peqgold Total RNA Kit

Transkript

1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Total RNA Kit V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 Eukaryotische Zellen und Gewebe 6 DNA-KONTAMINATIONEN 9 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 9 RNA-QUALITÄT 10 BESTELLINFORMATIONEN 10 TROUBLESHOOTING TIPS 11 CONTENT INTRODUCTION 12 PRINCIPLE 12 KIT COMPONENTS 13 STORAGE AND STABILITY 13 BEFORE STARTING 14 DANGEROUS COMPONENTS 15 PEQGOLD TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL 17 Eucaryotic cells and tissue 17 DNA CONTAMINATION 20 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 20 RNA QUALITY 20 ORDERING INFORMATION 21 TROUBLESHOOTING TIPS 22 APPENDIX 23

4 EINLEITUNG Der peqgold Total RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um bis zu 100 µg Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen und Geweben zu isolieren. Er gestattet die Bearbeitung einer oder zahlreicher Proben in weniger als 30 Minuten, wobei jeweils bis zu 1 x 10 7 Zellen oder bis zu 40 mg Gewebe eingesetzt werden können. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln müssen nicht durchgeführt werden. Obwohl der Kit prinzipiell auch für die Extraktion von RNA aus Vollblut geeignet ist, empfehlen wir hierfür die Verwendung des peqgold Blood RNA Kits. RNA, die mit dem peqgold Total RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease Protection Assays und in vitro-translationen, weiterverwendet werden. Der peqgold Total RNA Kit wird wahlweise mit Safety-Line oder mit Classic-Line Säulen geliefert (Safety-Line, Best.-Nr xx oder Classic-Line, Best.-Nr xx). Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das Handling. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Total RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 100 µg nicht degradierter RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen. Zudem kann auch mirna mit Hilfe eines speziellen Protokolls effizient isoliert werden. Aufzuarbeitende Zellen und Gewebe werden zunächst homogenisiert und unter denaturierenden Bedingungen lysiert, wobei alle vorhandenen RNasen und sonstige Enzyme effizient inhibiert werden. Das Lysat wird auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris und andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in sterilem RNase-freien Wasser eluiert. peqgold Total RNA Kit 1 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

5 KITBESTANDTEILE peqgold Total RNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Best.-Nr. Safety-Line Best.-Nr. Classic-Line Bestandteile PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes RNA Lysis-Buffer T 2 x 1,5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (konz.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung des peqgold Total RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im RNA Lysis Buffer T bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. peqgold Total RNA Kit 2 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglich durchgeführt werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.! Der verdünnte RNA Wash Buffer II kann bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur ausgeführt werden. peqgold Total RNA Kit 3 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Total RNA Kit Bestandteile PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns 2 ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T RNA Wash Buffer I Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Total RNA Kit 4 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H302+H312+H332 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H314 H225 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Total RNA Kit 5 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

9 PEQGOLD TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE Eukaryotische Zellen und Gewebe Benötigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind:! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol in sterilem RNase-freien dh 2O! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen 1. Homogenisierung und Lyse a. Gewebe 40 mg Gewebe (ca. 3 mm 3 ) ausschneiden und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Gewebestück mittels Pistill in einem Keramikmörser pulverisieren und in ca. 10 ml flüssigem Stickstoff aufnehmen. Flüssiger Stickstoff kann schwerste Verletzungen hervorrufen. Bei entsprechenden Arbeiten sollten deshalb immer Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden. Suspension vorsichtig in ein, mit flüssigem Stickstoff vorgekühltes, 15 ml Polypropylenröhrchen füllen. Dabei muss sorgfältig darauf geachtet werden, dass es durch das heftige Kochen des flüssigen Stickstoffs nicht zum Verlust von Teilen der Probe kommt. Nach dem vollständigen Verdampfen des Stickstoffs 400 µl RNA Lysis Buffer T zugeben. Eine DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken, das Lysat auf die DNA Removing Column laden und anschließend für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Für RNase-reiche Gewebe oder größere Mengen an Ausgangsmaterial kann die Menge an RNA Lysis Buffer T auf 600 µl erhöht werden. Es sollten jedoch keinesfalls mehr als 50 mg Gewebe verwendet werden. Die Homogenisierung von Gewebe kann auch mit Hilfe von Glas-, Teflon- oder elektrischen Homogenisatoren durchgeführt werden. b. Monolayer-Zellen Gewebekulturzellen, die in Monolayern wachsen (Fibroblasten, endotheliale Zellen, etc.), werden direkt in der Flasche oder Schale lysiert. Dazu Kulturmedium vollständig absaugen und 800 µl RNA Lysis Buffer T je T75-Flasche oder 10-cm-Schale zugeben. Für kleinere Kulturgefäße sind 400 µl RNA Lysis Buffer T ausreichend. Puffer dabei gleichmäßig über die ganze Oberfläche verteilen, um eine möglichst vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten. Eine DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken, das Lysat auf die DNA Removing Column laden und anschließend für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführen. Das beschriebene Vorgehen sollte einer Trypsinierung mit anschließendem Waschen vorgezogen werden, weil dadurch die Gefahr von RNase-Kontaminationen und RNA-Degradationen erheblich reduziert wird. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 23 peqgold Total RNA Kit 6 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

