Genexpression: Transkriptionsfaktoren (TF)

Transkript

1 Genexpression: Transkriptionsfaktoren (TF) Übersicht Transkriptionsregulation Enhancer, Isolatoren, cis-elemente DNA/TF Bindung TFs in Eukaryoten Anzahl Klassen Domain shuffling Kombinatorische Kontrolle Methoden zur Isolation DNA-bindender Proteine Koloniehybridisierung Yeast one-hybrid system Literatur

2 Regulatorische Transkriptionsfaktoren DNA-bindende Transkriptionsfaktoren (meist Aktivatoren) Assoziierte Co-Aktivatoren cis-elemente: 5 von der TATA-Box lokalisierte Nucleotidsequenzen, die als Bindestellen von regulatorischen Transkriptionsfaktoren erkannt werden

3 Chromatinrestrukturierung: Histon-Acetylierung öffnet Promotorbereich Histonacetyltransferase: CREB-Binding Protein (CBP, Homolog p300) Chromatin-Restrukturierungskomplex: SWI/SNF-Komplex plus andere Faktoren in Hefe (20S)

4 Anoxia in Mais aktiviert Expression der Alkoholdehydrogenase (ADH) Gekoppelt an Histonumverteilung amadh-promoter

5 Enhancer, Isolatoren, MAR-Elemente Enhancer: stimulieren Promotoraktivität unabhängig von ihrer Orientierung Isolator: blockiert Enhancerwirkung Matrixattachment-Regionen (MAR) und Isolatoren begrenzen Bereiche der Enhancerwirkung

6 Transkriptionsfaktoren (TF) in Eukaryoten TFs/Genom Gene für TFs Organismus Anzahl Gene Total % aller Gene A. thaliana ~26, S. cerevisiae ~6, D. melanogaster ~14,

7 Modularer Aufbau eines TFs Aufbau TF: DNA-bindende Domäne Aktivierungsdomäne Flexible Verbindung

8 TF-Klassen in Arabidopsis Genfamilien: Größe prop. zur Anzahl der Mitglieder Domäne: Größe prop. zur Länge der Domäne DNA-Bindungsdomäne: farbig Prot.-Prot.-Interaktionsdo.: schraffiert Figure 1. Relationships and domain shuffling among the different Arabidopsis transcription factor families. Gene families are represented by circles, whose size is proportional to the number of members in the family. Domains that have been shuffled and that therefore "connect" different groups of transcription factors are indicated with rectangles, whose size is proportional to the length of the domain. DNA binding domains are colored; other domains (usually protein-protein interaction domains) are shown with hatched patterns. Dashed lines indicate that a given domain is a characteristic of the family or subfamily to which it is connected. Gene names are written in italics. Whereas many of the indicated domain-shuffling events are specific to plants, others likely predate the appearance of the three distinct eukaryotic lineages. For an expanded version of this figure and the information that was used to construct it, see supplemental material. Arabidopsis Transcription Factors: Genome-Wide Comparative Analysis Among Eukaryotes Riechmann et al, Science (2000).

9 Transkriptions-Initiations Komplex trans-acting factor (Protein, z.b. TF) cis-element (DNA-Sequenz) Rep genspezifische Transkriptionsfaktoren Transkription DNA Interaktionen zwischen aktivierenden Transkriptionsregulatoren (Act) und allgemeinen Transkriptionsfaktoren stabilisieren und aktivieren den Transkriptions-Initiationskomplex. Repressoren (Rep) inhibieren bzw. destabilisieren.

10 DNA-Struktur DNA/TF Bindung TFs kontaktieren Doppelhelix und erkennen Sequenzabschnitte ohne Aufschmelzen der Basenpaarung Kontakte über die grosse Furche sind informativer!

11 DNA/TF Bindung H-Brücken Donor: blau H-Brücken Akzeptor: rot H-Brücke: rote Linie Hydrophobe Protuberanz: gelb Freies H-Atom: weiss Major groove: Erkennungsmuster für alle 4 Kombinationen Minor groove: AT gleicht TA; GC gleicht CG

12 Bindung eines TF an die major groove der DNA DNA/TF Bindung solcher nicht-kovalenten Kontakte tragen zur Bindungsenergie einer DNA/TF Interaktion bei.

13 Klassen: Einteilung nach DNA-Binde- und Interaktionsdomäne Helix-turn-helix MYB Homeobox Proteine Zink Finger Zinkfinger Steroidrezeptor Basische Helix-loop-helix bhlh Basische Leucine zipper bzip

14 Cis-regulatorischer Sequenzen in Pflanzenpromoteren: Spezifität durch flankierende Sequenzen und assoziierte Elemente G-Box:bZIP

15 Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter Deletionsanalyse : Promoteranalyse Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Deletion (Entfernung) Promotersequenzen mit funktionellem Test Beispiel: PR-1 Promoter Arabidopsis INA Induktion spezifische GUS Aktivität induction factor! ( + -) INA Induktion (2,6-dichloroisonicotinic acid, synthetischer Inducer für SAR) Kontrolle Induktion

