Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

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3 Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. 1. Auflage by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße Gießen 0641/

4 Aus dem Institut für Parasitologie und dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität in Bonn Untersuchungen zur Prävalenz und Epidemiologie von Neospora-Infektionen bei Hunden in Rheinland-Pfalz (Kreis Mayen-Koblenz) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Martina Staub geb. Krudewig aus Siegburg HANNOVER 2004

5 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. Astrid M. Tenter Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Lothar Kreienbrock Prof. Dr. med. Hanns M. Seitz 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. Astrid M. Tenter Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Lothar Kreienbrock 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. med. vet. Franz J. Conraths Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2004

6 Meinen Eltern

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8 INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. EINLEITUNG Abkürzungsverzeichnis LITERATURÜBERSICHT Taxonomie Geschichte von N. caninum Struktur und Biologie von N. caninum Entwicklungszyklus Morphologie der Entwicklungsstadien Wirtsspektrum Übertragungswege von N. caninum und Epidemiologie Neospora-Infektionen bei Hunden Serokonversion bei Hunden Isolate von Hunden Anteil seropositiver Hunde in verschiedenen Ländern Untersuchungen auf Prädispositionen Alter Rasse Geschlecht Fütterung Jagdliche Nutzung Haltungsbedingungen Geographische Region Seropositivität gegenüber T. gondii Klinische Symptome und Verlauf der Erkrankung Fallberichte Berichte über konnatale Neosporosen bei Wurfgeschwistern Einzelfallberichte Pathologie und Pathogenese Behandlungsversuche Differentialdiagnostik Toxoplasmose Hammondiose Protozoen im Hundekot H. heydorni 58

9 Cystoisospora-Arten Sarcocystis-Arten Giardien Kryptosporidien Diagnostik von Neospora-Infektionen Indirekte Nachweismethoden IFAT ELISA DAT Immunoblot Direkte Nachweismethoden Mikroskopischer und immunhistochemischer Nachweis im Gewebe PCR zum Nachweis von Neospora-DNA Biologische Verfahren Koproskopie MATERIAL UND METHODEN Material Geräte und Verbrauchsmaterialien Reagenzien und Lösungen Patientenmaterial Methoden Datenerhebung Untersuchung der Seren im IFAT auf Neospora-Antikörper Serumgewinnung und Serumlagerung Referenzseren Antigengewinnung für den IFAT Konjugat Testdurchführung Untersuchung der Seren auf Toxoplasma-Antikörper IFAT zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii Untersuchungsgut Antigengewinnung für den IFAT Konjugat Testdurchführung SFT zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii 86

10 Untersuchungsgut Herstellung des Antigens (Toxoplasma-Suspension, Exsudat) Aktivatorserum Testdurchführung Vorversuch zur Prüfung des Toxoplasma-Exsudates Hauptversuch Auswertung Beurteilung der Seren Vorversuche zur Untersuchung der Kotproben Präparation des Kotes Flotationslösungen Flotation mit Zentrifugation Flotation im Ovassay Untersuchung der Kotproben Gewinnung von Kotproben für den Ovassay Untersuchung der Kotproben Auswertung der erhobenen Daten ERGEBNISSE Fluoreszenz im Neospora-IFAT Untersuchung von Serumproben auf Neospora-Antikörper Zusammenhang zwischen den Eingangsdiagnosen und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Alter der Hunde und Neospora- Infektionen Zusammenhang zwischen der Rasse der Hunde und Neospora- Infektionen Zusammenhang zwischen der FCI-Gruppenzugehörigkeit der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Gewicht und der Schulterhöhe der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Geschlecht der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Herkunftsland der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen der Herkunftsstätte der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen der Haltungsart der Hunde und Neospora-Infektionen 105

11 Zusammenhang zwischen dem Wohnort der Hundebesitzer und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde und Neospora- Infektionen Auslauf im Garten Auslauf in öffentlichen Grünanlagen Auslauf im Wald Auslauf im Feld Auslauf auf befestigten Wegen (Stadt/Dorf) Andere Auslaufmöglichkeiten Zusammenhang zwischen einer jagdlichen Führung der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen einer gleichzeitigen Haltung anderer Tiere und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen der Fütterung der Hunde und Neospora-Infektionen Kategorie: Dosenfutter Kategorie: Trockenfutter Kategorie: Fleisch Fleisch vom Schwein Fleisch vom Rind Fleisch vom Schaf Fleisch von der Ziege Fleisch vom Wildwiederkäuer Fleisch vom Pferd Fleisch vom Geflügel Fleisch von anderen Tierarten Kategorie: Innereien Innereien vom Schwein Innereien vom Rind Innereien vom Schaf Innereien von der Ziege Innereien vom Wildwiederkäuer Innereien vom Pferd Innereien vom Geflügel Innereien von anderen Tierarten Kategorie: Gehirn oder Rückenmark Gehirn oder Rückenmark vom Rind Gehirn oder Rückenmark vom Schaf, von der Ziege, vom Wildwiederkäuer, vom Pferd oder von anderen Tierarten Kategorie: Speisereste Kategorie: Rohmilch oder Rohmilchprodukte 128

12 Kategorie: Behandlung des Futters bei Verfütterung von Fleisch oder Innereien Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern, Ratten, Kaninchen, Hunde- oder Fuchskot, Abortmaterial von Rindern, Schafen oder Ziegen durch die Hunde und Neospora-Infektionen Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern Aufnahme von Ratten Aufnahme von Kaninchen Aufnahme von Hundekot Aufnahme von Fuchskot Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten verschiedener Tierarten Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen Zusammenhang zwischen der Seropositivität von Hündinnen und Neospora-Infektionen bei ihren Welpen Zusammenhang zwischen der Seropositivität für N. caninum und für T. gondii Zusammenhang zwischen der Seropositivität und dem Ergebnis der Kotprobenuntersuchung Versuche zur Optimierung der Untersuchung der Kotproben auf Oozysten von N. caninum Untersuchung von Kotproben DISKUSSION DER ERGEBNISSE Untersuchung von Serumproben auf Neospora-Antikörper Neospora-Infektionen in Deutschland Zusammenhang zwischen den Eingangsdiagnosen und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Alter der Hunde und Neospora- Infektionen Zusammenhang zwischen der Rasse der Hunde und Neospora- Infektionen Zusammenhang zwischen dem Gewicht und Schulterhöhe der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Geschlecht der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Herkunftsland der Hunde und Neospora-Infektionen 150

13 Zusammenhang zwischen der Herkunftsstätte der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen der Haltungsart der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Wohnort der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde und Neospora- Infektionen Zusammenhang zwischen einer jagdlichen Führung der Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen einer gleichzeitigen Haltung anderer Tiere und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen der Fütterung der Hunde und der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern, Ratten, Kaninchen, Hunde- oder Fuchskot, Abortmaterial von Rindern, Schafen oder Ziegen durch die Hunde und Neospora-Infektionen Zusammenhang zwischen Seropositivität für N. caninum und für T. gondii Zusammenhang zwischen Seropositivität und dem Ergebnis der Kotprobenuntersuchung Untersuchung von Kotproben Ausblick ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Chemikalien und andere Reagenzien Lösungen Informationen zum untersuchten Hundekollektiv Fragebogen für Tierbesitzer Befundmitteilung für Tierbesitzer Ergebnisbogen zur Dokumentation des IFATs Ergebnisse der Einzeluntersuchungen im Neospora-IFAT und Endbeurteilung der Seren Berechnungen des OR und Ergebnisse des Fisher s Exact Tests TABELLENVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS 240

14 1. Einleitung EINLEITUNG Die Neosporose ist eine Erkrankung bei mehreren Tierarten. Durch die Infektion mit Neospora caninum kann es vorwiegend beim Hund zur klinischen Erkrankung und bei Rindern und Ziegen zu Aborten kommen. Bei Hunden bestimmen neuromuskuläre Symptome das klinische Bild: aufsteigende Paralysen der Hinterhand, Hyperextension der Hintergliedmaßen, Muskelschwäche sowie Muskelatrophie. Außerdem sind folgende Befunde möglich: Schluckbeschwerden, Paralyse des Kiefers, Kopfschiefhaltung, Herzinsuffizienz und Pneumonie. Die meisten klinischen Fälle von Neosporose treten bei jungen, konnatal infizierten Hunden auf. Der Hund und der Kojote sind die bisher bekannten Endwirte von N. caninum. Da nur die Endwirte Oozysten ausscheiden, spielt der Hund auch eine Rolle bei der Verbreitung dieses Erregers. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, aktuelle Daten zum Vorkommen von Neospora- Infektionen bei Hunden, die als Patienten einer Tierarztpraxis im Kreis Mayen- Koblenz vorgestellt wurden, zu erheben. Es sollte festgestellt werden, ob es einen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Neospora-Infektionen und Alter, Rasse, Geschlecht, Herkunft, Haltung oder Fütterung bei diesen Hunden gibt.

15 12 1. Einleitung 1.1. Abkürzungsverzeichnis bp Basenpaar DAT direkter Agglutinationstest DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EW Einwohner FCI Fédération Cynologique Internationale FITC Fluoreszeinisothiocyanat IFAT indirekter Fluoreszenzantikörpertest IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M i. m. intramuskulär i. p. intraperitoneal Iscom immunostimulating complex ITS-1 Internal transcribed Spacer-1 kda Kilodalton MAT modifizierter Agglutinationstest OR Odds ratio PAS Periodic Acid Schiff-Reagens PBS phosphat-buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) p. i. post infectionem p. n. post natum RNA Ribonukleinsäure rrna ribosomale RNA s. c. subkutan SFT Sabin-Feldman-Test trace zweifelhafte Reaktion ZNS Zentralnervensystem

16 2. Literaturübersicht LITERATURÜBERSICHT 2.1. Taxonomie N. caninum gehört, wie z. B. auch Arten der Gattungen Toxoplasma und Hammondia, zu den zystenbildenden Kokzidien im Stamm Apicomplexa. Über die endgültige systematische Einordnung der Gattungen Neospora, Toxoplasma und Hammondia herrscht noch Unklarheit. Aufgrund traditioneller phänotypischer Charakteristika wie Morphologie, Lebenszyklus und Lokalisation der Entwicklungsstadien ordnen ROMMEL et al. (2000) N. caninum folgendermaßen ein: Stamm: Apicomplexa (Levine, 1970) Klasse: Sporozoea (Leuckart, 1879) Unterklasse: Coccidia (Leuckart, 1879) Ordnung: Eucoccidiida (Léger and Duboscq, 1910) Unterordnung: Eimeriina (Léger, 1911) Familie: Isosporidae (Minchin, 1903) Gattung: Neospora (Dubey, Carpenter, Speer, Topper and Uggla, 1988) Art: Neospora caninum (Dubey, Carpenter, Speer, Topper and Uggla, 1988) Im Jahr 1998 beschrieben MARSH et al. (1998) eine weitere Art von Neospora, Neospora hughesi. Diese verursacht neurologische Erkrankungen bei Pferden. Die weitere Klassifizierung von Neospora-Arten innerhalb der Unterordnung Eimeriina ist noch unklar. So ordneten ROMMEL et al. (2000) N. caninum zwar in die Familie Isosporidae ein, sie wiesen aber auch darauf hin, dass die phylogenetischen Beziehungen der zystenbildenden Kokzidien derzeit auf molekularbiologischer Ebene untersucht werden, so dass weitere Umgruppierungen zu erwarten sind. ELLIS et al. (1994) ordneten aufgrund eines Vergleiches von Gensequenzen der kleinen Untereinheit der ribosomalen Ribonukleinsäure (rrna) von N. caninum und anderen parasitischen Protozoen, die zum Stamm der Apicomplexa zählen, N. caninum als Schwestertaxon zu Toxoplasma gondii in die Familie Sarcocystidae ein.

17 14 2. Literaturübersicht Hingegen konnten GUO und JOHNSON (1995) beim Vergleich der Genome von N. caninum, T. gondii und Sarcocystis-Arten mithilfe der Technik der Random Amplified Polymorphic Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Polymerasekettenreaktion (PCR) keine engere genetische Beziehung zwischen N. caninum und T. gondii feststellen. MUGRIDGE et al. (1999) zeigten durch den Vergleich der gesamten Gensequenz der großen Untereinheit der rrna von N. caninum, T. gondii, Hammondia hammondi und Hammondia heydorni, dass diese Arten entsprechend ihrer Endwirtsspezifität zu zwei Linien gehören. So bilden N. caninum und H. heydorni phylogenetisch eine andere Linie als T. gondii und H. hammondi. HEYDORN und MEHLHORN (2002) sehen in der Schaffung der Gattung Neospora einen Verstoß gegen die internationalen Regeln zur zoologischen Nomenklatur. Sie sind der Meinung, dass es nur zwei gültige Arten gibt: T. gondii und H. heydorni. Die erste beinhaltet H. hammondi und die zweite beinhaltet die nach Meinung der Autoren ungültigen Arten N. caninum und N. hughesi (MEHLHORN u. HEYDORN 2000). Zurzeit finden Diskussionen darüber statt, wie eine neue und umfassendere Klassifikation der Kokzidien aufgrund von phänotypischen und molekularen Merkmalen geschaffen werden kann. Eine solche Klassifikation sollte die Phylogenie der taxonomischen Gruppen widerspiegeln, indem sie sie so korrekt wie möglich beschreibt, um eine Stabilität der Klassifikation über viele Jahre zu gewährleisten. Ferner sollte eine internationale Expertengruppe eine solche Klassifikation aufstellen, um eine möglichst große Akzeptanz zu gewährleisten (TENTER et al. 2002) Geschichte von N. caninum Im Jahr 1984 beschrieben BJERKÅS et al. (1984) erstmals eine mit Enzephalomyelitis und Myositis einhergehende Erkrankung bei sechs Hunden in Norwegen, die alle zur Nachzucht einer Boxerhündin gehörten. Die Hunde entwickelten neurologische Symptome im Alter von 2 bis 6 Monaten. Toxoplasmaähnliche Protozoen wurden im Gehirn und in der Muskulatur gefunden. Allerdings hatten die Hunde keine nachweisbaren Antikörper gegen T. gondii und die Parasiten waren in dieser Studie nicht infektiös für Mäuse, deren Stamm nicht genannt wurde. Auch immunhistochemisch und ultrastrukturell unterschied sich der gefundene Parasit von T. gondii (BJERKÅS u. PRESTHUS 1988). Bei einer retrospektiven Untersuchung von Hunden in den USA, bei denen zuvor eine Toxoplasmose diagnostiziert wurde, fanden DUBEY et al. (1988a) einen ähnlichen Parasiten bei zehn Tieren. Weil der Parasit ultrastrukturell von allen bekannten Kokzidien verschieden war, nannten sie ihn N. caninum. Somit hatten sie eine neue Gattung

18 2. Literaturübersicht 15 und Art beim Hund eingeführt. N. caninum unterscheidet sich aufgrund folgender Merkmale von T. gondii und anderen verwandten Kokzidien: Erstens sind die neurologischen Symptome und die Myositis bei der Neosporose des Hundes stärker ausgeprägt als bei der Toxoplasmose; zweitens können bei N.-caninum-infizierten Hunden serologisch keine Antikörper gegen T. gondii gefunden werden und immunhistochemische Untersuchungen mit gegen T. gondii gerichteten Antikörpern verlaufen negativ; und drittens haben die Wände einiger Gewebezysten ein unterschiedliches Aussehen (DUBEY et al. 2002). Die Gewebezysten von N. caninum haben meist 1 bis 4 µm dicke Wände und sind auf Nervengewebe beschränkt (DUBEY et al. 1988a). Gewebezysten von T. gondii haben dagegen dünnere Wände (<0,5 µm) (SPEER et al. 1999) und werden in vielen Organen gefunden (DUBEY et al. 2002). DUBEY et al. (1988b) kultivierten Tachyzoiten von N. caninum in Zellkultur, indem sie die Zellkultur mit Gewebe natürlich infizierter Hunde beimpften. Gleichzeitig wurden Mäuse eines nicht genannten Stammes mit diesem Gewebe infiziert. Sechs bis zwölf Wochen später konnten Gewebezysten in den Gehirnen der Mäuse nachgewiesen werden. Mit den aus der Zellkultur erhaltenen Tachyzoiten wurde ein Hund experimentell infiziert, indem man ihm 1 x 10 5 Tachyzoiten subkutan (s. c.) injizierte und ihm zusätzlich 200 mg Methylprednisolon am 22. und 29. Tag nach Injektion der Tachyzoiten verabreichte. Dieser Hund erschien 4 Wochen nach der Infektion klinisch normal. Dann machte er einen geschwächten, aber ansonsten normalen Eindruck und verstarb innerhalb von 2 Tagen. Bei der Sektion dieses Hundes fand man makroskopisch eine hämorrhagische Lunge und eine dunkle, bröckelige Leber, die stellenweise blass verfärbt war. Mikroskopisch gab es in der Leber multifokale Koagulationsnekroseherde, in denen viele N.-caninum-Tachyzoiten enthalten waren. Über die Hälfte der Leber war nekrotisch. Im Myokard gab es nur wenige fokale Infiltrationen mit mononukleären Zellen und wenige N.-caninum-Tachyzoiten. In der Muskulatur wurden mehrere längliche Gruppen von Tachyzoiten gefunden. Dort gab es kaum Wirtsreaktion. Eine Gruppe Tachyzoiten kam in der Augenmuskulatur vor, und kleine Herde mit proliferierten Gliazellen wurden im Gehirn und Rückenmark gefunden. Es folgte die Entwicklung eines indirekten Fluoreszenzantikörpertestes (IFAT) zur serologischen Diagnose der Neosporose (DUBEY et al. 1988b). Die Entwicklung eines immunhistochemischen Tests im Jahr 1989 machte die spezifische Identifikation von N. caninum in formalinfixiertem Gewebe möglich (LINDSAY u. DUBEY 1989a). Im selben Jahr wurde die Infektion mit N. caninum als eine Abortursache bei Rindern identifiziert (THILSTED u. DUBEY 1989). Die transplazentare Übertragung von N. caninum gelang experimentell bei Hunden (DUBEY u. LINDSAY 1989c), Katzen (DUBEY u. LINDSAY 1989b), Schafen

19 16 2. Literaturübersicht (DUBEY u. LINDSAY 1990a) und Rindern (DUBEY et al. 1992b). Die ersten experimentellen Tiermodelle für die Neosporose wurden an Mäusen (LINDSAY u. DUBEY 1989b) und Ratten (LINDSAY u. DUBEY 1990c) entwickelt. BJERKÅS und DUBEY (1991) verglichen histologische Schnitte, die von den Hunden aus den Studien von BJERKÅS et al. (1984) und DUBEY et al. (1988a) stammten, morphologisch und immunhistochemisch. Sie gelangten zu der Schlussfolgerung, dass N. caninum mit dem in Norwegen gefundenen Erreger identisch ist. Ebenfalls 1991 identifizierte man N. caninum als wichtige Abortursache bei kalifornischen, trockenstehenden Milchrindern (ANDERSON et al. 1991, BARR et al. 1991). Es folgte die Isolierung von N. caninum aus abortierten Rinderföten (CONRAD et al. 1993a) sowie die experimentelle Infektion von Rindern mit einem bovinen Isolat (BARR et al. 1994b). PARÉ et al. (1994) zeigten, dass die Neospora-Infektion gewöhnlich asymptomatisch bei Milchrindern verläuft. Es wurde ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Diagnose der Neosporose bei Hunden und Rindern entwickelt (BJÖRKMAN et al. 1994a, PARÉ et al. 1995a, DUBEY et al. 1996a). LALLY et al. (1996a) produzierten die ersten rekombinanten Antigene von N. caninum für die Diagnostik. Für den molekularen Nachweis der Parasiten-DNA in infizierten Geweben entstanden verschiedene, Neospora-spezifische PCRs (HO et al. 1996, HOLMDAHL u. MATTSON 1996, LALLY et al. 1996b, MÜLLER et al. 1996, PAYNE u. ELLIS 1996, YAMAGE et al. 1996). Es folgte die Entwicklung eines direkten Agglutinationstests (DAT) zur Diagnose der Neosporose bei verschiedenen Tierarten (PACKHAM et al. 1998, ROMAND et al. 1998). MARSH et al. (1998) benannten aufgrund molekularer Unterschiede N. hughesi als eine von N. caninum verschiedene Art bei Equiden. Bovine und canine Isolate hielten sie für Angehörige derselben Art. Erst 1998, 10 Jahre nach der Beschreibung der Tachyzoiten und Zysten von N. caninum in caninen Zwischenwirten, gelang der Beweis, dass der Hund auch ein Endwirt von N. caninum ist und Oozysten ausscheiden kann. McALLISTER et al. (1998) infizierten weiße Auszucht-Mäuse experimentell mit N. caninum und verfütterten die so erhaltenen Gewebezysten an Hunde. Sie entdeckten N.-caninum- Oozysten im Kot dieser Hunde. Im Jahr 2001 beschrieben BASSO et al. (2001) erstmals den Nachweis von N.-caninum-Oozysten im Kot eines natürlich infizierten Hundes. Die Neosporose ist jedoch keine neue Erkrankung. Retrospektive Studien konnten zeigen, dass N. caninum schon 1957 schwere Erkrankungen bei Hunden in den USA verursachte (DUBEY et al. 1990c).

20 2. Literaturübersicht Struktur und Biologie von N. caninum Entwicklungszyklus N. caninum gehört zu den zystenbildenden Kokzidien, ist ein obligat intrazellulärer Parasit und hat wahrscheinlich einen obligat zweiwirtigen Entwicklungszyklus (Abb. 2.1.). Abb Entwicklungszyklus von N. caninum. Die Entwicklung im Endwirt ist noch unbekannt. Der Endwirt scheidet unsporulierte Oozysten mit dem Kot aus. Es schließt sich die Sporogonie (d. h. ein Teilungsvorgang nach der Befruchtung) in der Umwelt an. Hierbei entstehen sporulierte Oozysten, die zwei infektiöse Sporozysten mit je vier Sporozoiten enthalten. Zwischenwirte nehmen die sporulierten Oozysten oral auf. Im Zwischenwirt findet die ungeschlechtliche Vermehrung (Merogonie) in Form einer Endodyogenie (Zweiteilung) statt. Die Tachyzoiten (Teilungsstadien) befallen viele Organsysteme. Sie können vertikal auf den Fötus übertragen werden. Im Nervengewebe des Zwischenwirts bilden sich Gewebezysten, die Bradyzoiten enthalten. Wie es zu deren Bildung kommt, ist noch nicht erforscht. Der Endwirt infiziert sich oral durch Aufnahme von Gewebezysten mit Bradyzoiten. Ob es noch weitere Infektionsmöglichkeiten für den Endwirt gibt, ist nicht bekannt (LÖSCHENBERGER et al. 2000, ROMMEL et al. 2000, ANTONY u. WILLIAMSON 2001) Morphologie der Entwicklungsstadien Bis 1998 waren die Tachyzoiten und Gewebezysten die einzigen bekannten Entwicklungsstadien von N. caninum.

21 18 2. Literaturübersicht Die Tachyzoiten sind je nach Teilungsstadium oval oder sichelförmig und 3 bis 7 x 1 bis 5 µm groß. Tachyzoiten, die sich nicht teilen, sind etwa 7 x 2 µm groß (DUBEY et al. 2002). Die Tachyzoiten teilen sich durch Endodyogenie in zwei Tochterzellen. Sie finden sich in Nervenzellen, Makrophagen, Fibroblasten, Gefäßendothelzellen, Muskelzellen, Epithelzellen der Nierentubuli, Leberparenchymzellen und anderen Körperzellen infizierter Tiere (CUMMINGS et al. 1988, DUBEY et al. 1988a, BJERKÅS u. PRESTHUS 1989, DUBEY u. LINDSAY 1989c, SPEER u. DUBEY 1989). Infizierte Wirtszellen können mehr als 100 Tachyzoiten in einer Schnittebene enthalten. Die Tachyzoiten dringen aktiv in die Wirtszelle ein und können innerhalb von 5 Minuten nach Kontakt mit der Wirtszelle in das Zellinnere gelangen (HEMPHILL et al. 1996). Die Tachyzoiten befinden sich im Wirtszellzytoplasma gewöhnlich innerhalb einer parasitophoren Vakuole. Eine Wirtszelle kann mehrere parasitophore Vakuolen beinhalten (DUBEY u. LINDSAY 1996). Die Membran der parasitophoren Vakuole stammt ursprünglich von der Oberflächenmembran der Wirtszelle, wird aber kurz nach der Wirtszellinvasion von dem Parasiten modifiziert (HEMPHILL et al. 1996, 1998). In der parasitophoren Vakuole können sich wenige, viele oder keine Tubuli befinden (BJERKÅS u. PRESTHUS 1988, 1989, SPEER u. DUBEY 1989). Dieses intravakuoläre tubuläre Netzwerk stammt zumindest teilweise von sekretorischen Produkten der Tachyzoiten (HEMPHILL 1996, HEMPHILL et al. 1998). Unabhängig vom Isolat enthalten die Tachyzoiten folgende Membranen und Zellorganellen: ein dreischichtiges Plasmalemm, 22 subpellikuläre Mikrotubuli, zwei apikale Ringe, ein Konoid, einen Polring, Mitochondrien, bis zu 150 Mikronemen, acht bis 18 Rhoptrien, von denen sich einige bis hinter den Kern ausdehnen, einen Golgiapparat, raues und glattes endoplasmatisches Retikulum, einen Kern und einen Nukleolus. Die Anzahl der Mikronemen ist hoch variabel. Einige Mikronemen können senkrecht zur inneren Parasitenmembran stehen. Die Rhoptrien enthalten stabiles elektronendichtes Material (BJERKÅS u. PRESTHUS 1988, SPEER u. DUBEY 1989, LINDSAY et al. 1993). Die Diskrepanz in der Anzahl der Rhoptrien, die von den verschiedenen Untersuchern berichtet wird, kann auf die Schwierigkeit zurückzuführen sein, Rhoptrien von dichten Granula zu unterscheiden (BJERKÅS u. DUBEY 1991). In manchen Tachzoitengruppen ist die Matrix um die einzelnen Tachyzoiten herum elektronendicht und enthält freie mikronemenähnliche und Ansammlungen tubulusähnlicher Strukturen (DUBEY et al. 1995). Mikroporen konnten nicht bei Tachyzoiten in Tieren, aber bei Tachyzoiten in Zellkulturen gefunden werden (SPEER u. DUBEY 1989, LINDSAY et al. 1993). Die Gewebezysten sind rund bis oval und bis zu 107 µm lang. Sie kommen nur im Nervengewebe (Gehirn, Rückenmark, Nerven und Retina) vor (DUBEY et al. 1988a,

22 2. Literaturübersicht c). Die Zystenwand ist glatt und bis zu 4 µm dick (DUBEY 1993). In den meisten Gewebezysten ist die Wand 1 bis 2 µm dick (DUBEY u. LINDSAY 1996). Sie enthält verzweigte tubulusähnliche Strukturen (BJERKÅS u. PRESTHUS 1988). Septen fehlen und es gibt keine zweite Zystenwand. Die Zystenwand ist unterschiedlich mit Periodic Acid Schiff-Reagens (PAS) anfärbbar und argyrophil (DUBEY 1993). Sie stellt sicher, dass die Parasiten chemisch und physiologisch stabil eingeschlossen sind (HEMPHILL 1999). Gewebezysten können bis zu 14 Tage bei 4 C überleben, aber bei -20 C werden sie in einem Tag abgetötet (LINDSAY et al. 1992). Die Gewebezysten enthalten 50 bis 200 Bradyzoiten (SPEER u. DUBEY 1989), die sich nur sehr langsam teilen (LINDSAY u. DUBEY 2000). Die Bradyzoiten sind mit einer Größe von 6 bis 8 x 1 bis 1,8 µm schlanker als Tachyzoiten. Sie enthalten dieselben Organellen wie Tachyzoiten mit der Ausnahme, dass nur sechs bis zwölf Rhoptrien (DUBEY et al. 2002) und mehr PAS-positive Granula vorkommen (DUBEY 1993). JARDINE (1996) berichtet außerdem noch von ein bis acht runden, zentral lokalisierten, von einer Membran begrenzten, vesikulären Organellen. Diese enthalten kleinere, oft irreguläre doppelschichtige Vesikel und kurze, zweischichtige Membransegmente. Der Kern ist in den Bradyzoiten terminal bis subterminal lokalisiert (DUBEY u. LINDSAY 1996). Die Mikronemen sind in Bradyzoiten oft senkrecht zum Plasmalemm angeordnet (DUBEY 1993). Mikroporen sind selten (SPEER u. DUBEY 1989, BJERKÅS u. DUBEY 1991, JARDINE 1996). Tubulovesikuläre Strukturen befinden sich zwischen den Bradyzoiten in der Grundsubstanz der Zyste (BJERKÅS u. DUBEY 1991, JARDINE 1996). Entgegen der bisherigen Beschreibung von dickwandigen Gewebezysten, die nur im Nervengewebe vorkommen, berichteten PETERS et al. (2001) auch von dünnwandigen (0,3 bis 1,0 µm) Gewebezysten in Muskeln von vier Hunden und zwei Rindern, die natürlich mit N. caninum infiziert waren. Diese intramuskulären Gewebezysten reagierten mit Antikörpern gegen N. caninum und mit Antiserum gegen das bradyzoitenspezifische Antigen BAG-5, das sowohl mit T.-gondii- als auch mit N.-caninum-Bradyzoiten reagiert. Eine Koinfektion mit T. gondii wurde durch negative Ergebnisse in der Serologie und Immunhistochemie ausgeschlossen. Wegen schlechter Konservierung des Untersuchungsmaterials konnte die Lokalisation der Gewebezysten innerhalb der Muskelfasern jedoch nicht immer mit Sicherheit bestimmt werden. Manchmal kamen artifizielle optisch leere Räume um die Zysten vor. Die intramuskulären Zysten enthielten 14 bis 50 Bradyzoiten mit einer Größe von 5,2 x 1,6 µm. Morphologisch erinnerten die Gewebezysten und Bradyzoiten eher an Neospora als an Toxoplasma oder Sarcocystis. Obwohl Koinfektionen mit anderen zystenbildenden Kokzidien nicht völlig ausgeschlossen werden konnten, schlossen die Autoren, dass es sich bei den beobachteten Gewebezysten um Zysten von N. caninum handelte. Diese Beobachtung ist von

23 20 2. Literaturübersicht großer Bedeutung für die Epidemiologie, da der Erreger dann auch durch Verzehr infizierten Fleisches aufgenommen werden könnte, was für Karnivoren deutlich einfacher ist, als an das durch Knochen geschützte Gewebe des Zentralnervensystems (ZNS) zu gelangen. Solche intramuskulären Gewebezysten wurden jedoch noch nicht in experimentell infizierten Mäusen, Mongolischen Wüstenrennmäusen oder Katzen gefunden (DUBEY et al. 2002). Es bedarf daher weiterer Untersuchungen, um die Lokalisation der Zysten von N. caninum im Zwischenwirt zu klären. Im Jahr 1998 wurde der Hund und im Jahr 2004 der Kojote als Endwirt von N. caninum identifiziert, d. h. diese Tierarten können Oozysten mit dem Kot ausscheiden (McALLISTER et al. 1998, GONDIM et al. 2004). Die intestinalen Stadien, die einer Oozystenbildung vorangehen, sind jedoch noch unbekannt. Es war bisher nicht möglich, Meronten oder Gamonten im caninen Verdauungstrakt zu lokalisieren und zu beschreiben (DUBEY et al. 2002). Die Präpatenz nach Fütterung von Gewebezysten beträgt 5 Tage oder länger (LINDSAY et al. 1999a). N.-caninum- Oozysten werden unsporuliert ausgeschieden (McALLISTER et al. 1998) und können unter optimalen Bedingungen innerhalb von 24 Stunden sporulieren (LINDSAY et al. 1999a). Die Oozysten von N. caninum sind denen von T. gondii, H. hammondi und H. heydorni ähnlich (McALLISTER et al. 1998). Sie sind rund bis fast rund. Unsporulierte Oozysten besitzen einen Durchmesser von 10 bis 11 µm und beinhalten einen zentralen Sporonten (McALLISTER et al. 1998). Sporulierte Oozysten sind 11,7 x 11,3 µm groß. Ihr Längen/Breiten-Verhältnis beträgt 1,04. Sie haben eine glatte, farblose Oozystenwand ohne Mikropyle. Die Wanddicke beträgt 0,6 bis 0,8 µm. In der Oozyste kommt kein Restkörper vor. Es gibt keine polaren Granula, obwohl gelegentlich winzige refraktile Granula zwischen den Sporozysten gesehen werden. Die sporulierten Oozysten enthalten zwei Sporozysten. Diese sind ellipsenförmig und 8,4 x 6,1 µm groß mit einem Längen/Breitenverhältnis von 1,37. Ihre Wand ist 0,5 bis 0,6 µm dick, glatt und farblos. Dis Sporozystenwand enthält keine Stiedakörperchen. Ein runder oder fast runder Sporozystenrestkörper befindet sich in der Sporozyste und besteht aus einem Haufen schmaler, kompakter Granula von 4,3 x 3,9 µm Größe oder wird durch viele zerstreute Granula mit bis zu 1 µm Durchmesser dargestellt. Ferner enthält jede Sporozyste vier Sporozoiten. Diese sind lang und dünn, oft an einer Seite etwas abgeplattet und 6,5 x 2 µm groß. In den Sporozoiten befinden sich keine refraktilen Körper. Der Kern der Sporozoiten ist zentral oder leicht posterior lokalisiert (LINDSAY et al. 1999b). Die Tab gibt einen Überblick über die bisher veröffentlichten Daten zur Oozystengröße.