10 c. Zellsuspensionen Zellsuspension abzentrifugieren (5 Minuten bei rpm oder 400 x g*). Überstand verwerfen und die Zellen in 400 µl RNA Lysis Buffer T je 1 x 10 7 Zellen resuspendieren. Eine DNA Removing Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken, das Lysat auf die DNA Removing Column laden und anschließend für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Die Zellpellets sollten vor dem Lysieren nicht gewaschen werden, weil dadurch die Gefahr von RNase-Kontaminationen und RNA-Degradationen erheblich erhöht wird. 2. Laden und Binden Säulendurchfluss mit einem identischen Volumen 70 % Ethanol* (400 µl, 600 µl oder 800 µl) versetzen und durch Vortexen sorgfältig mischen. Eine PerfectBind RNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und Probe auf die PerfectBind RNA Column pipettieren. PerfectBind RNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. *Soll mirna aus den Proben isoliert werden, 70 % Ethanol durch 100 % Isopropanol ersetzen. Der Rest des Protokolls bleibt unverändert. Nach der Zugabe von 70 % Ethanol kann sich ein Präzipitat bilden, das mit der Probe auf die PerfectBind RNA Column gegeben werden muss. Das Fassungsvermögen der PerfectBind RNA Column beträgt 750 µl. Durch wiederholtes Befüllen und Zentrifugieren können jedoch auch größere Volumina bearbeitet werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die maximale Bindekapazität der PerfectBind RNA Column bei ca. 100 µg RNA liegt. 3. Waschen I PerfectBind RNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken, 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen, Collection Tube im nächsten Schritt weiter verwenden. 4. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: /02). a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75.0 µl * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 23 peqgold Total RNA Kit 7 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

11 Hinweise: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. PerfectBind RNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g* für 15 Sekunden zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 5) weiterverwenden. 5. Waschen II 600 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei x g* durch die PerfectBind RNA Column zentrifugieren. Waschschritt wiederholen. Säulendurchfluss verwerfen. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind RNA Column in das geleerte 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 7. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA mit 50 µl bis 100 µl sterilem RNase-freien dh 2O eluieren. Dazu das dh 2O direkt auf die Matrix pipettieren und 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-freien dh 2O auf 70 C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der PerfectBind RNA Column können die Erträge weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutions kann die RNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-freien dh 2O eluiert werden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 23 peqgold Total RNA Kit 8 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

12 DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT- PCRs muss deshalb in manchen Fällen ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column, der in das bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 4: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. Der Nachweis von DNA-Kontaminationen kann per PCR mit Hilfe von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse auf mögliche Kontaminationen zulässt. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. RNase-freies dh 2O ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatisch herabsetzen. Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in einer gepufferten Lösung wie beispielsweise TE verdünnt werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold Total RNA Kit erzielbare A 260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. RNA, die mit dem peqgold Total RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in sterilem RNasefreien dh 2O für mindestens ein Jahr bei 70 C aufbewahrt werden. peqgold Total RNA Kit 9 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