16 Linker Scanning: Promoteranalyse Ziel: Feinanalyse regulatorischer Promoterregionen Fusion zwischen Promoter und Reporter (GUS, GFP, LUC, Aequorin...) Veränderung kurzer (ca. 10 bp) Sequenzen eines Promoters mit Funktionstest

17 Identifizierung regulatorischer Sequenzen in einem Promoter: In vivo Footprinting Dimethylsulfat-Modifikation Micrococcus DNAse I bzw. Fe-H2O2-Protektionsanalyse

18 Helix-turn-helix TF in Eukaryoten erste identifizierte DNA-Erkennungssequenz 2 α-helices verbunden durch turn (Windung) C-terminale Helix erkennt DNA-Sequenz Erkennungs-Helix (recognition helix; rot) Bindung an major groove Dimere binden DNA Symmetrische Anordnung von Protein und DNA-Erkennungssequenz (Palindrom) Verdopplung der Kontakte vervierfacht die Bindungskonstante

19 Helix-turn-helix TF in Eukaryoten Myb isoliert aus avian myeloblastosis virus Vorkommen: Insekten, Pilzen, Pflanzen (Arabidopsis >100 Gene) In Pflanzen 3 Klassen: 1, 2 und 3 MYB-Domänen Multifunktionell z.b.: LHY CPC1 AtMYBGL1 AtMYB13 MSA-binding protein Regulation der circadianen Uhr Differenzierung von Epidermiszellen, Wurzelhaaren Trichomentwickung Sprossentwicklung Regulation von Zellcyclus-Regulatoren (cyclin)

20 Helix-turn-helix-(helix): Homeobox Proteine TF in Eukaryoten 1980 entdeckt, Drosophila Walter Gehring, Biozentrum Basel spezielle helix-turn-helix Proteine konservierte 60 aa Domäne Helix 2 und 3 bilden helix-turn-helix Motif Helix 3 erkennt DNA (major groove) Arm der Helix 1 greift um DNA in minor groove Funktion: Fundamentale Rolle bei der Steuerung der Entwicklung bei Tieren und Pflanzen

21

22 Phänotypen bei kn-1 Mutation Homöobox Proteine TF in Eukaryoten KN (knotted) Genfamilie: erstes Homöoboxgen aus Pflanze (Mais kn-1, knotted 1) wichtige Regulatoren der Pflanzenentwicklung Expression in Spross-Apikalmeristem Homöobox

23 Zink Finger TF in Eukaryoten Zink strukturelles Element Cys-Cys-His-His bindet Zink-Atom DNA-Bindung durch 3 Zink-Finger

24 Zink Finger TF in Eukaryoten SUPERMAN aus Arabidopsis Repressor der Blütenentwicklung Repressordomäne (RD) C-term. wild-type 35S::SUP RD 35S::SUP RD Phenotype of flowers of 35S::SUPDRD transgenic plants. A: Wild-type (Col-O) flower, with the normal number of stamen (six) and a central gynoecium, which consisted of two fused carpels. B: Flower from a 35S::SUPDRD transgenic T1 plant with 11 stamens and two incompletely fused carpels. C: Flower from a 35S::SUPDRD transgenic T1 plant with seven stamens and three incompletely fused carpels.

25 Leucine Zipper TF in Eukaryoten DNA-Erkennung und Dimerisierung in einer Domäne vereint 2 α-helices bilden coiled-coil hydrophobe Wechselwirkungen (Leucin) zwischen Helices bindet major groove Form einer Wäscheklammer auf der Leine Jun (blau), Fos (rot) L-Leu

26 Domain shuffling TF in Eukaryoten TF-Klassen in Arabidopsis Genfamilien: Größe prop. zur Anzahl der Mitglieder Domain-shuffeling: Größe prop. zur Länge der Domäne DNA-Bindungsdomäne: farbig Protein/Protein Bindung: gemustert Beispiel für Domain-shuffeling: HD-Zip Proteine Figure 1. Relationships and domain shuffling among the different Arabidopsis transcription factor families. Gene families are represented by circles, whose size is proportional to the number of members in the family. Domains that have been shuffled and that therefore "connect" different groups of transcription factors are indicated with rectangles, whose size is proportional to the length of the domain. DNA binding domains are colored; other domains (usually protein-protein interaction domains) are shown with hatched patterns. Dashed lines indicate that a given domain is a characteristic of the family or subfamily to which it is connected. Gene names are written in italics. Whereas many of the indicated domain-shuffling events are specific to plants, others likely predate the appearance of the three distinct eukaryotic lineages. For an expanded version of this figure and the information that was used to construct it, see supplemental material. Arabidopsis Transcription Factors: Genome-Wide Comparative Analysis Among Eukaryotes Riechmann et al, Science (2000).

