Splice-Stellen. Zentrales Dogma. Splicing. Introns & Exons. Genomische Datenanalyse 5. Kapitel

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1 Splice-Stellen Zentrales Dogma Genomische Datenanalyse 5. Kapitel Splicing Introns & Exons

2 Splice-Mechanismus Splice-Apparat Splice-Site-Erkennung Der GT-AG Typ Splicing findet immer nur an wenigen genau festgelegten Positionen statt. Diese Positionen müssen vom Splice-Apparat erkannt werden. Wie geht das? Sind es Eigenschaften der Sequenz? tcacccccttctccaggcgtgcagcccttcggcgtgccgctgtccatgccaccagtgatg gcagctgccctctcgcggcatggaatacggagcccggggatcctgcccgtcatccagccg gtggtggtgcagcccgtcccctttatgtacacaagtcacctccagcagcctctcatggtc tccttatcggaggagatggaaaattccagtagtagcatgcaagtacctgtaattgaatca tatgagaagcctatatcacagaaaaaaattaaaatagaacctgggatcgaaccacagagg Wie findet man sie? Donor Acceptor Viele Introns beginnen mit GT und enden mit AG. Das ist bemerkenswert, aber hilft es uns dabei, Splice-Stellen zu finden?

3 Das kann es noch nicht gewesen sein GGATCCCTGGAAAATGGAGAAGCTGTGCTAATAGAGGGGGGCCAGAAATCCCCACTCTAGAATGCT GTAGAATGTTGGGAGACACCCAGGATGTGAGCCAGGGACTTTCTGGAAGTGTTTGTTCTGGCCCCA CCCGACCCCAGGCAGTCCCCAGCTGTCTGCACAGTCGGATGGGGAGGGGGCTTGCACAGAGTTGGA GCCAGAGGAGAGAGCTGGCTCATCCCCTACGGTAGGATGGGGAAACCTCACAGACCACATTGTCAC CCGGCCTCAGCTCTCCGCCCCGGCGCTCAGAGGGTAACTCTCACCCACCTCGTCCGCTTCTCTGAA CCAGAGTGACCCAGGCTGCCGTCCGCCCCGCTCTCCTACCCCGAGTTGGCACGGAGGTATAGCGCC AGAGGGGGGCCCCAGGCGCCCCGAGGTCTTGCCCTTGCGGCTTTCCCTTTGCGGGGGTGGGCGCCT TCTTCCGGGTAGGGGCCACGTGGCCCTGGCCGGGCGGGGGGCTCGGCCCACCCCGCGCCGGGCCCA GTGACTCAGGCCGCAGCTGTTACCGCGTCACATGAGGGAGGCCGGCGGCCACTCGGCGGGGGAGGG Introns sind zwischen 100 und Basen lang. GT-Stellen liegen viel enger zusammen. Wir brauchen mehr Information! 10 bekannte Donor Positionen Exon CTCCGAAGTAGGATT TCAGAAGGTGAGGGC TTGGAAGGTTCGCAG TACTCAGGTACTCAC CGCCCAGGTGACCGG AGAAAGAGTAAGCTC CAATGCTGTATGTGT GGTCTCGGTAACTGC CCTGCTGGTAAGGCC TGTTGCGGTAGGTCC Intron Hier schauen wir auf den Kontext der GT-Position in echten Donor- Positionen. Die Donor-GT-Positionen sind untereinander geschrieben (multiples Alignment). Auf den ersten Blick können rechts und links vom GT alle möglichen Sequenzen stehen. Donor Alignment Hauptsächlich A 3 Donor Kandidaten CTCCGAAGTAGGATT CTCCGAAGTAGGATT 3 Kandidaten TCAGAAGGTGAGGGC TTGGAAGGTTCGCAG TACTCAGGTACTCAC CGCCCAGGTGACCGG AGAAAGAGTAAGCTC CAATGCTGTATGTGT GGTCTCGGTAACTGC CCTGCTGGTAAGGCC TGTTGCGGTAGGTCC Liest man das Alignment in vertikaler Richtung, so fällt auf, daß meist eine Base häufiger vorkommt als die anderen. TCAGAAGGTGAGGGC TTGGAAGGTTCGCAG TACTCAGGTACTCAC CGCCCAGGTGACCGG AGAAAGAGTAAGCTC CAATGCTGTATGTGT GGTCTCGGTAACTGC CCTGCTGGTAAGGCC TGTTGCGGTAGGTCC 1. AGGTACG 2. CCGTCCC 3. TGGTCCG Welche ist am ehesten eine Donor-Position? 1. AGGTACG 4 orange Positionen 2. CCGTCCC 0 orange Positionen 3. TGGTCCG 2 orange Positionen Hauptsächlich G