24 2. Literaturübersicht 21 Tab Daten zur Oozystengröße Parasitenart Isolat Entwicklungszustand Größe der Oozysten Anzahl gemessener Oozysten Anzahl der Hunde, von denen die Oozysten stammten Größe der Sporozysten (µm) (n) (n) (µm) Referenz N. caninum NC-2, NC-Liverpool, NC-beef unsporuliert 10-11? a 3 entfällt McALLISTER et al. (1998) NC-beef sporuliert 11,7 ± 0,43 x 11,3 ± 0, ,4 ± 0,40 x 6,1 ± 0,25 LINDSAY et al. (1999b)? a unsporuliert 10-11? a 3 entfällt DIJKSTRA et al. (2001) CZ-4 sporuliert 11,5 (10-13) x 10,8 (10-11) ,7 (9-10) x 6,6 (6-7) ŠLAPETA et al. (2002) H. heydorni-berlin- sporuliert 10,5 ± 0,5 x 1996 b 10,9 ± 0,5 50 4?a SCHARES et al. (2001b) H. heydorni? a sporuliert 11,9 ± 0,9 x 11,1 ± 0, ,7 ± 1,1 x HEYDORN 5,6 ± 0,7 c (1973) a, keine Angabe; b, Isolat als H. heydorni-berlin-1996 benannt, es handelt sich hierbei aber um ein N.-caninum-Isolat c, Daten aus der Messungen von 50 Sporozysten errechnet

25 22 2. Literaturübersicht Wirtsspektrum N. caninum besitzt ein breites Zwischenwirtsspektrum. Natürliche Infektionen spielen eine wichtige Rolle bei Hunden und Rindern (DUBEY u. LINDSAY 1996). Selten wird über natürliche Infektionen bei Hirschen (WOODS et al. 1994), Nashörnern (WILLIAMS et al. 2002), Pferden (DUBEY u. PORTERFIELD 1990, DAFT et al. 1996, LINDSAY et al. 1996b), Schafen (DUBEY u. Lindsay 1990a, OTTER et al. 1997, HÄSSIG et al. 2003) und Ziegen (BARR et al. 1992, DUBEY et al. 1992a, 1996b, CORBELLINI et al. 2001) berichtet. Vor der Beschreibung von N. hughesi gab es Berichte über N.-caninum-Infektionen bei einem abortierten Fohlen (DUBEY u. PORTERFIELD 1990), einem neugeborenen Fohlen (LINDSAY et al. 1996b) und einer 19-jährigen Stute mit einem Cushing-Syndrom (DAFT et al. 1996). LINDSAY et al. (1996b) fanden bei dem Fohlen dickwandige Gewebezysten mit einer Wanddicke von 1,5-3 µm, die Gewebezysten der alten Stute hatten bis zu 2 µm dicke Wände (DAFT et al. 1996, DUBEY et al. 2001). Es ist unklar, ob die dickwandigen Zysten dieser Pferde von N. hughesi oder N. caninum verursacht waren, weil es antigene Kreuzreaktionen zwischen N. caninum und N. hughesi gibt (DUBEY et al. 2002). Experimentelle Neospora-Infektionen können bei Füchsen (BJERKÅS et al. 1984), Hunden (DUBEY u. LINDSAY 1989c), Kaninchen (DUBEY et al. 1996a), Katzen (DUBEY u. LINDSAY 1989a), Kojoten (LINDSAY et al. 1996a), Mäusen (LINDSAY u. DUBEY 1990a), Mongolischen Wüstenrennmäusen (CUDDON et al. 1992), Ratten (LINDSAY u. DUBEY 1990c), Rhesusaffen (BARR et al. 1994a), Rindern (DUBEY et al. 1992b), Schafen (DUBEY et al. 1990a), Schweinen (DUBEY et al. 1996a, JENSEN et al. 1998), Tauben (McGUIRE et al. 1999) und Ziegen (LINDSAY et al. 1995b) erzeugt werden. Serologische Studien haben gezeigt, dass bei Dingos (BARBER et al. 1997a), Kamelen (HILALI et al. 1998), Kojoten (LINDSAY et al. 1996a), Rotfüchsen (BARBER et al. 1997a, BUXTON et al. 1997a, ALMERÍA et al. 2002) und Wasserbüffeln (DUBEY et al. 1998b, HUONG et al. 1998, GUARINO et al. 2000) Antikörper gegen N. caninum gefunden werden können. Sie deuten darauf hin, dass diese Tierarten mit N. caninum infiziert sein könnten. DUBEY et al. (1999) zeigten, dass beim Weißwedelhirsch eine hohe Seroprävalenz für N. caninum vorliegt. Auch beim Menschen konnten TRANAS et al. (1999) in der Verdünnung 1:100 im IFAT bei 6,7 % von 1029 Seren von kalifornischen Blutspendern Antikörper gegen N. caninum nachweisen. Ebenso fanden NAM et al. (1998) N.-caninum-Antikörper in menschlichem Serum. Die Bedeutung der menschlichen Exposition mit N. caninum

26 2. Literaturübersicht 23 ist jedoch unbekannt (TRANAS et al. 1999). GRAHAM et al. (1999) konnten in den Seren von 199 Blutspendern und von 48 Landarbeitern aus Nordirland keine N.- caninum-antikörper bei einer Verdünnung von 1:160 im IFAT feststellen. Auch PETERSEN et al. (1999) fanden in einer Studie an 76 dänischen Frauen, die wiederholt Fehlgeburten hatten, keinen Beweis für eine Neospora-Infektion. Zurzeit gibt es keine Hinweise darauf, dass die Neosporose eine Bedeutung für den Menschen hat. Bis zum Jahr 2004 war der Hund der einzige bekannte Endwirt für N. caninum (McALLISTER et al. 1998). Aufgrund des Vorkommens von Antikörpern bei Dingos, Kojoten und Rotfüchsen vermutete man, dass möglicherweise auch wilde Caniden als Endwirt für N. caninum dienen. Fütterungsversuche mit Gewebe infizierter Zwischenwirte an Katzen (CUDDON et al. 1992), drei Marder-Arten (McALLISTER et al. 1999), Rotfüchsen (SCHARES et al. 2002b), verschiedenen Vogelarten (BAKER et al. 1995) und Waschbären (DUBEY et al. 1993) führten zu keiner nachweisbaren N.-caninum-Oozystenausscheidung. Auch LINDSAY et al. (1996a) konnten keine N.-caninum-Oozysten im Kot von Kojoten nachweisen, denen zuvor Gehirne Neospora-infizierter Mäuse verfüttert worden waren. Im Jahr 2004 entdeckten GONDIM et al. (2004) den Kojoten als weiteren Endwirt für N. caninum. Ihnen gelang es, einen Welpen zum Ausscheiden von N.-caninum-Oozysten zu bringen, indem sie Gewebe Neospora-infizierter Kälber an vier in Gefangenschaft großgezogene Kojotenwelpen verfütterten.

27 24 2. Literaturübersicht Übertragungswege von N. caninum und Epidemiologie N. caninum kann auf natürlichem Wege sowohl vertikal als auch horizontal übertragen werden (Abb. 2.2.). Abb Übertragungswege und Epidemiologie von N. caninum. Die transplazentare Infektion des Fötus (vertikale Übertragung) ist bei Hunden (DUBEY et al. 1988b, 1990c, BARBER u. TREES 1998), Pferden (DUBEY u. PORTERFIELD 1990), Rindern (THILSTED u. DUBEY 1989, BARR et al. 1991, BJÖRKMAN et al. 1996, PARÉ et al. 1996, THURMOND et al. 1997), Schafen (DUBEY et al. 1990a) und Ziegen (BARR et al. 1992) beschrieben. Experimentell konnte eine transplazentare Infektion bei Hunden (DUBEY u. LINDSAY 1989c, COLE et al. 1995b), Katzen (DUBEY u. LINDSAY 1989b), Mäusen (COLE et al. 1995a, LONG u. BASZLER 1996), Rindern (DUBEY et al. 1992b, BARR et al. 1994b), Schafen (DUBEY u. LINDSAY 1990a, McALLISTER et al. 1996b, BUXTON et al. 1997b) und Ziegen (LINDSAY et al. 1995b) induziert werden. Die transplazentare Übertragung kann beim Rind über mehrere Generationen erfolgen (BJÖRKMAN et al. 1996). Außerdem kann sie sowohl beim Rind (BARR et al. 1993) als auch beim Hund (BJERKÅS et al. 1984, DUBEY et al. 1988b)

28 2. Literaturübersicht 25 wiederholt bei demselben Muttertier auftreten. Allerdings weisen nicht alle Welpen einer Neospora-positiven Hündin einen Neospora-Antikörpertiter auf, nicht alle Welpen erkranken und die erkrankten Welpen zeigen unterschiedlich schwere Symptome (BJERKÅS et al. 1984, DUBEY et al. 1988b, HAY et al. 1990, BARBER u. TREES 1998). Bei Rindern wird die transplazentare Infektion des Fötus für den Hauptübertragungsweg gehalten (PARÉ et al. 1996, ANDERSON et al. 1997, SCHARES et al. 1998, DAVISON et al. 1999a). Basierend auf der Anwesenheit präkolostraler Antikörper bei Kälbern von seropositiven Müttern wurde von 81 % (PARÉ et al. 1996), 93 % (SCHARES et al. 1998) und 95 % (DAVISON et al. 1999a) Effizienz dieser Übertragungsart berichtet. Generell wird angenommen, dass Rinder lebenslang mit N. caninum infiziert bleiben. Aber nicht alle infizierten Rinder übertragen die Infektion auf alle ihre Nachkommen (WOUDA et al. 1998b). Es ist unbekannt, welche Faktoren bestimmen, ob eine N.-caninum-infizierte Kuh die Infektion auf ihr Kalb während der Trächtigkeit überträgt oder nicht. Beim Hund scheint die vertikale Übertragung keine so wichtige Rolle für die Verbreitung der Neospora-Infektion zu spielen wie beim Rind. BARBER und TREES (1998) fanden, dass die Häufigkeit der vertikalen Übertragung bei natürlich infizierten Hunden in ihrer Studie zwischen 3 und 52 % variierte, aber mit durchschnittlich 20 % insgesamt zu niedrig war, um allein die relativ hohe Prävalenz von Neospora- Infektionen bei Hunden (siehe Tab. 2.3.) zu erklären. Aufgrund der beschriebenen Seroprävalenzen von 0 bis 47,4 % bei Hunden ist zu erwarten, dass die postnatale Infektion (horizontale Übertragung) den Hauptinfektionsweg für den Hund darstellt. Für das gehäufte Auftreten von postnatalen Infektionen bei Hunden spricht auch die Beobachtung, dass die Seroprävalenz von N. caninum bei Hunden mit zunehmendem Alter steigt (BARBER et al. 1997b, SAWADA et al. 1998, WOUDA et al. 1999b, BASSO et al. 2001b, WANHA 2002). Wie sich Hunde unter natürlichen Umständen horizontal mit N. caninum infizieren, ist jedoch noch nicht bekannt. Es wird angenommen, dass dies durch Aufnahme von mit Gewebezysten kontaminierten Organen geschieht (DUBEY u. LINDSAY 1996, WOUDA et al. 1999b, SCHARES et al. 2001b). Diese Annahme wird unterstützt durch die Beobachtung, dass Bradyzoiten resistent gegenüber einer Salzsäure- Pepsin-Lösung und oral infektiös für Mäuse (LINDSAY u. DUBEY 1990a) und für Hunde (McALLISTER et al. 1998, LINDSAY et al. 1999a) sind. Ferner konnten SCHARES et al. (2001b) diese Annahme dadurch bekräftigen, dass sie im Kot eines natürlich infizierten Hundes, der mit kommerziellem Trocken- und Dosenfutter und gelegentlich mit Rinderpansen gefüttert wurde, H.-heydorni-ähnliche Oozysten

29 26 2. Literaturübersicht fanden, die auf molekularer Ebene nicht vom NC-1-Isolat von N. caninum unterschieden werden konnten. Experimentell gelang die orale Infektion von Hunden durch Verfütterung von N.- caninum-gewebezysten aus Mäusen (McALLISTER et al. 1998, LINDSAY et al. 1999a, b, 2001). Es ist unbekannt, wie Hunde unter natürlichen Umständen infiziert werden. Es wurde berichtet, dass die Seroprävalenz für N. caninum bei Hofhunden signifikant höher als bei Hunden aus städtischen Regionen ist (SAWADA et al. 1998, WOUDA et al. 1999b, ANTONY u. WILLIAMSON 2001). Offensichtlich haben Hofhunde ein höheres Expositionsrisiko gegenüber N. caninum als Stadthunde. Rinder werden als potentielles Reservoir für die Infektion von Hunden angesehen. Aber ob abortierte Rinderföten, Fötalhüllen oder Fötalflüssigkeiten natürliche Infektionsquellen sind, bleibt noch zu beweisen. Eine andere mögliche Erklärung für die hohe Prävalenz von N.-caninum-Infektionen bei Hofhunden im Vergleich zu Stadthunden ist, dass Hofhunde eher ein karnivores und aasfressendes Verhalten entwickeln, welches zum Verzehr kleiner Säuger und Vögel führt, die N.-caninum-Gewebezysten enthalten können (HEMPHILL u. GOTTSTEIN 2000). Bisher gelang es nur dreimal, die Ausscheidung von Neospora-Oozysten bei natürlich infizierten Hunden nachzuweisen. BASSO et al. (2001) isolierten Neospora- Oozysten aus dem Kot eines natürlich infizierten, 45 Tage alten Rottweilers aus Argentinien. ŠLAPETA et al. (2002) konnten aus dem Kot eines natürlich infizierten, 1 Jahr alten Deutschen Schäferhundes aus der Tschechischen Republik 10 6 Neospora-Oozysten gewinnen. McGARRY et al. (2003) erhielten Neospora- Oozysten aus dem Kot eines natürlich infizierten britischen Foxhounds. Ihnen gelang die zweimalige Isolierung aus dem Kot desselben Hundes in einem Abstand von 4 Monaten. Aus dieser Beobachtung folgerten sie, dass die Oozystenausscheidung unter gewissen Umständen über einen relativ langen Zeitraum stattfinden kann oder dass ein erneutes Ausscheiden von Oozysten auftreten kann. Um den vermuteten natürlichen Infektionsweg für den Endwirt Hund nachzuahmen, wurden Fütterungsversuche mit Teilen infizierter Föten und Plazenten seropositiver Rinder sowie tachyzoitenangereichertem Kolostrum durchgeführt (BERGERON et al. 2001, DIJKSTRA et al. 2001). BERGERON et al. (2001) versuchten, Hunde experimentell zu infizieren, indem sie neun 2 bis 4 Monate alte Hunde mit Teilen boviner Föten fütterten, von denen sie annahmen, dass sie natürlich mit N. caninum infiziert waren. Im ersten Versuch erhielt jeder Hund eine Plazenta einer seropositiven Kuh und fötales Gehirn, das bei

30 2. Literaturübersicht C über 4 bis 28 Tage gelagert worden war. Im zweiten Versuch wurden jedem Hund zwei Föten verfüttert, die entweder für eine N.-caninum-Infektion typische histopathologische Veränderungen hatten, immunhistologisch positiv für N. caninum waren oder eine seropositive Mutter hatten. Diese Föten wurden vor der Verfütterung über 2 bis 4 Wochen bei 4 C gelagert. Allerdings schied kein Hund aus diesen Versuchen Oozysten aus, serokonvertierte oder hatte klinische, pathologische oder histologische Veränderungen, die auf eine Neospora-Infektion schließen ließen. Die Autoren vermuteten eine verminderte Infektiosität des Parasiten aufgrund der Lagerung der Föten. Deswegen wurden die Föten in einem dritten Versuch sofort nach dem Eintreffen verfüttert. Man ging davon aus, dass ein Hund genügend infektiöses Material erhalten hatte, wenn er vier Föten seropositiver Mütter gefressen hatte, wobei die fötalen Gehirne Veränderungen aufwiesen, die bei der histopathologischen oder immunhistochemischen Untersuchung für eine Infektion mit N. caninum sprachen, oder wenn der Hund wenigstens ein fötales Gehirn gefressen hatte, in dem immunhistologisch Gewebezysten von N. caninum nachgewiesen wurden. Um die Empfänglichkeit für die Infektion zu erhöhen, erhielt ein Hund zusätzlich Prednison. Aber auch in diesem Versuch entwickelte kein Hund Antikörper gegen N. caninum, schied Oozysten aus oder entwickelte Symptome, die auf eine Neosporose schließen ließen. Als eine weitere Ursache für das Misslingen dieses Experiments gaben die Autoren die Möglichkeit einer zu geringen Infektionsdosis an, da die genaue Anzahl der Parasiten, mit der die Hunde infiziert wurden, in dieser Studie nicht bestimmt wurde. Ferner wäre es möglich, dass die Föten nur Tachyzoiten enthielten, die durch die Verdauung zerstört wurden. Die Autoren geben auch zu bedenken, dass der Hund möglicherweise nicht der natürliche Endwirt von N. caninum ist und dass es einen Wildcaniden als natürlichen Endwirt geben könnte. Sie folgern aus ihren Versuchen, dass weitere Studien nötig sind, um die Rolle der Hunde und wilder Caniden bei der Epidemiologie der Neosporose zu klären. In einem ähnlichen Versuch gelang es DIJKSTRA et al. (2001), Hunde experimentell durch das Verfüttern von Kotyledonen von Rindern, die natürlich mit N. caninum infiziert waren, zum Ausscheiden von Neospora-Oozysten zu bringen. Andere Hunde erhielten oral Kolostrum mit zugesetzten Neospora-Tachyzoiten und schieden keine Oozysten aus. Die Autoren erklären ihre Beobachtungen damit, dass Tachyzoiten gegenüber Salzsäure und Pepsin nicht resistent sind und somit die Tachyzoiten im Kolostrum verdaut wurden und keine Infektion erzeugen konnten. Sie vermuten, dass möglicherweise in der Plazenta vorhandene Tachyzoiten den Magen passieren, bevor sie verdaut werden können oder dass es in der Plazenta enzystierte Bradyzoiten als Infektionsstadien gibt. Die Rolle des Hundes bei der Epidemiologie der Neosporose ist also noch weitgehend unbekannt. Einige epidemiologische Studien zeigten, dass die

31 28 2. Literaturübersicht Anwesenheit von Hunden ein Risikofaktor für N.-caninum-assoziierte Aborte bei Rindern sein kann (PARÉ et al. 1998, BARTELS et al. 1999, OULD-AMROUCHE et al. 1999, WOUDA et al. 1999b, DIJKSTRA et al. 2002) und dass die Anzahl der Hunde im Bestand positiv korreliert ist mit der Höhe der Seroprävalenz von N. caninum bei den Rindern (PARÉ et al. 1998, MAINAR-JAIME et al. 1999, WOUDA et al. 1999b). Dies legt nahe, dass Hunde als Endwirte bei der Übertragung von N. caninum auf Rinder von Bedeutung sind. Hunde könnten aber auch indirekt bei der Übertragung von N. caninum eine Rolle spielen, indem sie infiziertes Material an einen Reservoirwirt liefern. Hunde haben auf vielen Farmen freien Zugang zu abortierten Föten oder toten Kälbern (ANTONY u. WILLIAMSON 2001). Aufgrund der Beobachtung, dass nur geringe Oozystenzahlen von infizierten Hunden ausgeschieden wurden, folgerten LINDSAY et al. (2001), dass dies ein Hinweis dafür sein könnte, dass der Hund nicht der Hauptendwirt für N. caninum ist. Möglicherweise spielen wilde Caniden eine Rolle bei der Epidemiologie der Neosporose. N.-caninum-Antikörper wurden auch bei Dingos (BARBER et al. 1997a), Kojoten (LINDSAY et al. 1996a) und Rotfüchsen (BARBER et al. 1997a, BUXTON et al. 1997a, SIMPSON et al. 1997, ALMERÍA et al. 2002) nachgewiesen. DUBEY et al. (1999) fanden beim Weißwedelhirsch eine hohe Prävalenz von Antikörpern gegen N. caninum. Diese Beobachtung legt das Vorkommen eines silvatischen Zyklus nahe. Trotz der Effizienz der vertikalen Übertragung beim Rind ist es aufgrund theoretischer Modelle offensichtlich, dass das Vorkommen von N. caninum in einer Rinderherde ohne zusätzliche postnatale Infektionen nicht aufrechterhalten werden kann (FRENCH et al. 1999). Bei erwachsenen Rindern sind Aborte das einzige klinische Zeichen einer Neospora- Infektion (DUBEY 1999). Es gibt zwei charakteristische Muster, mit denen N.-caninum-assoziierte Aborte auftreten: epidemische Aborte, d. h. Abortausbrüche mit vielen Aborten innerhalb weniger Wochen, und endemische Aborte, d. h. Aborte, die verstreut über einen langen, unbestimmten Zeitraum auftreten (SCHARES et al. 2002a). Unterschiede in der serologischen Antwort zwischen Herden mit epidemischen und endemischen N.-caninum-assoziierten Aborten können auf unterschiedlichen Übertragungsarten, nämlich dem Auftreten einer Punktquelle in epidemischen Fällen und konnatalen Infektionen in endemischen Fällen, beruhen (SCHARES et al. 1999). Epidemiologische Studien und Feldbeobachtungen liefern zunehmend Hinweise auf postnatale Infektionen bei Rindern mit N. caninum. In diesem Zusammenhang

32 2. Literaturübersicht 29 wichtige Beobachtungen sind der epidemische Verlauf einiger N.-caninumassoziierter Abortausbrüche, der eine Punktquelle als Ursache nahe legt (McALLISTER et al. 1996a), und das Fehlen eines Zusammenhangs zwischen der Seropositivität von Müttern und Töchtern in einigen infizierten Herden (THURMOND et al. 1997, MAINAR-JAIME et al. 1999). Basierend auf einem Vergleich von 209 Mutter-Tochter-Paaren in 43 Milchviehherden in Spanien wurde der Anteil, der konnatalen Infektionen zugerechnet werden konnte, nur auf 56 % geschätzt (MAINAR-JAIME et al. 1999). FRENCH et al. (1999) schätzten, dass 0,85 % bis 9 % der Infektionen postnatal erfolgen müssen, damit sich der Parasit in einer Herde halten kann. Einige Studien fanden ein niedriges Vorkommen von Serokonversionen in Rinderherden mit endemischer Neosporose, was ein seltenes Vorkommen postnataler Infektionen auch bei diesen Herden nahe legt (PARÉ et al. 1996, 1997, SCHARES et al. 1998, WOUDA et al. 1998b, DAVISON et al. 1999b, HIETALA u. THURMOND 1999). HIETALA und THURMOND (1999) zeigten, dass eine postnatale N.-caninum-Infektion selten und sporadisch in Rinderherden mit hoher Prävalenz vorkommen kann, und zwar auf Farmen, auf denen auch potentielle Endund andere Zwischenwirte leben. Die Anwesenheit von Endwirten und anderen Zwischenwirten mit freiem Zugang zum Futter allein erschien den Autoren jedoch nicht ausreichend als Erklärung postnataler Transmissionen in solchen Herden. Sie folgerten, dass zusätzliche Faktoren, wie Interaktion spezifischer Management- Praktiken mit Dynamiken in der End- oder Zwischenwirtpopulation und ökologische Schnittstellen in einem Milchviehbetrieb die postnatale Exposition und das Potential für eine postnatale N.-caninum-Infektion beeinflussen können. Der epidemiologische Hinweis auf postnatale Infektionen bei Rindern wird durch den experimentellen Beweis, dass Kälber und Kühe oral mit N.-caninum-Oozysten infiziert werden können, unterstützt (DE MAREZ et al. 1999, TREES et al. 2002). Denkbare Quellen einer horizontalen Infektion beim Rind sind Kolostrum oder Milch infizierter Kühe (UGGLA et al. 1998), infizierte Plazenten oder Fötalflüssigkeiten (HO et al. 1997a) oder Futter, das mit Oozysten kontaminiert ist (McALLISTER et al. 1998). Diese Möglichkeiten der horizontalen Infektion konnten bei natürlich infizierten Rindern jedoch noch nicht nachgewiesen werden. Experimentelle horizontale Infektionen durch Verfütterung von Oozysten aus dem Kot zuvor experimentell mit N. caninum infizierter Hunde gelangen bei Mäusen (McALLISTER et al. 1998), Mongolischen Wüstenrennmäusen (DUBEY u. LINDSAY 2000) und Rindern (DE MAREZ et al. 1999). BASSO et al. (2001) gelang es auch, Mongolische Wüstenrennmäuse mit Oozysten aus dem Kot eines natürlich infizierten Hundes oral zu infizieren.

33 30 2. Literaturübersicht UGGLA et al. (1998) zeigten im Experiment, dass N.-caninum-Tachyzoiten aus der Zellkultur oral infektiös für neugeborene Kälber sind, wenn sie der Milch zugefügt werden. Die Möglichkeit einer laktogenen Infektion, besonders durch das Verfüttern von Kolostrum an neugeborene Kälber, wurde diskutiert. Aber es wurde noch kein Beweis für diesen Infektionsweg unter natürlichen Bedingungen gefunden (DAVISON et al. 1999a, HIETALA u. THURMOND 1999). Obwohl angenommen wird, dass Rinder durch Aufnahme von Oozysten aus Hundekot infiziert werden können, ist es zweifelhaft, dass alle N.-caninum- Abortausbrüche das unmittelbare Ergebnis eines kürzlichen Kontaktes mit oozystenausscheidenden Hofhunden ist. In einer niederländischen Studie war die Seroprävalenz bei Rindern in den meisten Herden mit epidemischen Aborten in allen Altersgruppen stabil. Dies legt nahe, dass die Infektionen vor dem Auftreten des Abortausbruchs infolge vertikaler Übertragungen über einige Jahre bestanden (WOUDA et al. 1999a). In einer spanischen Studie war das Vorkommen von Aborten aufgrund von N. caninum nicht assoziiert mit der Hundeanzahl auf dem Hof (MAINAR-JAIME et al. 1999). Die Anwesenheit von Geflügel im Betrieb wurde als ein Risikofaktor für N.-caninumassoziierte Abortausbrüche ermittelt. Es wird vermutet, dass Geflügel als mechanischer Vektor für die Oozysten fungiert. Eine andere Möglichkeit ist, dass Hunde die Infektion durch Fressen infizierten Geflügels erlangen (BARTELS et al. 1999). McGUIRE et al. (1999) konnten Tauben experimentell mit N. caninum infizieren. Möglicherweise können sie als Zwischenwirt für N. caninum auch unter natürlichen Bedingungen fungieren. In einer französischen Studie war die Seroprävalenz von N. caninum bei Rindern assoziiert mit der Anwesenheit von Kaninchen oder Enten auf dem Hof (OULD-AMROUCHE et al. 1999). In einer niederländischen Studie schien die Fütterung von verschimmelter Maissilage ein Risikofaktor für Neospora-assoziierte Abortausbrüche in Milchviehherden zu sein. Verschimmeltes Futter kann Mykotoxine enthalten, die eine Immunsuppression verursachen und somit zur Reaktivierung einer latenten N.-caninum-Infektion führen können. Stresserzeugende Ereignisse wie Impfungen, hohe Temperaturen und Diätfaktoren wie Proteinimbalanzen wurden von den Landwirten, die an der Studie teilnahmen, als mögliche Risikofaktoren vermutet, aber diese Faktoren erhöhten das Risiko für einen Neospora-verursachten Abort nicht signifikant (BARTELS et al. 1999). Schwedische Forscher fanden einen positiven Zusammenhang zwischen Seropositivität gegenüber N. caninum und Seropositivität gegenüber boviner Virusdiarrhöe (BJÖRKMAN et al. 2000). Andere Untersucher fanden einen solchen Zusammenhang nicht (BARTELS et al. 1999, GOTTSTEIN et al. 1999).

34 2. Literaturübersicht 31 Saisonalität im Auftreten von N.-caninum-assoziierten Abortausbrüchen wurde in den Niederlanden (BARTELS et al. 1999, WOUDA et al. 1999a) und in Kalifornien (THURMOND et al. 1995) beobachtet. In den Niederlanden fanden 38 von 50 Abortausbrüchen in den Jahren 1995 bis 1997 zwischen Juni und September (Sommer und früher Herbst) statt. In den Niederlanden werden Milchrinder von April bis Oktober tagsüber auf der Weide gehalten und erhalten nachts Zusatzfutter. In Kalifornien wurde ein erhöhtes Abortrisiko in den Wintermonaten Dezember bis Februar gesehen. Die Winter in Kalifornien sind mild und feucht, während die Sommer heiß und trocken sind. Involvierte Faktoren könnten die unterschiedliche Sporulationsfähigkeit und Überlebensdauer der Oozysten in der Umwelt oder eine erhöhte Exposition gegenüber Faktoren, die eine verminderte Immunkompetenz verursachen, zu bestimmten Jahreszeiten sein (THURMOND et al. 1995). HÄSSIG et al. (2003) berichteten über einen Zusammenhang zwischen einer Neospora-Infektion und Aborten beim Schaf. Zusammenfassend kann man sagen, dass bisher noch wenig über die natürlichen Übertragungswege von N. caninum und die Verbreitung dieses Parasiten in den verschiedenen Geweben der Wirte bekannt ist (DUBEY 2003). Bei der Epidemiologie der Neosporose sind noch viele Faktoren ungeklärt, und es sind weitere Studien notwendig, um den Lebenszyklus von N. caninum vollständig zu klären. Vor allem sollten weitere Daten über N.-caninum-Infektionen bei Hunden erhoben werden, um folgende Fragen zu beantworten: Wie hoch ist die Seroprävalenz von N. caninum bei Hunden in verschiedenen Regionen? Wie infizieren sich Hunde unter natürlichen Umständen horizontal mit N. caninum? Gibt es Faktoren, die eine Neospora-Infektion bei Hunden begünstigen? Wie viele Hunde scheiden unter natürlichen Bedingungen Oozysten aus? Gibt es weitere, für die Übertragung der N.-caninum-Infektion auf Hunde wichtige natürliche Zwischenwirte? Wie infizieren sich Rinder und andere natürliche Zwischenwirte horizontal?

35 32 2. Literaturübersicht 2.4. Neospora-Infektionen bei Hunden Serokonversion bei Hunden Da man noch sehr wenig über die Infektionsquellen für Hunde weiß, ist auch noch nicht in allen Einzelheiten bekannt, unter welchen Umständen Hunde serokonvertieren und in welchem Zeitraum das geschieht. McALLISTER et al. (1998) verfütterten N.-caninum-Gewebezysten an vier Hunde. Von diesen schieden drei Hunde Oozysten ab dem 8. bis 13. Tag post infectionem (p. i.) aus. Zwei der ausscheidenden Hunde hatten am 37. Tag p. i. einen im IFAT nachweisbaren Antikörpertiter gegen N. caninum von 1:800 und 1:1600. Der dritte Hund hatte zwar Oozysten ausgeschieden, aber er besaß keine im IFAT messbaren Antikörper im Blut, wohingegen der vierte Hund, der keine Oozysten ausgeschieden hatte, einen Antikörpertiter von 1:1600 aufwies. LINDSAY et al. (1999a) infizierten zwei Hunde experimentell mit Gewebezysten von N. caninum. Diese beiden Hunde begannen am 5. bzw. 6. Tag p. i. mit der Oozystenausscheidung. Im IFAT konnte bei einem Hund ab dem 35. Tag p. i. ein Immunglobulin G (IgG)-Antikörpertiter von 1:200 nachgewiesen werden. Der zweite Hund zeigte bis zum 42. Tag p. i. keine im IFAT messbare Antikörperantwort bei einer Serumverdünnung von 1:25. LINDSAY et al. (2001) verfütterten Gewebezysten an sechs Hunde. Von diesen schieden drei Hunde Oozysten aus und fünf Hunde serokonvertierten im MAT zwischen dem 7. und 28. Tag p. i. Ein Hund, der Oozysten ausgeschieden hatte, blieb seronegativ, wohingegen alle Hunde, die keine Oozysten ausgeschieden hatten, serokonvertierten. SCHARES et al. (2001a) untersuchten Seren von elf Hunden, die sie durch Infektion mit Gewebe infizierter Zwischenwirte zur Oozystenausscheidung gebracht hatten. Von diesen Hunden entwickelten zwei nach über 120 Tagen p. i. Antikörper im IFAT bei einer Verdünnung von 1:20 und sie reagierten positiv im Immunoblot. Nachdem die Sensitivität des Immunoblots durch Modifikation des Tests erhöht wurde, reagierten diese beiden Hunde auch schon früher positiv. Der eine Hund reagierte 2 Tage p. i., der zweite Hund zwischen dem 30. und 60. Tag positiv. Alle anderen Hunde waren negativ im IFAT und Immunoblot. Von den beiden Hunden, die serokonvertierten, erhielt ein Hund am 99. Tag p. i. 1x10 5 Oozysten des Isolates H. heydorni-berlin-1996 oral, der andere Hund wurde ein zweites Mal mit Gewebe infizierter Zwischenwirte am 113. Tag p. i. gefüttert. Danach fiel bei beiden Hunden

36 2. Literaturübersicht 33 die Antikörperreaktion gegen immunodominante Antigene stärker aus. Die Autoren fanden bei Hunden, die in der Vergangenheit Oozysten ausgeschieden hatten, Antikörper gegen ein 152 Kilodalton (kda)-antigen im Immunoblot und vermuten, so eine Möglichkeit gefunden zu haben, die Oozystenausscheidung retrospektiv nachzuweisen. Interessant ist, dass nicht alle Hunde, die Oozysten ausgeschieden haben, gegenüber Tachyzoiten-Antigen serokonvertieren (McALLISTER et al. 1998, LINDSAY et al. 1999a, 2001, SCHARES et al. 2001a). Diese Beobachtung wird damit erklärt, dass es zu keiner oder nur einer minimalen extraintestinalen Infektion kam und deswegen keine IgG-Antikörper gegen Tachyzoiten gebildet wurden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Ursache der Serokonversion bei den anderen Hunden eine Autoinfektion ist (LINDSAY et al. 1999a, SCHARES et al. 2001a). Aus der Tatsache, dass nicht alle Hunde serokonvertierten, folgerten LINDSAY et al. (1999a), dass die anhand serologischer Tests bei Hunden geschätzte Prävalenz von N. caninum unter der wirklichen Prävalenz liegen kann Isolate von Hunden Die Tab gibt einen Überblick über die von Hunden gewonnenen Neospora- Isolate.

