Einsatz von HPLC-Lösungsmitteln wieso gibt es trotz HPLC-Qualität Probleme?
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- Ewald Fertig
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1 Der HPLC-Tipp im Februar/März 2013 Einsatz von HPLC-Lösungsmitteln wieso gibt es trotz HPLC-Qualität Probleme? von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken Der Fall Selbstverständlich verwenden wir alle Lösungsmittel mit ausgewiesener HPLC- Qualität. Dennoch gibt es immer wieder im Alltag Probleme mit ihnen was sind die wichtigsten Ursachen dafür?
2 Die Lösung Halten wir zunächst wie folgt fest: In einem HPLC-Labor können Lösungsmittel mit folgenden Qualitätssiegel u A. zum Einsatz kommen: HPLC-Grade, Gradient-Grade, UHPLC-Grade, zur Spektroskopie. Die unterschiedlichen Bezeichnungen suggerieren eine unterschiedliche Reinheit per se, was jedoch nicht immer der Fall ist: So liegt manchmal der Unterschied zwischen Gradient- Grade und zur Spektroskopie in den zusätzlichen Prüfungen auf Reinheit und zwischen HPLC-Grade und UHPLC-Grade nur in dem zusätzlichen Filtrieren über 0,2 µm-filter der Herstellungsprozess des Lösungsmittels als solcher ist der gleiche. Nachfolgend möchte ich einige typische Probleme für gängige Lösungsmittel sowie mögliche Maßnahmen in aller Kürze vorstellen. Deswegen in aller Kürze, denn eine gründliche Darstellung der Problematik führte zu einer recht langen Abhandlung Wasser Organische Verunreinigungen, die aus der Wasseraufbereitungsanlage stammen können (Ionenaustauscherkartusche, Aktivkohlefilter), durch Kontaminationen während des Abfüllens (Spüllmittelreste bzw. Klarlösung, allerlei kontaminierte Oberflächen oder kontaminierte Hände, Lösungsmitteldämpfe in der Laborluft/aus dem Abzug) oder aufgrund der Aufbewahrungspraxis (z. B. Phthalate aus Plastikbehältnissen oder Farbstoffe/Eisenoxid aus Braunglas). Ferner Verunreinigungen aus der Pumpe und hier ist nicht nur das Getriebeöl gemeint! Abhilfe: Eine C18-Vorsäule wird zwischen Pumpe und Probengeber (vor der Mischkammer beim Gradienten!) eingebaut: Allerlei organische Verunreinigungen bleiben dort hängen, denn gleiches bindet gleiches. 2-3 Mal im Jahr sollte dieses Säulchen ausgewechselt werden. Wachstum von Algen, Bakterien und Pilzen, z. B. an der Entnahmestelle der Wasseraufbereitungsanlage, wenn am Wochenende kein Wasser entnommen wird. Oder, wenn die UV-Behandlung nach und nicht vor dem Ionenaustauscher erfolgt. Oder aber am Eingang der Mischkammer beim Gradienten, wenn in einem Kanal nur Wasser/Puffer gefördert wird. Merke: Das bekannte Bakterium Pseudomonas spp. beispielsweise wächst ca. alle 3 Stunden in Anwesenheit von Acetat oder Phosphat bei Raumtemperatur auf die doppelte Menge, in reinem Wasser erscheint bereits nach 1-2 Tagen ein Geisterpeak. Und: Bei einem Abbau von Bakterien können von sehr lipophilen Polysacchariden bis zu sehr polaren kleinen Molekülen entstehen, ergo: Mögliche (Geister)Peaks aus dem Wasser können recht unterschiedliche
