % ethanol! Sterile pipette tips and centrifuge tubes 1. Removal of paraffin Place up to 40 mg of tissue (ca. 3 to 4 mm 3 ) in a 2 ml centrifuge tube and remove the paraffin by vortexing thoroughly in 1 ml octane or xylene. The sample has to become transparent! Centrifuge for 5 min at maximum speed. Discard the whole supernatant carefully without destroying the tissue pellet. Repeat paraffin removal until paraffin is completely removed from the sample! * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 25

29 2. Washing of the tissue pellet Wash the tissue pellet with 1 ml of absolute ethanol by vortexing to completely remove the octane or xylene. Centrifuge for 3 min at maximum speed. Discard the supernatant containing ethanol without destroying the tissue pellet. Repeat this washing step once with another 1 ml of ethanol. Air-dry the tissue-pellet for 15 min at 37 C. 3. Lysis of the tissue pellet Add 400 µl DNA Lysis Buffer T and 25 µl Proteinase K solution to the tissue pellet and resuspend completely by vortexing for 10 sec. Incubate the preparation at 50 C in a Thermo-Shaker. The time required for the lysis depends on the type and amount of tissue to be prepared and is usually 30 min. Pre-heat thermomixer to 95 C during incubation time. The time required for the lysis of embedded material can be longer than for fresh tissues. If no Thermo-Shaker is available, mix the sample 3 to 4 times during incubation time by vortexing for 10 sec. Incubate sample in the thermomixer pre-heated to 95 C for 1 h. Do not place the lysate into the thermomixer until it has reached 95 C! 4. Loading and Binding Add 200 µl DNA Binding Buffer per 400 µl DNA Lysis Buffer T and mix thoroughly by pipetting. After addition of the DNA Binding Buffer a precipitate can form, which however has no influence on the DNA isolation. Place a PerfectBind DNA Column in a 2 ml Collection Tube and load up to 750 µl of the preparation (inclusive all precipitates) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through. Repeat this step until the entire preparation is loaded. Discard the flow-through and the Collection Tube. 5. Washing I Add 650 µl of the diluted DNA Wash Buffer (Buffer concentrate plus 1.5 volume absolute ethanol) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through, keep the Collection Tube. 6. Washing II Repeat the washing with 650 µl DNA Wash Buffer as described in step 5. Discard the Collection Tube. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 26

30 7. Drying (Important step! Do not reduce centrifugation time!) Place the PerfectBind DNA Column in a Collection Tube and dry the column completely by centrifugation for 2 min at x g*. 8. Elution Place the PerfectBind DNA Column in a new 1.5 ml tube and pipette µl Elution Buffer directly onto the membrane. Incubate for 3 min at room temperature, then centrifuge for 1 min at x g*. If necessary repeat the elution step once more with additional µl of the Elution Buffer. The yields can be slightly improved by incubating the column at 70 C instead of room temperature before centrifuging or by using Elution Buffer pre-heated to 70 C. The final yield can be increased together with the concentration of the DNA, if the eluate is used for a second elution. But note that the yield is about 30 % decreased compared to a second elution with a fresh aliquot of Elution Buffer. Use a maximum of 40 mg of tissue per PerfectBind DNA Column to be prepared, otherwise the column will be overloaded. If you need to isolate higher amounts of DNA, divide the lysate on more than one PerfectBind DNA Column. Adapt the volume of buffers and solutions to bigger sample volume. For example add 800 µl DNA Lysis Buffer T and 40 µl Proteinase K solution to 80 mg of tissue material. Also adapt the volumes of DNA Binding Buffer in the following steps. The yield and the quality of the extracted DNA depends on the size and the age of the starting material. Tissue fixed with paraformaldehyd leads to degraded DNA and RNA. Although the degree of degradation of the nucleic acids depends on the fixative. The resulting fragments are usually smaller than 500 bp. D. DNA isolation from mouse tail snips Required materials to be supplied by the user:! 100 % ethanol! Sterile pipette tips and centrifuge tubes 1. Homogenisation and Lysis Place cm mouse tail or alternatively 0.4 cm rat tail in a 1.5 ml tube and optionally in addition mash the sample at the inside of the reaction tube with a pipette tip. The mice should not be older than 6 weeks, otherwise the lysis will be difficult and the DNA yields will be decreased. The best results have been shown with samples from 2 to 4 week old mice. These samples can be stored at 70 C until the DNA isolation is done. The wound should be professionally treated and the mouse should be marked with an adequate label. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 27

31 Add 400 µl DNA Lysis Buffer T, 20 µl Proteinase K and 15 µl RNase A (20 mg/ml). Mix the lysate thoroughly by vortexing for 10 sec and incubate 2 to 3 h at 50 C in a Thermo- Shaker. Lysis time can also be extended, but should not be continued, when the raw material is completely lysed. If no Thermo-Shaker is available, mix the sample 3 to 4 times during incubation time by vortexing for 10 sec. Complete lyses of the mouse tail snips is not necessary for high yields and can lead to degradation of the genomic DNA. Centrifuge the lysed solution for 30 sec at x g* to pellet down unlysable debris. Transfer the supernatant carefully in a new 1.5 ml tube without carrying-over parts of the debris pellet. 2. Loading and Binding Add 400 µl DNA Binding Buffer per 400 µl DNA Lysis Buffer T and mix thoroughly by pipetting. After addition of the DNA Binding Buffer a precipitate can form, which however has no influences on the DNA isolation. Place a PerfectBind DNA Column in a 2 ml Collection Tube and load up to 750 µl of the preparation (inclusive all precipitates) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through. Repeat this step until the entire preparation is loaded. Discard the flow-through and the Collection Tube. 3. Washing I Add 650 µl of the diluted DNA Wash Buffer (Buffer concentrate plus 1.5 volume absolute ethanol) on the column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column with the Collection Tube for 1 min at x g*. Discard the flow-through, keep the Collection Tube. 4. Washing II Repeat the washing with 650 µl DNA Wash Buffer as described in step 3. Discard the Collection Tube. 5. Drying (Important step! Do not reduce centrifugation time!) Place the PerfectBind DNA Column in a Collection Tube and dry the column completely by centrifugation for 2 min at x g*. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 28