37 34 2. Literaturübersicht Tab N.-caninum-Isolate von Hunden Isolat Rasse Klinische Symptome Alter a Ort Referenz NC-1 Labrador Retriever Parese der Hgldm. b, Ataxie 5-8 Wo. Pennsylvania, USA DUBEY et al. (1988b) NC-2 Labrador Retriever progressive Paraparese, Hyperextension der Hgldm. b, Anisokurie 12 Wo. Virginia, USA HAY et al. (1990) NC-3 English Springer Spaniel Paraparese, Ataxie, hasenartiger plantigrader Gang, Schwanken des Rumpfes 9 Wo. Wisconsin, USA CUDDON et al. (1992) NC-Liverpool Boxer progressive Tetraparese, Dysphagie, Dyspnoe 4 Wo. Liverpool, Großbritannien BARBER et al. (1993), (1995) H. heydorni- Berlin-1996? c natürliche Oozystenausscheidung? c Berlin, Deutschland SCHARES et al. (2001b) NC-4 Labrador Retriever fortschreitende Lahmheit der Hgldm. b 40 Tg. Georgia, USA DUBEY et al. (1998a) NC-5 Labrador Retriever Lahmheit einer Hgldm. b 45 Tg. Georgia, USA DUBEY et al. (1998a) CN-1 Rhodesian Ridgeback schlechter Allgemeinzustand, unwilliges Stehen, neurologische Symptome 6 Wo. Kalifornien, USA MARSH et al. (1998) NC-HanC1 Dobermann Schwäche der Hgldm. b 9 Wo. Hannover, Deutschland HECKEROTH et al. (2000) NC-GER 1 Kleiner Münsterländer Parese und Hyperextension der linken Hgldm. b, Atrophie und Verhärtung der Oberschenkelmuskulatur beider Hgldm. b 6 Wo. Hannover, Deutschland PETERS et al. (2000) NC-Bahia Collie Ataxie, Parese der Hgldm. b 7 J. Salvador, Brasilien GONDIM et al. (2001) CZ-4 Deutscher Schäferhund Oozystenausscheidung 1 J. Zentralböhmen, Tschechische Republik ŠLAPETA et al. (2002) a, Tg.: Tag(e), Wo.: Woche(n), J.: Jahr(e); b, Hgldm.: Hintergliedmaße(n); c,?: unbekannt

38 2. Literaturübersicht 35 Zwischen den einzelnen von Rindern und Hunden gewonnenen Neospora-Isolaten konnte kein morphologischer (CONRAD et al. 1993a, JARDINE 1996, STENLUND et al. 1997, YAMANE et al. 1997), kein antigenetischer (CONRAD et al. 1993a, STENLUND et al. 1997) und nur ein geringer genetischer Unterschied (MARSH et al. 1995, HOLMDAHL et al. 1997, STENLUND et al. 1997) gefunden werden. Das deutet darauf hin, dass es sich um dieselbe Neospora-Art handelt Anteil seropositiver Hunde in verschiedenen Ländern Der in verschiedenen Studien und Ländern ermittelte Anteil der Hunde, die Neospora-Antikörper im Serum aufwiesen, ist in Tab aufgelistet. Tab Vorkommen von N.-caninum-Antikörpern bei Hunden Land Anteil positiver Hunde Anzahl der untersuchten Hunde Test Cut-off-Titer oder -Absorptionswert Referenz (%) (n) Argentinien 37,8 320 IFAT 1:50 BASSO et al. (2001b) 47,4 97 IFAT 1:50 DI LORENZO et al. (1997) Australien IFAT 1:50 BARBER et al. (1997a) Belgien IFAT 1:50 BARBER et al. (1997b) Brasilien 6,7 163 IFAT 1:25 MINEO et al. (2001) Chile IFAT 1:50 PATITUCCI et al. (2001) Dänemark 15,3 98 IFAT >1:80 RASMUSSEN und JENSEN (1996) Deutschland 4 50 IFAT 1:50 KLEIN und MÜLLER (2001) Falklandinseln 0,2 500 IFAT 1:50 BARBER et al. (1997a) Großbritannien 5,8 104 IFAT 1:50 LATHE (1994) 16,6 163 IFAT 1:50 TREES et al. (1993) Italien 6, IFAT 1:50 CRINGOLI et al. (2002) - Parma IFAT >1:50 KRAMER et al. (2001) Japan 7,1 198 IFAT 1:50 SAWADA et al. (1998) Kanada 12,5 88 IFAT 1:50 CHEADLE et al. (1999) Kenia IFAT 1:50 BARBER et al. (1997a) Neuseeland IFAT 1:40 REICHEL (1998)

39 36 2 Literaturübersicht Tab Vorkommen von N.-caninum-Antikörpern bei Hunden (Fortsetzung) Land Anteil positiver Hunde (%) (n) Anzahl der untersuchten Hunde Test Cut-off-Titer oder -Absorptionswert Referenz Österreich 3, IFAT 1:50 EDELHOFER et al. (2001) 3, IFAT 1:50 WANHA (2002) Schweden 0,5 398 ELISA >0,18 BJÖRKMAN et al. (1994b) 0, IFAT 1:80 BJÖRKMAN et al. (1994b) Spanien 12,2 139 IFAT 1:50 ORTUÑO et al. (2002) Tansania IFAT 1:50 BARBER et al. (1997a) Tschechische und Slowakische Republik 1,25 80 ELISA >0,2 KOUDELA et al. (1998) Türkei IFAT 1:50 ÇOŠKUN et al. (2000) Uruguay IFAT 1:50 BARBER et al. (1997a) USA 2,2 229 IFAT 1:50 LINDSAY et al. (1990) - Nordosten IFAT 1:50 CHEADLE et al. (1999) - Südosten IFAT 1:50 CHEADLE et al. (1999) - Mittlerer Westen IFAT 1:50 CHEADLE et al. (1999) - Westen IFAT 1:50 CHEADLE et al. (1999) Untersuchungen auf Prädispositionen In verschiedenen Studien wurde versucht, prädisponierende Faktoren für die Seropositivität gegenüber N. caninum bei Hunden zu ermitteln. TREES et al. (1993) untersuchten 163 Hunde aus Großbritannien, die Patienten des Small Animal Hospitals der Universität von Liverpool waren, mittels IFAT auf Antikörper gegen N. caninum. Sie untersuchten den Zusammenhang zwischen T.- gondii-spezifischen Antikörpern, Geschlecht, Alter, Fütterung sowie der Anwesenheit anderer Hunde im Haushalt und der Neospora-Seropositivität. RASMUSSEN und JENSEN (1996) führten eine serologische Studie an 98 Hunden in Dänemark durch. Das Serum wurde im IFAT untersucht. Die Besitzer der Hunde machten Angaben zu Rasse, Geschlecht, Alter, jagdlicher Nutzung des Hundes, Anwesenheit anderer Tiere im Haushalt und zur Fütterung des Hundes.

40 2. Literaturübersicht 37 BARBER et al. (1997b) testeten 300 Hunde aus Belgien im IFAT auf N.-caninumspezifische Antikörper. Einhundert Hunde waren neurologische Patienten der Universität Gent, 100 Hunde kamen aus der Stadt Gent und weitere 100 Hunde kamen aus der Stadt Antwerpen. Sie untersuchten, ob es einen Zusammenhang zwischen Alter, Rasse oder Geschlecht und der Seropositivität gibt. SAWADA et al. (1998) untersuchten die Seroprävalenz von N. caninum bei japanischen Hunden mittels IFAT. Dazu nahmen sie Blut von 198 Hunden aus städtischen Regionen, 48 Hunden von Milchviehfarmen und 20 Hunden eines Collie- Züchters, bei dem ein Welpe an Neosporose gestorben war. CHEADLE et al. (1999) ermittelten die Häufigkeit von N.-caninum-Antikörpern mittels IFAT bei 1077 Hunden mit Verdacht auf eine Neospora-Infektion aus 35 Staaten in den USA und drei Provinzen in Kanada. Sie untersuchten, ob es einen Zusammenhang zwischen Geschlecht oder geographischer Region und der Seropositivität gibt. In den Niederlanden untersuchten WOUDA et al. (1999b) Blut von 152 Hofhunden und von 344 Hunden aus überwiegend städtischen Regionen auf das Vorkommen von Neospora-Antikörpern mittels ELISA. Sie suchten nach Unterschieden in der Seropositivität zwischen diesen Gruppen sowie nach einem Zusammenhang zwischen Geschlecht oder Alter und der Seropositivität. In Argentinien testeten BASSO et al. (2001b) 320 Hundeseren auf das Vorkommen von Neospora-Antikörpern mittels IFAT. Einhundertsechzig Seren stammten von Hunden aus Tierkliniken in städtischen Regionen, 125 Seren von Hunden, die auf Milchviehfarmen lebten, und 35 Seren von Hunden, die auf Fleischrinderfarmen lebten. Sie untersuchten, ob es einen Unterschied in der Seropositivität zwischen diesen Gruppen gibt und ob sich das Alter der Hunde auf die Höhe der Seropositivität auswirkt. PATITUCCI et al. (2001) testeten 201 Hundeseren aus verschiedenen Veterinärkliniken und ländlichen Regionen in Chile im IFAT auf Neospora-Antikörper. Ferner untersuchten sie den Zusammenhang zwischen Fütterung, Geschlecht, Rasse oder Alter und der Seropositivität. GENNARI et al. (2002) untersuchten in der Stadt São Paulo in Brasilien Seren von 500 Hunden mit Besitzern und 611 wildlebenden Straßenhunden im DAT auf Antikörper gegen N. caninum und verglichen die Seropositivität dieser beiden Gruppen.

41 38 2 Literaturübersicht WANHA (2002) prüfte 1770 Hundeseren aus Österreich im IFAT auf das Vorkommen von Neospora-Antikörpern. Diese 1770 Seren stammten insgesamt aus fünf verschiedenen Quellen: 563 Seren stammten aus der Serothek der I. Medizinischen Universitätsklinik für Einhufer und Kleintiere der Veterinärmedizinischen Universität Wien, 664 Seren stammten aus dem Labor INVITRO, 267 Seren stammten von Hundepatienten der Tierklinik Breitensee, 242 Seren stammten von Hundepatienten der Tierklinik Hollabrunn und 34 Seren stammten aus der Bundesanstalt für Veterinärmedizinische Untersuchungen in Graz. In dieser Studie wurde zusätzlich untersucht, ob es einen Zusammenhang zwischen Seropositivität gegenüber N. caninum und geographischer Region, Quelle des Serums, Geschlecht, Rasse, Alter sowie Seropositivität gegenüber T. gondii gibt. Aus diesen Studien ergaben sich die nachfolgend beschriebenen Faktoren, die das Auftreten von Infektionen mit N. caninum beim Hund beeinflussen können Alter Es gibt Studien, in denen das Vorkommen von Antikörpern gegen N. caninum in keinem Zusammenhang mit dem Alter des Hundes steht (TREES et al. 1993, RASMUSSEN u. JENSEN 1996, PATITUCCI et al. 2001). Andere Autoren gelangten zu dem Ergebnis, dass die Seroprävalenz bei älteren Hunden höher ist als bei jüngeren (BARBER et al. 1997b, SAWADA et al. 1998, WOUDA et al. 1999b, BASSO et al. 2001b, WANHA 2002) Rasse Viele Autoren fanden keinen Hinweis auf eine Rassenprädisposition (TREES et al. 1996, BARBER et al. 1997b, CHEADLE et al. 1999, WOUDA et al. 1999b, PATITUCCI et al. 2001). Auch WOUDA et al. (1999b) fanden keine offensichtliche Rassenprädisposition, sie erwähnten aber, dass bei den positiven Hofhunden Hunde der Rasse Stabyhond und Mischlinge überrepräsentiert waren. BASSO et al. (2001) verglichen reinrassige Hunde und Mischlingshunde. Sie fanden eine Seroprävalenz von 23,9 % bei den reinrassigen Hunden (n=117) und eine Seroprävalenz von 36,1 % bei den Mischlingshunden (n=36). Dieser Unterschied war nicht signifikant. In verschiedenen Publikationen sind die Rassen der seropositiven Hunde aufgelistet. Tab zeigt, welchen Rassen die positiven Hunde in den einzelnen Publikationen angehörten. Sofern in den Publikationen quantitative Angaben gemacht wurden, sind diese mit aufgeführt.

42 2. Literaturübersicht 39 Tab Hunderassen, bei denen Antikörper gegen N. caninum nachgewiesen wurden Rasse Mischling, Border Collie, Boxer, Dalmatiner, Dobermann, English Bullterrier, Jack- Russell-Terrier, Labrador, Pudel, Deutscher Schäferhund, Yorkshireterrier Belgischer Schäferhund (Malinois), Belgischer Schäferhund (Tervueren), Bouvier, Boxer, Collie, Foxterrier, Französische Bulldogge, Deutscher Schäferhund, Deutscher Vorstehhund, Kleiner Münsterländer, Keeshond, Labrador Retriever, Zwergschnauzer, Pekinese, Pudel, Pyrenäenberghund, Bernhardiner, Yorkshireterrier (je 1 Hund) Basset (1/13), Boxer (9/29), Golden Retriever (1/52), Labrador Retriever (8/68), Pudel (2/19), Springer Spaniel (1/13), Mischlinge (2/81) Airdaleterrier (1/8), Amerikanischer Staffordshire-Terrier (1/2), Beagle (2/18), Berner Sennenhund (3/28), Boxer (2/15), Cairn-Terrier (1/4), Cockerspaniel (2/60), Collie (1/11), Dackel (5/88), Deutsch Kurzhaar (1/9), Deutscher Schäferhund (2/154), Hovawart (2/6), Jagdterrier (1/7), Kleiner Pyrenäenschäferhund (1/2), Kuvasz (1/5), Labrador Retriever (1/22), Leonberger (2/10), Pit-Bullterrier (1/3), Pointer (1/4), Rhodesian Ridgeback (1/3), Rottweiler (1/31), Yorkshireterrier (1/68) Referenz TREES et al. (1996) BARBER et al. (1997b) CHEADLE et al. (1999) WANHA (2002) Geschlecht Die meisten Studien konnten keinen Zusammenhang zwischen dem Geschlecht und dem Vorkommen von Neospora-Antikörpern feststellen (TREES et al. 1993, RASMUSSEN u. JENSEN 1996, BARBER et al. 1997b, SAWADA et al. 1998, CHEADLE et al. 1999, PATITUCCI et al. 2001, WANHA 2002). Auch in zwei Übersichtsartikeln wird die Aussage gemacht, dass es unbekannt ist, ob es eine Geschlechtsprädisposition für die Neosporose gibt (DUBEY u. LINDSAY 1996, DUBEY 2003). Nur bei einer Studie von WOUDA et al. (1999b) in den Niederlanden lag die Seroprävalenz bei weiblichen Hunden signifikant höher als bei männlichen Hunden Fütterung Einige Studien konnten keinen Zusammenhang zwischen der Seroprävalenz und der Fütterung der Hunde feststellen (TREES et al. 1993, RASMUSSEN u. JENSEN 1996). Dagegen fanden PATITUCCI et al. (2001) einen deutlichen Unterschied zwischen der Seropositivität von Hunden, denen rohes Fleisch gefüttert wurde, und Hunden, die kein rohes Fleisch erhielten. Es waren 29,5 % der ersten Gruppe und nur 7 % der zweiten Gruppe seropositiv [Odds ratio (OR) = 2,613].

43 40 2 Literaturübersicht Jagdliche Nutzung RASMUSSEN und JENSEN (1996) fanden keinen Zusammenhand zwischen dem Vorkommen von Antikörpern und der Verwendung der Hunde zur Jagd Haltungsbedingungen In der Studie von TREES et al. (1993) zeigte sich keine Beziehung zwischen dem Vorkommen von Neospora-Antikörpern und der Anwesenheit anderer Hunde im Haushalt. RASMUSSEN und JENSEN (1996) stellten dagegen eine deutlich höhere Seroprävalenz von N. caninum bei Hunden, in deren Haushalt auch Katzen leben, als bei Hunden ohne regulären Katzenkontakt fest. Sie fanden keinen Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Kühen und Schweinen und dem Vorkommen von Antikörpern gegen N. caninum. Andere Studien fanden bei Hunden mit Kontakt zu Rindern eine deutlich höhere Seroprävalenz als bei Hunden aus städtischen Regionen (SAWADA et al. 1998, WOUDA et al. 1999b, BASSO et al. 2001b). PATITUCCI et al. (2001) stellten bei Hunden aus ländlichen Regionen eine N.-caninum-Seroprävalenz von 26 % fest, wohingegen Hunde aus städtischen Regionen eine Seroprävalenz von 12,5 % aufwiesen (OR=2,45). In der Untersuchung von WANHA (2002) lag die Seroprävalenz in Wien signifikant niedriger als in den übrigen Bundesländern Österreichs. GENNARI et al. (2002) fanden eine mit 25 % deutlich höhere Seroprävalenz bei wildlebenden Straßenhunden als bei Hunden mit Besitzern (Seroprävalenz = 10 %). Die Autoren machen keine Aussage zur Signifikanz dieses Ergebnisses Geographische Region CHEADLE et al. (1999) ermittelten eine höhere Seroprävalenz bei Hunden aus dem mittleren Westen und den südöstlichen Regionen als bei Hunden aus den übrigen Regionen der USA. Als mögliche Ursachen hierfür nennen sie klimatische Faktoren wie Feuchtigkeit und Temperatur. So zeigten LINDSAY et al. (1999a), dass warme, feuchte Bedingungen, wie sie in den südöstlichen Regionen der USA herrschen, für die Sporulation der Neospora-Oozysten optimal sind Seropositivität gegenüber T. gondii Es konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen Neospora- und Toxoplasma- Positivität bei Hunden festgestellt werden (TREES et al. 1993, WANHA 2002).

44 2. Literaturübersicht Klinische Symptome und Verlauf der Erkrankung Hunde jeden Alters, jedoch am häufigsten im Welpenalter, können von der Neosporose betroffen sein. Am schwersten erkranken junge, konnatal infizierte Hunde. Sie zeigen meistens eine Parese der Hintergliedmaßen, die sich zu einer fortschreitenden Paralyse entwickelt. Die Hintergliedmaßen sind in der Regel schwerer betroffen als die Vordergliedmaßen und zeigen oft eine spastische Hyperextension (CUDDON et al. 1992, DUBEY 1993, BARBER u. TREES 1996, BARBER et al. 1996). Andere Symptome sind Schluckbeschwerden, Paralyse des Kiefers (HAY et al. 1990), Muskelschwäche, Muskelatrophie und auch Herzversagen (ODIN u. DUBEY 1993). Der Verlauf der Erkrankung ist variabel. In perakuten Fällen sterben die Hunde innerhalb einer Woche nach dem Auftreten der ersten Symptome, in anderen Fällen gibt es einen eher chronischen Verlauf, bei dem die Symptome langsam über einige Wochen fortschreiten (BARBER 1998). Hunde mit Paralyse der Hintergliedmaßen können sich klinisch verbessern und Monate überleben (HAY et al. 1990). Die Infektion kann lokalisiert oder generalisiert auftreten. Erwachsene Hunde können Symptome einer mulitfokalen Einbeziehung des ZNS genauso zeigen wie Polymyositis, Myokarditis, Dermatitis oder multifokale Disseminierung (DUBEY 1990). Alle Organe inklusive der Haut können betroffen sein (DUBEY et al. 1988a, 1995). Die Dermatitis kann stark von der Anzahl der involvierten Parasiten abhängig sein (DUBEY u. LINDSAY 1996). Berichte über Neosporose gibt es auch von sehr alten Hunden. So berichteten DUBEY et al. (1988a) von einem fünfzehnjährigen Mischling und DUBEY et al. (1995) von einem zwölfjährigen Golden Retriever, die beide an kutaner Neosporose erkrankten. HOSKINS et al. (1991) stellten den Fall eines zehnjährigen Bassets vor, bei dem viele Organe von der Neosporose betroffen waren. Subklinisch infizierte Hündinnen können den Parasiten auf ihre Föten übertragen, und mehrere Würfe derselben Hündin können infiziert werden (DUBEY et al. 1988b, 1990c, BJERKÅS u. PRESTHUS 1989). Eine konnatale Neosporose konnte experimentell erzeugt werden, indem eine Hündin am 35. Trächtigkeitstag s. c. und intramuskulär (i. m.) mit insgesamt 1,5 x 10 6 N.-caninum-Tachyzoiten infiziert wurde (DUBEY u. LINDSAY 1989c). Nach der Verabreichung hoher Dosen von Kortikosteroiden an klinisch unauffällige, konnatal infizierte Welpen entwickelten diese Hepatitis, Pneumonie und Myositis (DUBEY u. LINDSAY 1990b). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine subklinische Neosporose durch Unterdrückung des Immunsystems aktiviert werden kann. Auch postnatal durch s. c. Injektion von 5 x 10 6 N.-caninum-Tachyzoiten infizierte Welpen entwickelten eine klinische Neosporose (COLE et al. 1995b).

45 42 2 Literaturübersicht Fallberichte Berichte über konnatale Neosporosen bei Wurfgeschwistern Viele Autoren berichten über konnatale Neosporosen bei Hundewürfen. Hierüber gibt die Tab einen Überblick. Tab Berichte über konnatale Neosporosen bei Wurfgeschwistern Rasse Amerikanischer Staffordshire-Terrier Beschriebener Wurf der Hündin Wurf größe Anzahl erkrankter Welpen Alter zur Zeit der Erkrankung a Referenz 1 7 e 2 5 Wo.-8 Wo. WEISSENBÖCK et al. (1997) Berner Sennenhund 1 10 f 2 ca. 3 Mo. VAN HAM et al. (1996) Bluthund? b Wo. MAYHEW et al. (1991)? b Wo. MAYHEW et al. (1991) Boxer ,5 Mo. BJERKÅS et al. (1984), BJERKÅS und DUBEY (1991)? b 5 3 wenige Tg.- REICHEL et al. (1998) 13 Wo. Deutsch Kurzhaar? b 9 8 bis 6 Mo. DUBEY et al. (1990c)? b c 9? b DUBEY et al. (1990c) Tg. DUBEY et al. (1990c) Tg.-2 Mo. DUBEY et al. (1990c) English Springer? b 5 4 bis 10 Wo. CUDDON et al. (1992) Spaniel Greyhound? b ca. 6 Mo. SHEAHAN et al. (1994)? b ca. 10 Wo. SHEAHAN et al. (1994)? b? mind. 2 9 Wo. SHEAHAN et al. (1994) Kleiner Wo. PETERS et al. (2000) Münsterländer Labrador Retriever? b Wo. CUMMINGS et al. (1988)? b Wo. DUBEY et al. (1988b)? b Wo. DUBEY et al. (1988b)? b Wo. JACOBSON und JARDINE (1993) 2 10 d 4 25 Tg.-5 Mo. WOUDA et al. (1993)? b Wo. FLAGSTAD et al. (1995) 1 9 e 5 5 Wo-7,5 Mo VAN HAM et al. (1996) a, Tg.: Tag(e), Wo.: Woche(n), Mo.: Monat(e); b,?: unbekannt; c, von diesen 1 Welpe wegen Zwergenwuchses euthanasiert; d, 1 Totgeburt; e, 1 Welpe neonatal verstorben; f, 3 Welpen neonatal verstorben

46 2. Literaturübersicht 43 Eine Boxerhündin in Norwegen hatte drei infizierte Würfe mit insgesamt sieben Welpen. Außer einem Welpen ohne klinische Manifestation entwickelten alle anderen sechs Welpen neurologische Symptome, die zur Ataxie und Parese führten. Bis zum Alter von 2 bis 5,5 Monaten erschienen die Welpen gesund. Bei der histologischen Untersuchung fand man Enzephalomyelitis und Myositis in Zusammenhang mit Stadien von N. caninum (BJERKÅS et al. 1984, BJERKÅS u. DUBEY 1991). CUMMINGS et al. (1988) berichteten über einen Wurf einer Labrador-Retriever- Hündin mit acht Welpen, von denen vier an Neosporose erkrankten. Sie entwickelten sich normal bis zur 4. Woche post natum (p. n.). Plötzlich zeigten sie eine asymmetrische Paraparese. Die Hintergliedmaßenschwäche wurde schnell symmetrisch und ging bei drei Welpen in eine Tetraplegie mit Halsschwäche, Unfähigkeit zur Futteraufnahme und Dysphagie über. Der vierte, paraplegische Welpe wurde euthanasiert. Aus einer weiteren Anpaarung derselben Hündin mit demselben Rüden entstand ein Wurf, von dem die meisten Welpen wegen Neosporose euthanasiert wurden. Sie entwickelten ab der 5. bis 6. Lebenswoche eine starre Parese der Hintergliedmaßen, die klinisch unterschiedlich schnell fortschritt. Nur ein Welpe mit schwachen klinischen Symptomen überlebte. Er behielt eine minimale Ataxie (DUBEY et al. 1988b). Eine andere, nicht mit der ersten Hündin verwandte Labrador-Retriever-Hündin wurde mit demselben Rüden der oben beschriebenen Würfe gepaart. Sie hatte ebenfalls einen Wurf, bei dem die meisten Welpen an Neosporose erkrankten. Ein Welpe starb im Alter von 3 Wochen vermutlich an einer Pneumonie. Drei Welpen entwickelten eine Parese der Hintergliedmaßen im Alter von etwa 8 Wochen. Sie wurden euthanasiert. Drei gesunde Welpen wurden verkauft (DUBEY et al. 1988b). DUBEY et al. (1990c) berichteten über vier Deutsch-Kurzhaar-Würfe, die alle demselben Besitzer aus Ohio, USA gehörten. Mehrere Welpen entwickelten eine klinische Neosporose. Andere subklinisch erkrankte Tiere wurden zur Nachzucht verwendet und hatten ebenfalls Würfe, in denen Welpen an Neosporose erkrankten. Eine Bluthündin warf drei Welpen, von denen zwei progressive neurologische Symptome aufgrund einer Neosporose entwickelten. Nach einer Behandlung mit Trimethoprim und Sulfadiazin hatte dieselbe Hündin einen Wurf mit neun Welpen. Von diesen zeigten drei Welpen Symptome einer Neosporose (MAYHEW et al. 1991). Eine progressive Paraparese aufgrund einer N.-caninum-Infektion entwickelten vier von fünf English-Springer-Spaniel-Welpen eines Wurfes während der ersten 10 Lebenswochen. Betroffen waren vier männliche Welpen. Der einzige weibliche Welpe blieb klinisch unauffällig (CUDDON et al. 1992).

47 44 2 Literaturübersicht JACOBSON und JARDINE (1993) berichteten von einem Wurf mit elf Labradorwelpen, von denen drei progressive neuromuskuläre Symptome der Hintergliedmaßen entwickelten. Zwei erkrankte Welpen wurden mit Clindamycin behandelt, der dritte Welpe erhielt zusätzlich Prednisolon. Zwei dieser Welpen wurden euthanasiert. Ein nur mit Clindamycin behandelter Welpe zeigte nach 5 Monaten kein Fortschreiten der klinischen Symptome und wurde dem Besitzer zur Pflege zurückgegeben. In den Niederlanden erkrankten von einem Wurf mit neun Labrador-Retriever- Welpen zwei Welpen im Alter von 3 Wochen an Diarrhöe und Muskelschwäche. Einer dieser Welpen starb innerhalb von 2 Tagen, der andere wurde euthanasiert, nachdem er eine Tetraparalyse entwickelt hatte. Zwei Wochen später wurde ein dritter Welpe wegen paretischer Hintergliedmaßen euthanasiert. Im Alter von 5 Monaten wurde ein weiterer Welpe wegen progressiver Ataxie der Hintergliedmaßen euthanasiert. Bei der pathohistologischen Untersuchung wurden N.-caninum- Tachyzoiten gefunden (WOUDA et al. 1993). SHEAHAN et al. (1994) berichteten von einem Wurf mit fünf Greyhound-Welpen. Drei Welpen entwickelten innerhalb kurzer Zeit nacheinander neurologische Symptome. Einer dieser Welpen zeigte eine spastische Paraplegie im Alter von 6 Monaten. Die Mutterhündin erschien klinisch normal, aber es war ihr zweiter Wurf in Folge, bei dem neurologische Symptome auftraten. In einem weiteren Greyhound- Wurf, von dem die Autoren berichteten, entwickelten drei von sieben Welpen neurologische Symptome innerhalb von 1 bis 2 Wochen nach der Impfung gegen Staupe, Hepatitis contagiosa canis, Parvovirose und Leptospirose. Eine ähnliche Reaktion nach der Impfung wurde vom vorhergehenden Wurf derselben Hündin berichtet, aber nicht weiter untersucht. Einer der erkrankten Welpen zeigte im Alter von 10 Wochen eine Parese der Hintergliedmaßen. Es wurde von zwei weiteren, weiblichen Greyhound-Wurfgeschwistern aus einem anderen Wurf berichtet, die überwiegend identische Symptome neurologischer Defizite entwickelten. Sie zeigten im Alter von 9 Wochen eine Steifheit der Hintergliedmaßen, die zu einer Parese der Hintergliedmaßen fortschritt. Histologisch fand sich bei allen beschriebenen Hunden eine multifokale Enzephalomyelitis. Dickwandige protozoäre Zysten, die sich mit N.-caninum-Antikörpern markieren ließen, wurden in den histologischen Schnitten gefunden. FLAGSTAD et al. (1995) beschrieben eine N.-caninum-Infektion bei einem Labrador- Retriever-Wurf in Dänemark. Von den acht Welpen wurde ein männlicher Welpe im Alter von 12 Wochen wegen Überempfindlichkeit, Schwäche, Ataxie und Muskelatrophie euthanasiert. Ein weiblicher Welpe zeigte im Alter von 12 Wochen Überempfindlichkeit und Ataxie. Er entwickelte eine Schwäche der Hintergliedmaßen

48 2. Literaturübersicht 45 und eine Muskelatrophie. Ein weiterer Welpe zeigte im Alter von 16 Wochen einen Gang mit steifen Hintergliedmaßen. Die klinischen Symptome schritten über den Beobachtungszeitraum von 6 Monaten nicht fort. Die Mutter und die übrigen fünf Welpen zeigten zu keinem Zeitpunkt abnormale klinische Symptome. Eine 2 Jahre alte Labrador-Retriever-Hündin hatte neun Welpen. Von diesen starb ein unterentwickelter Welpe sofort nach der Geburt. Im Alter von 5 Wochen entwickelte ein Welpe eine Schwäche der Hintergliedmaßen, die sich schließlich zu einer Tetraplegie entwickelte. Wenige Tage später zeigte ein anderer Welpe ähnliche Symptome. Wiederum wenige Tage später erkrankte ein dritter Welpe. Auch dieser zeigte ähnliche Symptome wie der erste erkrankte Welpe. Die anderen fünf Welpen blieben zunächst klinisch unauffällig. Histopathologisch fand man bei dem zuerst erkrankten Welpen eine nichteitrige Enzephalomyelitis und Myositis. Die immunhistochemische Untersuchung der Muskelschnitte war positiv für N.-caninum- Tachyzoiten. Die fünf Welpen, die zu diesem Zeitpunkt noch nicht erkrankt waren, wurden sofort nach der Vorstellung beim Tierarzt mit Clindamycin behandelt. Trotzdem erkrankte ein Welpe im Alter von 7 Wochen und wurde euthanasiert. Ein weiterer Welpe erkrankte im Alter von 3 Monaten. Er zeigte eine Lahmheit der linken Vorder- und der rechten Hintergliedmaße. Das Serum wies einen Titer von 1:200 für N. caninum auf. Es wurde eine Neuromyopathie diagnostiziert. Der Hund wurde mit Clindamycin über etwa 10 Wochen behandelt. Eineinhalb Jahre nach der ersten Vorstellung zeigte der Hund noch manchmal eine Lahmheit der rechten Hintergliedmaße nach langen Spaziergängen. Ein Jahr später war der Hund nach den Angaben des Besitzers und nach den Ergebnissen der klinischen Untersuchung unauffällig. Der Serumtiter für N. caninum lag bei 1:3200. VAN HAM et al. (1996) berichteten außerdem von einem 3 Monate alten, männlichen Berner Sennenhund aus einem Wurf mit zehn Welpen. Der Welpe entwickelte eine progressive Schwäche der Hintergliedmaßen, war weniger aktiv, hatte herabgesetzten Appetit und biss sich häufig in die Oberschenkel oder beleckte diese. Im Serum fand man einen Neospora-Antikörpertiter von 1:3200. Histopathologisch waren im Gehirn einige kleine Herde glialer Reaktionen anzutreffen, ein großer glialer Herd befand sich im Halsteil des Rückenmarks. Die Muskulatur wies eine starke Muskeldystrophie auf. Immunhistochemisch konnten N.-caninum-Tachyzoiten in der Muskulatur nachgewiesen werden. In der Serumprobe eines klinisch unauffälligen Welpen desselben Wurfes fand man einen Neospora-Antikörpertiter von 1:200. Die Mütterhündin wies einen Neospora-Antikörpertiter von 1:1600 auf. Aus demselben Wurf starben drei Welpen neonatal, und ein weiterer Welpe wurde euthanasiert, weil er ähnliche klinische Symptome zeigte. Die übrigen fünf Welpen und die Mutterhündin blieben klinisch unauffällig. Es handelte sich um den ersten Wurf der 3 Jahre alten, regelmäßig geimpften Hündin.

