peqgold Tissue DNA/RNA Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Tissue DNA/RNA Kit V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KITBESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD TISSUE DNA/RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 A RNA Isolation aus eukaryotischen Gewebeproben 6 B RNA Isolation aus eukaryotischen Zellen 9 C RNA Isolation aus Bakterienzellen 11 DNA-KONTAMINATIONEN 14 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 14 RNA-QUALITÄT 15 BESTELLINFORMATIONEN 15 TROUBLESHOOTING TIPS 16 CONTENT INTRODUCTION 17 PRINCIPLE 17 KIT COMPONENTS 18 STORAGE AND STABILITY 18 DANGEROUS COMPONENTS 19 BEFORE STARTING 21 PEQGOLD TISSUE DNA/RNA ISOLATION PROTOCOL 22 A DNA and RNA extraction from tissue samples 22 B DNA and RNA isolation from eukaryotic cells 25 C RNA isolation from bacterial cells 27 DNA CONTAMINATION 29 QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 29 RNA QUALITY 30 ORDERING INFORMATION 30 TROUBLESHOOTING TIPS 31 APPENDIX 32

4 EINLEITUNG Der peqgold Tissue DNA/RNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um gleichzeitig bis zu 60 µg Gesamt-RNA und bis zu 40 µg DNA aus eukaryotischen Zellen und Geweben zu isolieren. Er gestattet die Bearbeitung einer oder zahlreicher Proben in weniger als 40 Minuten, wobei jeweils bis zu 5 x 10 6 Zellen, bis zu 20 mg Gewebe oder bis zu 1 x 10 9 gram-positive oder negative Bakterienzellen eingesetzt werden können. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln müssen nicht durchgeführt werden. Obwohl der Kit prinzipiell auch für die Extraktion von RNA aus Vollblut geeignet ist, empfehlen wir hierfür die Verwendung des peqgold Blood RNA Kits. RNA und DNA, die mit dem peqgold Tissue DNA/RNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease Protection Assays und in vitro-translationen, weiterverwendet werden. Der peqgold Tissue DNA/RNA Kit wird wahlweise mit Safety-Line oder mit Classic-Line Säulen geliefert (Safety-Line, Best.-Nr xx oder Classic-Line, Best.-Nr xx). Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das Handling. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Tissue DNA/RNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 60 µg nicht degradierter RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen sowie parallel die Aufreinigung von 40 µg DNA aus der gleichen Probe. Aufzuarbeitende Zellen und Gewebe werden zunächst homogenisiert und unter denaturierenden Bedingungen lysiert, wobei alle vorhandenen RNasen, DNasen und sonstige Enzyme effizient inhibiert werden. Das Lysat wird sowohl auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden, als auch auf eine PerfectBind DNA Removing Column, aus der die gebundene DNA im gleichen Arbeitsgang isoliert werden kann. Die maximale Bindekapazität der Säulen beträgt ca. 100 µg für RNA und mehr als 50 µg für DNA. Zellulärer Debris und andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in sterilem RNase-freien Wasser eluiert. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 1 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

5 KITBESTANDTEILE peqgold Tissue DNA/RNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Best.-Nr. Safety-Line Best.-Nr. Classic-Line Bestandteile PerfectBind RNA Columns (lachs) DNA Removing Columns (mint) ml Collection Tubes RNA Lysis-Buffer T 2 x 1,5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 8 ml 80 ml 300 ml RNA Wash Buffer II (konz.) 2,5 ml 25 ml 2 x 45 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Die Aufbewahrung des peqgold Tissue DNA/RNA Kits sollte bei Raumtemperatur erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im RNA Lysis Buffer T bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 2 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu vermeiden.! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, aber auch so zügig wie möglich durchgeführt werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im RNA Lysis Buffer T zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: ,5 ml RNA Wash Buffer II mit 10 ml 100 % EtOH mischen. 25 ml RNA Wash Buffer II mit 100 ml 100 % EtOH mischen. 2 x 45 ml RNA Wash Buffer II mit 2 x 180 ml 100 % EtOH mischen.! Der verdünnte RNA Wash Buffer II kann bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur ausgeführt werden. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 3 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Tissue DNA/RNA Kit Bestandteile Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze PerfectBind RNA Columns (lachs) DNA Removing Columns (mint) ml Collection Tubes RNA Lysis-Buffer T DANGER Guanidinthiocyana t, 40-50%, CAS: H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer I DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10- <25%, CAS: , H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, RNA Wash Buffer II (konz.) RNase-free Water peqgold Tissue DNA/RNA Kit 4 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H225 Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H302+H312+H332 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 5 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