4 3 Donor Kandidaten Donor Profil 1. AGGTACG 2. CCGTCCC 3. TGGTCCG 1. AGGTACG 4 orange Positionen 2. CCGTCCC 0 orange Positionen 3. TGGTCCG 2 orange Positionen Wir können von keinem der 3 Kandidaten mit Sicherheit entscheiden, ob er ein Donor ist oder nicht. Trotzdem scheint es wahrscheinlicher, daß 1 ein Donor ist verglichen mit 2 und 3 liegt in der Mitte CTCCGAAGTAGGATT TCAGAAGGTGAGGGC TTGGAAGGTTCGCAG TACTCAGGTACTCAC CGCCCAGGTGACCGG AGAAAGAGTAAGCTC CAATGCTGTATGTGT GGTCTCGGTAACTGC CCTGCTGGTAAGGCC TGTTGCGGTAGGTCC Numerieren wir die Spalten um die GT-Position. Für jede Position können wir die relativen Häufigkeiten der 4 Basen berechnen: Position 3: A: 20% C: 0% G: 70% T: 10% Position 5: A: 0% C: 0% G: 0% T: 100% Position 7: A: 50% C: 20% G: 20% T: 10% Donor Profil: Größeren Datensatz # DONOR FREQUENCY MATRIX from A C G T Konstruktion Zufallsexperiment Jede Spalte entspricht einer Zerlegung des Intervalls [0,1] A C G T G

5 Zufallszahlen : 0.73, 0.12, 0.50, 0.94, 0.81, 0.02, 0.92, 0.34, 0.35 G T A C G T G A G G T A T G C Wiederholtes Experiment A C G T G A G G T A T G C A A G G T G A G T C T G G T A A G G C C G G T A A A A... Alle Zufallssequenzen enthalten das GT Signal an Position 5 und 6. Dies ist in dem Experiment ein sicheres Ereignis. Und auch der Kontext um diese Ankerposition ist ähnlich wie bei den echten Donor-Positionen. Donor Model 9 Positionen 9 Zufallsvariablen Simulierte Sequenzen GAGGTATGC AAGGTGAGT CTGGTAAGG CCGGTAAAA... GAAGTAGGA AAGGTGAGG AAGGTTCGC CAGGTACTC... Echte Donor Sequenzen Die simulierten Sequenzen sind den echten zwar nicht gleich, aber ähnlich. Idee: Wir modellieren Donor-Sequenzen als ob sie aus der Simulation stammen würden. Die Zahlen sind relative Häufigkeiten gemessen in %. Aus ihnen ergeben sich die Wahrscheinlichkeiten, die den Verteilungen der Zufallsvariablen zugrunde liegen. In dem Zufallsexperiment werden 9 Zufallsvariablen X 1,...,X 9 realisiert. Dabei hat aber X 1 eine andere Verteilung als X 2 und X 3 etc. X 1 ~p 1, p 1 =(0.3408, , , ) X 4 ~p 4, p 4 =(0,0,1,0)