49 46 2 Literaturübersicht WEISSENBÖCK et al. (1997) berichteten über den ersten Wurf einer etwa 4 Jahre alten American-Staffordshire-Terrier-Hündin. Sie brachte sieben Welpen zur Welt. Kurz nach der Geburt starb ein Welpe. Es wurde keine pathologische Untersuchung durchgeführt. Im Alter von 5 Wochen zeigte ein weiblicher Welpe folgende Symptome: Inappetenz, Ataxie, Torticollis, Nystagmus, einseitiger Exophthalmus und Schreikrämpfe. Trotz Therapieversuch musste dieser Welpe euthanasiert werden. Im Alter von 8 Wochen erkrankte ein zweiter, männlicher Welpe mit denselben Krankheitssymptomen und wurde euthanasiert. Die übrigen Welpen und die Hündin wurden mit Sulfadoxin und Trimethoprim über 2 Wochen behandelt und blieben klinisch gesund. Bei der histologischen Untersuchung der beiden euthanasierten Welpen fand man disseminierte Malazieherde in allen Gehirnregionen und eine Myokarditis. Die Mutter und zwei getestete gesunde Welpen wiesen Antikörper gegen N. caninum auf, hatten aber keine Antikörper gegen T. gondii. Von einem Wurf mit fünf Boxerwelpen starben zwei nicht untersuchte Welpen. Ein 13 Wochen alter Boxerwelpe wurde wegen eines unbeweglichen linken Knies vorgestellt. Er hatte einen Neospora-IFAT-Titer von 1:51200 und wurde nach einem Therapieversuch euthanasiert. Pathologisch fand man eine Atrophie und Fibrose der linken Quadrizepsmuskulatur. Histologisch lag eine Enzephalitis vor. Die Mutter und die zwei übrigen Welpen blieben klinisch unauffällig, jedoch hatten auch die Mutter und einer der klinisch unauffälligen Welpen einen positiven Neospora-IFAT-Titer (REICHEL et al. 1998). PETERS et al. (2000) berichteten von einem Wurf mit acht Kleinen-Münsterländer- Welpen. Es handelte sich um den vierten Wurf einer klinisch gesunden Hündin. Die vorherigen Würfe waren klinisch unauffällig. Ein männlicher Welpe dieses vierten Wurfes entwickelte eine progressive Parese der Hintergliedmaßen im Alter von 1 Woche und starb, als er 7 Wochen alt war. Ein zweiter, weiblicher Welpe zeigte eine Steifheit der linken Hintergliedmaße im Alter von 6 Wochen und wurde über 12 Tage ohne klinische Besserung mit Trimethoprim und Sulfadiazin behandelt. Nach einer weiteren Woche ohne Therapie lag das Tier fest und wurde euthanasiert. Im Serum dieses Tieres fand man einen Neospora-Antikörpertiter von 1:1600. Die Mutterhündin wies einen Neospora-Titer von 1:50 auf. Im Immunoblot erwiesen sich der Welpe und das Muttertier als positiv für N. caninum. Auch in der Zerebrospinalflüssigkeit des Welpen ließen sich N.-caninum-Antikörper mittels IFAT (Titer 1:200) und Immunoblot nachweisen. Histologisch fand man eine Muskelatrophie vor allem an der linken Hintergliedmaße und eine Myositis der gesamten Skelettmuskulatur. Es lag eine multifokale granulomatöse, partiell eitrige Enzephalomyelitis vor. Viele protozoäre Zysten, die sich immunhistochemisch mit N.-caninum-Antikörpern markieren ließen, konnten im Gehirn, in den Kopfnerven und im Rückenmark gefunden werden.

50 2. Literaturübersicht Einzelfallberichte In der Tab sind Einzelfallberichte über Neosporose bei Hunden zusammengestellt. In den aufgelisteten 76 Fallberichten wurden in absteigender Häufigkeit folgende Symptome genannt: In 26 Fällen wurde von Ataxie berichtet. In 21 Fällen trat eine Parese und in 19 Fällen eine Paralyse einer oder mehrer Gliedmaßen auf. Je dreizehn Hunde zeigten eine Schwäche einer oder beider Hintergliedmaßen sowie herabgesetzte oder fehlende propiozeptive Reflexe. Zwölf Hunde wiesen eine Muskelatrophie auf. In elf Fällen trat eine Hyperextension einer oder beider Hintergliedmaßen auf. Neun Fälle zeigten eine Lahmheit der Vorder- oder Hintergliedmaßen. Jeweils siebenmal wurden eine Schmerzhaftigkeit im Bereich der Wirbelsäule, ein herabgesetzter oder fehlender Pupillarreflex sowie Anorexie genannt. In sechs Fällen wurde von schmerzhafter Muskulatur berichtet, die sich bei zwei Fällen im Bereich der Beckengliedmaßen befand. Ebenfalls sechs Fälle hatten einen herabgesetzten oder fehlenden Patellarreflex. Von diesen wiesen zwei gleichzeitig einen herabgesetzten oder fehlenden Flexorreflex auf. In je sechs Fällen kam es zu Fieber sowie zu einer Urininkontinenz, die in zwei Fällen auf einer Überlaufblase beruhte. In fünf Fällen trat eine Myokarditis auf. Je vier Fälle zeigten einen herabgesetzten oder fehlenden Anal/Perianalreflex sowie ein Maul, das sich nicht komplett öffnen ließ. In jeweils drei Fällen traten herabgesetzter Muskeltonus, nicht näher beschriebene Hyporeflexie, Ptosis, Kotinkontinenz, Megaösophagus, Stimmlosigkeit/Heiserkeit, Dyspnoe, Pneumonie, pyogranulomatöse Dermatitis, noduläre Dermatitis sowie andere Hautveränderungen auf. Je zwei Fälle zeigten eine Spastizität aller Gliedmaßen, geducktes Stehen, eine Muskelkontraktur, zentralnervöse Anfälle, Anstoßen an Gegenstände, Kopfschiefhaltung, irreguläre Kopf- und Nackenbewegungen, Kopftremor oder Kopfnicken, Hyperreflexie, fehlenden Drohreflex/partielle zentrale Blindheit, Enophthalmus, Nickhautvorfall, Strabismus, Nystagmus, Verlust der Stubenreinheit, Dysphagie, Husten sowie plötzlichen Tod. Jeweils einmal wurden folgende Symptome genannt: allgemeine Schwäche, Paralyse der Masseter- und Zungenmuskulatur, Seitenlage, Halsstarre, nicht weiter beschriebene Anzeichen von Schmerzen, Schmerzen in der Beckenregion, neurologische Veränderungen, Demenz, Patellarhyperreflexie, herabgesetzter Würgereflex, Miosis, Mydriasis, Anisokurie, Nystagmus, Polyurie, Haarverlust, plötzlicher Kollaps sowie ein Unvermögen aufzustehen.

51 48 2 Literaturübersicht Tab Einzelfallberichte über Neosporose bei Hunden Rasse Geschlecht a Alter b Land IFAT- Titer c Referenz Airdaleterrier 4 J. Deutschland 1:400 KORNBERG und KOSFELD (1997) Basset 8 Mo. USA? DUBEY et al. (1988a) Berner Sennenhund 5 J. USA? DUBEY et al. (1988a) ( ) 10 J. USA? HOSKINS et al. (1991)? 2 Mo. Ungarn? SRÉTER et al. (1992) 5 J. Italien 1:640 POLI et al. (1998) Border Collie 8 Wo. Großbritannien 1:51200 BARBER et al. (1996) Boxer 4 Wo. Großbritannien 1:3200 BARBER et al. (1995) 4 Wo. Großbritannien 1:800 BARBER et al. (1996) 5 Wo. Großbritannien 1:3200 KNOWLER und WHEELER (1995) 10 Wo. Großbritannien 1:12800 BARBER et al. (1996) 4 Mo. Belgien 1:3200 VAN HAM et al. (1996) 18 Mo. Großbritannien 1:12800 KNOWLER und WHEELER (1995) 8 Wo. Deutschland? BURKHARDT et al. (1992) 10 Wo. Schweden? UGGLA et al. (1989b) 2½ Mo. Belgien? PONCELET et al. (1990b) 3 Mo. Belgien? PONCELET et al. (1990b) 3½ Mo. Belgien? PONCELET et al. (1990b) 6 Mo. Australien? GASSER et al. (1993) a, : weiblich, ( ): weiblich kastriert, : männlich, ( ): männlich kastriert,?: unbekannt; b, Wo.: Woche(n), Mo.: Monat(e), J.: Jahr(e); c,?: unbekannt

52 2. Literaturübersicht 49 Tab Einzelfallberichte über Neosporose bei Hunden (Fortsetzung) Rasse Geschlecht a Alter b Land IFAT- Titer c Boxer (Fortsetzung) (Fortsetzung) Referenz 6 Mo. Irland? SHEAHAN et al. (1993) 11 J. Israel? PERL et al. (1998) Braque Français 1½ Mo. Frankreich 1:640 PLUYE (1999) Bullmastiff 10 Mo. Kanada? ODIN und DUBEY (1993) 3 Mo. USA? DUBEY et al. (1988a) Cockerspaniel 2 J. Costa Rica? MORALES et al. (1995) Collie 8 Mo. USA? DUBEY et al. (1988a) 9 Mo. Großbritannien? DUBEY et al. (1990b) Deutsch Drahthaar 4 J. USA? DUBEY et al. (1988a) 7 J. Brasilien 1:1600 GONDIM et al. (2001) 6 J. Tschechische Republik 1:160 KOUDELA et al. (1998) Deutsche Dogge 8 Mo. Finnland? RUDBÄCK et al. (1991)? 12 Wo. Südafrika? JARDINE und DUBEY (1992) Dobermann 4 Wo. Belgien? PONCELET et al. (1990b) 9 Wo. Deutschland 1:20000 HECKEROTH et al. (2000) Epagneul bleu de Picardie Flat-coated Retriever 4 Wo. Frankreich? PONCELET et al. (1990b)? 4½ Wo. Großbritannien? BARBER et al. (1996) Golden Retriever 6 Mo. USA? DUBEY et al. (1988a) ( ) 12 J. USA 1:3200 DUBEY et al. (1995) 12 Wo. Kanada? COCHRANE und DUBEY (1993) a, : weiblich, ( ): weiblich kastriert, : männlich, ( ): männlich kastriert,?: unbekannt; b, Wo.: Woche(n), Mo.: Monat(e), J.: Jahr(e); c,?: unbekannt

53 50 2. Literaturübersicht Tab Einzelfallberichte über Neosporose bei Hunden (Fortsetzung) Rasse Geschlecht a Alter b Land IFAT- Titer c Golden Retriever (Fortsetzung) (Fortsetzung) Referenz 3½ J. USA >1:400 JACKSON et al. (1995) Greyhound 4 Mo. Schweden? HILALI et al. (1986) Irischer Wolfshund Italienisches Windspiel 7 Wo. Irland? SHEAHAN et al. (1993)? Welpe Australien? MUNDAY et al. (1990) Welpe Australien? MUNDAY et al. (1990) 21 Mo. Großbritannien 1:800 PANNWITZ (2001) ( ) 9 J. USA? LA PERLE et al. (2001) Labrador 6 Wo. Belgien? PONCELET et al. (1990b) 19 Mo. Neuseeland? PATITUCCI et al. (1997) Labrador Retriever Mastino Napoletano 2 Mo. Belgien? PONCELET et al. (1990a) 5 Mo. Deutschland? BURKHARDT et al. (1992) 2½ J. Großbritannien 1:51200 BARBER et al. (1996)? 6 Mo. Südafrika? JARDINE und DUBEY (1992) 15 Wo. Großbritannien 1:3200 KNOWLER und WHEELER (1995) 6 Mo. Belgien 1:800 VAN HAM et al. (1996) ( ) 6 J. USA? LA PERLE et al. (2001) 12 Wo. USA 1:800-1:3200 HAY et al. (1990) 4 Mo. Spanien? PUMAROLA et al. (1996) a, : weiblich, ( ): weiblich kastriert, : männlich, ( ): männlich kastriert,?: unbekannt; b, Wo.: Woche(n), Mo.: Monat(e), J.: Jahr(e); c,?: unbekannt

54 2. Literaturübersicht 51 Tab Einzelfallberichte über Neosporose bei Hunden (Fortsetzung) Rasse Geschlecht a Alter b Land IFAT- Titer c Referenz Mischling ( ) 15 J. USA? DUBEY et al. (1988a) 5 Mo. USA? DUBEY et al. (1988a) 6 J. Costa Rica? MORALES et al. (1995) Pit-Bullterrier? 2 Mo. Italien 1:3200 PASQUALI et al. (1998) Pointer 10 Mo. Irland? SHEAHAN et al. (1993) Pudel 2 J. USA? DUBEY et al. (1988a) Rhodesian Ridgeback 5 J. Österreich 1:5120 LÖSCHENBERGER et al. (2000) Riesenschnauzer 4 J. Schweden? UGGLA et al. (1989a) Rottweiler 2 J. Belgien 1:12800 VAN HAM et al. (1996) Scottish Terrier? ca. 2 Wo. Südafrika? JARDINE und DUBEY (1992) Sheltie 5 Mo. Japan? UMEMURA et al. (1992) Siberian Husky 6 J. Frankreich 1:12800 FRITZ et al. (1997) Toy Pudel 6 Wo. USA? DUBEY et al. (1988a) Vizsla 3 J. USA? RUEHLMANN et al. (1995) West Highland White Terrier ( ) 11 J. USA? GREIG et al. (1995) 1 J. Neuseeland? PATITUCCI et al. (1997) 6 J. Neuseeland? PATITUCCI et al. (1997) unbekannt? Welpe Australien? MUNDAY et al. (1990) adult Australien? MUNDAY et al. (1990) a, : weiblich, ( ): weiblich kastriert, : männlich, ( ): männlich kastriert,?: unbekannt; b, Wo.: Woche(n), Mo.: Monat(e), J.: Jahr(e); c,?: unbekannt

55 52 2. Literaturübersicht Pathologie und Pathogenese N. caninum ist ein intrazellulärer Parasit, der die Wirtszellen schnell durch Vermehrung der Tachyzoiten töten kann (DUBEY 1990). Der Erreger kann sichtbare schwere nekrotische Veränderungen innerhalb weniger Tage verursachen (DUBEY 1992, DUBEY u. LINDSAY 1993). Es ist unklar, ob der Erreger primär pathogen ist. Einerseits scheint er primär pathogen zu sein, weil bei natürlich infizierten Hunden mit fataler Neosporose keine anderen ätiologischen oder modifizierenden Agenzien identifiziert wurden (DUBEY et al. 1988a), andererseits gibt es im Verhältnis zur Zahl der seropositiven Hunde nur wenige Berichte von an Neosporose erkrankten Hunden. DUBEY und LINDSAY (1990b) stellten fest, dass die exogene Zufuhr von Kortikosteroiden eine latente N.-caninum-Infektion aktivieren kann. Hieraus kann man folgern, dass eine Immunsuppression bei seropositiven Hunden möglicherweise auch unter natürlichen Bedingungen zu einer klinischen Neosporose führen kann. N. caninum kann schwere neuromuskuläre Erkrankungen bei Hunden verursachen (DUBEY 1992, DUBEY u. LINDSAY 1996), indem der Erreger verschiedene Nervenzellen einschließlich derer der Kopf- und Spinalnerven zerstört und sich auf die Leitfähigkeit der infizierten Zellen auswirkt (MAYHEW et al. 1991, DUBEY 1992, DUBEY u. DE LAHUNTA 1993). Die Ursache der Hintergliedmaßenhyperextension ist nicht bekannt. Als Ursache denkbar ist die Kombination einer Paralyse der oberen Motoneurone und einer Myositis, die zu einer schnell fortschreitenden fibrösen Kontraktur der Muskeln und somit zu einer Fixation der Gelenke führt (MAYHEW et al. 1991). Gewebezysten werden meistens nicht von einer Zone umgeben, in der eine Reaktion des Wirtes stattfindet. Wie lange die Zysten im ZNS persistieren ist unbekannt, jedoch können Gewebezysten bei experimentell infizierten Swiss-Webster-Mäusen mindestens noch ein Jahr p. i. gefunden werden (LINDSAY et al. 1992). Die Bildung von Granulomen um degenerierende Gewebezysten und Bradyzoiten (DUBEY et al. 1990a, 1992a, 1996b, MAYHEW et al. 1991) legt nahe, dass einige Gewebezysten zerstört werden und die nachfolgende Wirtsreaktion Entzündungsherde verursacht (DUBEY 1990, 1992). N. caninum kann makroskopisch sichtbare Veränderungen wie Nekrosen im ZNS und in der Leber (DUBEY et al. 1988a), Granulome in den Eingeweiden (DUBEY et al. 1988a), gelblich-weiße Streifen in der Skelettmuskulatur und teilweise im Zwerchfell (DUBEY et al. 1988b, DUBEY u. LINDSAY 1990b), zerebelläre Atrophie (BJERKÅS u. PRESTHUS 1989, JACKSON et al. 1995) sowie ulzerative Dermatitis (DUBEY et al. 1988a, 1995) verursachen.

56 2. Literaturübersicht 53 Mikroskopisch findet man eine nicht eitrige, multifokale Meningoenzephalitis mit kleinen Nekroseherden in der grauen und weißen Substanz mit Mikrogliaknötchen. Die Entzündung der Muskulatur ist nicht eitriger Natur. Tachyzoiten lassen sich oft in den Myozyten finden. Myokarditis, Pneumonie und Hepatitis sind häufige Befunde bei der Sektion. Die Veränderungen in diesen Organen sind oft diffus und bestehen aus einer nicht eitrigen Entzündung mit Parasiten, die in den Zellen gefunden werden (DUBEY et al. 1988a, RUEHLMANN et al. 1995) Behandlungsversuche Viele Hunde, die an Neosporose erkrankten, wurden zunächst unspezifisch entsprechend der jeweils gezeigten klinischen Symptome behandelt. Hierzu wurden häufig Chloramphenicol, Kortikosteroide und Vitamin-B-Komplex-Präparate verwendet (DUBEY et al. 1990b, BURKHARDT et al. 1992, SRÉTER et al. 1992, COCHRANE u. DUBEY 1993, WOUDA et al. 1993, MORALES et al. 1995, LA PERLE et al. 2001). Diese Behandlungsversuche führten in der Regel nicht zur Genesung des Tieres. Spezifische Behandlungsversuche wurden bei Hunden aufgrund der Ergebnisse von Studien mit Chemotherapeutika an Tachyzoiten in vitro und in vivo (LINDSAY u. DUBEY 1990b, LINDSAY et al. 1994) sowie aufgrund der Erfahrung bei der Therapie der Toxoplasmose (MAYHEW et al. 1991) durchgeführt (BARBER u. TREES 1996). Die in Tab aufgeführten Medikamente und Dosierungen wurden bevorzugt verwendet (HAY et al. 1990, McGLENNON et al. 1990, MAYHEW et al. 1991, DUBEY et al. 1995, KNOWLER u. WHEELER 1995, BARBER u. TREES 1996, LÖSCHENBERGER et al. 2000, LA PERLE et al. 2001). Die Medikamente wurden einzeln oder in Kombination von zwei oder auch drei Wirkstoffen gegeben. Bevorzugt wurde Clindamycin verabreicht (JACOBSON u. JARDINE 1993, KNOWLER u. WHEELER 1995, VAN HAM et al. 1996, POLI et al. 1998, PLUYE 1999, HECKEROTH et al. 2000, LA PERLE et al. 2001). Viele spezifische Therapieversuche, die nach erfolgter Diagnosestellung oder aufgrund des Verdachtes auf Neosporose durchgeführt wurden, verliefen erfolglos und die Hunde starben oder mussten euthanasiert werden (KNOWLER u. WHEELER 1995, BARBER et al. 1996, VAN HAM et al. 1996, HECKEROTH et al. 2000, GONDIM et al. 2001). Konnte die spezifische Therapie mit Auftreten der ersten klinischen Symptome eingeleitet werden, war sie in manchen Fällen erfolgreich (McGLENNON et al. 1990, MAYHEW et al. 1991, PANNWITZ 2001). Auch bei

57 54 2. Literaturübersicht Hautmanifestationen kam es zur klinischen Genesung (POLI et al. 1998, LA PERLE et al. 2001). Bei einigen Hunden, besonders bei denen, deren Hintergliedmaßen stark betroffen waren, konnte zwar das Fortschreiten der Erkrankung gestoppt werden und eine Besserung der klinischen Symptome erreicht werden, es blieben aber Defizite, z. B. eine Hyperextension der Beckengliedmaßen, Muskelatrophie und Ganganomalien (HAY et al. 1990, KNOWLER u. WHEELER 1995, PLUYE 1999). Die Prognose ist ungünstig bei akuten disseminierten Fällen und spätem Behandlungsbeginn. Im günstigsten Fall erholen sich 20 % der Patienten voll, und bei etwa 60 % der Patienten wird eine Besserung erzielt. Rückfälle sind jederzeit möglich (SUTER 2001). Der Erfolg der Behandlung ist abhängig von der Geschwindigkeit, mit der die Erkrankung ausbricht, und der Schwere der anfänglichen klinischen Symptome. Bei Welpen, die schwere klinische Symptome in 2 bis 3 Tagen entwickeln, ist die Wahrscheinlichkeit geringer, eine Besserung zu erreichen als bei Hunden mit langsam fortschreitenden Symptomen. Der frühzeitige Beginn der Behandlung verbessert die Prognose (BARBER u. TREES 1996). Deshalb sollte eine spezifische Behandlung sofort eingeleitet werden, wenn ein Verdacht auf Neosporose besteht. Weil die Medikamente wenige Nebenwirkungen haben und relativ preiswert sind, sollte die Behandlung auch schon vor den Ergebnissen serologischer Tests begonnen werden. Wenn der Hund auf die Behandlung anspricht, kann man eine Besserung innerhalb weniger Tage nach Beginn der Behandlung feststellen. Die Behandlung sollte mindestens so lange fortgeführt werden bis der Hund vollständig genesen ist oder keine weitere klinische Besserung gesehen wird (BARBER 1998). In publizierten Fällen variiert die Therapiedauer von 2 Wochen bis über mehrere Monate (BARBER u. TREES 1996, KORNBERG u. KOSFELD 1997). Zurzeit gibt es kein wirksames Medikament gegen Gewebezysten (DUBEY 1999) und es existiert auch noch kein Behandlungsplan, der die diaplazentare Übertragung von N. caninum verhindert (DUBEY u. LINDSAY 1996, HEMPHILL 1999). Tab Medikamente und Dosierungen zur Therapie der Neosporose beim Hund Medikament Clindamycin potenzierte Sulfonamide Pyrimethamin Dosierung 7,5-25 mg/kg zwei- oder dreimal täglich mg/kg zweimal täglich 1-1,3 mg/kg täglich

58 2. Literaturübersicht Differentialdiagnostik Es gibt einige andere Erkrankungen, die zu ähnlichen klinischen Symptomen wie die Neosporose führen können. Hierzu zählen Traumata, Diskopathien, Toxoplasmose und andere Infektionserkrankungen, wie z. B. Staupe und Tollwut, angeborene Neuropathien, wie z. B. die progressive Axonopathie der Boxer, lysosomale Speicherkrankheiten oder Erkrankungen, die mit einer Hypomyelinisierung einhergehen, granulomatöse Meningoenzephalopathie und andere entzündliche Erkrankungen des ZNS, Thrombembolien, Neoplasien, Vergiftungen, z. B. Botulismus, verschiedene Arten von Myopathien oder Myositiden, einschließlich metabolischer Myopathien und Muskeldystrophien sowie andere Ursachen von Myokarditis und Pneumonie (BARBER 1998) Toxoplasmose Die Toxoplasmose ist eine besonders wichtige Differentialdiagnose zur Neosporose. Bevor N. caninum bekannt war, wurde die Neosporose des Hundes häufig als Toxoplasmose fehldiagnostiziert. Retrospektive Studien konnten zeigen, dass es sich bei vielen als Toxoplasmose beim Hund diagnostizierten Fällen um eine Neosporose handelte. So fanden DUBEY et al. (1988a) N. caninum als Verursacher einer toxoplasmoseähnlichen Erkrankung bei zehn von 23 Hunden. DUBEY et al. (1990c) zeigten, dass N. caninum schon 1957 toxoplasmoseähnliche Erkrankungen bei Hunden in den USA verursachte. Hunde infizieren sich mit T. gondii durch orale Aufnahme von zystenhaltigem Schweine-, Schaf- oder Ziegenfleisch, das weder tiefgekühlt (-18 C) noch genügend erhitzt (66 C) wurde. Auch kann eine Ansteckung durch Oozysten aus Katzenkot erfolgen. Die Pathogenität von T. gondii für Hunde ist gering, und die meisten angesteckten Hunde serokonvertieren, ohne klinische Symptome zu zeigen. Dabei können aber Toxoplasma-Zysten in der Muskulatur oder im Nervengewebe gebildet werden. Nur selten treten klinisch manifeste Erkrankungen bei Hunden unter einem Jahr, ferner bei immunsupprimierten, mit Glukokortikoiden behandelten oder an Begleiterkrankungen wie Staupe oder Neoplasmen leidenden Hunden auf. Je nach dem Verlauf der Erkankung und der Lokalisation der Erreger werden etwas andere Symptome verzeichnet (SUTER 2001). Die bei natürlich infizierten Hunden beschriebenen Erkrankungen lassen sich in drei Gruppen einteilen: (1) eine generalisierte Form, die bei 7 bis 12 Monate alten Tieren auftritt und mit intermittierendem Fieber, Tonsillitis, Dyspnoe, Diarrhöe und Erbrechen einhergeht; (2) eine zentralnervöse Form, die bei über 4 Monate alten Hunden vorkommt; die Symptome wechseln je nach verändertem Gehirnabschnitt; beschrieben wurden Ataxie, Tremor, Hemiparese, Hemianopsie, Benommenheit und Schwäche; (3) die

59 56 2. Literaturübersicht durch progressive Paralyse und Parese gekennzeichnete Radikuloneuritis; sie wird bei unter 3 Monate alten Welpen beobachtet (ROMMEL et al. 2000). Da Radikuloneuritis und Polymyositis beim Hund nicht nur bei Toxoplasma- Infektionen, sondern auch bei Infektionen mit N. caninum auftreten, ist nicht auszuschließen, dass es sich zumindest bei einem Teil der in der älteren Literatur beschriebenen Toxoplasmose-Fälle in Wirklichkeit um Neosporose gehandelt hat (ROMMEL et al. 2000). Seit N. caninum bekannt ist, wurden nur noch wenige Toxoplasmose-Fälle bei Hunden publiziert. PIMENTA et al. (1993) fanden T. gondii in Geweben von zwei Hunden im Alter von 3 und 10 Monaten. Die Primärläsionen bestanden in nekrotisierender intestinaler Myositis in Verbindung mit vielen Tachyzoiten, die mit Anti-T.-gondii-Serum, nicht aber mit Anti-N.-caninum-Serum reagierten. MORALES et al. (1995) berichteten vom ersten dokumentierten Fall von Polyradikuloneuritis bei einem Hund aufgrund von Toxoplasmose nach der Entdeckung von N. caninum im Jahr BERNSTEEN et al. (1999) schrieben über die Toxoplasmose bei einem Beagle nach Nierentransplantation. Für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen T. gondii existieren viele Testsysteme. Der klassische, aufwendige SFT ist Referenztest, wird aber in der Praxis nur noch selten eingesetzt. Stattdessen werden der IFAT, der DAT sowie der ELISA verwendet (SUTER 2001). Das Prinzip des SFT wird im Folgenden kurz erläutert (Abb. 2.3.). Hitzeinaktiviertes Patientenserum wird nach Zusatz eines so genannten Aktivatorserums (accessory factor) zusammen mit lebenden Toxoplasmen bei 37 C inkubiert. Sind Toxoplasma-Antikörper im Serum vorhanden, findet eine komplementvermittelte Zytolyse der Toxoplasmen statt und diese lassen sich mit der zugesetzten basischen Methylenblaulösung nicht mehr anfärben (positive Reaktion). Ist das Patientenserum frei von Toxoplasma-Antikörpern, findet keine Zytolyse statt und der Farbstoff wird in die Zellen eingeschleust, die dann eine blaue Färbung (negative Reaktion) annehmen (BUNDESGESUNDHEITSBLATT 1989).

60 2. Literaturübersicht 57 Prinzip der Methode: MB negativ Toxoplasma- Tachyzoit Maus Patientenserum inakt. + Aktivator + Farbstoff (Methylenblau, MB) Ig+C positiv I. Reiter-Owona MB Lyse Abb Prinzip des SFT (mit freundlicher Genehmigung von Dr. I. Reiter-Owona) Hammondiose H.-heydorni-ähnliche Oozysten findet man in Deutschland in 0,5 bis 1 % der Hundekotproben. Der Hund kann sowohl End- als auch Zwischenwirt dieses Parasiten sein. Im Endwirt laufen in Epithelzellen des Dünndarms eine Merogonie und die Gamogonie ab. Die Präpatenz im Hund dauert nach der Aufnahme von Organen von infizierten Zwischenwirten 7 bis 17, die Patenz 1 bis 18 Tage. Die Sporulationszeit in der Umwelt beträgt bei 21 C etwa 3 Tage. Der Hund kann sowohl Zwischenwirt als auch Endwirt für H. heydorni sein. Die Zysten sind vorwiegend in der Muskulatur, aber auch im Gehirn und in anderen inneren Organen lokalisiert. Experimentelle Infektionen verliefen sowohl im End- als auch im Zwischenwirt meist symptomlos, es wird jedoch auch über Durchfall und Anorexie bei Welpen berichtet (ROMMEL et al. 2000). FISHER (2002) berichtet, dass nicht angenommen wird, dass H. heydorni pathogen für canine Zwischen- oder Endwirte ist. Auch SUTER (2001) berichtet, dass keine intestinalen Störungen durch H. heydorni bekannt sind.

61 58 2. Literaturübersicht Protozoen im Hundekot H. heydorni H. heydorni bildet im Hund 10,0 bis 14,6 x 9,2 bis 13.1 µm große Oozysten mit glatter, dünner und farbloser Hülle. Die Oozyste sporuliert in der Umwelt und enthält dann zwei Sporozysten mit je vier Sporozoiten und einem granulierten Restkörper (ROMMEL et al. 2000) Cystoisospora-Arten Im Hund parasitieren Cystoisospora canis, Cystoisospora ohioensis und Cystoisospora burrowsi. Die Oozystengröße beträgt im Mittel bei C. canis 39 x 32 µm, bei C. ohioensis 17 x 12 µm und bei C. burrowsi 14 x 10 µm. Die Oozysten aller Cystoisospora-Arten haben eine glatte und farblose Oozystenwand ohne Mikropyle. Die Oozysten werden unsporuliert mit dem Hundekot ausgeschieden und sporulieren in der Umwelt. Sporulierte Oozysten enthalten jeweils zwei ovale Sporozysten mit je vier Sporozoiten und einem granulierten Restkörper. Die Oozysten können im Kot mithilfe von Flotationsmethoden nachgewiesen werden. Die Oozysten der einzelnen Arten unterscheiden sich in ihrer Größe voneinander. Auch von den Oozysten von Toxoplasma und Hammondia grenzen sie sich durch ihre Größe ab (ROMMEL et al. 2000) Sarcocystis-Arten Hunde und Katzen sind neben dem Menschen die Endwirte der Sarkosporidien der Haustiere und vieler Wildtierarten. Der Hund ist Endwirt für S. cruzi des Rindes, Sarcocystis arieticanis und S. tenella des Schafes, Sarcocystis capracanis und Sarcocystis hircicanis der Ziege, Sarcocystis bertrami und Sarcocystis equicanis des Pferdes, Sarcocystis miescheriana des Schweins, zwei Sarcocystis-Arten des Huhns sowie zahlreiche Spezies aus anderen Tierarten. Die mit dem Hundekot ausgeschiedenen Sporozysten sind im Mittel je nach Art 12,6 bis 16,3 µm lang und 8,3 bis 10,8 µm breit. Sie enthalten vier Sporozoiten sowie einen granulierten Restkörper. Nur selten ist die sehr dünne Oozystenhülle eng angeschmiegt um zwei nebeneinander liegende Sporozysten erhalten. Die im Kot stets nur in geringer Zahl vorhandenen Sporozysten lassen sich mithilfe der Flotationsmethoden anreichern und nachweisen. Die Differenzierung einzelner Sarcocystis-Arten anhand der Sporozystengröße ist nicht möglich (ROMMEL et al. 2000).