9 PEQGOLD TISSUE DNA/RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE Benötigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind:! 100 % Ethanol! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen! ddh 2O Optional:! DNase I! Lysozym! TE Puffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) A RNA Isolation aus eukaryotischen Gewebeproben 1. Homogenisierung und Lyse Zur Homogenisierung von Gewebeproben können sowohl handelsübliche Rotor-Stator- Homogenisatoren als auch Kugelmühlen, wie z.b. Precellys 24/24-Dual eingesetzt werden. Ebenso kann die Homogenisierung mit einem Mörser unter flüssigem Stickstoff erfolgen, wobei das Gewebe zu feinem Pulver vermahlen wird. a. Homogenisierung mit Rotor-Stator-Homogenisatoren oder Kugelmühlen wie z.b. Precellys 24/24-Dual Bis zu 20 mg frisches oder gefrorenes Gewebe in einem für den Homogenisator geeigneten Probengefäß aufnehmen. 450 µl RNA Lysis Buffer T zugeben. Probe nach Herstellerangaben möglichst vollständig homogenisieren. Homogenat in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Die Probe kann direkt zur RNA Isolation verwendet werden (s. Schritt 2 im Protokoll) oder für eine spätere Verwendung bei -20 C gelagert werden. b. Homogenisierung mittels Mörser und flüssigem Stickstoff Bis zu 20 mg frisches oder gefrorenes Gewebe unter Zugabe von flüssigem Stickstoff in einem Mörser zu feinem Pulver mahlen. Pulverisierte Probe in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Die Probe darf dabei nicht auftauen! 450 µl Lysis Buffer T zugeben und für einen geeigneten Zeitraum unter Schütteln inkubieren. Die Probe kann direkt zur RNA Isolation verwendet werden (s. Schritt 2 im Protokoll) oder für eine spätere Verwendung bei -20 C gelagert werden. Flüssiger Stickstoff kann schwerste Verletzungen hervorrufen. Bei entsprechenden Arbeiten sollten deshalb immer Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 6 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

10 2. Bindung der genomischen DNA an die DNA Removing Column (mint) Nach der Lyse unverdautes Material durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute abzentrifugieren. Setzen Sie eine DNA Removing Column (mint) in ein 2.0 ml Collection Tube. Pipettieren Sie vorsichtig den Überstand des zentrifugierten Lysats auf die DNA Removing Column (mint) und zentrifugieren Sie bei x g* für 2 Minuten. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Auf keinen Fall das Filtrat verwerfen, da dieses die zu isolierende RNA enthält! Setzen Sie die DNA Removing Column (mint) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Die genomische DNA ist an den Silikafilter der DNA Removing Column gebunden und wird im Anschluss an den RNA Bindungsschritt weiter verarbeitet. 3. Bindung der Total-RNA an die PerfectBind RNA Column (lachs) Setzen Sie eine PerfectBind RNA Column (lachs) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Geben Sie das gleiche Volumen (ca. 400 µl) 70 % Ethanol zum Filtrat aus Schritt 2. Mischen Sie die Probe vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Pipettieren Sie die Probe jetzt auf die PerfectBind RNA Column (lachs) und zentrifugieren Sie für 2 Minuten bei x g*. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Verwerfen Sie jetzt das 2.0 ml Collection Tube inklusive Filtrat und setzen Sie die PerfectBind RNA Column (lachs) auf ein neues 2.0 ml Collection Tube. 4. Parallel Isolation von DNA und RNA: DNA Removing Column (mint) mit DNA und PerfectBind RNA Column (lachs) mit RNA 4.1 Waschen I Jeweils 500 µl RNA Wash Buffer I auf beide Säulen geben und bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 7 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

11 4.2 DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (lachs) (Bestellnr.: /02). a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75.0 µl Hinweise: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 30 C) für 15 Minuten inkubieren. d. PerfectBind RNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei x g* für 15 Sekunden zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 4.3) weiterverwenden. 4.3 Waschen II Jeweils 700 µl RNA Wash Buffer II auf beide Säulen geben und bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4.4 Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Beide Säulen durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. Collection Tube inkl. Durchfluss verwerfen. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 8 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

12 4.5 Elution Beide Säulen in jeweils ein frisches 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Geben Sie 100 µl TE Puffer auf die DNA Removing Column (mint) und µl RNase freies Wasser auf die PerfectBind RNA Column (lachs). Inkubieren Sie beide Säulen bei Raumtemperatur für ca. 1 Minute. Anschließend bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Abhängig von der erwarteten Ausbeute oder der benötigten Konzentration von DNA und RNA können verschiedene Elutionsvolumina an TE Puffer und RNase free Water eingesetzt werden. Ein geringeres Volumen führt zu einer höheren Konzentration, während ein höheres Volumen die Ausbeute erhöht bei reduzierter Konzentration. Es sollten nicht weniger als 20 µl Elutionsvolumen eingesetzt werden. Isolierte Nukleinsäuren im Anschluss entsprechend weiterverarbeiten oder lagern (RNA bei -70 C und DNA bei -20 C). B RNA Isolation aus eukaryotischen Zellen Hinweis: Es können maximal bis zu 5 x 10 6 Zellen eingesetzt werden! 1. Zelllyse 400 µl Lysis Buffer T zum Zellpellet geben und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zellen durch Auf- und Abpipettieren vollständig resuspendieren. Probe für weitere 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Für maximalen RNA-Ertrag ist eine vollständige Homogenisierung und Lyse des Zellpellets ausschlaggebend! Es sollten keine Zellklumpen mehr sichtbar sein! 2. Bindung der genomischen DNA an die DNA Removing Column (mint) Nach der Lyse unverdautes Material durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute abzentrifugieren. Setzen Sie eine DNA Removing Column (mint) in ein 2.0 ml Collection Tube. Pipettieren Sie vorsichtig den Überstand des zentrifugierten Lysats auf die DNA Removing Column (mint) und zentrifugieren Sie bei x g* für 2 Minuten. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Auf keinen Fall das Filtrat verwerfen, da dieses die zu isolierende RNA enthält! * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 9 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