13 RNA-QUALITÄT Vor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierende Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst die Qualität der extrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rrnas repräsentieren. Auf dem Gel kann noch eine dritte distinkte Bande aus trnas erscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders hoch war. BESTELLINFORMATIONEN Für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut: peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Safety Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Classic Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Safety Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit 10 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

14 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Wenig oder keine RNA im Eluat Säule verstopft RNA- Degradation DNA- Kontamination Niedrige Absorptionsraten Probleme bei Folgereaktionen RNA bleibt auf der PerfectBind RNA Column PerfectBind RNA Column ist überladen Unvollständige Homogenisierung Schlechtes Ausgangsmaterial Ausgangsmaterial sofort nach Probennahme in Stickstoff einfrieren Ausgangsmaterial erst lysieren und dann lagern Präparation zügig und exakt nach Vorschrift durchführen RNase- Kontamination Physikalische Ähnlichkeit von RNA und DNA RNA in saurem Puffer oder Wasser verdünnt Salzrückstände im Eluat Elution wiederholen RNAse-freies-dH 2O vor dem Eluieren auf 70 C erwärmen PerfectBind RNA Column vor dem Eluieren für 10 min mit RNase-freiem dh 2O inkubieren Menge des Ausgangsmaterials reduzieren Probe vollständig homogenisieren Zentrifugationszeit verlängern Menge des Ausgangsmaterials reduzieren Nur RNase-freies Material verwenden und Handschuhe tragen. Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen. Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei 37 C inkubieren.) RNase-freies dh 2O ist sauer und kann die A 260- Werte dramatisch herabsetzen. Zum Messen in TE-Puffer verdünnen. Sicherstellen, dass Wash Buffer II mit 4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde. Sicherstellen, dass Wash Buffer II bei Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde. Waschschritt mit Wash Buffer II wiederholen. peqgold Total RNA Kit 11 Art.-Nr.: / PEQLAB_v0815_D

15 INTRODUCTION The peqgold Total RNA Kit provides a rapid and easy method for the isolation of up to 100 µg of total RNA from eukaryotic cells and tissues. This kit allows processing of a single or multiple samples in less than 30 min. Normally, up to 1 x 10 7 cells or 40 mg tissue can be used in a single experiment. There is no need for phenol/chloroform extractions and time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation or precipitation with isopropanol. While this kit may be used for isolation of RNA from whole blood, we recommend to use the peqgold Blood RNA Kit (product # ) as it is specifically designed for effective hemolysis and hemoglobin removal and gives therefore higher RNA yields from blood. RNA purified using the peqgold Total RNA Kit is ready for applications such as RT-PCR, Northern blotting, poly(a) + -RNA (mrna) purification, nuclease protection assays and in vitro translation. peqgold Total RNA Kits are available with Safety-Line (Order No xx) or Classic Line (Order No xx) columns. Safety-Line columns can be closed tightly by lids to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line columns do not have lids for a more comfortable handling. PRINCIPLE The peqgold Total RNA Kit uses the reversible binding properties of the PerfectBind RNA Column, a new silica-based material. This is combined with the speed of minicolumn spin technology. A specifically formulated high salt buffer system allows more than 100 µg of RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix. MiRNA can be isolated using an adapted protocol. Cells or tissues are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate RNases. Samples are then applied to the PerfectBind RNA Columns to which total RNA binds, while cellular debris and other contaminants are effectively washed out. High quality RNA is finally eluted in RNase-free sterile water. peqgold Total RNA Kit 12 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

16 KIT COMPONENTS peqgold Total RNA Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Order No. Safety-Line Order No. Classic-Line Components PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T 2 x 1,5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml RNA Wash Buffer II (conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY The peqgold Total RNA Kit components should be stored at room temperature. If stored under these conditions, all components are stable for at least 12 months from the date of purchase. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T. Warm up to 37 C to dissolve. peqgold Total RNA Kit 13 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