62 2. Literaturübersicht Giardien Giardien-Zysten können im Kot mithilfe der üblichen Flotationsmethoden (spezifisches Gewicht der Flotationslösung 1,2) festgestellt werden. Der Zysteninhalt wird dabei jedoch verformt. Die Zysten sind 9 bis 5 x 7 bis 11 µm groß, besitzen vier Kerne, ein Konvolut von Geißeln und eine farblose dünne Hülle (ROMMEL et al. 2000). Der Nachweis von Giardien erfolgt in der Regel durch Spezialverfahren Kryptosporidien Durch Zinksulfat-Flotation kann man Kryptosporidien im Hundekot nachweisen. Bei den 4,5 x 5 µm großen Oozysten handelt es sich wahrscheinlich um C. parvum, bei den 5 x 6 µm großen vermutlich um Cryptosporidium muris (ROMMEL et al. 2000). Meist werden Spezialverfahren zum Nachweis von Kryptosporidien eingesetzt Diagnostik von Neospora-Infektionen Es gibt verschiedene diagnostische Nachweismethoden, insbesondere zur Differenzierung der Neosporose von Infektionen mit Arten der eng verwandten Gattungen Toxoplasma und Sarcocystis. Sie beinhalten indirekte Methoden zum Nachweis von Antikörpern im Blut oder direkte Methoden. Zu den direkten Methoden zählen die immunhistopathologische und histopathologische Darstellung des Parasiten, die In-vitro-Isolierung des Parasiten, der Nachweis von Parasiten-DNA mittels PCR und die Elektronenmikroskopie (HEMPHILL 1999), die allerdings nur zu Forschungszwecken eingesetzt wird. Die Untersuchung des Liquors ergibt oft nur unspezifische Veränderungen, wie erhöhtes Gesamteiweiß und Pleozytose (BARBER 1998). Aber es können auch Tachyzoiten im Sediment entdeckt werden (McGLENNON et al. 1990) und Antikörpertests mit dem Liquor durchgeführt werden. IFAT-Titer im Liquor sind zwar niedriger als die entsprechenden Serumtiter, aber der Nachweis von Antikörpern im Liquor ist diagnostisch (DUBEY u. LINDSAY 1996) Indirekte Nachweismethoden Eine Infektion mit N. caninum verursacht häufig eine Antikörperproduktion, die durch verschiedene Tests nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von N.-caninumspezifischen Antikörpern in einem Tier zeigt an, dass es mit dem Parasiten infiziert ist oder kürzlich exponiert war (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die indirekte Diagnostik

63 60 2. Literaturübersicht kann nicht beweisen, dass N. caninum tatsächlich die Ursache der entsprechenden Symptome ist, dies kann nur durch den direkten Nachweis von N. caninum in Zusammenhang mit entsprechenden Läsionen in den betroffenen Geweben geschehen. Trotzdem sind serologische Untersuchungen wichtig, um den Kontakt mit dem Parasiten nachzuweisen und das Risiko, an einer Neosporose zu erkranken, einzuschätzen (HEMPHILL 1999) IFAT Der IFAT war der erste serologische Test, den DUBEY et al. (1988b) entwickelten, um bei Hunden Antikörper gegen N. caninum nachzuweisen. Er beruht auf dem Prinzip, dass intakte N.-caninum-Tachyzoiten auf Objektträgern fixiert werden. Diese werden zunächst mit verdünntem Testserum und in einem zweiten Schritt mit fluoreszeinmarkierten Sekundärantikörpern (Konjugat) inkubiert, die gegen Immunglobuline der zu untersuchenden Tierspezies gerichtet sind. Die Reaktion wird unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Ein positives Ergebnis wird durch eine helle, ununterbrochene periphere Fluoreszenz der Parasiten angezeigt. Eine alleinige Fluoreszenz des apikalen Teils der Tachyzoiten (Kappen- oder Polfluoreszenz) wird als nicht spezifische Reaktion beurteilt, die durch Infektion mit kreuzreaktiven apicomplexen Arten verursacht wird (CONRAD et al. 1993b, PARÉ et al. 1995b). Die Durchführung des IFATs erfordert Übung und Erfahrung sowie eine individuelle Interpretation der Reaktionen, weil es sich um einen visuellen Test handelt. Die Ergebnisse des IFATs sind zu einem gewissen Grad subjektiv. Es ist unbedingt erforderlich, dass die optimale Verdünnung des fluoreszeinmarkierten sekundären Antikörpers sorgfältig mit bekannten positiven und negativen Kontrollseren ermittelt wird. Die Reagenzien für den IFAT zur Untersuchung auf Antikörper gegen N. caninum sind kommerziell erhältlich (VMRD, Pullman, WA), jedoch werden in vielen Labors eigene Antigenpräparationen verwendet. Weil im IFAT intakte Tachyzoiten als Antigen benutzt werden, werden mit diesem Test hauptsächlich Antigene erfasst, die sich auf der Zelloberfläche des Parasiten befinden (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Solche Antigene sind oftmals parasitenspezifisch im Gegensatz zu einigen nicht spezifischen Antigenen, die sich im Zellinnern befinden und mit anderen verwandten Parasiten kreuzreagieren (WILLIAMS et al. 1997, PACKHAM et al. 1998). Es gibt viele Untersuchungen zur Kreuzreaktivität von N. caninum mit anderen Kokzidien im IFAT. So konnten bei Hunden ab einem Titer von 1:100 keine Kreuzreaktionen zwischen N. caninum und T. gondii beobachtet werden (DUBEY et al. 1988b). Ebenso fanden TREES et al. (1993) keinen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Neospora-Antikörpern bei Hunden in einer Serumverdünnung

64 2. Literaturübersicht 61 von 1:50 oder 1:200 im IFAT und dem Vorkommen von Toxoplasma-Antikörpern im Sabin-Feldman-Test (SFT) in einer Verdünnung von 1:32. YAMANE et al. (1993) untersuchten die serologische Kreuzreaktivität zwischen Babesia gibsoni, Babesia canis, T. gondii und N. caninum im IFAT. Seren von zwei experimentell mit B. gibsoni infizierten Hunden reagierten mit N.-caninum-Antigenen bis zu einer Serumverdünnung von 1:10240, aber Seren von experimentell mit N. caninum infizierten Hunden zeigten keine serologische Reaktivität mit B.-gibsoni-Antigen. Seren von experimentell mit T. gondii infizierten Hunden reagierten nicht mit N. caninum im IFAT. Diese beobachtete Kreuzreaktion mit B. gibsoni im Neospora-IFAT ist für N.-caninum-Studien in Europa von untergeordneter Bedeutung, da es sich bei B. gibsoni um einen Parasiten handelt, der in Asien, Nordafrika und Nordamerika vorkommt (ROMMEL et al. 2000). Eine weitere Studie zur Kreuzreaktivität zwischen N. caninum und eng verwandten Apicomplexa führten DUBEY et al. (1996a) durch. Dazu infizierten sie Rinder, Schafe, Ziegen, Schweine, Katzen, Kaninchen, Ratten und Mäuse mit N. caninum und untersuchten deren Seren im IFAT auf Antikörper gegen N. caninum und im modifizierten Agglutinationstest (MAT), SFT oder IFAT auf Antikörper gegen T. gondii. Zusätzlich wurden Rinder experimentell mit den ebenfalls gewebezystenbildenden Protozoen T. gondii und Sarcocystis-Arten sowie Kälber mit den intestinalen Kokzidien Eimeria bovis und Cryptosporidium parvum oral infiziert, und es erfolgte eine experimentelle Immunisierung von Kaninchen mit T. gondii, H. hammondi und Sarcocystis-Arten. Auch die von diesen Tieren erhaltenen Seren wurden auf Kreuzreaktivität mit N. caninum untersucht. Rinder, die mit Sarcocystis- Arten oder T. gondii infiziert wurden, entwickelten keine messbaren N.-caninum- Antikörpertiter. Eine Infektion von Kälbern mit E. bovis oder C. parvum hatte keinen Einfluss auf den Neospora-Titer im IFAT. Kaninchen, die mit Sarcocystis neurona, Sarcocystis muris, Sarcocystis cruzi, H. hammondi oder T. gondii immunisiert wurden, entwickelten keine positiven Titer gegen N. caninum im IFAT. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es im Neospora-IFAT keine Kreuzreaktionen mit T. gondii, H. hammondi, Sarcocystis-Arten, E. bovis oder C. parvum gibt und der Neospora-IFAT somit weitgehend spezifisch für die Diagnose der Neospora-Infektion bei Tieren ist. Insgesamt kann man sagen, dass der N.-caninum-IFAT sehr wenig Kreuzreaktivität mit anderen Protozoen aufweist (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Zu beachten ist, dass Hunde gleichzeitig mit N. caninum, T. gondii und anderen Apicomplexa infiziert sein können (DUBEY et al. 1995). Die Serologie ist eine wichtige diagnostische Maßnahme bei der Identifikation von Infektionen mit N. caninum bei Hunden, aber das Vorkommen von Antikörpern ist nicht diagnostisch für eine Erkrankung, weil die meisten seropositiven Hunde klinisch gesund bleiben. Die Höhe des Titers kann jedoch ein nützlicher diagnostischer

65 62 2. Literaturübersicht Indikator sein (BARBER u. TREES 1996). Obwohl auch einige klinisch unauffällige Tiere Titer 1:800 haben können, zeigen epidemiologische Studien, dass solche Titer meist indikativ für eine durch N. caninum bedingte klinische Erkrankung sind (TREES et al. 1993, BARBER u. TREES 1996). So wurden in einer Studie bei nur 1,2 % von 1603 neosporoseunverdächtigen Tieren IFAT-Titer 1:800 gefunden, während alle 20 untersuchten klinischen Neosporosefälle Titer 1:800 im N.-caninum-IFAT hatten (BARBER und TREES 1996). In einer anderen Studie hatten alle parasitologisch bestätigten Neosporosefälle Titer 1:200 im IFAT (DUBEY u. LINDSAY 1996). Der Cut-off-Titer für die Differenzierung zwischen negativen und positiven Reaktionen variiert zwischen verschiedenen Labors, hauptsächlich aufgrund von Unterschieden bei Puffern, Inkubationsbedingungen und Konjugaten. Auch der Typ und die Qualität des Fluoreszenzmikroskops können die Nachweisgrenzen beeinflussen (HEMPHILL 1999). Der IFAT wird vor allem benutzt, um Antikörper im peripheren Blut und in der Zerebrospinalflüssigkeit infizierter Hunde sowie in maternalen und fötalen Seren infizierter Rinder nachzuweisen (HEMPHILL 1999). Nachteile des IFATs liegen in der Zeitaufwendigkeit des Tests (BJÖRKMAN et al. 1994a) und der Notwendigkeit geschulten Personals zum Ablesen des Tests (LALLY et al. 1996a) ELISA Zur Durchführung des indirekten ELISAs wird zunächst die Oberfläche einer Mikrotiterplatte mit einer Antigenpräparation beschichtet. Nach Inkubation mit den Testseren wird ein enzymmarkierter, tierartspezifischer Sekundärantikörper (Konjugat) zugegeben. Im letzten Schritt wird ein Substrat zugefügt, das in Gegenwart des Konjugats in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Nach einer bestimmten Zeit wird die Enzym-Substrat-Reaktion gestoppt und die Absorption oder die optische Dichte mit einem Spektralphotometer gemessen (HARLOW u. LANE 1988). Alternativ entwickelten PARÉ et al. (1995a) einen kinetischen ELISA, bei dem die Veränderung der Absorption gemessen und als Maximalgefälle der optischen Dichte über der Zeit (V max ) berechnet wird. Ferner wurde ein kompetitiver ELISA, der zum Nachweis von N.-caninum- Antikörpern bei Rindern benutzt wird, beschrieben (BASZLER et al. 1996, 2001, DUBEY et al. 1997). Kompetitive ELISAs sind indirekte Tests, die einen

66 2. Literaturübersicht 63 monoklonalen Antikörper beinhalten, der mit den Antikörpern im Testserum um Epitope des Testantigens konkurriert. Der sekundäre Antikörper ist gegen Mäuse- Immunglobuline gerichtet, die mit dem monoklonalen Antikörper reagieren. Wenn das Testserum Antikörper enthält, die gegen dieselben Epitope gerichtet sind wie der monoklonale Antikörper, ist die Absorption in den Vertiefungen, die monoklonale Antikörper und Testserum enthalten, geringer als in Vertiefungen, die nur monoklonale Antikörper enthalten. Das Ergebnis wird meistens als prozentuale Hemmung durch das Testserum angegeben. Ein Vorteil des kompetitiven ELISAs liegt darin, dass er die Höhe der Antikörper misst, die gegen ein einziges oder wenige Epitope gerichtet sind, und somit meist spezifischer ist als konventionelle ELISAs. Außerdem wird neben dem Anti-Maus-Sekundärantikörper kein weiteres Konjugat benötigt, was den kompetitiven ELISA sehr vielseitig macht (HARLOW u. LANE 1988, BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Traditionelle indirekte N.-caninum-ELISAs benutzen Antigenpräparationen aus zerstörten nativen Tachyzoiten. Diese enthalten viele Antigene, die wahrscheinlich überwiegend zytoplasmatischen Ursprungs sind (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Es wird von Sensitivitäten von 88,6-98 % und Spezifitäten von % bei diesen ELISAs berichtet (PARÉ et al. 1995a, OSAWA et al. 1998, WOUDA et al. 1998a). Aber die Spezifität und Sensitivität von ELISAs, die auf intrazellulären Antigenen beruhen, wurden in Frage gestellt und es wird angenommen, dass serologische Untersuchungen, die auf Antigenen der Oberflächenmembran beruhen, parasitenspezifischer sind (HULDT 1981, UGGLA u. BUXTON 1990). Um die Reaktion mit intrazellulärem Antigen zu begrenzen, können die Vertiefungen der Mikrotiterplatte z. B. mit chemisch fixierten ganzen Tachyzoiten beschichtet werden (WILLIAMS et al. 1997). Die Parasitenmembranantigene können auch angereichert und in so genannte immunstimulierende Komplexe (Iscoms) eingeschlossen werden, die dann als Antigen im Test verwendet werden (BJÖRKMAN et al. 1994a). Das Iscom-Konzept wird also als Mittel benutzt, um amphiphatische Antigene wie die Tachyzoitenmembranproteine auszuwählen und somit die Anzahl innerer Proteine, die Probleme mit nicht spezifischer Bindung und Kreuzreaktivität verursachen können, zu verringern (BJÖRKMAN u. LUNDÉN 1998). Der erste veröffentlichte ELISA zum Nachweis von N.-caninum-Antikörpern war ein Iscom-ELISA. Dieser wurde zur Untersuchung von Hundeseren entwickelt und besaß im Vergleich zum IFAT als Referenzmethode eine Sensitivität und Spezifität von 97,6 % bzw. 95,6 % (BJÖRKMAN et al. 1994a). Bei epidemiologischen Untersuchungen zur Neosporose ist es wichtig, zwischen akuter und chronischer Infektion unterscheiden zu können. Dazu können jedoch

67 64 2. Literaturübersicht weder die Höhe der N.-caninum-IgG-Antikörper noch die Antikörperdynamik verwendet werden, weil diese Antikörper einerseits lange Zeit auf hohen Leveln persistieren und andererseits während der Trächtigkeit schwanken können (PARÉ et al. 1997). Daher wurde der Iscom-ELISA modifiziert, um die Analyse der IgG-Avidität zu ermöglichen. In dem Aviditäts-ELISA werden Antikörper mit einer niedrigen Avidität zum Antigen durch einen Inkubationsschritt mit Harnstoff nach der Seruminkubation wieder abgelöst. Die Antikörpertiter, die mit und ohne Harnstoffinkubation gemessen werden, werden benutzt, um den IgG-Aviditäts-Wert zu kalkulieren (BJÖRKMAN et al. 1999). Aviditätsuntersuchungen beruhen auf dem Phänomen, dass die ersten Antikörper, die nach Antigenkontakt bei einer Primärinfektion gebildet werden, eine geringere Avidität für das Antigen besitzen als die Antikörper, die später produziert werden. Der N.-caninum-IgG-Aviditäts-ELISA ist noch nicht vollständig evaluiert, aber die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, zwischen akuter und chronischer Infektion zu unterscheiden (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Es wurden auch andere Techniken versucht, um die Spezifität von ELISAs zu verbessern. Dazu gehört die Verwendung definierter rekombinanter Proteine als Antigen (LALLY et al. 1996a, LOUIE et al. 1997) oder das Einfangen eines spezifischen Antigens durch einen monoklonalen Antikörper (DUBEY et al. 1997). Alle diese verschiedenen Antigenzubereitungen werden in verschiedenen Labors für den N.-caninum-ELISA benutzt (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die allgemein in ELISAs am meisten benutzten sekundären Antikörper sind polyklonale Antiseren, die gegen Immunglobuline der untersuchten Tierart gerichtet sind (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). In einigen der veröffentlichten N.-caninum-ELISAs werden monoklonale Antikörper als Sekundärantikörper gegen spezifische Immunglobuline benutzt, um die Sensitivität und Spezifität des Tests zu steigern (BJÖRKMAN et al. 1994a, 1997, WILLIAMS et al. 1997). Der ELISA erwies sich als nützliche Technik zum Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Antigene. Er ermöglicht eine schnelle Bestimmung und Titration der Antikörper (BJÖRKMAN u. LUNDÉN 1998). Gegenüber dem IFAT besitzt der ELISA den Vorteil, dass die Erfassung der Ergebnisse objektiv geschieht und der Test leicht automatisierbar ist. Deswegen ist der ELISA gut geeignet für Screening- Untersuchungen großer Probenzahlen, z. B. serologische Reihenuntersuchungen (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die Benutzung des ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen N. caninum kann jedoch problematisch sein, wenn hohe Hintergrundabsorptionen und nicht spezifische Reaktionen, die am wahrscheinlichsten durch Kreuzreaktivität mit verwandten Kokzidien hervorgerufen werden, auftreten (HEMPHILL 1999).

68 2. Literaturübersicht DAT Das Prinzip des DAT ist, dass intakte, formalinbehandelte Tachyzoiten in der Gegenwart spezifischer Antikörper agglutinieren. Durch Zusatz von Farbstoffen kann diese Agglutination sichtbar gemacht werden. Der Test detektiert nur IgG-Antikörper, weil spezifische und unspezifische Immunglobulin M (IgM)-Antikörper durch Zusatz von Mercaptoethanol zerstört werden. Für die Durchführung des Tests werden viele Tachyzoiten benötigt, damit die Reaktion in der Vertiefung der Mikrotiterplatten mit dem bloßen Auge sichtbar wird (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Im Jahr 1998 beschrieben zwei unabhängige Veröffentlichungen einen DAT für N. caninum (PACKHAM et al. 1998, ROMAND et al. 1998). Als Antigen setzten ROMAND et al. (1998) Tachyzoiten des caninen NC-1-Isolats ein, PACKHAM et al. (1998) benutzten Tachyzoiten des bovinen Isolats BPA-1. Sie stellten fest, dass die eingesetzte Tachyzoitensuspension eine Konzentration von 3-4 x 10 4 Tachyzoiten/µl haben muss. Ist die Konzentration zu niedrig, kann man die Reaktion nicht sehen, ist sie zu hoch, sehen die negativen Ergebnisse aus wie schwach positive Reaktionen. Durch Untersuchung einer großen Anzahl von Seren von 16 verschiedenen Tierarten gelangten PACKHAM et al. (1998) zu dem Ergebnis, dass der DAT eine mit dem IFAT vergleichbare Sensitivität und Spezifität hat. Der Test erwies sich auch als hochspezifisch, als Seren von Tieren getestet wurden, die mit verwandten Parasiten (einschließlich T. gondii) infiziert waren (PACKHAM et al. 1998, ROMAND et al. 1998). ROMAND et al. (1998) untersuchten Seren von mit S. muris, S. neurona, S. cruzi, H. hammondi und T. gondii immunisierten Kaninchen. Dabei kam es nur zu einer schwachen Kreuzreaktion bei einem Kaninchen, das mit S. cruzi immunisiert worden war. PACKHAM et al. (1998) stellten fest, dass es bei Untersuchung von hämolysierten Seren oder Fötalflüssigkeiten zu falsch positiven Ergebnissen im DAT kommen kann. PACKHAM et al. (1998) testeten für den N.-caninum-DAT 15 verschiedene Farbstoffe, von denen sich Eosin Y am besten eignete, obwohl es das Pellet nicht so charakteristisch färbte, wie dies im kommerziellen Toxoplasma-Kit (biomérieux, Marcy l'etoile, Frankreich) der Fall ist. Wenn man den MAT für T. gondii mit dem für N. caninum vergleicht, kann man insgesamt sagen, dass die Agglutinationen im Toxoplasma-MAT charakteristischer und leichter ablesbar sind. Außerdem kann man den Toxoplasma-Testkit schon nach 5 Stunden ablesen, wohingegen der Neospora- MAT über Nacht inkubieren muss, was ein großer Nachteil dieses Tests ist (PACKHAM et al. 1998). Der DAT ist ein Test zum Nachweis und zur Quantifizierung von IgG-Antikörpern gegen N. caninum bei verschiedenen Wirtsspezies. Er ist billig, leicht ables- und durchführbar und erfordert ein Minimum an Laborausstattung und Materialien. Mit

69 66 2. Literaturübersicht diesem Test können Serumproben verschiedener Wirtsspezies in demselben Testdurchlauf mit vergleichbaren Agglutinationsmustern untersucht werden, ohne dass wie beim IFAT oder ELISA tierartspezifische Anti-IgG-Konjugate benötigt werden, die für jede Tierart zeitaufwendig standardisiert werden müssen. Der DAT ist gut geeignet für große epidemiologische Screening-Untersuchungen bei Feldstudien (ROMAND et al. 1998) Immunoblot Beim Immunoblot werden die Antigene durch Gelelektrophorese aufgetrennt, elektrophoretisch auf eine Trägermembran übertragen und dann mit Antikörpern nachgewiesen (VOET u. VOET 1994). Der Immunoblot wird eher zusätzlich zu anderen Tests verwendet als als Mittel zur Routineuntersuchung von Seren. Er ist wichtig, um immunodominante Antigene zu identifizieren (ATKINSON et al. 2000b) und wurde auch in begrenztem Umfang bei Herdenuntersuchungen verwendet (SCHARES et al. 1998, ATKINSON et al. 2000a). Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn mindestens zwei von vier spezifischen immunodominanten Antigenbanden reagieren (SCHARES et al. 1998, 1999). Bei dieser Art der Auswertung scheint die Kreuzreaktivität mit T. gondii im Immunoblot vernachlässigbar, hängt jedoch von dem jeweils benutzten Antigenextrakt und den Serumverdünnungen ab (ATKINSON et al. 2000b). Wenn Kreuzreaktivität auftritt, ist sie mit keinem der immunodominanten Antigene assoziiert (BJERKÅS et al. 1994, PARÉ et al. 1995a, HOWE et al. 1998, SCHARES et al. 1998, ATKINSON et al. 2000a) Direkte Nachweismethoden Mikroskopischer und immunhistochemischer Nachweis im Gewebe Lichtmikroskopisch kann man Tachyzoiten von N. caninum nicht von denen von T. gondii unterscheiden. Die Unterscheidung gelingt im Transmissionselektronenmikroskop aufgrund des Aussehens der Rhoptrien (DUBEY et al. 1988a, LINDSAY et al. 1993). Rhoptrien von N.-caninum-Tachyzoiten sind elektronendicht, die von T.-gondii-Tachyzoiten sind schwammartig. Die Anzahl und Anordnung der Rhoptrien allein kann nicht zur Unterscheidung herangezogen werden, weil sie sehr stark variieren (DUBEY u. LINDSAY 1996). Für vergleichende Studien ist es wichtig, dass die Fixierung und Behandlung der Parasiten standardisiert sind. Nachteilig an der Transmissionselektronenmikroskopie ist, dass die Aufarbeitung und die

70 2. Literaturübersicht 67 Untersuchung der Proben zeitaufwendig sind. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit, dass man durch einen Gewebsbezirk schneidet, der Parasitenmaterial beinhaltet, gering. Deswegen ist die Transmissionselektronenmikroskopie ein ungeeignetes Mittel für die Routinediagnostik (HEMPHILL 1999). Gut entwickelte Gewebezysten von N. caninum können lichtmikroskopisch von denen von T. gondii unterschieden werden (DUBEY et al. 1988a). N.-caninum- Gewebezysten finden sich vor allem im Nervengewebe und ihre Wand kann bis zu 4 µm dick sein, während Gewebezysten von T. gondii in vielen Organen gefunden werden und ihre Wand immer weniger als 1 µm dick ist (DUBEY u. LINDSAY 1993). Die Gewebezysten liegen reaktionslos im Wirtsgewebe. In Fällen akuter Neosporose können histopathologische Veränderungen in vielen Organen gefunden werden, die nicht in Verbindung mit Gewebezysten auftreten. Im ZNS sind diese Veränderungen meistens durch einen zentralen Nekroseherd, der von infiltrierenden Entzündungszellen umgeben wird, charakterisiert (HEMPHILL 1999). Eine immunhistochemische Markierung der histologischen Schnitte ist nötig, um die Diagnose zu bestätigen (HEMPHILL 1999). N. caninum kann durch das Verwenden eines Anti-N.-caninum-Serums immunhistochemisch in Schnitten erkannt werden (LINDSAY u. DUBEY 1989a). Die meisten Berichte von Neosporose bei Tieren basieren auf der spezifischen Markierung von N. caninum, indem man ein polyklonales Serum von Kaninchen verwendet, die mit Tachyzoiten aus der Zellkultur immunisiert wurden. Man muss bedenken, dass keines der immunhistochemischen Reagenzien komplett uniform ist, was zu kleinen Unterschieden in der Spezifität in den verschiedenen Labors führen kann. Zusätzlich kann das Antiserum unterschiedlich reagieren, abhängig von den zur Herstellung des Serums verwendeten Kaninchen und dem Antigentyp, mit dem das Kaninchen immunisiert wurde, sowie der Fixierung des Parasitenantigens. Das Ergebnis des immunhistochemischen Tests kann auch beeinflusst werden durch technische Aspekte wie Inkubationszeit, Trypsin- oder Pepsin-Behandlung oder fehlende Enzymbehandlung des Gewebes. Gelegentlich reagieren unterschiedliche Gewebeblöcke desselben Tieres und mit derselben Fixierung unterschiedlich. Deswegen sollte die Diagnose nicht nur auf den Ergebnissen einer einzelnen immunhistologischen Untersuchung beruhen (DUBEY u. LINDSAY 1993). Auch Kreuzreaktionen mit anderen verwandten Kokzidien wie T. gondii oder Sarcocystis- Arten können bei der Benutzung polyklonaler Seren auftreten. So berichteten SUNDERMANN et al. (1997) von einem kommerziell erhältlichen polyklonalen Antikörper gegen T. gondii, der mit N. caninum kreuzreagierte. McALLISTER et al. (1996c) wiesen nach, dass sich Bradyzoiten von T. gondii und auch von N. caninum

71 68 2. Literaturübersicht mit Antikörpern, die gegen ein Toxoplasma-bradyzoitenspezifisches Antigen (BAG5) gerichtet sind, anfärben lassen. Um das Problem der Kreuzreaktivität zwischen N. caninum und T. gondii in formalinfixierten und in paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu umgehen, wurde ein System entwickelt, das auf einem monoklonalen Antikörper basiert, der spezifisch für N.-caninum-Tachyzoiten und -Bradyzoiten ist und in immunhistochemischen Untersuchungen mit diesen reagiert (COLE et al. 1993). BJÖRKMAN und HEMPHILL (1998) entwickelten mehrere monoklonale Antikörper gegen Antigene, die in Neospora-Iscoms (BJÖRKMAN et al. 1994a) integriert waren. Diese Antikörper zeigten weder beim Immunoblot noch bei der Immunfluoreszenzmarkierung gereinigter Tachyzoiten Kreuzreaktionen mit T. gondii. Außerdem markierten die Antikörper N.-caninum-Tachyzoiten in Paraffinschnitten nach Vorbehandlung der Objektträger mit Pronase, und das Fehlen jeglicher Markierung in Gewebeschnitten, die T.-gondii-Tachyzoiten enthielten, zeigte, dass diese Antikörper für immunhistochemische Untersuchungen verwendet werden können (HEMPHILL 1999). Polyklonale Antikörper gegen die N.-caninum-Oberflächenproteine Nc-p43 (HEMPHILL u. GOTTSTEIN 1996) und Nc-p36 (HEMPHILL et al. 1997) wurden in Hinblick auf ihr diagnostisches Potential untersucht. Nc-p43-spezifische Antikörper markieren Tachyzoiten und Bradyzoiten von N. caninum, wohingegen Nc-p36- spezifische Antikörper nur Tachyzoiten markieren, weil es sich bei dem Nc-p36 um ein stadienspezifisches Antigen handelt, das nur in Tachyzoiten exprimiert wird. Es gibt keine Kreuzreaktion zwischen diesen Antikörpern und T. gondii. Antikörper gegen Nc-p43 und Nc-p36 stellen nützliche Werkzeuge für immunhistochemische Untersuchungen dar, um spezifisch das Tachyzoiten- oder Bradyzoiten-Stadium oder beide Stadien in infizierten Geweben zu finden. Ferner können diese Antikörper zur Untersuchung der Stadienkonversion während verschiedener Infektionsphasen mit N. caninum verwendet werden (FUCHS et al. 1998). Ein Nachteil der immunhistologischen Untersuchung ist, dass diese zeitaufwendig ist und die Ergebnisse gelegentlich schwer zu interpretieren sind (ROMAND et al. 1998) PCR zum Nachweis von Neospora-DNA Weil immunhistochemische Untersuchungen of nicht sensitiv genug sind, sind sensitivere Techniken zum direkten Nachweis des Parasiten in Gewebeproben und Körperflüssigkeiten nötig. Deswegen konzentrierten sich viele Labors auf die Entwicklung Neospora-spezifischer PCRs zum Nachweis der Parasiten DNA. Die

72 2. Literaturübersicht 69 Effizienz der Amplifikation mittels PCR ermöglicht die Untersuchung sehr kleiner Mengen als Startmaterial (HEMPHILL 1999). Außerdem kann das Verfahren durch die Verwendung so genannter Nested-Primer noch effizienter gestaltet werden (LALLY et al. 1996b, ELLIS et al. 1997). Aber man muss vorsichtig sein, um eine Kontamination zu vermeiden. Diese kann aus anderen Proben, aus der Umwelt oder von vorher amplifizierten PCR-Produkten stammen (HEMPHILL 1999). Gegenwärtige PCRs, die in der Neospora-Diagnostik verwendet werden, basieren auf verschiedenen Sequenzen, z. B. dem Internal transcribed Spacer 1 (ITS-1) (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996, PAYNE u. ELLIS 1996), rrna-gensequenzen (HO et al. 1996), dem Gens von N. caninum (LALLY et al. 1996b) oder einer Neospora-spezifischen genomischen DNA-Sequenz, die mit Nc5 bezeichnet wird (KAUFMANN et al. 1996, MÜLLER et al. 1996, 2002, YAMAGE et al. 1996, LIDDELL et al. 1999a, b, HILL et al. 2001). Die ITS-1-Region ist eine Zielsequenz, die den Vorteil hat, dass sie in einer hohen Anzahl an Kopien vorliegt (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996, PAYNE u. ELLIS 1996, HOMAN et al. 1997). Die PCR auf Basis der ITS-1-Region kann spezifisch fünf N.-caninum-Tachyzoiten aus der Zellkultur nachweisen (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996). Sie wurde erfolgreich an Gewebeproben experimentell infizierter Mäuse und an Liquor, Buffy-Coat-Zellen, Amnionflüssigkeit, Plazenta, Rückenmark, Herz und Gehirn experimentell infizierter Mutterschafe und Föten durchgeführt. ELLIS et al. (1997) führten neue Primer zur Verwendung in einer Nested-PCR ein, um ein möglichst kurzes Fragment zu amplifizieren, weil die DNA, die von klinischem Material wie z. B. von autolysierten Föten stammt, oft degradiert ist. Dieser Test wurde auch erfolgreich an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe durchgeführt. Im Jahr 1999 beschrieben ELLIS et al. (1999) eine Single-tube-nested- PCR, mit der man unter experimentellen Bedingungen 10 fg N.-caninum-DNA nachweisen kann. HO et al. (1996) entwickelten eine kokzidienspezifische PCR, die eine konservierte Region des 18SrRNA-Gens amplifiziert. Das Amplifikat kann durch die Hybridisierung mit einer Neospora-spezifischen Sonde, die einen Unterschied von nur einem einzigen Basenpaar von einer ähnlichen Toxoplasma-spezifischen Sonde aufweist, identifiziert werden. Mit dieser PCR konnte unter experimentellen Bedingungen ein Neospora-Tachyzoit aus der Zellkultur oder 5 Tachyzoiten in Blutproben oder Amnionflüssigkeit, denen Tachyzoiten experimentell hinzugefügt wurden, nachgewiesen werden. Diese PCR kann N.-caninum-DNA in bovinem Gehirn, Rückenmark, Herz, Lunge, Nieren, Zwerchfell, Skelettmuskel und Plazenta sowie in Amnionflüssigkeit Neospora-infizierter Rinder detektieren (HO et al. 1997a). Zusätzlich wurden N.-caninum-DNA-Fragmente aus verschiedenen fötalen Geweben