13 Setzen Sie die DNA Removing Column (mint) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Die genomische DNA ist an den Silikafilter der DNA Removing Column gebunden und wird im Anschluss an den RNA Bindungsschritt weiter verarbeitet. 3. Bindung der Total-RNA an die PerfectBind RNA Column (lachs) Setzen Sie eine PerfectBind RNA Column (lachs) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Geben Sie das gleiche Volumen (ca. 400 µl) 70 % Ethanol zum Filtrat aus Schritt 2. Mischen Sie die Probe vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Pipettieren Sie die Probe jetzt auf die PerfectBind RNA Column (lachs) und zentrifugieren Sie für 2 Minuten bei x g*. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Verwerfen Sie jetzt das 2.0 ml Collection Tube inklusive Filtrat und setzen Sie die PerfectBind RNA Column (lachs) auf ein neues 2.0 ml Collection Tube. 4. Parallel Isolation von DNA und RNA: DNA Removing Column (mint) mit DNA und PerfectBind RNA Column (lachs) mit RNA 4.1 Waschen I Jeweils 500 µl RNA Wash Buffer I auf beide Säulen geben und bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4.2 DNase I Verdau (optional) Optional. Protokoll siehe S Waschen II Jeweils 700 µl RNA Wash Buffer II auf beide Säulen geben und bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4.4 Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Beide Säulen durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. Collection Tube inkl. Durchfluss verwerfen. 4.5 Elution Beide Säulen in jeweils ein frisches 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 10 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

14 Geben Sie 100 µl TE Puffer auf die DNA Removing Column (mint) und µl RNase freies Wasser auf die PerfectBind RNA Column (lachs). Inkubieren Sie beide Säulen bei Raumtemperatur für ca. 1 Minute. Anschließend bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Abhängig von der erwarteten Ausbeute oder der benötigten Konzentration von DNA und RNA können verschiedene Elutionsvolumina an TE Puffer und RNase free Water eingesetzt werden. Ein geringeres Volumen führt zu einer höheren Konzentration, während ein höheres Volumen die Ausbeute erhöht bei reduzierter Konzentration. Es sollten nicht weniger als 20 µl Elutionsvolumen eingesetzt werden. Isolierte Nukleinsäuren im Anschluss entsprechend weiterverarbeiten oder lagern (RNA bei -70 C und DNA bei -20 C). C RNA Isolation aus Bakterienzellen Hinweis: Es können maximal bis zu 1 x 10 9 Zellen eingesetzt werden! Wir empfehlen ein Vorinkubation mit Lysozym oder anderen Bakterien-lysierenden Enzymen (optional). Stocklösung Lysozym für gram(-) Bakterien: 20 mg/ml in wässriger Lösung. Lagerung der Lysozym Stocklösung in Aliquots bei -20 C. Stocklösung Lysozym für gram(+) Bakterien: 50 mg/ml in wässriger Lösung. Lagerung der Lysozym Stocklösung in Aliquots bei -20 C. Herstellung von TE Puffer: 10 mm Tris-HCl / 1 mm EDTA; ph Homogenisierung und Lyse Bakterienkultur für 2-5 Minuten bei x g* abzentrifugieren. Überstand so komplett wie möglich abnehmen. Für gram(-) Bakterien das Zellpellet in 100 µl TE Puffer unter Zugabe von 2 µl der entsprechenden Stocklösung Lysozym resuspendieren. Mehrmals auf- und abpipettieren. Die Lösung sollte klar und viskös werden. Für gram(+) Bakterien das Zellpellet in 100 µl TE Puffer unter Zugabe von 6 µl der entsprechenden Stocklösung Lysozym resuspendieren. Mehrmals auf- und abpipettieren. Solange inkubieren, bis die Lösung klar und viskös wird!. Hinweis: Die Menge an Lysozym sowie die Inkubationszeit können je nach Bakterienstamm variieren. Bitte beachten Sie auch die Herstellerangaben zum Lysozym. Eine vollständige Zerstörung der Zellwand ist wichtig! 450 µl Lysis Buffer T zum Lysat geben und gründlich vortexen oder mehrmals auf- und abpipettieren. Für 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 11 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