17 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using the supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! Under cool ambient conditions, crystals may form in RNA Lysis Buffer T. This is normal and the bottle should be warmed (37 C) to dissolve the salt before use.! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Add 8 ml 100% EtOH to 2 ml Wash Buffer II Add 80 ml 100% EtOH to 20 ml Wash Buffer II Add 3 x 80 ml 100% EtOH to 3 x 20 ml Wash Buffer II.! Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature.! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold Total RNA Kit 14 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

18 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Total RNA Kit Components PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns 2 ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T RNA Wash Buffer I Signal word / symbols Dangerous components H and P statements DANGER Guanidinthiocyanat %, CAS: DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer II (Konz.) RNase-free Water peqgold Total RNA Kit 15 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

19 H and P statements H302+H312+H332 H314 H225 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Descriptions Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage. Highly flammable liquid and vapour. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Total RNA Kit 16 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

20 PEQGOLD TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL Eucaryotic cells and tissue Materials to be supplied by the user:! 100 % Ethanol! 70 % Ethanol in sterile RNase-free dh 2O! Sterile RNase-free pipet tips and centrifuge tubes 1. Homogenization and lysis a. Tissue Excise tissue (~ 40 mg, 3 mm 3 ) and promptly freeze in a small volume of liquid nitrogen. Grind tissue with a ceramic mortar and pestle under approximately 10 ml of liquid nitrogen. Wear gloves and take great care when working with liquid nitrogen. Transfer the suspension into a pre-cooled 15 ml polypropylene tube. If the tube is not precooled (in liquid nitrogen), the suspension will boil vigorously possibly causing loss of tissue. When the liquid nitrogen has completely evaporated, add 400 µl RNA Lysis Buffer T. Transfer the lysate directly into a DNA Removing Column placed in a 2.0 ml Collection Tube. Centrifuge at x g* for 1 min at room temperature. Transfer the flow-through lysate into a new 1.5 ml tube. For RNase rich tissues or more than 40 mg tissue, use 600 µl of RNA Lysis Buffer T. However, do not use more than 50 mg tissue. For homogenization, you may also use glass-, teflon- or electric homogenisators. b. Monolayer Cells For tissue culture cells grown in monolayer (adherent fibroblasts, endothelial cells etc.), lyse the cells directly in the culture vessel as follows. Aspirate culture medium completely and add RNA Lysis Buffer T directly to the cells. Use 800 µl for T75 flasks or 10 cm dishes, and 400 µl for smaller vessels. Pipet buffer over entire surface of vessel to ensure complete lysis. Transfer the lysate directly into a DNA Removing Column placed in a 2.0 ml Collection Tube. Centrifuge at x g* for 1 min at room temperature. Transfer the flow-through lysate into a new 1.5 ml tube. This method is preferable to trypsinization followed by washing because it minimizes RNA degradation by nuclease contamination. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 23 peqgold Total RNA Kit 17 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

21 c. Suspension culture For cells grown in suspension cultures, pellet cells at rpm (400 x g*) for 5 min. Pour off supernatant and add 400 µl RNA Lysis Buffer T per 1 x 10 7 cells. Transfer the lysate directly into a DNA Removing Column placed in 2.0 ml Collection Tube. Centrifuge at x g* for 1 min at room temperature. Transfer the flow-through lysate into a new 1.5 ml tube. 2. Load and Bind Add an equal volume (400 µl, 600 µl or 800 µl) 70 % Ethanol* to the lysate and mix thoroughly by vortexing. Place a PerfectBind RNA Column in a new 2.0 ml Collection Tube (supplied) and add the lysate directly to the membrane. Centrifuge the PerfectBind RNA Column / Collection Tube assembly at x g* for 1 min. Discard the flowthrough liquid and Collection Tube. *If mirna shall be isolated use 100 % isopropanol instead of 70 % Ethanol. The rest of the protocol remains unchanged. A precipitate may form on addition of 70 % ethanol. Vortex and add the entire mixture to the column. The maximum capacity of the PerfectBind RNA Column is 750 µl, larger volumes can be loaded successively. However, the total binding capacity of a PerfectBind RNA Column is approx. 100 µg RNA. 3. Wash I Place the PerfectBind RNA Column in a fresh 2.0 ml Collection Tube, add 500 µl RNA Wash Buffer I to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 15 sec at x g*. (supplied). Discard the flow-throw liquid and reuse the collection tube in the next step. 4. DNase Digestion (optional) Since PerfectBind RNA Column technology actually removes most of DNA without a DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75.0 µl * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 23 peqgold Total RNA Kit 18 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