73 70 2. Literaturübersicht von experimentell infizierten Rhesusaffen, einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Milz, Skelettmuskel, Haut und Plazenta, amplifiziert (HO et al. 1997b). Die PCR basiert auf der Sequenz des Gens von N. caninum. Mittels einer Nested-PCR wurde ein 614 Basenpaar (bp) großes Fragment der DNA von N. caninum amplifiziert. Diese PCR amplifizierte keine Fragmente von T. gondii, S. muris, Sarcocystis tenella oder S. cruzi (LALLY et al. 1996b). Die Amplifikation von N.-caninum-DNA war sowohl aus Gewebeproben von experimentell infizierten Mäusen als auch aus infiziertem Mäusegehirn, das stark autolysiert war, möglich. Um die Sensitivität der PCR zu testen, wurde die PCR mit extrahierter DNA aus nicht infizierten Mäusegehirnen, zu denen DNA einer bekannten Anzahl von Tachyzoiten hinzugefügt wurde, durchgeführt. Dadurch konnte man feststellen, dass diese PCR etwa 5000 Parasiten pro g Gehirngewebe nachweisen kann. KAUFMANN et al. (1996) stellten Primer für die Nc5-PCR her, die spezifisch ein 944 bp-fragment der DNA von N. caninum amplifizierten. YAMAGE et al. (1996) entwickelten die PCR durch andere Primersätze (z. B. Np21 + /Np6 + ) weiter. Mit dieser PCR kann man 10 pg Parasiten-DNA nachweisen. Es war möglich einen einzigen Neospora-Tachyzoiten vor dem Hintergrund von DNA, die aus 2 mg Gehirngewebe gewonnen wurde, zu detektieren. Später optimierten MÜLLER et al. (1996) diesen Test für die Anwendung in der Routinediagnostik. Sie führten das Uracil-DNA- Glycosidase-System ein, das eine mögliche Kontamination mit amplifizierter Ziel- DNA von vorherigen Reaktionen eliminiert. Der PCR folgt ein DNA-Hybridisations- Assay, der die Neospora-spezifischen Amplifikationsprodukte unzweifelhaft identifiziert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von einem Parasiten aus der Zellkultur. LIDDELL et al. (1999a) entwickelten eine quantitativ-kompetitive PCR, um die Menge von N. caninum in Geweben von infizierten Tieren festzustellen. Dazu synthetisierten sie ein Oligonukleotid, das in der PCR als Konkurrenz zur Neospora-spezifischen Nc5-Sequenz dient. Dieses Oligonukleotid dient gleichzeitig zur Erkennung möglicher falsch negativer Resultate. Mithilfe dieser PCR ist es möglich etwa 0,09 pg N.-caninum-DNA vor einem Hintergrund von 250 mg DNA aus Gewebe von der Maus darzustellen, was etwa einem Parasiten in 0,45 mg Mausgewebe entspricht (LIDDELL et al. 1999a, b). HILL et al. (2001) isolierten N.-caninum-Oozysten aus Hundekot und extrahierten die DNA. Es folgte eine Nc5-PCR, bei der ein Kompetitionsmolekül verwendet wurde, um mögliche falsch negative PCR-Ergebnisse zu erkennen und die N.-caninum- Oozysten-DNA zu quantifizieren. Die Autoren konnten in 1 g schweren Kotproben Parasiten-DNA erst dann entdecken, wenn den Kotproben mehr als 50 Oozysten

74 2. Literaturübersicht 71 zugefügt wurden. Diese Methode ist wichtig, um die Rolle des Hundes und anderer Karnivoren bei der Epidemiologie der Neosporose zu klären. Allerdings ist es vermutlich nötig, die Sensitivität weiter zu erhöhen. MÜLLER et al. (2002) entwickelten eine Real-time-PCR, die es ermöglicht, die eingesetzte Parasitenmenge quantitativ zu ermitteln. Sie basiert auf der Nc5- Sequenz, einem dualen fluoreszierenden Hybridisationssonden-System und dem Real-time-PCR-Light-Cycler, welcher den Nachweis amplifizierter DNA ermöglicht. Diese Real-time-PCR kann verwendet werden, um Infektionsintensitäten in Gewebe und Körperflüssigkeiten experimentell und natürlich infizierter Tiere festzustellen und ist damit nützlich für epidemiologische und klinische Studien sowie für die Erforschung effizienter Therapien Biologische Verfahren DUBEY et al. (1988b) benutzten Mäuse und Zellkulturen, um N. caninum aus tierischem Gewebe zu isolieren. CONRAD et al. (1993a) isolierten mittels Zellkultur N. caninum aus nur zwei von über 100 Rinderföten, die im Verdacht standen, wegen N. caninum abortiert worden zu sein. Die Isolierung von N. caninum in Zellkultur ist so schwierig, weil die Föten zum Zeitpunkt des Abortes meist zu stark autolysiert sind und weil relativ wenige Parasiten in den infizierten Föten vorkommen (BARR et al. 1990). BRYAN et al. (1994) isolierten N. caninum mittels CRL:CD1(ICR)BR-Mäusen, die mit Nervengeweben von einem Kalb aus Kanada inokuliert worden waren. Diese Isolierung ist interessant, weil das Gewebe des Kalbes vor der Inokulation 4 Monate bei -52 C gelagert wurde. Bis zum Jahr 2000 gab es kein zufrieden stellendes Nagermodell für eine Neosporose. N. caninum ist nicht pathogen für Auszucht-Mäuse (LINDSAY u. DUBEY 1989b, 1990a). Obwohl einige ingezüchtete Mäusestämme und chemisch immunsupprimierte Mäuse empfänglich für eine parenterale Infektion mit N.-caninum- Tachyzoiten sind (LINDSAY u. DUBEY 1989b, LINDSAY et al. 1995a), scheint es keine hohe Empfänglichkeit der Mäuse bei oraler Infektion mit N.-caninum-Oozysten zu geben (LINDSAY et al. 1999a). Dann fanden DUBEY und LINDSAY (2000) heraus, dass Mongolische Wüstenrennmäuse hoch empfänglich für eine orale Infektion mit N.-caninum-Oozysten sind. Nach Aufnahme von etwa 1 x 10 3 Oozysten erkranken oder sterben die Tiere nach etwa 6 bis 13 Tagen. Bei einer Mongolischen Wüstenrennmaus, der 10 Oozysten verfüttert wurden, fand man Läsionen im Gehirn. Mongolische Wüstenrennmäuse, die 10 Oozysten oral erhielten, entwickelten nach 18 Tagen Titer 1:500 im MAT. Aufgrund der hohen Empfänglichkeit für eine orale Infektion mit Oozysten werden Mongolische Wüstenrennmäuse seither als Zwischenwirte benutzt, um N.-caninum-Oozysten im Kot von Hunden nachzuweisen

75 72 2. Literaturübersicht (BASSO et al. 2001a, DIJKSTRA et al. 2001, LINDSAY et al. 2001). Ferner kann die orale Infektion von Mongolischen Wüstenrennmäusen mit N.-caninum-Oozysten nützlich sein, um Antworten eines immunkompetenten Wirtes auf die orale Infektion zu untersuchen (DUBEY u. LINDSAY 2000) Koproskopie Die Kotuntersuchung ist kein Mittel zur Routinediagnostik der Neosporose. McALLISTER et al. (1998) gelang erstmals der Nachweis von N.-caninum-Oozysten im Kot experimentell infizierter Hunde mithilfe einer Sucrose-Flotationstechnik. Dazu wurden 10 g Kot gründlich mit fünf Volumenteilen Sucroselösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,28 gemischt, durch Gaze gefiltert, in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 1180 g zentrifugiert. Ein Tropfen, der am obersten Ende des Meniskus entnommen wurde, wurde mikroskopisch untersucht, indem man ihn auf einen Objektträger gab und mit einem Deckglas bedeckte (DUBEY 1995). Andere Autoren (LINDSAY et al. 1999a, 2001) flotierten N.-caninum-Oozysten in Sheather s Zuckerlösung (ERNST u. BENZ 1981). ŠLAPETA et al. (2002) wiesen Neospora-Oozysten im Kot eines natürlich infizierten Hundes durch Flotation in modifizierter Sheather s Zuckerlösung mit einem spezifischen Gewicht von 1,30 nach. In der Studie von BASSO et al. (2001) wurden Oozysten im Kot eines natürlich infizierten Hundes mithilfe einer Zinksulfat- und einer Zuckerflotation nachgewiesen. McGARRY et al. (2003) fanden Neospora-Oozysten im Kot eines natürlich infizierten britischen Foxhounds, indem sie diesen nach zentrifugaler Flotation in gesättigter Kochsalzlösung mithilfe einer semiquantitativen Deckglas-Methode mikroskopisch untersuchten. Hierzu wurde 1 g Kot homogenisiert, indem man den Kot in 15 ml gesättigter Kochsalzlösung mit Glaskugeln vortexte. Ein Deckglas wurde sofort auf dem oberen Ende des Röhrchens platziert, und das Röhrchen wurde 2 min bei 700 g zentrifugiert und schnell geöffnet.

76 3. Material und Methoden MATERIAL UND METHODEN 3.1. Material Geräte und Verbrauchsmaterialien Angaben zu Geräten oder sonstigen Materialien finden sich bei ihrer ersten Erwähnung im Text oder in Form einer Fußnote Reagenzien und Lösungen Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien sind bei ihrer ersten Erwähnung im Text mit einem Stern (*) gekennzeichnet und im Anhang 9.1. alphabetisch mit ihren Bezugsquellen aufgeführt. Lösungen sind bei ihrer ersten Erwähnung im Text unterstrichen. Alle verwendeten Lösungen und deren Zusammensetzungen sind im Anhang 9.2. alphabetisch aufgeführt. Da die verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Lösungen sowohl aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover als auch aus dem Institut für Medizinische Parasitologie der medizinischen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn stammten, sind sie mit H für Hannover gekennzeichnet, falls es Unterschiede zwischen den Chemikalien, Reagenzien oder Lösungen aus den zwei Instituten gab Patientenmaterial Von August 2000 bis Mai 2002 wurden 299 Serumproben und 154 Kotproben von insgesamt 315 Hunden gewonnen. Diese Hunde gehörten zur Klientel einer Gemischtpraxis im Kreis Mayen-Koblenz. Die Proben wurden von allen Hunden genommen, deren Besitzer die Zustimmung zur Gewinnung dieser Proben gaben und bereit waren, den Fragebogen für die Studie auszufüllen. Es beantworteten 273 Hundebesitzer (86,67 %) den Fragebogen und 42 Hundebesitzer (13,33 %) beantworteten ihn nicht, obwohl sie vorher ihre Zustimmung gegeben hatten. Die aus der Patientenkartei der Praxis erkennbaren

77 74 3. Material und Methoden Daten der Hunde, zu denen kein beantworteter Fragebogen vorlag, wurden in die Auswertung mit einbezogen; so ließ sich der Kartei in der Regel das Alter, die Rasse und das Geschlecht des Hundes sowie die Postleitzahl des Wohnortes des Besitzers entnehmen. Von 305 Hunden war die Postleitzahl des Wohnortes und von 286 Hunden der Wohnort der Hundebesitzer bekannt. Die Hunde stammten aus insgesamt 70 verschiedenen Orten mit 284 bis Einwohnern und einer Größe von 2,32 bis 122,09 km 2. Die Einwohnerdichte schwankte von 61,54 bis 1918,05 Einwohnern (EW) pro km 2. Im Anhang 9.3. wird die Häufigkeit, mit der die Hunde aus den einzelnen Orten kamen, aufgeführt. Fasst man die Orte nach der Einwohnerzahl zusammen, erhält man die in Abb dargestellte Situation. Das Kollektiv der 315 Hunde bestand zu 36,83 % (116 Tiere) aus unkastrierten Rüden, zu 10,48 % (33 Tiere) aus kastrierten Rüden, zu 37,78 % (119 Tiere) aus unkastrierten Hündinnen und zu 14,92 % (47 Tiere) aus kastrierten Hündinnen. Zu allen 315 Hunden war eine Altersangabe vorhanden. Der jüngste Hund war 2 Monate alt, der älteste 15 Jahre. Unterteilt man die Altersstufen nach Jahren, erhält man die in Abb dargestellte Verteilung. Eine Rassenangabe gab es zu 314 Hunden. Die Hunde gehörten insgesamt 61 verschiedenen Rassen sowie den Mischlingen über 20 kg und Mischlingen unter 20 kg an. Die Häufigkeit, mit der die einzelnen Rassen vertreten waren, ist im Anhang 9.3. dargestellt. Für die Hunde gab es insgesamt 70 verschiedene Eingangsdiagnosen sowie 20 verschiedene Kombinationen dieser Diagnosen. Fasst man diese Eingangsdiagnosen zu 15 Gruppen zusammen, so erhält man die in Tab dargestellte Verteilung. Es machten 272 Besitzer Angaben zum Herkunftsland ihres Hundes. Aus Deutschland kamen 240 Hunde (88,24 %), aus Spanien fünf Hunde (1,84 %), aus den Niederlanden vier Hunde (1,47 %), aus Griechenland drei Hunde (1,10 %), aus Österreich zwei Hunde (0,74 %) sowie aus Belgien, Nigeria, Polen, Thailand, der Türkei und Ungarn jeweils ein Hund (0,37 %). Zwölf Besitzer (4,41 %) machten die Angabe, dass das Herkunftsland ihres Hundes unbekannt sei.

78 3. Material und Methoden 75 In 270 Fällen wurden Angaben zur Herkunftsstätte der Hunde gemacht. Die Angaben verteilten sich, wie in Abb dargestellt. Es lagen 273 Angaben zur Haltungsart der Hunde vor. In der Wohnung oder im Haus wurden 236 Hunde (86,45 %), im Zwinger zehn Hunde (3,66 %), auf einem Gehöft oder Bauernhof 13 Hunde (4,76 %), in der Wohnung oder im Haus und gleichzeitig auf einem Gehöft oder Bauernhof 13 Hunde (4,76 %) sowie überwiegend im Freien ein Hund (0,37 %) gehalten. Die Abb stellt dar, wie die Hunde ihren Auslauf erhielten. Darüberhinaus wurden als weitere Auslaufsmöglichkeiten der Hof (fünf Angaben), der Hundeplatz (drei Angaben), der Reitstall (drei Angaben), der Auslauf durch Schwimmen (drei Angaben), der Auslauf auf Ausritten (eine Angabe), das Gelände einer Autowerkstatt (eine Angabe), das Gelände einer Zimmerei (eine Angabe) sowie der Tierheimauslauf (eine Angabe) angegeben. Es lagen 272 Angaben darüber vor, ob der Hund jagdlich geführt wurde. Nicht jagdlich geführt wurden 96,32 % (262 Hunde), jagdlich geführt 3,68 % (zehn Hunde) der Tiere. 35,00 30,00 n=87 Relative Häufigkeit (%) 25,00 20,00 15,00 10,00 n=60 n=70 n=55 5,00 n=12 0,00 Dorf Landstadt Kleinstadt Mittelstadt Großstadt < Stadttyp Einwohnerzahl (EW) Abb Zusammensetzung des Hundekollektivs nach der Einwohnerzahl ihrer Herkunftsorte.

79 76 3. Material und Methoden 14,00 n=42 12,00 n=36 Relative Häufigkeit (%) 10,00 8,00 6,00 4,00 n=31 n=20 n=19 n=19 n=28 n=20 n=26 n=25 n=23 n=12 2,00 n=2 n=6 n=3 n=3 0,00 Abb Alter (Jahre) Zusammensetzung des Hundekollektivs nach Altersstufen. Tab Zusammensetzung des Hundekollektivs nach Eingangsdiagnosen Eingangsdiagnose Absolute Häufigkeit Relative Häufigkeit (n) (%) Kastration Hündin 56 18,42 Kastration Rüde 42 13,82 MD-Erkrankungen 28 9,21 Hautprobleme 24 7,89 Sonstiges Kombinationen verschiedener Erkrankungen 20 6,58 Ohne besonderen Befund Tumoren Organinsuffizienzen 16 5,26 Neuromuskuläre Erkrankungen 12 3,95 Augenerkrankungen 11 3,62 Mammatumore, Scheinträchtigkeit Lahmheiten/Arthrosen 10 3,29 Zahnsanierung 6 1,97 Atemwegserkrankungen 4 1,32

80 3. Material und Methoden 77 45,00 n=114 40,00 Relative Häufigkeit (%) 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 n=5 n=80 n=52 n=11 n=3 n=1 n=1 n=1 n=1 n=1 eingetragener Züchter Tierhandlung Zufallswurf (privat) Tierheim/Fundtier geplanter privater Wurf privater Abgabehund Bauernhof Bundeswehr Tierpension Zeitungsannonce andere Herkunftsstätte Abb Zusammensetzung des Hundekollektivs nach Herkunftsstätten. Relative Häufigkeit (%) 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 9,26 15,93 20,00 54,07 0,74 Auslauf Garten 48,98 24,90 11,43 14,69 0,00 Auslauf in öffentlichen Grünanlagen 16,67 29,46 28,29 24,81 0,78 7,66 9,68 31,85 48,79 2,02 19,85 29,39 20,23 29,77 0,76 Auslauf im Wald Auslauf im Feld Auslauf auf befestigten Wegen n=270 n=245 n=258 n=248 n=262 Art des Auslaufs Anzahl (n) niemals manchmal häufig immer anderes Abb Auslauf der Hunde.

81 78 3. Material und Methoden 3.2. Methoden Datenerhebung Die Tierbesitzer füllten allein oder zusammen mit einer Tierärztin oder einer Tierarzthelferin der Praxis den im Anhang 9.4. aufgeführten Fragebogen aus. Alle Hunde erhielten eine fortlaufende Nummerierung. Es wurde das Datum der Probenentnahme erfasst, danach erfolgten Angaben zum Hund wie Alter, Rasse und Geschlecht. Zur Herkunft des Hundes wurden Herkunftsland und Herkunftsstätte [eingetragener Züchter, Tierhandlung, Zufallswurf (privat), Tierheim/Fundtier oder anderes (mit Angabe)] erfragt. Es folgten Aussagen zur Haltung des Hundes. Unter diesem Stichwort wurde die Haltungsform (überwiegend in der Wohnung/im Haus, überwiegend im Zwinger oder auf einem Gehöft/Bauernhof), die Postleitzahl des Wohnortes, der Auslauf und die jagdliche Führung des Hundes sowie die Art und Anzahl anderer Tiere, die zusammen mit dem untersuchten Hund gehalten wurden, erfasst. Dann machten die Besitzer Angaben zur Fütterung des Hundes und zur oralen Aufnahme von verschiedener Tiere oder Ausscheidungen von Tieren (Mäuse oder andere Kleinnager, Ratten, Kaninchen, Hundekot, Fuchskot sowie Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern, Schafen oder Ziegen). Zuletzt wurde bei Hündinnen erfasst, ob diese bereits einen Wurf hatten. Falls die Hündin einen Wurf hatte, wurde erfragt, wie lange der Besitzer der Hündin die Welpen beobachtet hatte und ob bei den Welpen im Beobachtungszeitraum neuromuskuläre Symptome aufgetreten waren. Die Hundehalter machten Aussagen zum Auslauf der Hunde und zur Fütterung der Hunde, indem sie die Kästchen niemals, manchmal (d. h. 1x pro Woche oder seltener), häufig (d. h. öfter als 1x pro Woche, aber nicht täglich) oder immer (d. h. täglich) ankreuzen konnten. Angaben zur Aufnahme verschiedener Dinge durch ihre Hunde wurden gemacht, indem die Hundehalter die Kästchen niemals, manchmal (d. h. höchstens 4x pro Monat), häufig (d. h. öfter als 4x pro Monat) oder weiß nicht ankreuzen konnten. Hatte ein Hundebesitzer bei einer Frage zwei Kategorien angekreuzt (z. B. niemals und manchmal), so wurde bei der Zusammenfassung der Gruppen diejenige Kategorie für die Berechnung verwendet, die die häufigere Frequenz darstellte (z. B. manchmal).

82 3. Material und Methoden Untersuchung der Seren im IFAT auf Neospora-Antikörper Serumgewinnung und Serumlagerung Es wurden Vollblutproben von 299 Hunden aus der Vena cephalica antebrachii oder der Vena saphena lateralis entnommen. Die Blutproben wurden in Eppendorf- Reaktionsgefäße 1 aufgefangen. Nach etwa einer Stunde war das Blut geronnen und wurde zweimal 95 Sekunden bei g zentrifugiert 2. Das Serum wurde abpipettiert und bei -22 C in Eppendorf-Reaktionsgefäßen gelagert Referenzseren Als Referenzseren dienten kommerziell erhältliche negative und positive Hundeseren 3. Außerdem wurde ein positives Serum eines Hundes, der an klinischer Neosporose erkrankt war, verwendet. Die Neospora-Infektion wurde durch Immunhistochemie und Parasitenisolation bestätigt Antigengewinnung für den IFAT Für die Untersuchung aller Seren in dieser Studie wurde eine Charge Antigen produziert und verwendet. Parasitenkulturen des NC-1-Isolates N. caninum wurden auf Verozellen in Zellkulturflaschen 4 gezüchtet. Zur Gewinnung von Tachyzoiten als Material für die IFAT-Objektträger 5 wurden Flaschen gewählt, in denen sich ein Verozell-Monolayer gebildet hatte, der viele Zellen mit Parasitenclustern und ersten Plaques aufwies. Die Zellkulturflasche wurde auf die Seite mit dem Monolayer gelegt, und die Parasiten mitsamt den restlichen Zellen wurden mit dem Zellscraper 6 abgekratzt. Die Parasitensuspension wurde in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen 7 überführt, dabei wurde die Suspension in der Pipette mehrmals hoch- und herunterpipettiert, um Zellcluster zu lösen. Danach wurde die Zellkulturflasche mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, H) gespült und die Spülflüssigkeit ebenfalls in das Zentrifugenröhrchen überführt. Die Parasitensuspension wurde Safe-Lock 1,5 ml Reaktionsgefäße, EPPENDORF-NETHELER-HINZ-GmbH, Hamburg Stat Spin -Mehrzweckzentrifuge, Modell SSMP, STATSPIN TECHNOLOGIES, Massachusetts (USA) VMRD, INC., Pullman, Washington (USA) Easyflask, 75 cm 2, mit Filterkappen, NUNC, Wiesbaden teflonbeschichtete Diagnostik-Objektträger mit 24 4-mm-Vertiefungen, Teflonbeschichtung schwarz, RENNER, Dannstadt 24 cm, Klingenbreite 12 mm, RENNER, Dannstadt NUNC, Wiesbaden

83 80 3. Material und Methoden dreimal durch eine Kanüle 8 gezogen, um die Zellen zu zerstören. Es folgte eine 10- minütige Zentrifugation 9 bei 1000 g. Der Überstand wurde abgegossen und das Sediment in PBS (H) resuspendiert. Es wurde noch mindestens dreimal mit PBS (H) gewaschen, wobei jedes Mal gründlich resuspendiert wurde und eine 10-minütige Zentrifugation bei 1000 g erfolgte. Nach dem letzten Waschschritt wurde erneut gründlich resuspendiert. Die Tachyzoiten wurden in einer Thoma-Zählkammer 10 gezählt und die Suspension auf 10 6 Tachyzoiten pro ml eingestellt. Zehn µl dieser Suspension wurden in jede Vertiefung der Objektträger für den Neospora-IFAT pipettiert. Die Objektträger wurden über Nacht in einem Umluft- Trockenschrank 11 bei 27 C und leichtem Umluftstrom getrocknet. Am nächsten Tag wurden sie luftdicht und feuchtigkeitsabweisend verpackt. Die Lagerung der Objektträger erfolgte bei -80 C Konjugat Als Konjugat diente FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)-konjugiertes Kaninchen-Anti- Hund-IgG 12, das in einer Verdünnung von 1:60 verwendet wurde Testdurchführung 1. Auftauen der Objektträger Zur Durchführung des IFATs wurden die mit NC-1-Tachyzoiten beschichteten Objektträger etwa 30 Minuten bei Zimmertemperatur aufgetaut. 2. Fixierung des Antigens Es erfolgte eine 10-minütige Fixierung in Methanol* in einer Färbeküvette. 3. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger Die Objektträger wurden mit PBS aus einer Spritzflasche abgespült und dann 10 Minuten in PBS gewaschen. Dazu stellte ich sie 10 Minuten in eine Färbeküvette mit 8 9 0,4 mm, BRAUN, Melsungen Sigma 3 K-1 für 50-ml-Zentrifugenröhrchen, SIGMA Laborzentrifugen, Osterode 10 LANDGRAF, Hannover 11 HERAEUS, Hanau 12 FITC-konjugiertes Kaninchen Anti-Hund IgG (H + L), Code , JACKSON IMMUNO RESEARCH LABORATORIES INC., Baltimore (USA)

84 3. Material und Methoden 81 PBS und bewegte die Küvette nach etwa 5 Minuten vorsichtig. Nach dem Waschen wurden die Objektträger entnommen und die Flüssigkeit auf den Objektträgern auf einer saugfähigen Unterlage vorsichtig abgeklopft. Anschließend wurden die Objektträger am Rand und zwischen den Vertiefungen mit einem fusselfreien Papier 13 getrocknet. 4. Verdünnung der Testseren und Beschichtung der Objektträger Die Testseren und das negative Kontrollserum 14 wurden in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:25 (1:25, 1:50, 1:100 und 1:200) mit PBS in einer Mikrotiterplatte 15 verdünnt. Die Verdünnung der Testseren erfolgte zunächst bis zur Verdünnungsstufe 1:200. War aus vorhergehenden Untersuchungen bekannt, dass das Testserum bei 1:200 positiv reagierte, wurde es soweit weiterverdünnt, dass es in der Endverdünnung negativ war. Das positive Kontrollserum 16 wurde in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:40 verdünnt (1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560 und 1:5120). In jedem Test wurden eine Konjugatkontrolle, eine PBS- Kontrolle und eine Negativkontrolle in vier Verdünnungsstufen sowie eine Positivkontrolle in acht Verdünnungsstufen mitgeführt. Auf die Objektträgerfelder der Konjugat- und der PBS-Kontrolle wurden je 7 µl PBS aufgetragen. Auf die übrigen Objektträgerfelder wurden je 7 µl Serumverdünnung aufgetragen. Die Seruminkubation erfolgte 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 C im Brutschrank Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger Siehe Punkt Inkubation mit Konjugat Die Konjugatgebrauchslösung (1:60) wurde mit PBS hergestellt und Evans Blau* zur Gegenfärbung verwendet (20 µl Konjugat wurden mit 1,12 ml PBS und 60 µl Evans- Blau-Lösung vermischt). Je 7 µl der Konjugatverdünnung wurden auf jedes Objektträgerfeld gegeben (außer in die der PBS-Kontrolle, hier wurden 7 µl PBS zugegeben), worauf eine erneute Inkubation für 30 Minuten bei 37 C in der feuchten Kammer erfolgte. 13 KIMWIPES, KIMBERLY-CLARK, Roswell, Georgia (USA) 14 VMRD, INC., Pullman, Washington (USA) 15 PS-Microplatte, 96 K, U-Form, GREINER BIO-ONE, Frickenhausen 16 VMRD, INC., Pullman, Washington (USA) 17 MEMMERT, Schwabach

85 82 3. Material und Methoden 7. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger Siehe Punkt 3. Allerdings wurde die Färbeküvette so in Alufolie eingepackt, dass kein Licht auf die Objektträger fallen konnte. 8. Eindecken der Objektträger Nachdem die Objektträger am Rand trockengewischt waren, wurden drei bis vier Tropfen des Eindeckmediums aufgetropft und der Objektträger mit einem großen Deckgläschen 18 abgedeckt. Die Objektträger wurden bis zur Auswertung dunkel aufbewahrt. 9. Auswertung Die Auswertung erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop 19 bei 400facher Vergrößerung, wobei folgende Einteilung vorgenommen wurde: Abb Beurteilung der Fluoreszenz im Neospora-IFAT. Bei der Polkappenfluoreszenz (apikale Fluoreszenz) handelt es sich meistens um eine unspezifische Reaktion, die wahrscheinlich durch Reaktion mit anderen Apicomplexa hervorgerufen wird. 18 Deckgläser für Mikroskopie, 24 x 60 mm, KNITTEL GLÄSER, Braunschweig 19 Laborlux D, LEICA, Solms

86 3. Material und Methoden 83 Die Ergebnisse wurden in dem im Anhang 9.6. aufgeführten Ergebnisbogen dokumentiert. Es wurde die Fluoreszenz für jede einzelne Verdünnungsstufe beurteilt. Als Titer wurde die Verdünnungsstufe des Serums angegeben, in der die Fluoreszenz des Parasiten noch mit 1+ beurteilt wurde. Die Endbewertung eines Serums erfolgte anhand mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführter IFATs. Wich das Ergebnis der einzelnen IFATs um eine Titerstufe voneinander ab, wurde das Serum endgültig mit der niedrigeren Titerstufe bewertet oder es wurde ein weiterer IFAT durchgeführt. Bei drei durchgeführten IFATs wurde das Serum endgültig mit der Titerstufe bewertet, die bei zwei der drei IFATs noch zu einer Fluoreszenz führte. Fielen alle drei IFATs unterschiedlich aus, wurde ein vierter IFAT durchgeführt und der Titer endgültig durch das Mittel zwischen dem höchsten und niedrigsten Einzel-IFAT-Ergebnis beurteilt. Die Einzel- und Endbewertungen der Seren sind im Anhang 9.7. aufgeführt. Die Seren wurden in zwei Kategorien eingeteilt: Tab Einteilung der Seren in die Kategorien positiv und negativ Kategorie Endbewertung des Serums Negativ Keine Fluoreszenz, trace bis zu 1:100 oder Titer <1:50 Positiv Titer 1: Untersuchung der Seren auf Toxoplasma-Antikörper Die Testdurchführung (IFAT und SFT) erfolgte am Institut für Medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität in Bonn. Zur Einstellung des IFATs und internen Qualitätskontrolle wurde das nationale Standardserum verwendet, das mit dem Anti-Toxoplasma Serum Human (2000 IU/Ampulle) der Weltgesundheitsorganisation (Referenzserum) abgeglichen ist und mit dem im IFAT ein Titer von 1:4000 erreicht werden muss. Außerdem wurde zur internen Qualitätskontrolle bei jedem Testansatz ein bekannt positives 20 und negatives 21 Hundeserum mitgeführt. 20 Serum von Hund Nr Serum von Hund Nr. 177

87 84 3. Material und Methoden IFAT zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii Untersuchungsgut Im IFAT wurden 185 der 299 Hundeseren, die bereits im Neospora-IFAT getestet waren, auf das Vorhandensein von Toxoplasma-Antikörpern untersucht Antigengewinnung für den IFAT Zehn Mäuse 22 wurden mit ca. 3 x 10 6 Toxoplasma-Tachyzoiten 23 in maximal 0,3 ml PBS intraperitoneal (i. p.) infiziert. Die Tachyzoiten wurden 48 Stunden p. i. durch Spülung der Bauchhöhle mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewonnen. Das gesamte Exsudat einer Maus wurde in je einem Glasröhrchen gesammelt, anschließend 5 Minuten bei 1409 g abzentrifugiert 24, der Überstand abgenommen und danach das Sediment zweimal in PBS gewaschen (5 Minuten, 1409 g). Nach dem letzten Waschen wurde das Sediment in 0,5 ml PBS aufgeschwemmt und die Tachyzoiten vorsichtig resuspendiert. Zu jeder Suspension wurden 4,5 ml einer 1%igen Formaldehyd-Lösung gegeben, Minuten fixiert und das Sediment zweimal mit PBS gewaschen (10 Minuten, 1409 g). Nach jedem Zentrifugieren wurde das Sediment sorgfältig resuspendiert. Nach dem dritten Zentrifugieren wurde das Sediment in 1 ml PBS aufgenommen und in Ampullen 25 lyophylisiert. Die Lagerung der Ampullen erfolgte bei -20 C. Vor der Beschichtung von gefelderten IFAT-Objektträgern 26 wurden die Ampullen 10 Minuten bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Lyophilisat wurde entsprechend der Ausgangskonzentration mit PBS so verdünnt, dass es ca. 2 x 10 6 Tachyzoiten pro ml enthielt. Nach einer Stunde Lagerung bei Raumtemperatur wurden mit dem Dispenser µl Antigensuspension (etwa 1-2 x 10 4 Tachyzoiten) pro markiertes Feld aufgetragen. Die Trocknung erfolgte zunächst bei Raumtemperatur (1 Stunde), danach bei 37 C im Brutschrank (1 Stunde). Anschließend wurden die Objektträger durch zehnmaliges, kurzes Eintauchen in destilliertes Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Die Objektträger wurden luftdicht und feuchtigkeitsabweisend verpackt und mit dem Datum der Herstellung beschriftet. Die Lagerung der Objektträger erfolgte bei -20 C für bis zu 6 Monate. 22 Stamm NMRI, weiblich, ca. 10 Wochen alt 23 Stamm BK 24 Rotanta/TC 4403, HETTICH, Tuttlingen 25 Flasche R 10-D, klar, Art.-Nr , CS-CHROMATOGRAPHIE SERVICE, Langerwehe 26 Dunn Labortechnik, Asbach 27 Multipette plus, EPPENDORF, Hamburg

88 3. Material und Methoden Konjugat Als Konjugat diente FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)-konjugiertes Kaninchen-Anti- Hund-IgG 28, das in einer Verdünnung von 1:60 verwendet wurde Testdurchführung 1. Auftauen der Objektträger Die Toxoplasma-beschichteten Objektträger wurden etwa 15 Minuten bei Zimmertemperatur aufgetaut. 2. Verdünnung der Testseren und Beschichtung der Objektträger Kontroll- und Testseren wurden in Viererschritten ab einer Verdünnung von 1:16 (1:16, 1:64, 1:256 und 1:1024) mit PBS in Mikrotiterplatten verdünnt. Das negative Kontrollserum wurde nur in zwei Verdünnungsstufen mitgeführt, das positive Kontrollserum mindestens bis zur bekannten Endtiterstufe. Je 10 µl Serumverdünnung wurde auf ein Objektträgerfeld aufgetragen. Die Seruminkubation erfolgte 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 C im Brutschrank. 3. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger Nach der Inkubation wurde jeder Objektträger durch zwei mit PBS gefüllte Schalen gezogen, um die Serumverdünnungen abzuspülen, anschließend für 15 Minuten in mit PBS gefüllte Küvetten gestellt. Zwischendurch wurden sie einmal bewegt. Nach dem Waschen wurden die Objektträger entnommen, die ihnen anhaftende Flüssigkeit abgeklopft, und dann zum Trocknen bei Raumtemperatur für ca. 10 Minuten aufgestellt. Abschließend wurden die Objektträger am Rand und zwischen den Vertiefungen mit fusselfreiem Papier getrocknet. 28 FITC-konjugiertes Kaninchen Anti-Hund IgG (H + L), Code , JACKSON IMMUNO RESEARCH LABORATORIES INC., Baltimore (USA)

89 86 3. Material und Methoden 4. Inkubation mit Konjugat Die Konjugatgebrauchslösung (1:60) wurde mit PBS hergestellt und Evans Blau zur Gegenfärbung verwendet (20 µl Konjugat wurden mit 1,12 ml PBS und 60 µl Evans- Blau-Lösung vermischt). Je 10 µl der Konjugatverdünnung wurden auf jedes Objektträgerfeld gegeben, worauf eine erneute Inkubation für 45 Minuten bei 37 C in der feuchten Kammer erfolgte. 5. Spülen und Waschen der Objektträger Siehe Punkt Eindecken der Objektträger Nachdem die Objektträger am Rand trockengewischt waren, wurden sie mit Eindeckmedium und mit einem großen Deckgläschen abgedeckt. Die Objektträger wurden bis zur Auswertung im Kühlschrank dunkel aufbewahrt. 7. Auswertung Die Auswertung erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung, wobei folgende Einteilung vorgenommen wurde: Positive Reaktion: Leuchtend grüne Fluoreszenz Der jeweilige Endtiter entspricht der Serumverdünnung, bei der noch mehr als 50 % der Tachyzoiten eine leuchtend grüne Fluoreszenz zeigen. Negative Reaktion: Rötliche Färbung (Evans Blau) bei der überwiegenden Mehrzahl der Tachyzoiten. Markierung an einem Pol der Parasiten wird als unspezifisch bewertet SFT zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii Untersuchungsgut Insgesamt wurden 291 der 299 Hundeseren im SFT auf Toxoplasma-Antikörper getestet. Alle Seren wurden zuvor hitzeinaktiviert bei 56 C für 60 Minuten.