27 Eukaryotic transcriptional regulators. Number of transcriptional regulators in Arabidopsis (A.t.), Drosophila (D.m.), C. elegans (C.e.), and S. cerevisiae (S.c.), classified by families on the basis of sequence similarity. The table is nonredundant: proteins are counted only once, regardless of whether they have more than one signature motif. The way in which proteins combine different DNA binding motifs were organized into families is reflected in. Families that are specific to one lineage are indicated in color. Families are listed under "Transcription factors" or "Other transcriptional regulators," as described in the text. However, this distinction is not without problems (for example, the ARID and HMG-box families). Information about the signature motif(s) or sequences that define each family is provided as an InterPro (IPR) or GenBank accession number. (Zn) indicate a zinc coordinating DNA binding motif. In the bhlh class, only proteins with a discernible basic region were included. "Other" includes some single-copy genes and small families that are not individually mentioned in the text. The results of the database searches (P, motif searches; B, BLAST) and sequence comparisons were inspected by eye.

28 Transkriptionsregulatoren von Licht-regulierten Genen Box Consensus Gen Transkr.fakt. Eigenschaften rbcs HLHLH GT-1 G GT AA T chs GT1 trihelikale DBD AA A phya GT2 myb-ähnlich G-Box CACGTG rbcs GBF1 bzip Domäne chs GBF2 GBF3,4 lichtreg. cab GBF3+4 BoxI CC T ACC rbcs GA1 lichtreg. TF A chs GAF1 AT-reich ATTAT rbcs ATH1 Homeobox Region cab ATH2+4

29 HD-ZIP HD-ZIP Transkriptionsregulatoren von ABA-regulierten Genen AT-rich VP1/ABI bzip ABRE bzip AP2- type CE CAATNATTG c/tacgtggc GC-rich CTD- PPase P P CTD TATA P RNA Pol II general transcriptional regulators mrna HD-ZIP: bzip: AP2-type: CTD-PPase: AtHB5 AtHB6 OsHox1 CpHB2... ABI5 AREBs/ABFs EmBP1 TRAB1... ABI4 ZmABI4 DBF1/DBF2... AtCPL1 AtCLP3

30 Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Einsetzen von einer begrenzten Anzahl TFs in unterschiedlichen Kombinationen, um ein breites Spektrum von Expressionsmustern zu erzeugen z.b. Heterodimerisierung von Leucine zipper Proteinen verändert die Spezifität der DNA-Bindung. Eukaryotische Genregulatoren bilden häufig Komplexe auf der DNA 5 Regulator- Proteine Gen an Gen aus

31 Kombinatorische Kontrolle TF in Eukaryoten Homo-, Heterodimere 3 TFs: 6 DNA-Sequenzen 4 TFs: 10 DNA-Sequenzen 5 TFs: 15 DNA-Sequenzen etc. plus Kombinationen mit Inhibitor-Bindung bzw. Repressoren

32 Koloniehybridisierung (South-Western) Methoden Identifizierung von Proteinen, die sequenzspezifisch DNA erkennen

33 Yeast one-hybrid system Methoden Fusionsprotein Aktivierungsdomäne (AD) cdna Bindung der Fusion an künstlichen Promoter führt zur Aktivierung des Reportergens (HIS3 oder lacz). Isolation von DNA-bindenden Proteinen möglich.

34 Gel-mobility shift assay Methoden Schema Fraktionierung eines Extraktes durch Chromotographie mit anschließendem gel-shift assay

35 DNA-Affinitätschromatographie Methoden

36 Lehrbücher: Splicing: Polyadenylierung: Promoteranalyse: Molecular Biology of the Cell. 4rd ed. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Martin; Roberts, K. and Walter, P. (2002) New York and London: Garland Publishing. + CD Genes VII, Lewin (2000) Oxford University Press and Cell Press. Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem and Jones (2000) American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland Lorkovic,Z.J., Wieczorek-Kirk,D.A., Lambermon,M.,H. and Filipowicz,W. (2000) Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends Plant Sci., 5, Rothnie,H.,M. (1996) Plant mrna 3'-end formation. Plant Mol. Biol., 32, Lebel,E., Heifetz,P., Thorne,L., Uknes,S., Ryals,J. and Ward,E. (1998) Functional analysis of regulatory sequences controlling PR-1 gene expression in Arabidopsis. Plant J., 16, Arabidopsis Transkriptionsfaktoren: Riechmann,J.,L, Heard,J., Martin,G., Reuber,L., Jiang,C., Keddie,J., Adam,L., Pineda,O., Ratcliffe,O.,J., Samaha,R.,R., Creelman,R., Pilgrim,M., Broun,P., Zhang,J.,Z., Ghandehari,D., Sherman,B.K. and Yu,G. (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 290, Yeast one-hybrid und yeast two-hybrid system: Homeobox Proteine:

37 Transiente Genexpression: Transiente Genexpression Ziel: Promoteranalyse Testsysteme: Protoplasten, Particle bombardment Protoplasten: Verdauen der Zellwände (z.b. Blätter) mit Enzymmix (Zellulasen, Pektinasen etc.) Inkubation mit Plasmid-DNA (Effektor, Reporter) PEG-Zugabe Analyse von Reporteraktivität in Abhängigkeit von Effektoren (Proteinen, Signalmolekülen) - GFP + GFP Particle bombardment: Beschichtung kleiner Goldkügelchen mit Plasmid-DANN Beschuss (Pressluft) von Gewebe (z.b. Zwiebelepidermis) Analyse von Reporteraktivität GFP-Aktivität in Arabidopsis Protoplasten

38