22 Note: 1. DNase I is very sensitive to physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I digestion buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA Column. c. Incubate at room temperature (25 30 C) for 15 minutes. d. Place the PerfectBind RNA Column into a 2.0 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Incubate the PerfectBind RNA Column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g* for 15 sec and discard flow-through. Re-use collection tube in the next step. Continue with step Wash II Add 600 µl completed RNA Wash Buffer II to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 15 sec at x g*. Discard the flow-through liquid. Repeat this wash step and discard the flow-through liquid. 6. Dry (Important! Do not skip this step!) Place the PerfectBind RNA Column containing your RNA in the collection tube used in step 5 and centrifuge for 2 min at x g* to completely dry the column matrix. This step is essential to remove ethanol from the column. 7. Elution Place the PerfectBind RNA Column (step 6) into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 50 to 100 µl (depending on the desired final concentration of RNA) sterile RNAse-free dh 2O directly to the binding matrix in the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 1 min at x g* to elute RNA. A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA may be eluted with a higher volume of water. While an additional elution increase total RNA yield, the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution. Pre-heating RNase-free dh 2O to 70 C before adding to the PerfectBind RNA Column and incubating the PerfectBind RNA Column for 5 min at room temperature before centrifugation may increase yield. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 23 peqgold Total RNA Kit 19 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

23 DNA CONTAMINATION No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol between the washing steps (see page 14/15). Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. A PCR reaction, which uses the RNA as template, will also allow the detection of DNA contamination. QUANTITATION AND STORAGE OF RNA Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at 260 nm and 280 nm. RNase-free water is slightly acidic and can dramatically lower absorption values. We suggest that you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometric analysis. One A 260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows: RNA conc. (µg /ml) = Absorption Dilution Factor The ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8 indicates > 90 % nucleic acid. Store RNA samples at 70 C in sterile RNase-free dh 2O. Under such conditions RNA prepared with the peqgold system is stable for at least one year. RNA QUALITY It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications. Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These represent the 28S and 18S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA, then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling or storage. A third RNA band, the trna band, may be visible on the gel when a large number of cells was processed. peqgold Total RNA Kit 20 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

24 ORDERING INFORMATION For RNA isolation from cells, tissues and blood: peqgold Total RNA Kit Preparations (Safety Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit Preparations (Classic Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Safety Line) Preparations Preparations peqgold Total RNA Kit 21 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

25 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Little or no RNA eluted Clogged column Degraded RNA Problem in downstream applications DNA contamination Low Absorption ratios RNA remains on the PerfectBind RNA Column PerfectBind RNA Column is overloaded Incomplete homogenization Source RNase contamination Salt carry-over during elution RNA diluted in acidic buffer or water Repeat elution Pre-heat RNase-free water to 70 C prior to elution Incubate column for 10 min with water prior to centrifugation Reduce quantity of starting material Completely homogenize sample Increase centrifugation time Reduce amount of starting material Freeze starting material quickly in liquid nitrogen Do not store tissue culture cells prior to extraction unless they are lysed first Follow protocol closely and work quickly Ensure not to introduce RNase during the procedure Check buffers for RNase contamination Ensure Wash Buffer II Concentrate has been diluted with 4 volumes of 100 % ethanol as indicated on bottle Diluted Wash Buffer II must be stored and used at room temperature Repeat wash with Wash Buffer II Digest with RNase-free DNase and incubate at 37 C for 5 min RNase-free treated water is acidic and can dramatically lower Abs 260 values Use TE buffer to dilute RNA prior to spectrophotometric analysis peqgold Total RNA Kit 22 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

26 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Total RNA Kit 23 Order No.: / PEQLAB_v0815_E

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