90 3. Material und Methoden Herstellung des Antigens (Toxoplasma-Suspension, Exsudat) Zur Gewinnung der Toxoplasma-Suspension wurden Mäuse 29 mit etwa 2,5 x 10 6 Tachyzoiten 30 in steriler, physiologischer Kochsalzlösung i. p. infiziert. Etwa 48 Stunden p. i. wurde aus der Bauchhöhle der getöteten Tiere nach Spülung mit ca. 2 ml PBS das Exsudat entnommen. Jedes einzelne Exsudat wurde zunächst mikroskopisch kontrolliert. Das gesammelte Exsudat enthielt ca. 20 x 10 6 Toxoplasmen pro ml Aktivatorserum Das Aktivatorserum stammte von einer Toxoplasma-negativen Person, deren Serum zuvor im SFT auf seine lytische Funktion getestet worden war. In Vortesten wurde sichergestellt, dass das Serum im SFT keine falsch positiven Reaktionen verursachen kann Testdurchführung Vorversuch zur Prüfung des Toxoplasma-Exsudates In einem Vorversuch mit bekannt positivem (Standardserum) und negativem Serum wurde kontrolliert, ob mit dem gewonnenen Exsudat der vorgeschriebene Endtiter von 1:4000 erreicht wird und das negative Serum keine Zytolyse induziert. Bei diesem Ansatz wurde das Exsudat einmal unverdünnt und einmal in einer Verdünnung von 1:2 ausgetestet. Die Testdurchführung erfolgte in Mikrotiterplatten: Vorlegen der Kontrollseren: In Reihe 1, 2 und 3, 4 wurden in der ersten Vertiefung (A) je 50 µl positives 31 oder negatives Kontrollserum 32 vorgelegt. In die Vertiefungen B-H wurde zuerst je 25 µl PBS pipettiert, danach je 50 µl Aktivator eingefüllt. Die Serumverdünnung erfolgte von Reihe A-H mit jeweils 25 µl. 29 Stamm NMRI, ca. 10 Wochen alt 30 Stamm BK 31 Serum von Hund Nr Serum von Hund Nr. 77

91 88 3. Material und Methoden Nach der Serumverdünnung gab man 50 µl Aktivator in Reihe A hinzu. Abschließend wurde in jede Vertiefung 25 µl Toxoplasma-Exsudat unverdünnt (Reihe 1, 3) oder 1:2 verdünnt (Reihe 2, 4) pipettiert. Bei jedem Testansatz wurde eine Aktivator-Exsudat-Kontrolle mitgeführt, die 25 µl PBS anstelle von Serum enthielt. Die Mikrotiterplatte wurde mit Klebefolie 33 verschlossen, kurz auf den Rüttler 34 gelegt und danach für 30 Minuten in einem 37 C warmen Wasserbad inkubiert. Als Indikator wurden dann in jede Vertiefung ca. 25 µl der gebrauchsfertigen Methylenblaulösung eingetropft. Nach kurzer Einwirkungszeit und Mischen mittels einer Pasteurpipette wurde pro Serumverdünnungsstufe je ein Tropfen der Suspension (ca. 10 µl) auf einen Objektträger gebracht und mikroskopisch 35 ausgewertet (Objektiv 40x). Als positiv galt die Serumverdünnungsstufe, bei der die Anzahl der ungefärbten Tachyzoiten mehr als 50 % betrug. Für den Hauptversuch wurde diejenige Exsudat-Verdünnung ausgewählt, mit der das Standardserum den vorgeschriebenen Endtiter von 1:4000 erreichte Hauptversuch Der Hauptversuch wurde ähnlich dem Vorversuch durchgeführt. Neben dem Standardserum wurden jeweils 50 µl der unverdünnten Hundeseren in Reihe A pipettiert. Von dort wurden 4-er Verdünnungsreihen (1:4, 1:16, 1:64, 1:256, 1:1024 und 1:4096) hergestellt. Das Standardserum wurde bei jedem Testansatz mitgeführt ebenso wie eine Aktivator-Exsudat-Kontrolle. Diese enthielt 25 µl PBS anstelle von Serum Auswertung Wie im Vorversuch beschrieben wurden von jeder Verdünnungsstufe ca. 10 µl gefärbte Suspension mikroskopisch ausgewertet. Es wurden mehrere Gesichtsfelder durchmustert (Objektiv 40x) und das Verhältnis von gefärbten zu ungefärbten Tachyzoiten bestimmt. Die negative (Antigen-Aktivator-)Kontrolle soll nicht mehr als 33 Plate Sealing Tape, ICN BIOMEDICALS INC., Kalifornien (USA) 34 MS 1 Minishaker, IKA-WORKS INC., Wilmington, North Carolina (USA) 35 LEITZ, Wetzlar

92 3. Material und Methoden % ungefärbte Zellen (d. h. positiv reagierende Tachyzoiten) enthalten. Das positive Kontrollserum musste einen klaren Übergang von annähernd 100 % ungefärbten Tachyzoiten zu einwandfrei negativer Reaktion (d. h. blau gefärbte Tachyzoiten) innerhalb von drei Verdünnungsstufen zeigen. Als SFT-Titer wurde diejenige Verdünnungsstufe angegeben, in der die Zahl der ungefärbten Toxoplasmen noch mehr als 50 % betrug Beurteilung der Seren Die Ergebnisse von SFT und IFAT bildeten die Grundlage für eine abschließende Beurteilung der Seren hinsichtlich der Seropositivität für T. gondii nach dem in Tab aufgeführten Schema. Tab Beurteilung der Seren nach SFT und IFAT hinsichtlich der Seropositivität für T. gondii SFT IFAT Beurteilung Negativ Negativ Negativ Nicht durchgeführt Negativ 1:16 1:4 Negativ 1:4 Nicht durchgeführt 1:16 Negativ Negativ Negativ 1:64 trace bis 1:256 Fraglich 1:4 1:64 trace bis 1:64 1:64 bis 1:256 Negativ 1:16 1:64 trace und >1:64 Positiv Vorversuche zur Untersuchung der Kotproben Um festzustellen, welche Methode und welche Flotationslösung am besten geeignet sind, Oozysten von Angehörigen der Isosporidae/Toxoplasmatinae im Hundekot nachzuweisen, wurden Vorversuche durchgeführt. Dabei fand der Vergleich zwischen der Flotation in gesättigter Zinksulfatlösung mit Zentrifugation und der

93 90 3. Material und Methoden Flotation in gesättigter Zinksulfatlösung im Ovassay 36 verschiedenen Oozystenzahlen vermischt wurde. statt, wobei Hundekot mit Präparation des Kotes Für die Vorversuche wurde Hundekot verwendet, dessen parasitologische Untersuchung mittels Flotation in gesättigter Zinksulfatlösung mit Zentrifugation negativ war. Etwa 2 g dieses Kotes wurden mit 1 x 10 4, 1 x 10 3, 5 x 10 2, 3 x 10 2 oder 1 x 10 2 unsporulierten Oozysten von H. hammondi, die von Mai bis August 1998 im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover gewonnen wurden, vermischt. Da sich H.-hammondi-Oozysten morphologisch kaum von N.-caninum- Oozysten unterscheiden, wurden für die Vorversuche H.-hammondi-Oozysten verwendet, die in großer Anzahl vorhanden waren Flotationslösungen Es wurden vier verschiedene Flotationslösungen mit unterschiedlichen Dichten verglichen. Tab Flotationslösungen Flotationslösung Dichte (g/cm 3 ) gesättigte Zinksulfatlösung 1,315 gesättigte Kochsalzlösung 1,196 Zuckerlösung 1,183 Kochsalz-Zucker-Lösung 1, Flotation mit Zentrifugation Für jede Oozystenanzahl und jede Flotationslösung wurde die im Folgenden beschriebene Methode durchgeführt. Etwa 2 g Kot wurden mit einer bestimmten Oozystenzahl im Mörser vermischt. Danach erfolgten die Zugabe von Flotationslösung zu diesem Kot und eine gründliche Vermischung mittels Pistill zu einer möglichst homogenen Suspension. Die gesamte Kotsuspension wurde durch ein Teesieb und einen Trichter in ein 36 Parasiten-Diagnose-System, JANSSEN-CILAG, Neuss

94 3. Material und Methoden 91 Zentrifugenröhrchen überführt und 10 Minuten bei 1500 g zentrifugiert 37. Anschließend wurden von der Flüssigkeitsoberfläche mit einer rechtwinklig abgebogenen Drahtöse mehrere Tropfen entnommen, auf einen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt und bei 160facher Vergrößerung mikroskopisch 38 untersucht Flotation im Ovassay Für jede Oozystenanzahl und jede Flotationslösung wurde die im Folgenden beschriebene Methode durchgeführt. Etwa 2 g Kot wurden mit einer bestimmten Oozystenzahl im Sammelbehälter des Parasiten-Diagnose-Systems mithilfe eines Holzstäbchens vermischt. Danach wurde der Sammelbehälter etwa zur Hälfte mit Flotationslösung gefüllt und der Kot mit der Flotationslösung durch Umrühren mit dem dem Parasiten-Diagnose-System beigefügten Einmal-Holzstäbchen gründlich vermischt. Nach Einsetzen des Spezialfilters in den Sammelbehälter wurde dieser soweit mit Flotationslösung aufgefüllt, dass sich ein konvexer Meniskus am inneren oberen Filterrand bildete. Nach Auflegen eines 22 x 22 mm 2 großen Deckgläschens blieb der Ansatz 15 bis 20 Minuten zur Flotation stehen. Das Deckgläschen wurde auf einen Objektträger überführt und bei 160facher Vergrößerung mikroskopisch untersucht Untersuchung der Kotproben Aufgrund der Ergebnisse der Vorversuche wurde ein Flotationsverfahren in gesättigter Kochsalzlösung in einem Ovassaygefäß durchgeführt Gewinnung von Kotproben für den Ovassay Kotproben wurden rektal entnommen oder durch den Hundebesitzer aufgesammelt Untersuchung der Kotproben Die Kotproben wurden in der Regel an dem Tag untersucht, an dem sie von den Patientenbesitzern abgegeben oder von den Patienten durch rektale Entnahme 37 Labofuge 6000, HERAEUS, Osterode 38 Standardmikroskop, ZEISS, Oberkochen

95 92 3. Material und Methoden gewonnen wurden. In seltenen Fällen wurden sie einen Tag bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Durchführung der Flotation entspricht der in den Vorversuchen verwendeten Methode. Die mikroskopische Untersuchung 39 erfolgte bei 200facher Vergrößerung für mindestens 15 Minuten Auswertung der erhobenen Daten Die Daten aus den Fragebögen wurden unabhängig von zwei verschiedenen Personen in eine Excel 40 -Tabelle eingegeben, um mögliche Eingabefehler oder interpretationsbedingte falsche Eingaben zu vermeiden. Anschließend wurden die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen und der Kotproben in diese Tabelle eingefügt. Die Auswertung der erhobenen Daten erfolgte mithilfe des Computer- Programmpaketes SAS 41. Die Anzahl der in die statistischen Auswertungen einbezogenen Daten schwankte von Parameter zu Parameter, da nicht von allen Tieren Daten zu allen einzelnen Parametern vorhanden waren. Da im Fragebogen die Parameter Gewicht und Schulterhöhe des Hundes nicht erfragt wurde, wurden sie hinterher erzeugt, indem ich von Standardgewichten und -größen ausging, die zunächst dem Buch Hunderassen von ALDERTON (1995) entnommen wurden. Fand ich dort keine Angaben, wurden die in den Standards der Fédération Cynologique Internationale (FCI) vorkommenden Werte verwendet. Die noch fehlenden Angaben wurden mit Werten aus dem Buch Hunderassen und ihr Idealgewicht von PEUKERT und JUNHOLD (1996) ergänzt. Die zuletzt noch fehlenden Werte der Rassen Alpenländische Dachsbracke, Altdeutscher Langhaarschäferhund sowie Deutsch Kurzhaar wurden auf der Internetseite Alle Hunderassen im Überblick (ZECHMANN ) nachgeschlagen. Im Fragebogen wurden Angaben zur Postleitzahl des Wohnortes der Hundebesitzer gemacht. Aufgrund dieser und der im Befundbogen gemachten Angaben wurden Rückschlüsse auf den Wohnort der Hundebesitzer gezogen. Mithilfe von Daten, die vom Bundesamt für Bauordnung und Raumwesen in Bonn stammten, wurden die 39 Mikroskop aus Jena, Nr. M , hergestellt in der DDR, 220 V, 15 W 40 Microsoft Excel 2002 ( ) SP-2, MICROSOFT CORPORATION, Redmond, Washington (USA) 41 Software Release 8.2 (TS2M0), SAS INSTITUTE INC., Cary, North Carolina (USA)

96 3. Material und Methoden 93 Einwohnerzahl und die Fläche der einzelnen Orte ermittelt. Hieraus konnte ich die Bevölkerungsdichte, d. h. EW pro km 2, errechnen. Es wurden mit der Prozedur SAS-FREQ Kontingenztafeln erstellt. Das OR zwischen den einzelnen Zeilen der Kontingenztafeln wurde berechnet. Es ist definiert als das Verhältnis von Exponierten zu Nicht-Exponierten bei seropositiven zum Verhältnis von Exponierten zu Nicht-Exponierten bei seronegativen Hunden. Asymptotische Konfidenzintervalle für das OR wurden nach der Methode von Wald berechnet. Falls der Wert eines Feldes 0 betrug, wurde das OR nicht bestimmt. Bei der Auswertung der einzelnen Parameter wurden die Hunde möglichst so in Gruppen eingeteilt, dass die Gruppen biologisch sinnvoll erschienen und dass die Größe in den einzelnen Feldern der Kontingenztafel möglichst gleich groß war. Da nur 13 seropositive Hunde vorhanden waren, waren die erwarteten Häufigkeiten in einem oder mehreren Feldern oft sehr klein. Lagen sie bei Werten von 1 oder kleiner, wurde auf eine statistische Prüfung verzichtet. Ansonsten wurde mit dem exakten Test von Fisher die Homogenität der Verteilung in den einzelnen Gruppen überprüft. Die Differenzen in den Mittelwerten der quantitativen Merkmale Alter und Gewicht zwischen seropositiven und seronegativen Hunden wurden mithilfe des t-testes verglichen.

97 94 4. Ergebnisse 4. ERGEBNISSE 4.1. Fluoreszenz im Neospora-IFAT Die Abb zeigt Fotos vom durchgeführten Neospora-IFAT mit verschiedenen Fluoreszenzstärken und deren Beurteilung. 3+: Der gesamte Parasit fluoresziert. 2+: Die Zellwand des Parasiten fluoresziert stark. 1+: Die Zellwand des Parasiten fluoresziert. Abb Fotos verschiedener Fluoreszenzstärken und deren Beurteilung.

98 4. Ergebnisse 95 Trace: Die Zellwand des Parasiten fluoresziert nur schwach. Trace: Nur die Polkappen fluoreszieren. Negativ: Keine Fluoreszenz. Abb Fotos verschiedener Fluoreszenzstärken und deren Beurteilung (Fortsetzung).

99 96 4. Ergebnisse 4.2. Untersuchung von Serumproben auf Neospora-Antikörper Insgesamt wurden 299 Seren untersucht. Von diesen Seren konnten 292 endgültig bewertet werden. Die Ergebnisse sind in Tab aufgeführt. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurden alle Seren, die keine Reaktion zeigten, als trace beurteilt wurden oder einen Titer von 1:25 hatten, zur negativen Gruppe zusammengefasst. Somit waren 279 Seren (95,55 %) negativ und 13 Seren (4,45 %) positiv. Von den positiven Seren wiesen fünf einen Titer von 1:50, drei einen Titer von 1:100, je eines einen Titer von 1:200 oder 1:400 sowie drei einen Titer von 1:800 auf. Zu den 292 bewerteten Serumproben lagen 256 beantwortete Fragebögen vor. Es fehlten 36 Fragebögen zu negativen Seren. Tab Häufigkeit der verschiedenen Titer bei den bewerteten Seren Titer Anzahl Relative Häufigkeit (n) (%) Kein 69 23,63 Trace 1: ,71 Trace 1: ,97 Trace 1: ,22 1: ,01 1:50 5 1,71 1: ,03 1: ,34 1: ,34 1: , Zusammenhang zwischen den Eingangsdiagnosen und Neospora- Infektionen Zu 281 der 292 bewerteten Seren war die Eingangsdiagnose der Hunde bekannt. Es fehlten die Eingangsdiagnosen von zehn Hunden der negativen Gruppe sowie von einem Hund der positiven Gruppe. Zu den fünf Hunden, deren Seren mit 1:50 bewertet wurden, gab es folgende Eingangsdiagnosen: zweimal Pyo- oder Mucometra sowie je einmal Kastration Hündin, gutartiger Mammatumor und Zahnstein oder Zahnsanierung. Die drei Hunde mit einem Serumtiter von 1:100 hatten folgende Eingangsdiagnosen: zweimal gutartiger Hauttumor sowie einmal Leishmaniose. Der mit 1:200 bewertete Hund litt

100 4. Ergebnisse 97 an einer Gastroenteritis. Das Serum mit einem Titer von 1:400 stammte von einem Hund mit unbekannter Eingangsdiagnose. Die drei Hunde mit einem Serumtiter von 1:800 hatten folgende Eingangsdiagnosen: Otitis, Chalazion sowie gutartiger Zehentumor Zusammenhang zwischen dem Alter der Hunde und Neospora- Infektionen Zu allen Hunden lag eine Altersangabe vor. Der jüngste untersuchte Hund war 4 Monate, der älteste 15 Jahre alt. Das durchschnittliche Alters aller Hunde lag bei 68,04 ± 45,79 Monaten (arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung). Der jüngste positive Hund war 3, der älteste 13,5 Jahre alt. Der jüngste negative Hund war 4 Monate, der älteste 15 Jahre alt. Im t-test waren die negativen Hunde mit 66,95 ± 46,08 Monaten nicht signifikant (p=0,0583) jünger als die positiven Hunde mit 91,54 ± 31,98 Monaten. Ich unterteilte die Hunde in zwei Altersgruppen: junge Hunde, d. h. Hunde bis 3 Jahre, und alte Hunde, d. h. Hunde, die 3 Jahre und älter waren. Bei den jungen Hunden fand ich mittels Fisher s exaktem Test mit 0 % (keiner von 101 Hunden) eine statistisch signifikant (p=0,0053) niedrigere Seroprävalenz als bei alten Hunden. Hier betrug die Seroprävalenz 6,81 % (13 von 191 Hunden).

101 98 4. Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Rasse der Hunde und Neospora- Infektionen Von den 292 bewerteten Seren war in 291 Fällen die Rasse des Hundes, von dem das Serum stammte, bekannt. Die Hunde, deren Seren bewertet wurden, gehörten 53 verschiedenen FCI-anerkannten Rassen, den nicht FCI-anerkannten Rassen Altdeutscher Langhaarschäferhund und Pitbull sowie den Kategorien Mischlinge bis 20 kg und Mischlinge über 20 kg an. Tab zeigt, welchen Rassen die positiven Hunde angehörten. Tab Rassen der positiven Hunde Titerhöhe Anzahl Rassen (n) 1:800 3 Mischling über 20 kg Rauhaardackel Rottweiler 1:400 1 Boxer 1:200 1 Mischling bis 20 kg 1:100 3 Deutsch Kurzhaar Dobermann Mischling über 20 kg 1:50 5 Golden Retriever (2x) Hovawart Mischling über 20 kg Setter Zusammenhang zwischen der FCI-Gruppenzugehörigkeit der Hunde und Neospora-Infektionen Die Rassen wurden, sofern es sich nicht um Mischlinge oder nicht FCI-anerkannte Rassen handelte, entsprechend Ihrer FCI-Sektions- und -Gruppenzugehörigkeit in 20 verschiedene Gruppen eingeteilt (Tab. 4.3.). Weil die Gruppengröße zu klein war, wurde auf Signifikanzprüfung zwischen diesen Gruppen verzichtet. Die Berechnungen des OR finden sich im Anhang 9.8. wieder.

102 4. Ergebnisse 99 Tab Verteilung seropositiver und seronegativer Hunde in Abhängigkeit von der Rasse und FCI-Gruppenzugehörigkeit Gruppe Rassen Seronegative Hunde Seropositive Hunde Anzahl Relative Häufigkeit Anzahl Relative Häufigkeit (n) (%) (n) (%) Schäferhunde Amerikanisch-kanadischer Weißer Schäferhund, Belgischer Schäferhund, Bobtail, Border Collie, Collie, Deutscher Schäferhund, Kuvasz ,00 0 0,00 Treibhunde Bouvier des Flandres 1 100,00 0 0,00 Pinscher Dobermann 2 66, ,33 Schnauzer Riesenschnauzer, Schnauzer, Zwergschnauzer 7 100,00 0 0,00 Doggenartige Hunde Boxer, Deutsche Dogge, Rottweiler 6 75, ,00 Berghunde Hovawart, Neufundländer 7 87, ,50 Schweizer Sennenhunde Berner Sennenhund, Entlebucher Sennenhund 7 100,00 0 0,00 Terrier Airdaleterrier, Amerikanischer Staffordshire-Terrier, Cairn-Terrier, Jack-Russell-Terrier, Welsh Terrier, West Highland White Terrier, Yorkshireterrier ,00 0 0,00 Dachshunde Dackel 5 83, ,67 Nordische Schlittenhunde Alaskan Malamute, Siberian Husky 7 100,00 0 0,00 Europäische Spitze Wolfsspitz 1 100,00 0 0,00 Asiatische Spitze Akita Inu, Chow Chow 2 100,00 0 0,00

103 Ergebnisse Tab Verteilung seropositiver und seronegativer Hunde in Abhängigkeit von der Rasse und FCI-Gruppenzugehörigkeit (Fortsetzung) Gruppe Rassen Seronegative Hunde Seropositive Hunde Anzahl Relative Häufigkeit Anzahl Relative Häufigkeit (n) (%) (n) (%) Lauf- und Schweißhunde Alpenländische Dachsbracke, Bayrischer Gebirgsschweißhund, Beagle, Dalmatiner, Rhodesian Ridgeback 9 100,00 0 0,00 Vorstehhunde Deutsch Drahthaar, Deutsch Kurzhaar, Deutsch Langhaar, Kleiner Münsterländer, Setter 12 85, ,29 Apportierhunde Golden Retriever, Labrador Retriever 22 91,67 2 8,33 Stöberhunde Cockerspaniel, Deutsch Wachtel, English Springer Spaniel 5 100,00 0 0,00 Gesellschafts- und Begleithunde Französische Bulldogge, Lhasa Apso, Maltester, Pekinese, Pudel, Tibetspaniel ,00 0 0,00 Nicht-FCIanerkannte Rassen Altdeutscher Langhaarschäferhund, Pitbull 6 100,00 0 0,00 Mischlinge bis 20 kg Mischlinge bis 20 kg 43 97,73 1 2,27 Mischlinge über 20 kg Mischlinge über 20 kg 65 95,59 3 4,41

104 4. Ergebnisse Zusammenhang zwischen dem Gewicht und der Schulterhöhe der Hunde und Neospora-Infektionen Bezüglich des Gewichtes waren 291 Angaben zu den 292 bewerteten Hunden vorhanden. Ich hatte bei 179 Hunden konkrete Gewichtsangaben, bei den 112 Mischlingen, wusste ich, dass 44 unter 20 kg und 68 über 20 kg wogen. Das Durchschnittsgewicht aller 179 Hunde mit konkreten Gewichtsangaben lag bei 24,68 ± 12,94 kg. Der leichteste positive Hund wog 9 kg, der schwerste 35 kg. Der leichteste negative Hund wog 2,5 kg, der schwerste 59 kg. Die Gewichtsunterschiede zwischen positiven (28,83 ± 7,79 kg) und negativen Hunden (24,46 ± 13,13 kg) waren im t-test nicht signifikant (p=0,3243). Um auch die Mischlinge mit in die Untersuchung des Gewichtseinflusses einzubeziehen, unterteilte ich die Hunde in Gruppen unter 20 kg und über 20 kg. In der Gruppe der Hunde unter 20 kg waren 1,94 % (zwei von 103 Hunden) seropositiv, in der Gruppe der Hunde über 20 kg lag die Seroprävalenz bei 5,85 % (elf von 188 Hunden). Diese Unterschiede waren nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Bezüglich der Schulterhöhe gab es 179 Angaben zu den 292 bewerteten Seren. Der kleinste positive Hund war 35 cm hoch, der größte 67 cm. Der kleinste negative Hund war 20 cm hoch, der größte 83 cm. Ich unterteilte ich die Hunde in Anlehnung an das Buch Hunderassen von ALDERTON (1995) in Hunde bis 46 cm Widerristhöhe (kleine Hunde), Hunde mit einer Widerristhöhe von 46 bis 61 cm (mittelgroße Hunde) und Hunde mit einer Widerristhöhe über 61 cm (große Hunde) und erhielt die in Abb dargestellte Verteilung der Hunde. Von den kleinen Hunden waren 1,75 % (einer von 57 Hunden), von den mittelgroßen Hunden 3,70 % (drei von 82 Hunden) und von den großen Hunden 12,50 % (fünf von 40 Hunden) positiv. Die Unterschiede in den Gruppen waren nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Die genauen statistischen Berechnungen bezüglich des Gewichts und der Schulterhöhe befinden sich im Anhang 9.8. wieder.

105 Ergebnisse Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 98,25 96,34 1,75 3,66 87,50 12,50 kleine Hunde (<46 cm) mittelgroße Hunde (46-61cm) große Hunde (>61 cm) n=57 n=82 n=40 31,84 % 45,81 % 22,35 % Größenkategorie (Schulterhöhe der Hunde) Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Schulterhöhe der Hunde Zusammenhang zwischen dem Geschlecht der Hunde und Neospora- Infektionen Es stammten 108 Serumproben (36,99 %) von unkastrierten Rüden, 31 Proben (10,62 %) von kastrierten Rüden, 111 Proben (38,01 %) von unkastrierten Hündinnen sowie 42 Proben (14,38 %) von kastrierten Hündinnen. Ich konnte mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied in der Seroprävalenz zwischen männlichen und weiblichen Hunden feststellen. Weibliche Hunde reagierten mit 6,54 % (zehn von 153 Tieren) etwas häufiger positiv als männliche Hunde (2,16 %, drei von 139 Tieren). Es wurden 219 Serumproben (75 %) von unkastrierten sowie 73 Proben (25 %) von kastrierten Hunden gewonnen. Untersuchte ich, ob die Kastration einen Einfluss auf die Seroprävalenz hat, fand ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied zwischen kastrierten und unkastrierten Hunden. Kastrierte Hunde waren mit 5,48 % (vier von 73 Hunden) nur geringgradig häufiger seropositiv als nichtkastrierte Hunde mit 4,11 % (neun von 219 Hunden).

106 4. Ergebnisse 103 Ferner gab es in Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied zwischen kastrierten und unkastrierten Hündinnen. Es waren 7,14 % der kastrierten Hündinnen (drei von 42) und 6,31 % der unkastrierten Hündinnen (sieben von 111) seropositiv. Bei den Rüden waren 3,23 % der kastrierten Tiere (einer von 31 Hunden) und 1,85 % der unkastrierten Rüden (zwei von 108 Hunden) seropositiv. Hier wurde aufgrund zu kleiner Gruppen auf statistische Berechnungen verzichtet. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder Zusammenhang zwischen dem Herkunftsland der Hunde und Neospora-Infektionen Zu 255 der 292 bewerteten Seren lag eine Angabe zum Herkunftsland vor. Es kamen 223 Hunde (87,45 %) aus Deutschland, fünf Hunde (1,96 %) aus Spanien, vier Hunde (1,57 %) aus den Niederlanden, drei Hunde (1,18 %) aus Griechenland, zwei Hunde (0,78 %) aus Österreich sowie jeweils ein Hund (0,39 %) aus Belgien, Nigeria, Polen, Thailand, Türkei und Ungarn. Zwölf Hunde (4,71 %) hatten ein unbekanntes Herkunftsland. Es waren ein Hund mit Herkunftsland Polen, einer von vier Hunden mit Herkunftsland Niederlande, einer von fünf Hunden mit Herkunftsland Spanien sowie zehn von 223 Hunden mit Herkunftsland Deutschland seropositiv. Die Hunde, die aus den übrigen Herkunftsländern stammten, hatten keine positiven Serumproben. Der einzige aus Polen stammende Hund war seropositiv mit einem Titer von 1:100. Aufgrund der geringen Tierzahl in dieser Gruppe wurde auf eine statistische Prüfung der Unterschiede zwischen der Seroprävalenz von Hunden aus Polen und Hunden aus anderen Ländern verzichtet. Unterteilte ich die Hunde nach ihrem Herkunftsland in zwei Gruppen, indem ich die Hunde, die aus Deutschland stammten, mit den Hunden verglich, die ein unbekanntes oder anderes Herkunftsland als Deutschland hatten, waren 4,8 % der Hunde mit Herkunftsland Deutschland (zehn von 223 Hunden) und 9,38 % der Hunde mit unbekanntem oder anderem Herkunftsland (drei von 32 Hunden) seropositiv. Diese Unterschiede waren nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder.

107 Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Herkunftsstätte der Hunde und Neospora-Infektionen Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Informationen über die Herkunftsstätte vor. Die Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Herkunftsstätte ist in Abb dargestellt. Bezüglich der Seroprävalenz ließ sich mittels Fisher s exaktem Test kein signifikanter Zusammenhang zur Herkunftsstätte finden. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Abb ,23 93,67 eingetragener Züchter 5,77 6,33 Zufallswurf (privat) 97,96 2,04 Tierheim/ Fundtier 90,91 9,09 geplanter privater Wurf 100,00 Tierhandlung 28,57 0,00 0,00 andere n=104 n=79 n=49 n=11 n=3 n=7 41,11 % 31,23 % 19,37 % 4,35 % 1,19 % 2,77 % Herkunftsstätte Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Herkunftsstätte der Hunde.

108 4. Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Haltungsart der Hunde und Neospora- Infektionen Zu 256 der 292 bewerteten Hunde lagen Informationen zur Haltungsart vor. Die Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Haltungsart ist in Abb dargestellt. In Fisher s exaktem Test gab es keinen signifikanten Zusammenhang zwischen Seroprävalenz und Haltung der Hunde. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Abb ,00 5,00 100,00 0,00 84,62 15,38 Wohnung/ Haus Zwinger Gehöft/ Bauernhof 100,00 100,00 Wohnung/ Haus und Gehöft/ Bauernhof 0,00 0,00 überwiegend im Freien n=220 n=9 n=13 n=13 n=1 85,94 % 3,52 % 5,08 % 5,08 % 0,39 % Haltungsart Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit in Abhängigkeit von der Haltungsart der Hunde Zusammenhang zwischen dem Wohnort der Hundebesitzer und Neospora-Infektionen Zu 283 der 292 bewerteten Hunde war die Postleitzahl des Wohnortes und zu 265 der Wohnort der Hundebesitzer bekannt. Die Tab zeigt die Verteilung Neospora-positiver und Neospora-negativer Hunde in Abhängigkeit von den einzelnen Wohnorten. Fasste ich die Orte nach der Einwohnerzahl zusammen, ergab sich die in Abb dargestellte Situation. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen Seroprävalenz von N.-caninum-Infektionen bei Hunden und Wohnort oder Stadtgröße in Fisher s exaktem Test. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder.