15 Hinweis: Für maximalen RNA-Ertrag ist eine vollständige Homogenisierung und Lyse des Zellpellets ausschlaggebend! Es sollten keine Zellklumpen mehr sichtbar sein! 2. Bindung der genomischen DNA an die DNA Removing Column (mint) Nach der Lyse unverdautes Material durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute abzentrifugieren. Setzen Sie eine DNA Removing Column (mint) in ein 2.0 ml Collection Tube. Pipettieren Sie vorsichtig den Überstand des zentrifugierten Lysats auf die DNA Removing Column (mint) und zentrifugieren Sie bei x g * für 2 Minuten. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Auf keinen Fall das Filtrat verwerfen, da dieses die zu isolierende RNA enthält! Setzen Sie die DNA Removing Column (mint) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Die genomische DNA ist an den Silikafilter der DNA Removing Column gebunden und wird im Anschluss an den RNA Bindungsschritt weiter verarbeitet. 3. Bindung der Total-RNA an die PerfectBind RNA Column (lachs) Setzen Sie eine PerfectBind RNA Column (lachs) in ein neues 2.0 ml Collection Tube. Geben Sie das gleiche Volumen (ca. 600 µl) 70 % Ethanol zum Filtrat aus Schritt 2. Mischen Sie die Probe vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Pipettieren Sie max. 650 µl der Probe auf die PerfectBind RNA Column (lachs) und zentrifugieren Sie für 1 Minuten bei x g*. Den Durchfluss verwerfen und Collection Tube wieder verwenden. Die verbliebene Probe auf die PerfectBind RNA Column (lachs) laden und erneut für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Sollte das Lysat nicht vollständig durch die Säule zentrifugiert worden sein, zentrifugieren Sie erneut bei höherer Geschwindigkeit oder verlängern Sie die Zentrifugationszeit. Verwerfen Sie jetzt das 2.0 ml Collection Tube inklusive Filtrat und setzen Sie die PerfectBind RNA Column (lachs) auf ein neues 2.0 ml Collection Tube. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 12 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

16 4. Parallel Isolation von DNA und RNA: DNA Removing Column (mint) mit DNA und PerfectBind RNA Column (lachs) mit RNA 4.1 Waschen I Jeweils 500 µl RNA Wash Buffer I auf beide Säulen geben und bei x g für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4.2 DNase I Verdau (optional) Optional. Protokoll siehe S Waschen II Jeweils 700 µl RNA Wash Buffer II auf beide Säulen geben und bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Durchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden. 4.4 Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Beide Säulen durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. Collection Tube inkl. Durchfluss verwerfen. 4.5 Elution Beide Säulen in ein frisches 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. Geben Sie 100 µl TE Puffer auf die DNA Removing Column (mint) und µl RNase freies Wasser auf die PerfectBind RNA Column (lachs). Inkubieren Sie beide Säulen bei Raumtemperatur für ca. 1 Minute. Anschließend bei x g* für 1 Minute zentrifugieren. Abhängig von der erwarteten Ausbeute oder der benötigten Konzentration von DNA und RNA können verschiedene Elutionsvolumina an TE Puffer und RNase free Water eingesetzt werden. Ein geringeres Volumen führt zu einer höheren Konzentration, während ein höheres Volumen die Ausbeute erhöht bei reduzierter Konzentration. Es sollten nicht weniger als 20 µl Elutionsvolumen eingesetzt werden. Isolierte Nukleinsäuren im Anschluss entsprechend weiterverarbeiten oder lagern (RNA bei -70 C und DNA bei -20 C). * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 13 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

17 DNA-KONTAMINATIONEN Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT- PCRs muss deshalb in manchen Fällen ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column, der in das bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 4: DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit RNase-freier DNase durchgeführt werden. Der Nachweis von DNA-Kontaminationen kann per PCR mit Hilfe von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse auf mögliche Kontaminationen zulässt. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. RNase-freies dh 2O ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatisch herabsetzen. Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in einer gepufferten Lösung wie beispielsweise TE verdünnt werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold Tissue DNA/RNA Kit erzielbare A 260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. RNA, die mit dem peqgold Tissue DNA/RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in sterilem RNase-freien dh 2O für mindestens ein Jahr bei 70 C aufbewahrt werden. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 14 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

18 RNA-QUALITÄT Vor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierende Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung zunächst die Qualität der extrahierten RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rrnas repräsentieren. Auf dem Gel kann noch eine dritte distinkte Bande aus trnas erscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders hoch war. BESTELLINFORMATIONEN Für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut: peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Safety Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Total RNA Kit Reinigungen (Classic Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Blood RNA Kit Reinigungen (Safety Line) Reinigungen Reinigungen peqgold Tissue DNA/RNA Kit 15 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