6 Wahrscheinlichkeiten der Kandidatensequenzen A C G T P (AAGGTACGT) 0.34*0.6*0.8*1*1*0.53*0.71*0.81*0.46 = P (CCCGTCCCC) 0.36*0.13*0.03*1*1*0.03*0.08*0.05*0.16 =2.7e P (CTGGTCCGA) 0.36*0.14*0.8*1*1*0.03*0.08*0.81*0.16 =1.25e P (TACCTCCGT) = 0 P (AAGGTACGT) = ist doch eher eine kleine Wahrscheinlichkeit. Hintergrundmodell Wie sieht es mit der Wahrscheinlichkeit von Nicht- Donor-Positionen aus? Hintergrundmodell (Q): Alle 4 Basen in etwa gleich wahrscheinlich in allen Positionen Y i ~ (0.25, 0.25, 0.25, 0.25) für alle i. Q (AAGGTACGT) = (0.25) e-06 Die Sequenz ist entweder ein Donor oder nicht. Die Chancen stehen ca zu 1 zu Gunsten des Donors ( Modellvergleich P vs. Q ). Wahrscheinlichkeit P(AAGGTACGT) = P(CCCGTCCCC) = 2.7e-08 AAGGTACGT ist mal wahrscheinlicher ein Donor als CCCGTCCCC. Hier vergleichen wir die Wahrscheinlichkeiten zweier Sequenzen bezüglich des gleichen Modells. Dies ist ein sinnvolles Vorgehen, wenn wir wissen, daß eine der beiden Sequenzen ein Donor ist und die andere nicht. Die Evidenz ist dann erdrückend zugunsten der ersten Sequenz. Situation: Ein Modell (P) und viele Sequenzen. Likelihood P(AAGGTACGT) = Q(AAGGTACGT) = 3.815e-06 Für AAGGTACGT stehen die Chancen ca. 6000:1 zugunsten des Donors. Hier vergleichen wir die Wahrscheinlichkeiten einer Sequenz unter zwei verschiedenen Modellen. Einem Donor-Model (P) und einem Hintergrundmodell (Q). Man spricht hier auch von der Likelihood der Modelle gegeben die Sequenz. Situation: Eine Sequenz und viele Modelle

7 Likelihood-Ratio Für eine beliebige Sequenz S können wir den Likelihood-Ratio ρ=p(s)/q(s) ausrechnen. Er gibt an, wie die Chancen stehen, daß die Sequenz vom Donor-Modell generiert wurde oder vom Hintergrundmodell. 1. Für AAGGTACGT stehen die Chancen ca. 6000:1 zugunsten des Donors. 2. Für CCCGTCCCC etwa 140:1 zugunsten des Hintergrundes. 3. Für CTGGTCCGA etwa 3:1 zugunsten des Donors. Kanonische Experimente Um zu Verstehen was es bedeutet, daß ein Ereignis eine Wahrscheinlichkeit von p=0.2 hat, bedienten wir uns eines kanonischen Zufallsexperiments und des Als-Ob-Prinzips 0 p 1 Ein Ereignis mit Wahrscheinlichkeit p ist genauso wahrscheinlich wie das Ereignis, daß eine Zufallszahl in das rote Intervall fällt. Likelihood und Wahrscheinlichkeit sind nicht das gleiche. Wie verstehen wir Likelihood? Ein Zufallsexperiment Likelihood-Ratio Wir haben zwei Kisten mit Bällen darin. In der ersten Kiste sind nur weiße Bälle, in der zweiten Kiste sind 50% weiße und 50% rote Bälle. Wir werfen eine faire Münze um zu entscheiden welche Kiste wir benutzen werden. Dann ziehen wir n Bälle mit Zurücklegen aus dieser Kiste. Angenommen alle gezogenen Bälle sind weiß! Aus welcher Kiste kommen sie? Der Likelihood-Ratio ist:

