Protein Expression. Purification. Tag-nology

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1 Protein Expression Purification Tag-nology Expression, homolog oder heterolog? Heterologe Expression in anderem Host Kompartment Codon usage Posttranslationale Modifikationen Kofaktoren Chaperone

2 Non-leaky Expression Ein Expressionsytem soll möglichst dicht - non-leaky sein. Grund: Proteine, die exprimiert werden sollen, können toxisch sein. Das kann zur Folge haben, dass sich der Expressionshost gar nicht transformieren lässt, da die transformierten Zellen sofort sterben. Stirbt der Expressionshost nicht, kann aber das Zeilprotein, das durch leaky Expression produziert wird, eine negative Selektion gut exprimierender Zellen bewirken. Erklärung: Gut exprimierende Zellen produzieren viel Zielprotein, aber weniger eigene Proteine, d.h. wachsen schlechter. Die gut exprimierenden sind nach einigen Verdopplungsrunden fast nicht mehr vorhanden. Man selektioniert also auf schlecht exprimierende Zellen. Das pet System von Studier für Expression in E.coli ist extrem dicht aufgrund verschiedener Vorkehrungen. E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem T7 Polymerase T7 Repressor Promoter Operator Gen zur Expression Zielprotein Operator T7 Promoter High copy plasmid Operator T7 Promoter Repressor Repressor Repressor Operator T7 Promoter LacI Promoter Operator Repressor Gen T7 Polymerase genomische DNA

3 E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem E.coli Genom E.coli Polymerase Repressor Lac T7 Promoter Operator Polymerase Keine Expression ohne Induktion da -Repressor Protein auf Operatorregion sitzt und Bindung der E.coli Polymerase verhindert, d.h es wird keine T7 Polymerase synthetisiert. Plasmid T7 Promoter Repressor Gen zur Operator Expression Ohne T7 Polymerase keine Expression des Zielproteins. Als zusätzliche Sicherung sitzt auch beim T7 Promoter noch eine Operatorregion. Sollten T7 Polymerase dennoch in geringen Mengen synthetisiert worden sein, kann das Gen trotzdem nicht abgelsen werden. Zusätzliche Kopien des Lac Repressors sind Plamid kodiert. So wird genügend Repressor synthetisiert. E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem E.coli Genom E.coli Polymerase Lac T7 Promoter Operator Polymerase Zusätzliche Sicherung Eine weitere Absicherung gegen T7 Polymerase, die in geringen Mengen synthetisiert wurde, ist die Co-Expression von Lysozym, welches auch als Inhibitor der T7 Polymerase wirkt. Die T7-Polymerase wird abgefangen, bevor die Expression des Zielgens stattfindet. Das Lysozym wird auf einem zweiten Vektor kodiert. Lysozym Plasmid T7 Promoter Repressor Gen zur Operator Expression

4 E.coli Genom Lac Promoter Repressor INAKTIV Gatose / IPTG Operator T7 Polymerase E.coli BL21 (DE3)- pet Expressionssystem Expression erst nach Induktion da -Repressor von Operator (Genom) abfällt E.coli Polymerase liest Gen für T7 Polymerase ab. Repressor von Operator (Plasmid) fällt ab. T7 Polymerase liest Gen für Zielprotein ab. Repressor INAKTIV Gatose / IPTG Plasmid T7 Promoter Operator Gen zur Expression Zielprotein Kompartment Cytosol => Cytosol (E.coli, Hefe, Insektenzellen) Membran => Spezieller E.coli Stämme Walker strains C41, C43 Extrazellulär => Expression in Hefe, Sekretion ins Medium Signalpeptid & Sekretion ins Periplama von E.coli Expression im Cytosol in E.coli Stämmen mit defizienter Thioredoxin- und Glutathionreduktase

5 Codon usage Verschiedene Codon Präferenz Verschiedene trna levels in Organismen Bei seltenen Codons => Translationsstop

6 Rare Codons

7 Rare Codons- Expression in Rosetta BL21(DE3) Rosetta BL21(DE3) plys BL21(DE3) Nicht induziert Protein purification First Enrichment / Purification step is a successful expression

8 General aim:3 STEP Purification Under normal conditions you lose at each purification step ca 20%, 1.Step capture 2. Step purify 3. Step polish Each step should be a different type of separation, has different capacities and different performance. E.g. capacity decreases from step1 to 3, performance increases step 1-3. General rules Until you don t know better -Use protease inhibitors -Work fast (prepare buffers, SDS PAGE, Blots etc) -Keep cold protein (slower denaturation and less proteolysis) -Do NOT freeze in between; if necessary shock freeze with glycerol. -Start with high amounts of protein -Make small scale tests prior large scale preparations

9 Column self made / or ready-to-use Depends on material Kind of separation Prize of material Knowledge / experience of experimentator Principles of Protein Separation Ion exchange (IEX, cation / anion exchange) Hydrophobic interaction (HIC) Reversed phase (RP) Size exclusion (SEC, gelfiltration) Affinity (IMAC, MBP, GST)

10 Ion exchange Suited as capture, purification, or polishing step Two types: Anion exchange and Cation exchange + Anion exchange: Matrix has positive charge Protein is negative charged Protein stick to matrix; elution with a anion, e.g. Cl -, SO 2-4, PO 3-4 the more neg. charges the better binding + ph dependence of IEX separation Three proteins : blue acidic pi, green neutral pi, red basic pi