19 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe Wenig oder keine RNA im Eluat Säule verstopft RNA- Degradation DNA- Kontamination der isolierten RNA Niedrige Absorptionsraten Probleme bei Folgereaktionen RNA bleibt auf der PerfectBind RNA Column PerfectBind RNA Column ist überladen Unvollständige Homogenisierung Schlechtes Ausgangsmaterial RNase- Kontamination Physikalische Ähnlichkeit von RNA und DNA RNA in saurem Puffer oder Wasser verdünnt Salzrückstände im Eluat Ethanolrückstände im Eluat Elution wiederholen RNAse-freies-dH 2O vor dem Eluieren auf 70 C erwärmen PerfectBind RNA Column vor dem Eluieren für 5 min mit RNase-freiem dh 2O inkubieren Menge des Ausgangsmaterials reduzieren Probe vollständig homogenisieren Zellfragmente im Lysat länger abzentrifugieren Menge des Ausgangsmaterials reduzieren Ausgangsmaterial sofort nach Probennahme in Stickstoff einfrieren Ausgangsmaterial erst lysieren und dann lagern Präparation zügig und exakt nach Vorschrift durchführen. Nur sterile, RNase freie Materialien verwenden. Nur RNase-freies Material verwenden und Handschuhe tragen. Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen. Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei 37 C inkubieren.) Menge des Ausgangsmaterials reduzieren. Entsprechende Lysetechnik verwenden. RNase-freies dh 2O ist sauer und kann die A 260- Werte dramatisch herabsetzen. Zum Messen in TE-Puffer verdünnen. Sicherstellen, dass Wash Buffer II mit 4 Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde. Sicherstellen, dass Wash Buffer II bei Raumtemperatur gelagert und verwendet wurde. Waschschritt mit Wash Buffer II wiederholen. Trocknungsschritt entsprechend Protokoll durchführen oder verlängern. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 16 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_D

20 INTRODUCTION The peqgold Tissue DNA/RNA Kit provides a rapid and easy method for the parallel isolation of up to 60 µg of total RNA and up to 40 µg of DNA from the same sample of eukaryotic cells, tissues and gram+ and gram- bacteria. This kit allows processing of a single or multiple samples in less than 40 minutes. Normally, up to 5 x 10 6 cells, 20 mg tissue or up to 1 x 10 9 gram+ and gram- bacteria cells can be used in a single experiment. There is no need for phenol/chloroform extractions and time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation or precipitation with isopropanol. While this kit may be used for isolation of RNA from whole blood, we recommend to use the peqgold Blood RNA Kit (product # ) as it is specifically designed for effective hemolysis and hemoglobin removal and gives therefore higher RNA yields from blood. RNA and DNA purified using the peqgold Tissue DNA/RNA Kit is ready for downstream applications such as RT-PCR, Northern blotting, poly(a) + -RNA (mrna) purification, nuclease protection assays and in vitro translation. peqgold Tissue DNA/RNA Kits are available with Safety-Line (Order No xx) or Classic Line (Order No xx) columns. Safety-Line columns can be closed tightly by lids to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line columns do not have lids for a more comfortable handling. PRINCIPLE The peqgold Tissue DNA/RNA Kit uses the reversible binding properties of the PerfectBind RNA Column, a new silica-based material. This is combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated high salt buffer system allows up to 60 µg of RNA molecules greater than 200 bases to bind to the matrix. Cells, tissues or bacteria are first lysed under denaturing conditions that practically inactivate RNases. Samples are then applied to the PerfectBind DNA Removing columns and RNA Columns to which DNA and total RNA bind, while cellular debris and other contaminants are effectively washed out. High quality RNA is finally eluted in RNase-free sterile water. The maximum binding capacity is approx. 100 µg for RNA and more than 50 µg for DNA. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 17 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

21 KIT COMPONENTS peqgold Tissue DNA/RNA Kit 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Order No. Safety-Line Order No. Classic-Line Components PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes RNA Lysis Buffer T 2 x 1,5 ml 25 ml 100 ml RNA Wash Buffer I 8 ml 80 ml 300 ml RNA Wash Buffer II (conc.) 2,5 ml 25 ml 2 x 45 ml RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml Instruction manual STORAGE AND STABILITY The peqgold Tissue DNA/RNA Kit components should be stored at room temperature. If stored under these conditions, all components are stable for at least 12 months from the date of purchase. During shipment crystals may form in the RNA Lysis Buffer T. Warm up to 37 C to dissolve. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 18 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

22 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Tissue DNA/RNA Kit Components Signal word / symbols Dangerous components H and P statements PerfectBind RNA Columns DNA Removing Columns ml Collection Tubes RNA Lysis-Buffer T DANGER Guanidinthiocyana t, 40-50%, CAS: H302+H312+H332, H314, H412, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 RNA Wash Buffer I DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10- <25%, CAS: , H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, RNA Wash Buffer II (konz.) RNase-free Water peqgold Tissue DNA/RNA Kit 19 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

23 H and P statements H225 H314 H302+H312+H332 H412 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P405 P501 Descriptions Highly flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Harmful to aquatic life with long lasting effects. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Tissue DNA/RNA Kit 20 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

24 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using the supplied reagents.! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.! Under cool ambient conditions, crystals may form in RNA Lysis Buffer T. This is normal and the bottle should be warmed (37 C) to dissolve the salt before use.! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Add 10 ml 100% EtOH to 2.5 ml Wash Buffer II. Add 100 ml 100% EtOH to 25 ml Wash Buffer II. Add 2 x 180 ml 100% EtOH to 2 x 45 ml Wash Buffer II.! Store diluted RNA Wash Buffer II at room temperature.! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold Tissue DNA/RNA Kit 21 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