8 Kanonisches Experiment für Likelihood-Ratio Ein Likelihood-Ratio von 2 ist vergleichbar mit einem weißen Ball, ein Likelihood-Ratio von 8 ist vergleichbar mit 3 weiße Bällen. Ein Likelihood-Ratio von 6000 zugunsten des Splicesitemodells verglichen mit dem Hintergrundmodel ist vergleichbar mit weißen Bällen. Haben wir bei einen beliebigen Modellvergleich einen Likelihood-Ratio von ρ beobachtet, dann können wir ρ auch ausdrücken in einer Anzahl weißer Bälle. Ein numerisches Problem Wahrscheinlichkeiten für eine feste Sequenz sind Produkte von Zahlen, die kleiner als 1 sind. P (CCCGTCCCC) 0.36*0.13*0.03*1*1*0.03*0.08*0.05*0.16 = 2.7e-08 Dies führt für lange Sequenzen zu sehr kleinen Zahlen. Der Likelihood-Ratio ist dann das Verhältnis zweier sehr kleiner Zahlen, was wiederum zu numerischer Instabilität führt. Der Computer hat Schwierigkeiten, diese Zahlen nahe Null zu unterscheiden (interne Zahlendarstellung). Log-Likelihood & Score Deshalb ist es oft besser, den Log-Likelihood-Ratio zu berechnen: Die Summe läßt sich numerisch stabil berechnen. Man nennt die Summanden auch positionsspezifische Scores. Und den Log-Likelihood-Ratio den Score der Sequenz Scores in der Bioinformatik Ausdrücke der Form log( P(...)/Q(...) ) gibt es in der Bioinformatik häufig. Sie werden zum Suchen eingesetzt. Dabei ist P immer ein Modell, das beschreibt wonach man sucht und Q ein Hintergrundmodell. Anwendungen: Sequenzalignment Homologiesuche Gendetektion Mustererkennung im Allgemeinen

9 Zurück zu den Donors Bisher haben wir nur einzelne Sequenzstücke der Länge 9 betrachtet. In der Praxis wird man aber eher ein langes Stück DNA auf mögliche Splicestellen untersuchen wollen. Hier können wir wieder von gleitenden Fenstern Gebrauch machen: 1,2,... n... S(n)=AAGGTACGT Fenster der Länge 9 Ribosomal-Protein S6 Anwendung auf das humane Ribosomal-Protein S6 An jeder GT-Stelle gibt es einen Ausschlag nach oben. Die meisten sind aber zu schwach um gesehen zu werden (ungünstiger Kontext um die GT-Stelle). Es gibt einige sehr starke Ausschläge. Hier spricht der Kontex sehr für Donor-Stellen. Sind es auch welche? Score (S(n)) Validierung Rauschen Es gibt 5 experimentell bestätigte Donor-Stellen in der Sequenz. Der Score in der Umgebung dieser Splice-Stellen ist unten aufgetragen. Die echten Donorstellen sind alle deutlich erkennbar. Aber was ist mit den anderen? Peaks?