3 Retentionszeiten haben, sie können sich über das ganze Chromatogramm verteilen. Abhilfe: Spuren von Natriumazid (0,004% (w/v)) verhindert das Wachstum von Mikroorganismen. Zu entfernen wären sie mit heißem Wasser, Natronlauge, Dichlormethan, Isopropanol, oder einer 3%igen Wasserstoffperoxidlösung; mit den zwei letztgenannten Lösungsmitteln kann bei Bedarf auch die Säule gespült werden. Methanol Methanol wird aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid hergestellt das ist also ein einfacher, sauberer Prozess, deswegen gibt es mit Methanol selten Probleme mit Verunreinigungen, merke jedoch: Wenn Methanol in Alu- Fässern aufbewahrt wird, besteht die Gefahr, dass Aluminium-Hydroxid entsteht, was u U in der Pumpe Probleme bereitet. Selten sind in Methanol oder Acetonitril auch Aluminiumpartikelchen gefunden worden. Abhilfe: Lieber Stahlfässer als Gebinde verwenden sollten Probleme festgestellt worden sein, ansonsten haben Alu-Fässer schon Vorteile. Acetonitril Bekanntlich entstehen hier Polymere, die zu Druckschwankungen, Buckel in der Basislinie oder zu Geisterpeaks führen können Abhilfe: Beim Gradienten vormischen, möglichst kein 100%iges Acetonitril fördern etwas Wasser tut gut ; bei Bedarf Polymere in der Pumpe oder in der Mischkammer mit Hilfe von Isopropanol oder Tetrahydrofuran entfernen. Es zeigt sich, dass manch eine Charge von Acetonitril trotz HPLC- Qualität merklich kontaminiert sein kann. Abb. 1 zeigt Kontaminanten, die in Acetonitril HPLC-Qualität nachgewiesen worden sind.
4 Abb. 1 Kontaminanten, die in Acetonitril mit ausgewiesener HPLC-Qualität nachgewiesen wurden Abhilfe: Acetonitril online filtrieren, indem in die Acetonitril-Kapillare (vor der Mischkammer beim Gradienten!) eine kleine Aluminiumoxid-Säule eingebaut wird. N-haltige Komponenten wie Amine und Imine werden dort festgehalten, apolare Komponenten könnten evtl. an einem organischen Ionenaustauscher oder an Polystyrol-Divinylbenzol gebunden werden. Übrigens: Verunreinigungen aus dem Wasser eluieren im Gradienten eher früh, jene aus dem Acetonitril spät. Wenn schließlich Acetonitril bestimmter Chargen filtriert wird, tauchen kleine schwarze Körnchen auf (Polymere?). Wenn kurzfristig keine Lösung möglich ist (andere Charge, anderer Lieferant), bleibt nur das Filtrieren als einziger Ausweg. Tetrahydrofuran Hier herrscht folgendes Dilemma: - Stabilisiertes THF; Vorteil: Ein solches hält länger, Peroxidbildung wird verhindert, Nachteil: Der Stabilisator wie z. B. BHT (2,6-di-t-Butyl-4- Methylphenol) erscheint als Geisterpeak ungefähr in der Mitte des Chromatogramms bei einer Gradientelution.
5 - THF, HPLC-Qualität; Vorteil: Rein, deswegen keine Geisterpeaks, Nachteil: Gefahr von Peroxidbildung, Ergebnis: Geisterpeaks, PEEK- Oberflächen können bei Temperaturen von über ca. 50 C angegriffen werden. Abhilfen: 1. Kleine(re) THF-Faschen HPLC-Qualität kaufen, möglichst frisch verwenden. Nach dem ersten Gebrauch, die (braune) THF-Flasche mit Alufolie gewickelt im Kühlschrank aufbewahren, optimal wäre darüber hinaus eine Stickstoff-Atmosphäre in der Flasche. 2. Eine interessante Alternative zu THF stellt MTBE (Methyl-t-Butyl-Ether) dar: Keine Peroxid-Bildung, ähnlich interessante Selektivitätseffekte wie THF. Das Fazit HPLC ist leider im hier besprochenen Zusammenhang eine wirklich empfindliche Methode, allerlei Verunreinigungen werden können detektiert werden. Je anspruchsvoller die HPLC-Analytik (Spurenbereich, Reinheitsmethode, empfindliche UHPLC-Trennung), umso mehr rückt die Reinheit der eingesetzten Lösungsmittel und der Chemikalien! in den Fokus. Erhöhter Aufwand und erhöhte Sorgfalt bei deren Handhabung sind hier ein notwendiges Muss.
Vorbemerkung: In den Abbildungen weiter unten werden Chromatogramm-Ausschnitte aus längeren Läufen gezeigt.
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