25 PEQGOLD TISSUE DNA/RNA ISOLATION PROTOCOL Materials to be supplied by the user:! 100 % Ethanol! Sterile RNase-free pipet tips and reaction tubes! ddh 2O Optional:! DNase I! Lysozyme! TE Buffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) A DNA and RNA extraction from tissue samples 1. Homogenization and lysis For the homogenization of tissue sample it is possible to use commercially available rotorstator homogenizer or bead mills, e.g. Precellys 24/24-Dual. It is also possible to disrupt the starting material using mortar and pestle in liquid nitrogen and grind the tissue sample to fine powder. To maximize the final yield of total RNA a complete homogenization of tissue sample is important. a. Homogenization of the tissue sample using a rotor-stator homogenizer or bead mills, e.g. Precellys 24/24-Dual Transfer the weighed amount (up to 20 mg) of fresh or frozen starting material in a suitable reaction vessel for the homogenizer. Add 450 µl RNA Lysis Buffer T. Homogenize the sample according to manufacturer s instructions. Transfer the homogenized tissue sample into a 1.5 ml reaction tube and place the sample under RNA Lysis Buffer T for longer storage at -20 C or use sample immediately for isolation of total RNA following the protocol step 2. b. Disruption of the tissue sample using a mortar and pestle and liquid nitrogen Transfer the weighed amount (up to 20 mg) of fresh or frozen starting material under liquid nitrogen and grind the material to a fine tissue powder. Transfer the powder into a 1.5 ml reaction tube. Don't allow the sample to thaw! Add 450 µl Lysis Buffer T and incubate the sample for appropriate time for a further lysis under continuous shaking. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 22 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

26 Finally place the sample under Lysis Buffer T for longer storage at -20 C or use sample immediately for isolation of genomic DNA/total RNA following the protocol step 2/3. 2. Binding of genomic DNA onto DNA Removing Columns (mint) After lysis spin down unlysed material by centrifugation at maximum speed for 1 minute. Place a DNA Removing Column (mint) into a 2.0 ml Collection tube. Transfer the supernatant of the lysed sample onto the DNA Removing Column (mint). Centrifuge at x g* for 2 minutes. Do not discard the filtrate, as the filtrate contains the RNA! If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Place the DNA Removing Column (mint) into a new 2.0 ml Collection Tube. The genomic DNA is bound onto the DNA Removing Column (mint). Processing of the DNA Removing Column (mint) will be continued after binding of the RNA onto the PerfectBind RNA Column. 3. Binding of total RNA onto PerfectBind RNA Column (salmon) Place a PerfectBind RNA Column (salmon) into a new 2.0 ml Collection Tube. Add an equal volume (approx. 400 µl) of 70 % Ethanol to the filtrate from step 2. Mix the sample by pipetting up and down several times. Transfer the sample onto the PerfectBind RNA Column (salmon). Centrifuge at x g* for 2 minutes. If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Discard the 2.0 ml Receiver Tube with filtrate. Place the PerfectBind RNA Column (salmon) into a new 2.0 ml Collection tube. The total RNA is bound on the PerfectBind RNA Column (salmon). Both Columns - DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) - will be processed in parallel now. 4. Parallel processing of both - DNA Removing Column (mint) for isolation of genomic DNA and PerfectBind RNA Column (salmon) for isolation of total RNA 4.1 Wash I Add 500 µl Wash Buffer I to each column and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 23 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

27 4.2 DNase Digestion (optional) Since PerfectBind RNA Column technology actually removes most of DNA without a DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order No ). a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Total volume 75.0 µl Note: 1. DNase I is very sensitive to physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture! Mix gently by inverting the tube. Prepare fresh DNase I digestion mixture directly before RNA isolation. 2. DNase I digestion buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers are not compatible with on-membrane DNase digestion! b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA Column. c. Incubate at room temperature (25 30 C) for 15 minutes. d. Place the PerfectBind RNA Column into a 2.0 ml Collection Tube and add 400 µl RNA Wash Buffer I. Incubate the PerfectBind RNA Column at benchtop for 5 minutes. Centrifuge at x g* for 15 sec and discard flow-through. Re-use collection tube in the next step. Continue with step 4.3 "Wash II". 4.3 Wash II Add 700 µl completed Wash Buffer II and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. 4.4 Dry (Important! Do not skip this step!) Place the columns into the 2.0 ml Collection tubes again. Centrifuge at x g* for 2 minutes to completely dry the column matrix. This step is essential to remove all traces of ethanol from the column. Discard the 2.0 ml Collection tube. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 24 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