10 Rauschen Zufällige Peaks Generieren wir eine Zufallssequenz X 1 (ω),...,x 5000 (ω) mit X i ~(0.25, 0.25, 0.25, 0.25) und suchen diese nach Donor-Stellen ab. Diese Stelle wird von den beiden Modellen mit 500:1 zugunsten des Donor-Modells bewertet. Aber sie ist kein Donor.... GTGGTAAGT ACGGTAAGC......AGGGTAAGA......AAGGTAAAA... Die Zufällige Sequenz hat natürlich keine Donorstellen. Aber wir finden doch kräftige Ausschläge des Scores. Sogar eine Stelle, an der wir ein Verhältnis von mehr als 700:1 zugunsten eines Donors haben....aaggtaaaa ACGGTAAGC... Fatamorganas... GTGGTAAGT......AGGGTAAGA... Zufälligen Segmente, die wie eine Donorposition erscheinen, sind typisch für lange zufällige Sequenzen. Sie sind wie eine Fatamorgana. Lange Zufallssequenzen gaukeln alles mögliche vor. Und auch beim Durchsuchen der sehr langen Genome findet man viele Erscheinungen, die hoch interessant erscheinen, aber Täuschungen sind. Lemma von Borel-Cantelli Jede unendlich lange zufällige Folge von Buchstaben enthält jeden beliebigen endlichen Text unendlich oft. Dies schließt die gesammelten Werke Shakespeares mit ein. In jeder zufälligen Buchstabenfolge steht also irgendwo der gesamte Shakespeare... am Stück... vom ersten bis zum letzten Wort... ohne jegliche Fehler. Die Frage ist nur wo? Genome sind zwar sehr lange Sequenzen, aber doch endlich. Lange vorgegebene Wörter zu finden, ist eher unwahrscheinlich. Für kurze gilt das nicht. Das Genom ist voll von GATTACA... ohne daß das was zu bedeuten hätte.

11 Nicht Signifikante Peaks Sequenzen aussieben GGATCCCTGGAAAATGGAGAAGCTGTGCTAATAGAGGGGGGCCAGAAATCCCCACTCTAGAATGCTGTAGAATGTTGGGAGACACCCA GGATGTGAGCCAGGGACTTTCTGGAAGTGTTTGTTCTGGCCCCACCCGACCCCAGGCAGTCCCCAGCTGTCTGCACAGTCGGATGGGG AGGGGGCTTGCACAGAGTTGGAGCCAGAGGAGAGAGCTGGCTCATCCCCTACGGTAGGATGGGGAAACCTCACAGACCACATTGTCAC CCGGCCTCAGCTCTCCGCCCCGGCGCTCAGAGGGTAACTCTCACCCACCTCGTCCGCTTCTCTGAACCAGAGTGACCCAGGCTGCCGT CCGCCCCGCTCTCCTACCCCGAGTTGGCACGGAGGTATAGCGCCAGAGGGGGGCCCCAGGCGCCCCGAGGTCTTGCCCTTGCGGCTTT CCCTTTGCGGGGGTGGGCGCCTTCTTCCGGGTAGGGGCCACGTGGCCCTGGCCGGGCGGGGGGCTCGGCCCACCCCGCGCCGGGCCCA GTGACTCAGGCCGCAGCTGTTACCGCGTCACATGAGGGAGGCCGGCGGCCACTCGGCGGGGGAGGG Ribosomal-Protein S6 Zufallssequenz Der Score einiger echter Donor-Positionen ist nicht signifikant. Man findet vergleichbare Ausschläge in zufälligen Sequenzen. Wozu das ganze? Oben sehen wir ca 600 Basen, darin sind 25 GT- Positionen enthalten. Rechnet man das auf 5000 Basen hoch (etwa die Länge des Ribosom-Protein S6 Gens), so erhält man ca. 208 GT-Positionen. Nimmt man den Kontext der GT-Position dazu... und betrachtet Positionen mit einem Score >100, bleiben nur 11 Positionen über und darunter sind die 5 echten Donor-Stellen. Hypothesen-Generierung Im Vergleich zu 208 GT-Positionen hat man das Kandidatenfeld durch das statistische Modell deutlich lichten können. Und das ist schon ein Erfolg. Keinem der Peaks kann man bereits trauen. Man findet sie auch in zufälligen Sequenzen. Hier ging es nicht darum, die Hypothese zu beweisen, daß ein bestimmter Sequenzabschnitt ein Donor ist (statistische Inferenz), sondern um Hypothesen über mögliche Donor-Positionen zu generieren. Hypothesen-Generierung ist typisch für Bioinformatik und kommt in den Statistik-Lehrbüchern (noch) zu kurz. Zusammenfassung - Likelihood - Likelihood-Ratio -Score - Lemma von Borel-Cantelli - Statistische Inferenz - Hypothesengenerierung