32 6. Elution Place the PerfectBind DNA Column in a new 1.5 ml tube and pipette 200 µl Elution Buffer directly onto the membrane. Incubate for 3 min at room temperature, then centrifuge for 1 min at x g*. If necessary repeat the elution step once more with additional 200 µl of the Elution Buffer. The yields can be slightly improved by incubating the column at 70 C instead of room temperature before centrifuging or by using Elution Buffer pre-heated to 70 C. The final yield can be increased together with the concentration of the DNA, if the eluate is used for a second elution. But note that the yield is about 30 % decreased compared to a second elution with a fresh aliquot of Elution Buffer. Do not use more than 0.8 cm of mouse tail snip per PerfectBind DNA Column for the preparation of genomic DNA, otherwise the column will be overloaded. If you need to isolate higher amounts of DNA, divide the lysate on more than one PerfectBind DNA Column. Adapt the volume of buffers and solutions to bigger sample volume. Use for example 800 µl of DNA Lysis Buffer T and 40 µl of Proteinase K solution for 1.6 cm mouse tail. Also adapt the volumes of DNA Binding Buffer in the following steps. CONCENTRATING THE DNA Genomic DNA purified with the peqgold Tissue DNA Mini Kits can be further concentrated if required. Add NaCl to an end concentration of 0.1 M and 2 sample volumes of absolute ethanol. Incubate thoroughly by vortexing and incubate for 10 min at 20 C. Centrifuge for 15 min at x g* and discard the supernatant. Add 700 µl of 80 % ethanol and centrifuge for 2 min at x g*. Discard the supernatant, air-dry the pellet for 2 min and dissolve the DNA in 20 µl of Elution Buffer or sterile, deionised water. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 32 peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 29

33 QUANTITATION AND STORAGE OF DNA To determine the concentration and the purity of a DNA containing solution, the absorbance of a 10- to 50-fold diluted aliquot is measured at 260 nm and 280 nm in a spectrophotometer. One A 260 unity corresponds to 50 µg of DNA per ml. The concentration can be determined as follows: DNA concentration (µg/ml) = absorbance 260 x 50 x dilution factor Alternatively the approximate yield and the quality of the received DNA can also be determined by agarose gel electrophoresis with subsequent ethidium bromide staining and comparison with well-known DNA samples. The A 260/280 ratio of pure nucleic acids is 2.0. Generally genomic DNA isolated with the peqgold Tissue DNA Mini Kit shows ratios between 1.7 and 1.9 corresponding to a purity of 85 % to 95 %. Genomic DNA isolated with the peqgold Tissue DNA Mini Kits can be stored in Elution Buffer, 10 mm Tris-HCl (ph 9.0) or sterile, deionised water for several years at 20 C. Avoid frequent freezing and thawing as this will shear the DNA and result in a reduction of molecule size. ORDERING INFORMATION For the isolation of genomic DNA from cells, fresh or paraffin-embedded tissue and mouse tail snips: peqgold Tissue DNA Mini Kit Preparations (Classic Line) Preparations Preparations peqgold Tissue DNA Mini Kit Preparations (Safety Line) Preparations Preparations peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 30

34 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Possible Cause Suggestions Clogged column Incomplete lysis Extend incubation time of lysis with DNA Lysis Buffer T and Proteinase K solution. Add the correct volume of DNA Binding Buffer and extend incubation time at 70 C by 10 min. Sample too large Sample too viscous Increase volumes of Proteinase K solution, DNA Lysis Buffer T and DNA Binding Buffer. Distribute lysate on more than one column. Dilute lysate with 10 mm Tris-HCl and divide sample into multiple tubes. Low DNA yield Poor elution Repeat elution or increase elution volume. Incubate column at 70 C for 5 min with Elution Buffer before centrifugation. No DNA eluted Improper washing Clogged column Poor cell and/or protein lysis in DNA Lysis Buffer T Poor cell lysis due to improper mixing with DNA Binding Buffer No ethanol added to DNA Wash Buffer concentrate Low A 260/280 ratio Resin from the column present in the eluate Problems with downstream applications Poor cell lysis due to incomplete mixing with DNA Binding Buffer Incomplete cell lysis or protein degradation Salt carry-over Ethanol carry-over DNA Wash Buffer concentrate must be diluted with ethanol before use. See above. Tissue sample must be cut or minced into small pieces. Increase incubation time at 50 C with DNA Lysis Buffer T. Mix thoroughly with DNA Binding Buffer prior to loading PerfectBind DNA Column. Dilute DNA Wash Buffer with the indicated volume of absolute ethanol before use. Avoid centrifugation at speeds higher than specified. The material can be removed from the eluate by centrifugation and will not interfere with enzymatic reactions. Vortex the sample with DNA Binding Buffer immediately and completely. Increase incubation time with DNA Lysis Buffer T and Proteinase K solution. Ensure that no visible pieces of tissue remain. Ensure that the DNA Wash Buffer is at room temperature. Dry the columns after the second washing for at least 2 min by centrifugation at x g*. peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 31

35 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Tissue DNA Mini Kit Order No.: / PEQLAB_v0815_E 32