28 4.5 Elution Place the DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) into a 1.5 ml Elution tube. Add 100 µl TE Buffer to the DNA Removing Column (mint) and µl RNase free Water to the PerfectBind RNA Column. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 6000 x g* for 1 minute. Depending on the extracted yield or the needed concentration of genomic DNA/total RNA you can also elute with different volumes of RNase-free water. A lower volume of TE Buffer/RNasefree water increases the concentration of DNA/RNA and a higher volume of TE Buffer/RNAsefree water leads to an increased yield but a lower concentration of genomic DNA and total RNA. Please note that the minimum of TE Buffer/RNase-free water should be 20 µl. Store nucleic acids at appropriate conditions (RNA at -70 C, DNA at -20 C) B DNA and RNA isolation from eukaryotic cells Up to 5 x 10 6 cells can be processed 1. Homogenization and lysis Add 400 µl Lysis Buffer T to the cell pellet. Incubate for 2 minutes at room temperature. Resuspend the cell pellet completely by pipetting up and down. Incubate the sample for further 3 minutes at room temperature. To maximize the final yield of total RNA a complete disruption and lysis of the cell pellet is important. No cell clumps should be visible after lysis step. 2. Binding of genomic DNA onto DNA Removing Columns (mint) After lysis spin down unlysed material by centrifugation at maximum speed for 1 minute. Place a DNA Removing Column (mint) into a 2.0 ml Collection tube. Transfer the supernatant of the lysed sample onto the DNA Removing Column (mint). Centrifuge at x g* for 2 minutes. Do not discard the filtrate, as the filtrate contains the RNA! If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Place the DNA Removing Column (mint) into a new 2.0 ml Collection Tube. The genomic DNA is bound onto the DNA Removing Column (mint). Processing of the DNA Removing Column (mint) will be continued after binding of the RNA onto the PerfectBind RNA Column. 3. Binding of total RNA onto PerfectBind RNA Column (salmon) Place a PerfectBind RNA Column (salmon) into a new 2.0 ml Collection Tube. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 25 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

29 Add an equal volume (approx. 400 µl) of 70 % Ethanol to the filtrate from step 2. Mix the sample by pipetting up and down several times. Transfer the sample onto the PerfectBind RNA Column (salmon). Centrifuge at x g* for 2 minutes. If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Discard the 2.0 ml Receiver Tube with filtrate. Place the PerfectBind RNA Column (salmon) into a new 2.0 ml Collection tube. The total RNA is bound on the PerfectBind RNA Column (salmon). Both Columns - DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) - will be processed in parallel now. 4. Parallel processing of both - DNA Removing Column (mint) for isolation of genomic DNA and PerfectBind RNA Column (salmon) for isolation of total RNA 4.1 Wash I Add 500 µl Wash Buffer I to each column and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. 4.2 DNase Digestion (optional) Optional! Protocol see page Wash II Add 700 µl completed Wash Buffer II and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. 4.4 Dry (Important! Do not skip this step!) Place the columns into the 2.0 ml Collection tubes again. Centrifuge at x g* for 2 minutes to completely dry the column matrix. This step is essential to remove all traces of ethanol from the column. Discard the 2.0 ml Collection tube. 4.5 Elution Place the DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) into a 1.5 ml Elution tube. Add 100 µl TE Buffer to the DNA Removing Column (mint) and µl RNase free Water to the PerfectBind RNA Column. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 6000 x g* for 1 minute. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 26 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

30 Depending on the extracted yield or the needed concentration of genomic DNA/total RNA you can also elute with different volumes of RNase-free water. A lower volume of TE Buffer/RNasefree water increases the concentration of DNA/RNA and a higher volume of TE Buffer/RNAsefree water leads to an increased yield but a lower concentration of genomic DNA and total RNA. Please note that the minimum of TE Buffer/RNase-free water should be 20 µl. Store nucleic acids at appropriate conditions (RNA at -70 C, DNA at -20 C) C RNA isolation from bacterial cells Please note that up to 1 x 10 9 cells can be processed. We recommend a pre-incubation of bacterial cells with Lysozyme or optionally other bacterial lysis proteins. Stock solution of Lysozyme for gram(-) bacteria: 20 mg/ml in water, storage of Lysozyme stock solution in aliquots at -20 C. Stock solution of Lysozyme for gram(+) bacteria: 50 mg/ml in water, storage of Lysozyme stock solution in aliquots at -20 C. Prepare TE Buffer: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph Homogenization and lysis Spin down the bacterial cells by centrifugation at 5000 x g* for 2-5 minutes. Discard the supernatant as complete as possible. For gram(-) bacteria resuspend the cell pellet in 100 µl TE Buffer and add 2 µl of the corresponding Lysozyme stock solution. Pipette up and down several times. The solution should become clear and viscous. For gram(+) bacteria resuspend the cell pellet in 100 µl TE Buffer and add 6 µl of the corresponding Lysozyme stock solution. Pipette up and down several times. The solution should become clear and viscous. The amount of Lysozyme and also the essential time for incubation may need to be diversified depending on bacterial strains. Read also the guideline of the Lysozyme supplier. A complete destruction of bacterial cell walls is important! Add 450 µl Lysis Buffer T to the sample and vortex vigorously or pipette sometimes up and down. Incubate the sample for further 3 minutes at room temperature. To maximize the final yield of total RNA a complete disruption and lysis of the cell pellet is important. No cell clumps should be visible after lysis step. 2. Binding of genomic DNA onto DNA Removing Columns (mint) After lysis spin down unlysed material by centrifugation at maximum speed for 1 minute. Place a DNA Removing Column (mint) into a 2.0 ml Collection tube. Transfer the * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 27 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