11 Different materials Anion exchange DEAE Di Ethyl Amino Ethyl; weak and mild anion exchanger, Separation is satisfying C 2 H + 5 R-C 2 H 5 NH C 2 H 5 Q, TMAE Quaternary Nitrogen, Tri Methyl Amino Ethyl Strong an.ex., not so mild, for some proteins to hard, good to excellent separation CH 3 + R-C 2 H 5 N CH3 CH 3 Different media /columns Separation prize DE-52 (Whatman) DEAE on Cellulose matrix DEAE (Amersham; on sepharose matrix) Q-sepharose [fast flow] [Re -] Source Q30 [Re -] Source Q15 MonoQ MiniQ

12 Comparison 150 SFr SFr 250 SFr SFr Cation exchange Carboxymethyl, CM, weak, mild, etc R-C-O-CH 3 O Sulfonicacid S, strong, harsh R-SO - 3 Hydroxyapatite (neither anion nor cation exchange) CaPO 4 matrix, proteins can bind as cations but also as anions Elution with PO 4 3- or Cl -

13 General aspects IEX Very Fast flow (e.g. Source30, 1 cm diameter up to 20 ml/min) High chemical stability High mechanical stability High capacity High perfomance Easy upscaling Hydrophobic interaction Suited as capture step or purification step

14 Different HIC media Strong influence of matrix on separation influence not predictable!

15 General aspects HIC Fast flow High chemical stability mechanical stability High capacity Good - high perfomance Easy upscaling Size exclusion

16 Different types have different pore size => different media according to size of proteins Pitfalls in SEC Wrong material, not suited for proteins to separate

17 Cloggy sample, closes pores of material Top of column is not even => smear, bad separation Application of to large volume Large dilution of sample Long duration General aspects SEC slow flow (required for good separation) chemical stability in some cases not that high low mechanical stability! Overpressure can ruin the column Medium - low capacity High perfomance Upscaling not so easy. You have to buy columns for best perfomance.

18 His 6 -tag (1 kda) GST-tag (26 kda) MalE-tag (40 kda) CBP-tag (4 kda) Strep-tag (1 kda) Tags His-tag Immobilized Metal ion Adsorption Chromatography (IMAC) Prinzip Protein mit N- oder C-terminaler Fusion an 6 His bis 10 His Reste His-Reste koordinieren immobilisiertes Metal-Ion auf Säulenmatrix Elution mit Imidazol Metallionen: Ni 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+ Matrix: GE-Healthcare, Quiagen, BioRad, TALON

19 His-tag Säulenmatrix His-tag Vorteile Sehr gute Bindung Kleiner Tag Detergenzien stören nicht Benötigte Technik gering

20 His-tag Nachteile Unspezifische Bindung His-tag (1 kda) Nachteile EDTA kann nicht benutzt werden EDTA komplexiert Metalionen der Säulenmatrix

21 His-tag (1 kda) Nachteile DTT kann nicht benutzt werden DTT komplexiert Metalionen der Säulenmatrix His-tag Nachteile Ni 2+ als Verunreinigung in Proteinpräperation Oxidation von Met und Cys durch Ni 2+

22 GST-tag (26 kda) Glutathion-S-transferase Prinzip Protein mit N- oder C-terminaler Fusion von GST GST bindet an glutathion an Säulenmatrix Elution mit Glutathion Verschiedene Anbieter GST-Tag Matrix

23 GST-tag Vorteile Protein Tag Spezifische Bindung Batch- wie Säulenverfahren möglich GST-tag Nachteile Sehr großer tag Bindung sehr, sehr langsam Elution mit Glutathion -> kann Disulfide reduzieren GST dimerisiert => artifizielles Dimer

24 MalE / MBP-tag (40 kda) maltose binding protein Prinzip Protein meist mit N-terminaler Fusion von MalE MalE bindet an Amylose an Säulenmatrix Elution mit Maltose Verschiedene Anbieter (NEB, GE-Healthcare, etc) MBP-tag Vorteile Protein Tag Spezifische Bindung Batch- wie Säulenverfahren möglich

25 Nachteile MBP-tag Sehr großer tag Bindung langsam Keine denaturierende Isolation möglich Viele Proteine bleiben in Lösung mit tag, aber präzipitieren, wenn der tag abgespalten wird. CBP-tag (4 kda) Calmodulin binding peptide Prinzip Protein mit Fusion von Peptid der Myosin Light Chain Kinase (MLCK) Peptid bindet an Calmodulin an Säulenmatrix Bindung in Gegenwart von Ca 2+ Elution mit EDTA

26 CBP-tag Matrix CBP-tag Vorteile Protein Tag Bindung schnell Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden

27 CBP-tag Nachteile Säulenmatrix ist Calmodulin Bindung schnell Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden Prinzip Strep-tag (4 kda) Streptavidin von Streptomyces avidinii, Protein mit Fusion von Peptid Asn-Trp-Ser-His-Pro- Gln-Phe-Glu-Lys- Bindung an Strepavidin Elution mit Biotin / Desthiobiotin

28 Strep-tag Matrix Minimal Strepavidin Strep-tag Vorteile Protein / Peptid tag Sehr spezifische Bindung Kleiner Tag

29 Strep-tag Nachteile Detergenzien nur bedingt möglich Saurer ph nicht möglich Protein auf Säulenmatrix (Cleaning of column etc)