31 supernatant of the lysed sample onto the DNA Removing Column (mint). Centrifuge at x g* for 2 minutes. Do not discard the filtrate, as the filtrate contains the RNA! If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Place the DNA Removing Column (mint) into a new 2.0 ml Collection Tube. The genomic DNA is bound onto the DNA Removing Column (mint). Processing of the DNA Removing Column (mint) will be continued after binding of the RNA onto the PerfectBind RNA Column. 3. Binding of total RNA onto PerfectBind RNA Column (salmon) Place a PerfectBind RNA Column (salmon) into a new 2.0 ml Collection Tube. Add an equal volume (approx. 600 µl) of 70 % Ethanol to the filtrate from step 2. Mix the sample by pipetting up and down several times. Transfer 650 µl of the sample onto the PerfectBind RNA Column (salmon). Centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and place the PerfectBind RNA Column (violet) back into the 2.0 ml Collection tube. Load the residual sample on the PerfectSpin RNA Column and centrifuge again at x g* for 1 minute. If the solution has not completely passed through the Spin filter centrifuge again at higher speed or prolong the centrifugation time. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. The total RNA is bound on the PerfectBind RNA Column (salmon). Both Columns - DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) - will be processed in parallel now. 4. Parallel processing of both - DNA Removing Column (mint) for isolation of genomic DNA and PerfectBind RNA Column (salmon) for isolation of total RNA 4.1 Wash I Add 500 µl Wash Buffer I to each column and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. 4.2 DNase Digestion (optional) Optional! Protocol see page 24. * Translation g (rcf) / rpm see Appendix, p. 32 peqgold Tissue DNA/RNA Kit 28 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

32 4.3 Wash II Add 700 µl completed Wash Buffer II and centrifuge at x g* for 1 minute. Discard the filtrate and re-use the 2.0 ml Collection tube. 4.4 Dry (Important! Do not skip this step!) Centrifuge at x g* for 2 minutes to completely dry the column matrix. This step is essential to remove all traces of ethanol from the column. Discard the 2.0 ml Collection tube. 4.5 Elution Place the DNA Removing Column (mint) and PerfectBind RNA Column (salmon) into a 1.5 ml Elution tube. Add 100 µl TE Buffer to the DNA Removing Column (mint) and µl RNase free Water to the PerfectBind RNA Column. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at 6000 x g* for 1 minute. Depending on the extracted yield or the needed concentration of genomic DNA/total RNA you can also elute with different volumes of RNase-free water. A lower volume of TE Buffer/RNasefree water increases the concentration of DNA/RNA and a higher volume of TE Buffer/RNAsefree water leads to an increased yield but a lower concentration of genomic DNA and total RNA. Please note that the minimum of TE Buffer/RNase-free water should be 20 µl. Store nucleic acids at appropriate conditions (RNA at -70 C, DNA at -20 C) DNA CONTAMINATION No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work (such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion is a simple and fast method and can be integrated into the standard protocol between the washing steps (see page 14/15). Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination. A PCR reaction, which uses the RNA as template, will also allow the detection of DNA contamination. QUANTITATION AND STORAGE OF RNA Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at 260 nm and 280 nm. RNase-free water is slightly acidic and can dramatically lower absorption values. We suggest that you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometric analysis. One A 260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows: RNA conc. (µg /ml) = Absorption Dilution Factor peqgold Tissue DNA/RNA Kit 29 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

33 The ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8 indicates > 90 % nucleic acid. Store RNA samples at 70 C in sterile RNase-free dh 2O. Under such conditions RNA prepared with the peqgold system is stable for at least one year. RNA QUALITY It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications. Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These represent the 28S and 18S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA, then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling or storage. A third RNA band, the trna band, may be visible on the gel when a large number of cells was processed. ORDERING INFORMATION For RNA isolation from cells, tissues and blood: peqgold Tissue DNA/RNA Kit Preparations (Safety Line) Preparations Preparations peqgold Tissue DNA/RNA Kit Preparations (Classic Line) Preparations Preparations peqgold Blood RNA Kit Preparations (Safety Line) Preparations Preparations peqgold Tissue DNA/RNA Kit 30 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

34 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Little or no RNA eluted Clogged column Degraded RNA Problem in downstream applications DNA contamination Low Absorption ratios RNA remains on the PerfectBind RNA Column PerfectBind RNA Column is overloaded Incomplete homogenization Source RNase contamination Salt carry-over during elution RNA diluted in acidic buffer or water Repeat elution Pre-heat RNase-free water to 70 C prior to elution Incubate column for 10 min with water prior to centrifugation Reduce quantity of starting material Completely homogenize sample Increase centrifugation time Reduce amount of starting material Freeze starting material quickly in liquid nitrogen Do not store tissue culture cells prior to extraction unless they are lysed first Follow protocol closely and work quickly Ensure not to introduce RNase during the procedure Check buffers for RNase contamination Ensure Wash Buffer II Concentrate has been diluted with 4 volumes of 100 % ethanol as indicated on bottle Diluted Wash Buffer II must be stored and used at room temperature Repeat wash with Wash Buffer II Digest with RNase-free DNase and incubate at 37 C for 5 min RNase-free treated water is acidic and can dramatically lower Abs 260 values Use TE buffer to dilute RNA prior to spectrophotometric analysis peqgold Tissue DNA/RNA Kit 31 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E

35 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Tissue DNA/RNA Kit 32 Art.-Nr.: /3498 PEQLAB_v0815_E