109 Ergebnisse Tab Verteilung seropositiver und seronegativer Hunde in Abhängigkeit von den einzelnen Wohnorten Wohnort Seronegative Hunde Seropositive Hunde Anzahl Relative Häufigkeit Anzahl Relative Häufigkeit (n) (%) (n) (%) Waldbreitbach 0 0, ,00 Thür 1 50, ,00 Weißenthurm 3 60, ,00 Oberzissen 2 66, ,33 Bassenheim, Ochtendung 4 80, ,00 Burgbrohl 7 87, ,50 Koblenz 10 90,91 1 9,09 Kruft 11 91,67 1 8,33 Andernach 41 97,62 1 2,38 Plaidt ,00 0 0,00 Mendig ,00 0 0,00 Mülheim-Kärlich 9 100,00 0 0,00 Neuwied, Polch 8 100,00 0 0,00 Saffig 7 100,00 0 0,00 Mayen, Nickenich 6 100,00 0 0,00 Kobern-Gondorf, Wehr 5 100,00 0 0,00 Bad Breisig, Bell, Kempenich, 4 100,00 0 0,00 Münstermaifeld Kettig, Kottenheim, Niederzissen, Remagen, 3 100,00 0 0,00 Weibern Binningen, Düngenheim, Ettringen, Kaifenheim, Kretz, Laubach, Mertloch, Niederdürenbach, Sinzig, Spessart, Vallendar, Wassenach, Welling 2 100,00 0 0,00 Brohl-Lützing, Budenheim, Dieblich, Engeln, Gappenach, Hausten, Kaisersesch, Kaltenengers, Kehrig, Klotten, Königsfeld, Langenfeld, Leienkaul, Leubsdorf, Leutesdorf, Lonnig, Moers, Monreal, Naunheim, Pleitersheim, Rüber, Schalkenbach, Schleiden, Simmern, St. Sebastian, Urmitz, Weiler 1 100,00 0 0,00

110 4. Ergebnisse 107 Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 96,55 93,75 96,20 98,00 3,45 6,25 3,80 2,00 91,67 8,33 Dorf Landstadt Kleinstadt Mittelstadt Großstadt < n=58 n=64 n=79 n=50 n=12 22,05 % 24,33 % 30,04 % 19,01 % 4,56 % Stadttyp Einwohnerzahl (EW) Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Stadtgröße, in der die Hunde lebten.

111 Ergebnisse Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde und Neospora- Infektionen Auslauf im Garten Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über den Auslauf im Garten vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit vom Auslauf im Garten. In Fisher s exaktem Test bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde im Garten und der Seroprävalenz von N. caninum. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 100,00 0,00 92,50 7,50 98,04 1,96 93,33 6,67 100,00 niemals manchmal häufig immer häufig bis immer n=25 n=40 n=51 n=135 n=2 Auslauf im Garten Anzahl (n) 0,00 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit vom Auslauf der Hunde im Garten.

112 4. Ergebnisse Auslauf in öffentlichen Grünanlagen Zu 230 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über den Auslauf der Hunde in öffentlichen Grünanlagen vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit vom Auslauf in öffentlichen Grünanlagen. In Fisher s exaktem Test bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde in öffentlichen Grünanlagen und der Seroprävalenz von N. caninum. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 94,55 5,45 98,28 96,30 1,72 3,70 91,43 8,57 0,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=110 n=58 n=27 n=35 n=0 Auslauf in öffentlichen Grünanlagen Anzahl (n) 0,00 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit vom Auslauf der Hunde in öffentlichen Grünanlagen.

113 Ergebnisse Auslauf im Wald Zu 241 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über den Auslauf im Wald vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit vom Auslauf im Wald. In Fisher s exaktem Test bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auslauf der Hunde im Wald und der Seroprävalenz von N. caninum. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 90,00 10,00 95,71 94,29 4,29 5,71 98,31 100,00 1,69 0,00 niemals manchmal häufig immer häufig bis immer n=40 n=70 n=70 n=59 n=2 Auslauf im Wald Anzahl (n) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit vom Auslauf der Hunde im Wald.

114 4. Ergebnisse Auslauf im Feld Zu 249 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über den Auslauf im Feld vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit vom Auslauf im Feld. In Fisher s exaktem Test bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auslauf im Feld und der Seroprävalenz von N. caninum. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 87,50 12,50 97,50 2,50 92,11 7,89 96,43 3,57 100,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=16 n=40 n=76 n=112 n=2 Auslauf im Feld Anzahl (n) 0,00 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit vom Auslauf der Hunde im Feld Auslauf auf befestigten Wegen (Stadt/Dorf) Zu 246 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über den Auslauf auf befestigten Wegen in der Stadt oder im Dorf vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit vom Auslauf auf befestigten Wegen in der Stadt oder im Dorf. In Fisher s exaktem Test bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Häufigkeit des Auslaufes auf befestigten Wegen und der Seroprävalenz von N. caninum. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder.

115 Ergebnisse Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 92,00 8,00 95,77 94,12 95,83 4,23 5,88 4,17 100,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=50 n=71 n=51 n=72 n=2 Auslauf auf befestigten Wegen (Stadt/Dorf) Anzahl (n) 0,00 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit vom Auslauf der Hunde auf befestigten Wegen Andere Auslaufmöglichkeiten Als weitere Auslaufsmöglichkeiten wurden der Auslauf im Hof (zweimal negativ/keine Reaktion, einmal trace bei 1:50, einmal Titer 1:50, einmal Titer 1:800), der Hundeplatz (zweimal Titer 1:25, einmal trace bei 1:50), der Auslauf im Reitstall (zweimal negativ, einmal trace bei 1:50), der Auslauf auf dem Gelände einer Autowerkstatt (einmal Titer 1:50), der Auslauf durch Schwimmen (einmal trace bei 1:50), der Auslauf im Tierheim (einmal trace bei 1:25) sowie der Auslauf auf dem Zimmereigelände (einmal trace bei 1:25) genannt. Da diese Kategorien sehr selten genannt wurden, wurde auf eine statistische Auswertung dieser Daten verzichtet Zusammenhang zwischen einer jagdlichen Führung der Hunde und Neospora-Infektionen Zu 255 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben darüber vor, ob sie jagdlich geführt wurden oder nicht. Zehn Hunde (3,92 %) wurden jagdlich geführt, die restlichen 245 Hunde (96,08 %) nicht. Von den jagdlich geführten Hunden war einer (10,00 %), von den Hunden, die nicht jagdlich geführt wurden, waren zwölf (4,90 %) seropositiv. Die Berechnungen des OR finden sich im Anhang 9.8. wieder.

116 4. Ergebnisse Zusammenhang zwischen einer gleichzeitigen Haltung anderer Tiere und Neospora-Infektionen Die Tab zeigt die Verteilung negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Haltung anderer Tiere. Fasste ich die Haushalte, in denen die untersuchten Hunde lebten, in Haushalte mit anderen Tieren und in Haushalte ohne andere Tiere zusammen, waren 4,03 % der Hunde aus Haushalten mit anderen Tieren (sechs von 149 Hunden) und 4,90 % der Hunde aus Haushalten ohne andere Tiere (sieben von 143 Hunden) seropositiv. Dieser Unterschied war nicht signifikant in Fischer s exaktem Test. Unterteilte ich die Tiere in Hunde aus Haushalten mit einer speziellen Tierart [weitere(r) Hund(e), Katze(n), Pferd(e) oder Ziervogel (-vögel)], Hunde aus Haushalten mit anderen Tierarten außer dieser speziellen und Hunde aus Haushalten ohne andere Tiere, ließ sich mittels Fisher s exaktem Test in diesen Gruppen kein signifikanter Unterschied darstellen. Auf statistische Prüfung der Haushalte mit 16 oder weniger Tieren einer Tierart wurde aufgrund zu kleiner erwarteter Zahlen verzichtet. Unterteilte ich die Hunde in Hunde aus Haushalten mit einer speziellen Tierart [weitere(r) Hund(e), Katze(n), Pferd(e) oder Ziervogel (-vögel)] und Hunde aus Haushalten ohne diese Tierart, konnte ich bezüglich der einzelnen Tierarten keinen signifikanten Unterschied in Fisher s exaktem Test feststellen. Auf statistische Prüfung der Haushalte mit 16 oder weniger Tieren einer Tierart wurde aufgrund zu kleiner erwarteter Zahlen verzichtet. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder. Tab Verteilung seropositiver und seronegativer Hunde in Abhängigkeit von der Haltung anderer Tiere Tierart Seronegative Hunde Seropositive Hunde Anzahl Relative Häufigkeit Anzahl Relative Häufigkeit (n) (%) (n) (%) Hund 70 95,43 3 4,11 Katze 59 96,72 2 3,28 Pferd ,00 0 0,00 Ziervogel 25 96,15 1 3,85 Kaninchen ,00 0 0,00 Fisch 9 100,00 0 0,00 Geflügel, Meerschweinchen 8 100,00 0 0,00 Schildkröte 6 100,00 0 0,00 Eichhörnchen, Schaf, Ziege 3 100,00 0 0,00 Echse, Schwein 2 100,00 0 0,00 Chinchilla, Damwild, Ratte, Rotwild 1 100,00 0 0,00

117 Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Fütterung der Hunde und Neospora- Infektionen Die genauen statistischen Berechnungen bezüglich des Zusammenhangs zwischen Fütterung der Hunde und Seroprävalenz von N. caninum finden sich im Anhang 9.8 wieder Kategorie: Dosenfutter Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Häufigkeit der Fütterung mit Dosenfutter vor. Die Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Dosenfutter sowie der Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Dosenfutter ist in Abb dargestellt. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen waren ebenso wie der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Dosenfutter erhielten, und den Hunden, die Dosenfutter in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,89 98,28 96,00 4,11 1,72 4,00 91,67 8,33 niemals manchmal häufig immer anderes n=73 n=58 n=50 n=72 n=0 28,85 % 22,92 % 19,76 % 28,46 % 0,00 % Fütterung mit Dosenfutter Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Absolute und relative Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit Dosenfutter sowie Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Dosenfutter.

118 4. Ergebnisse Kategorie: Trockenfutter Zu 255 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Häufigkeit der Fütterung mit Trockenfutter vor. Die Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Trockenfutter sowie der Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Trockenfutter ist in Abb dargestellt. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Trockenfutter erhielten, und den Hunden, die Trockenfutter in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 100,00 0,00 90,91 9,09 97,14 94,79 2,86 5,21 niemals manchmal häufig immer anderes n = 6 n = 22 n = 35 n = 192 n = 0 2,35 % 8,63 % 13,73 % 75,29 % 0,00 % Fütterung mit Trockenfutter Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Absolute und relative Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit Trockenfutter sowie Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Trockenfutter.

119 Ergebnisse Kategorie: Fleisch Die Angaben zur Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit bestimmten Fleischsorten sind in Abb dargestellt. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 70,40 25,60 2,40 1,60 63,89 25,00 5,95 4,76 0,40 94,80 5,20 99,20 0,80 97,58 2,02 0,40 Schwein Rind Schaf Ziege Wild-wiederkäuer 99,60 0,40 Pferd 62,80 22,80 11,20 3,20 Geflügel n=250 n=252 n=250 n=249 n=248 n=249 n=250 Fütterung mit Fleisch verschiedener Tierarten Anzahl (n) niemals manchmal häufig immer anderes Abb Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit Fleisch verschiedener Tierarten.

120 4. Ergebnisse Fleisch vom Schwein Zu 250 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Schweinefleisch vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Schweinefleisch. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Schweinefleisch erhielten, und den Hunden, die Schweinefleisch in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. 120,00 100,00 94,89 95,31 100,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,11 4,69 0,00 75,00 25,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=176 n=64 n=6 n=4 n=0 Fütterung mit Schweinefleisch Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Schweinefleisch.

121 Ergebnisse Fleisch vom Rind Zu 252 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Rindfleisch vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Rindfleisch. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Rindfleisch erhielten, und den Hunden, die Rindfleisch in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,65 96,83 4,35 3,17 80,00 20,00 91,67 8,33 100,00 0,00 niemals manchmal häufig immer niemals bis manchmal n=161 n=63 n=15 n=12 n=1 Fütterung mit Rindfleisch Anzahl (n) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Rindfleisch Fleisch vom Schaf Zu 250 der 292 bewerteten Hunden Angaben über die Fütterung mit Schaffleisch vor. Von diesen 250 Hunden bekamen 237 (94,80 %) niemals und 13 (5,2 %) manchmal Schaffleisch gefüttert. In der Gruppe der Hunde, denen die Besitzer niemals Schaffleisch fütterten, waren zwölf Hunde (5,06 %) seropositiv, in der Gruppe der Hunde, die manchmal Schaffleisch bekamen, war ein Hund (7,69 %) seropositiv. Auf statistische Prüfung der Unterschiede in den Gruppen wurde aufgrund zu kleiner erwarteter Zahlen verzichtet.

122 4. Ergebnisse Fleisch von der Ziege Zu 249 der 292 untersuchten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Ziegenfleisch vor. Ziegenfleisch wurde niemals an 247 Hunde (99,20 %) und manchmal an zwei Hunde (0,80 %) verfüttert. Von den Hunden, die niemals Ziegenfleisch bekamen, waren zwölf (4,86 %) seropositiv. Von den zwei Seren, die von Hunden stammten, die manchmal mit Ziegenfleisch gefüttert wurden, war eins negativ und eins wies einen Titer von 1:100 auf. Der Besitzer dieses Hundes verfütterte das Fleisch roh, der Besitzer des seronegativen Hundes machte keine Angabe zur Behandlung des Fleisches. Aufgrund der geringen Tierzahl in der Gruppe, die manchmal Ziegenfleisch bekam, wurde auf eine Signifikanzprüfung verzichtet Fleisch vom Wildwiederkäuer Zu 248 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Fleisch vom Wildwiederkäuer vor. Fleisch vom Wildwiederkäuer wurde niemals an 242 Hunde (97,58 %), manchmal an fünf Hunde (2,02 %) und häufig an einen Hund (0,40 %) verfüttert. In der Gruppe der Hunde, die niemals Fleisch vom Wildwiederkäuer erhielten, waren 5,37 % (13 Seren) positiv. In den übrigen Gruppen gab es keine positiven Seren. Da sich alle positiven Seren in der Gruppe der Hunde befanden, die niemals mit Fleisch vom Wildwiederkäuer gefüttert wurden, und die anderen Gruppen sehr klein waren, ließ sich keine Aussage über einen Zusammenhang zwischen der Häufigkeit der Fütterung von Fleisch von Wildwiederkäuern und der Seroprävalenz von N. caninum machen. Es wurde somit auf Signifikanzprüfung verzichtet Fleisch vom Pferd Zu 249 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Pferdefleisch vor. Nur ein Hund (0,40 %) bekam manchmal Pferdefleisch verfüttert. Das Serum dieses Hundes war negativ. Die restlichen 248 Hunde (99,6 %) bekamen niemals Pferdefleisch. In dieser Gruppe waren 13 Hunde (5,24 %) seropositiv. Da nur einmal die Angabe gemacht wurde, dass dem Hund Pferdefleisch gefüttert wurde, und das Serum dieses Hundes negativ war, konnte keine Aussage über den Zusammenhang zwischen Häufigkeit der Fütterung von Pferdefleisch und der Seroprävalenz getroffen werden. Es wurde auf Signifikanzprüfung verzichtet.

123 Ergebnisse Fleisch vom Geflügel Zu 250 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Geflügelfleisch vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Geflügelfleisch. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Geflügelfleisch erhielten, und den Hunden, die Geflügelfleisch in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,54 4,46 92,98 7,02 96,43 3,57 87,50 12,50 niemals manchmal häufig immer anderes n=157 n=57 n=28 n=8 n=0 Fütterung mit Geflügelfleisch Anzahl (n) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Geflügelfleisch Fleisch von anderen Tierarten Zweimal wurde die Verfütterung von Fisch angegeben. Ein Serum hatte keinen Titer, das andere wurde als trace bei 1:25 beurteilt. Aufgrund der geringen Zahlen ließ sich hier über signifikante Zusammenhänge mit der Seroprävalenz von N. caninum keine Aussage treffen.

124 4. Ergebnisse Kategorie: Innereien Die Angaben zur Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit Innereien bestimmter Tierarten sind in der Abb dargestellt. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 91,63 7,57 0,40 0,40 83,73 12,70 1,98 1,59 98,81 1,19 Schwein Rind Schaf Ziege Wildwiederkäuer 100,00 98,02 1,98 100,00 Pferd 90,40 6,40 2,40 0,80 Geflügel n=251 n=252 n=252 n=252 n=253 n=252 n=250 Fütterung mit Innereien verschiedener Tierarten Anzahl (n) niemals manchmal häufig immer Abb Häufigkeit der Fütterung der Hunde mit Innereien verschiedener Tierarten.

125 Ergebnisse Innereien vom Schwein Zu 251 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien vom Schwein vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Innereien vom Schwein. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Innereien vom Schwein erhielten, und den Hunden, die Innereien vom Schwein in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. 120,00 100,00 94,78 94,74 100,00 100,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,22 5,26 0,00 0,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=230 n=19 n=1 n=1 n=0 Fütterung mit Innereien vom Schwein Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Innereien vom Schwein.

126 4. Ergebnisse Innereien vom Rind Zu 252 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien vom Rind vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Innereien vom Rind. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Innereien vom Rind erhielten, und den Hunden, die Innereien vom Rind in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. 120,00 100,00 94,79 93,75 100,00 100,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,21 6,25 0,00 0,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=211 n=32 n=5 n=4 n=0 Fütterung mit Innereien vom Rind Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Innereien vom Rind Innereien vom Schaf Zu 252 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien vom Schaf vor. Drei Hunde (1,19 %) bekamen manchmal, die restlichen 249 Hunde (98,81 %) niemals Innereien vom Schaf. Von den drei Hunden, die manchmal Innereien vom Schaf fraßen, wurde ein Serum negativ, eins als trace bei 1:50 und eins als trace bei 1:100 bewertet. Von den Hunden, die niemals Innereien vom Schaf bekamen, waren 13 (5,22 %) seropositiv. Aufgrund der geringen Zahlen ließ sich hier über signifikante Zusammenhänge zwischen der Verfütterung von Innereien vom Schaf und der Seroprävalenz von N. caninum keine Aussage treffen. Es wurde auf eine Signifikanzprüfung verzichtet.

127 Ergebnisse Innereien von der Ziege Zu 252 der 292 untersuchten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien von der Ziege vor. Keinem Hund wurden Innereien von der Ziege gefüttert. Die Seroprävalenz bei diesen Hunden lag bei 5,16 % (13 Hunde). Da kein Hund Innereien von der Ziege bekam, ließen sich keine Aussagen über den Zusammenhang zwischen Fütterung der Innereien von der Ziege und Seroprävalenz von N. caninum machen Innereien vom Wildwiederkäuer Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien von Wildwiederkäuern vor. Fünf Hunde (1,98 %) wurden manchmal mit Innereien vom Wildwiederkäuer gefüttert, die restlichen 248 Hunde (98,02 %) bekamen niemals Innereien vom Wildwiederkäuer. Die fünf Seren von den Hunden der ersten Gruppe wurden wie folgt beurteilt: ein Serum war negativ, eins trace bei 1:100, zwei hatten einen Titer von 1:25 sowie eins einen Titer von 1:800. Die Seroprävalenz in der Gruppe der Hunde, die manchmal mit Innereien von Wildwiederkäuern gefüttert wurden, war mit 20 % (ein Hund) höher als in der Gruppe der Hunde, die niemals Innereien von Wildwiederkäuern bekamen (4,84 %, zwölf Hunde). Aufgrund der niedrigen Zahlen in der Gruppe der manchmal mit Innereien von Wildwiederkäuern gefütterten Hunde wurde auf eine Signifikanzprüfung verzichtet. Alle Besitzer der Hunde, die Innereien von Wildwiederkäuern bekamen, verfütterten die Innereien unter anderem auch roh Innereien vom Pferd Zu 252 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien vom Pferd vor. Kein Hund bekam Innereien vom Pferd gefüttert. Die Seroprävalenz in dieser Gruppe lag bei 5,16 % (13 Hunde). Da kein Hund Innereien vom Pferd erhielt, ließen sich keine Aussagen über den Zusammenhang zwischen Fütterung der Innereien vom Pferd und Seroprävalenz von N. caninum machen.

128 4. Ergebnisse Innereien vom Geflügel Zu 250 der 292 untersuchten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Innereien vom Geflügel vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Geflügelinnereien. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Innereien vom Geflügel erhielten, und den Hunden, die Geflügelinnereien in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. 120,00 100,00 94,25 100,00 100,00 100,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,75 0,00 0,00 0,00 niemals manchmal häufig immer anderes n=226 n=16 n=6 n=2 n=0 Fütterung mit Geflügelinnereien Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Geflügelinnereien Innereien von anderen Tierarten In den beantworteten Fragebögen wurde keine Verfütterung von Innereien anderer Tierarten genannt.

129 Ergebnisse Kategorie: Gehirn oder Rückenmark Gehirn oder Rückenmark vom Rind Zu 252 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Gehirn oder Rückenmark vom Rind vor. Gehirn oder Rückenmark vom Rind wurde niemals an 245 Hunde (97,22 %), manchmal an sechs Hunde (2,38 %) sowie häufig an einen Hund (0,40 %) verfüttert. Das Serum dieses Hundes besaß einen Titer von 1:25. Von den sechs Hunden, denen manchmal Gehirn oder Rückenmark vom Rind gefüttert wurde, wurde ein Serum negativ, zwei Seren als trace bei 1:25, zwei Seren als trace bei 1:50 sowie ein Serum als trace bei 1:100 beurteilt. Alle positiven Hunde befanden sich in der Gruppe der Hunde, die niemals Gehirn oder Rückenmark vom Rind verfüttert bekamen. Die Seroprävalenz lag in dieser Gruppe bei 5,31 % (13 Hunde). Aufgrund der geringen Zahlen ließ sich hier über signifikante Zusammenhänge zwischen der Verfütterung von Gehirn oder Rückenmark vom Rind und der Seroprävalenz von N. caninum keine Aussage treffen. Es wurde auf eine Signifikanzprüfung verzichtet Gehirn oder Rückenmark vom Schaf, von der Ziege, vom Wildwiederkäuer, vom Pferd oder von anderen Tierarten Von den 292 bewerteten Hunden lagen zu 252 Seren Angaben über die Verfütterung von Gehirn oder Rückenmark vom Schaf, von der Ziege, vom Wildwiederkäuer oder vom Pferd vor. Da alle Hundebesitzer die Angabe machten, niemals Gehirn oder Rückenmark dieser Tierarten zu verfüttern, konnte ich in Bezug auf diese Punkte keinen Zusammenhang zwischen Häufigkeit der Verfütterung von Gehirn oder Rückenmark dieser Tierarten und der Seroprävalenz von N. caninum finden. Die Seroprävalenz in diesen Gruppen lag bei 5,16 % (13 Tiere). Die Besitzer machten keine Angaben zur Verfütterung von Gehirn oder Rückenmark von anderen Tierarten.

130 4. Ergebnisse Kategorie: Speisereste Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Speiseresten vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Speiseresten. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Speisereste erhielten, und den Hunden, die Speisereste in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 94,83 96,43 94,74 5,17 3,57 5,26 66,67 33,33 niemals manchmal häufig immer anderes n=116 n=112 n=19 n=6 n=0 45,85 % 44,27 % 7,51 % 2,37 % 0 % Fütterung mit Speiseresten Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Absolute und relative Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Speiseresten sowie Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Speiseresten.

131 Ergebnisse Kategorie: Rohmilch oder Rohmilchprodukte Zu 245 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Fütterung mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten vor. Die Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten sowie der Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten ist in der Abb dargestellt. Der Unterschied zwischen den Hunden, die niemals Rohmilch oder Rohmilchprodukte erhielten und den Hunden, die Rohmilch oder deren Produkte in unterschiedlicher Häufigkeit erhielten, war nicht signifikant in Fisher s exaktem Test. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 94,51 5,49 97,67 2,33 93,33 6,67 75,00 25,00 100,00 0,00 niemals manchmal häufig immer niemals bis manchmal n=182 n=43 n=15 n=4 n=1 74,29 % 17,55 % 6,12 % 1,63 % 0,41 % Fütterung mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Absolute und relative Häufigkeit der Fütterung des Hundes mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten sowie Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Fütterung mit Rohmilch oder Rohmilchprodukten Kategorie: Behandlung des Futters bei Verfütterung von Fleisch oder Innereien Von den 292 Hunden, deren Seren bewertet wurden, wurden 141 Hunden Fleisch oder Innereien verfüttert. 113 Besitzer dieser Hunde machten Angaben zur Behandlung des Futters. Fünf Hundebesitzer hatten die Frage zur Behandlung des Futters falsch verstanden und machten Angaben zur Behandlung des Futters, obwohl sie kein Fleisch und keine Innereien verfütterten. Diese Angaben wurden bei

132 4. Ergebnisse 129 der statistischen Berechnung außer Acht gelassen. Die Häufigkeit der einzelnen Behandlungsformen sowie der Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Behandlung des verfütterten Fleisches oder der verfütterten Innereien ist in der Abb dargestellt. Verglich ich die Hunde, denen gekochtes Fleisch oder gekochte Innereien verfüttert wurden, mit allen anderen Hunden, deren Besitzer Angaben zur Behandlung des Futters machten, konnte ich keinen signifikanten Unterschied mittels Fisher s exaktem Test feststellen. Alle anderen Gruppen waren zu klein, um statistische Berechnungen durchzuführen. Beim Vergleich der Hunde, die Fleisch oder Innereien auch roh verfüttert bekamen (n=21), mit Hunden, deren Besitzer kein rohes Fleisch oder rohe Innereien verfütterten (n=92), fand ich bei den Hunden der ersten Gruppe drei positive (14,29 %), bei allen anderen Hunden zwei positive (2,17 %). Die Gruppengröße war für statistische Berechnungen zu klein. Nur von fünf positiven Hunden war bekannt, wie das Fleisch oder die Innereien, die sie erhielten, behandelt wurden. Von diesen Hunden bekam ein Hund das Fleisch oder die Innereien roh verfüttert, zwei Hunde bekamen es gekocht und wiederum 2 Hunde roh oder gekocht. Da Behandlungsformen roh und gekocht aber auch die mit Abstand häufigsten Behandlungsformen waren, ließ sich keine Aussage über Zusammenhänge mit der Seroprävalenz machen. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 90,00 10,00 gar nicht (roh) 97,47 2,53 gekocht 100,00 0,00 tiefgefroren (mind. 3 Tage) 71,43 28,57 gar nicht oder gekocht 100,00 0,00 gekocht oder tiefgefroren 100,00 0,00 gar nicht, gekocht oder tiefgefroren 100,00 0,00 gekocht oder gebraten 100,00 0,00 gar nicht oder tiefgefroren n=10 n=79 n=2 n=7 n=7 n=1 n=4 n=3 8,85 % 69,91 % 1,77 % 6,19 % 6,19 % 0,88 % 3,54 % 2,65 % Behandlung des Fleisches oder der Innereien vor der Verfütterung Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) negativ positiv Abb Absolute und relative Häufigkeit der Behandlung des Fleisches oder der Innereien sowie Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Behandlungsform.

133 Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern, Ratten, Kaninchen, Hunde- oder Fuchskot, Abortmaterial von Rindern, Schafen oder Ziegen durch die Hunde und Neospora- Infektionen Die Angaben zur Häufigkeit der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern, Ratten, Kaninchen, Hunde- oder Fuchskot, Abortmaterial von Rindern, Schafen oder Ziegen durch die Hunde sind in der Abb dargestellt. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 66,27 22,35 3,53 7,84 Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern 89,33 0,79 0,00 9,88 85,38 7,51 0,00 7,11 Aufnahme Aufnahme von Ratten von Kaninchen 71,26 16,93 2,36 9,45 Aufnahme von Hundekot 78,35 1,57 0,00 20,08 Aufnahme von Fuchskot 95,26 0,40 0,00 4,35 Aufnahme von Abortmaterial vom Rind 95,65 0,00 0,00 4,35 Aufnahme von Abortmaterial vom Schaf 95,65 0,00 0,00 4,35 Aufnahme von Abortmaterial von der Ziege n=255 n=253 n=253 n=254 n=254 n=253 n=253 n=253 Orale Aufnahme Anzahl (n) niemals manchmal häufig immer Abb Häufigkeit der oralen Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern, Ratten, Kaninchen, Hunde- oder Fuchskot, Abortmaterial von Rindern, Schafen oder Ziegen. Die genauen statistischen Berechnungen finden sich im Anhang 9.8. wieder.

134 4. Ergebnisse Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern Zu 255 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Mäusen und anderen Kleinnagern vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern. Verglich ich die Hunde, die niemals Mäuse oder andere Kleinnager aufnahmen, mit den Hunden, die diese in unterschiedlicher Frequenz aufnahmen, konnte ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied feststellen. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,27 4,73 92,98 7,02 100,00 0,00 95,00 5,00 niemals manchmal häufig weiß nicht n=169 n=57 n=9 n=20 Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern Anzahl (n) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Mäusen oder anderen Kleinnagern durch den Hund.

135 Ergebnisse Aufnahme von Ratten Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Ratten vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Ratten. Beim Vergleich der Hunde, die niemals Ratten aufnahmen, mit den Hunden, die Ratten in unterschiedlicher Frequenz aufnahmen, konnte ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied feststellen. 120,00 100,00 94,69 100,00 96,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,31 0,00 4,00 niemals manchmal häufig weiß nicht n=226 n=2 n=0 n=25 Aufnahme von Ratten Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Ratten durch den Hund.

136 4. Ergebnisse Aufnahme von Kaninchen Zu 253 der 292 untersuchten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Kaninchen vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Kaninchen. Beim Vergleich der Hunde, die niemals Kaninchen aufnahmen, mit den Hunden, die Kaninchen in unterschiedlicher Frequenz aufnahmen, konnte ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied feststellen. 120,00 100,00 94,44 100,00 94,44 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 5,56 0,00 5,56 niemals manchmal häufig weiß nicht n=216 n=19 n=0 n=18 Aufnahme von Kaninchen Anzahl (n) Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Kaninchen durch den Hund.

137 Ergebnisse Aufnahme von Hundekot Zu 254 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Hundekot vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Hundekot. Beim Vergleich der Hunde, die niemals Hundekot aufnahmen, mit den Hunden, die Hundekot in unterschiedlicher Frequenz aufnahmen, konnte ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied feststellen. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,03 95,35 4,97 4,65 100,00 0,00 91,67 8,33 niemals manchmal häufig weiß nicht n=181 n=43 n=6 n=24 Aufnahme von Hundekot Anzahl (n) negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Hundekot durch den Hund.

138 4. Ergebnisse Aufnahme von Fuchskot Zu 254 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Fuchskot vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Fuchskot. Beim Vergleich der Hunde, die niemals Fuchskot aufnahmen, mit den Hunden, die Fuchskot in unterschiedlicher Frequenz aufnahmen, konnte ich mittels Fisher s exaktem Test keinen signifikanten Unterschied feststellen. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 95,48 4,52 100,00 0,00 92,16 niemals manchmal häufig weiß nicht n=199 n=4 n=0 n=51 Aufnahme von Fuchskot Anzahl (n) 7,84 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Fuchskot durch den Hund.

139 Ergebnisse Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten verschiedener Tierarten Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern Zu 253 der 292 bewerteten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern vor. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern. Der einzige Hund, der manchmal Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern aufnahm, wies einen Titer von 1:800 auf. Da die Anzahl in den einzelnen Gruppen zu klein war, wurde auf eine statistische Auswertung des Zusammenhangs zwischen Häufigkeit der Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern und der Seroprävalenz von N. caninum verzichtet. 120,00 100,00 95,02 100,00 100,00 negativ positiv Relative Häufigkeit (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 4,98 0,00 niemals manchmal häufig weiß nicht n=241 n=1 n=0 n=11 Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Rindern Anzahl (n) 0,00 Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Häufigkeit der Aufnahme von Abortmaterial von Rindern durch den Hund Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen Zu 253 der 292 untersuchten Hunde lagen Angaben über die Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen vor. Niemals nahmen

140 4. Ergebnisse Hunde (95,65 %) und in unbekannter Frequenz elf Hunde (4,35 %) Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen auf. Die Seroprävalenz in der Gruppe der Hunde, die niemals Abortmaterial von Schafen oder Ziegen aufnahmen, lag bei 5,37 % (13 Hunde). Da in der Gruppe der Hunde, die in unbekannter Frequenz Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen aufnahmen, nur Hunde waren, deren Serum negativ bewertet wurde, ließ sich keine Aussage über den Zusammenhang zwischen Aufnahme von Abortmaterial oder Nachgeburten von Schafen oder Ziegen und der Seroprävalenz machen. Es wurde auf statistische Berechnungen in diesen Gruppen verzichtet Zusammenhang zwischen der Seropositivität von Hündinnen und Neospora-Infektionen bei ihren Welpen Da von keiner Mutterhündin mit einem Titer ein Wurf beobachtet wurde, ließ sich keine Aussage über den Zusammenhang zwischen Seroprävalenz und Ausprägung klinischer Symptome bei den Welpen machen. Somit wurde der Punkt Beobachtungszeitraum der Welpen nicht statistisch ausgewertet. Zu 133 von 153 untersuchten Seren von Hündinnen lagen Angaben vor, ob die Hündin bereits einen Wurf hatte. Von den zwei Hündinnen mit einem Titer von 1:800 hatte keine einen Wurf. Eine Hündin mit einem Titer von 1:100 hatte einen Wurf. Allerdings beobachtete der Besitzer der Hündin diesen Wurf nicht, weil die Hündin zu dem Zeitpunkt, als sie den Wurf hatte, einem anderen Besitzer gehörte. Die beiden anderen Hündinnen mit einem Titer von 1:100 hatten keinen Wurf. Fünf Hündinnen mit einem Titer von 1:50 hatten keinen Wurf. Von 24 Hündinnen mit einem Titer von 1:25 hatte eine Hündin einen Wurf, der allerdings vom Besitzer nicht beobachtet wurde, 20 Hündinnen hatten keinen Wurf, bei zwei Hündinnen war unbekannt, ob sie einen Wurf hatten, und bei einer Hündin machten die Besitzer keine Angabe, ob die Hündin schon einen Wurf hatte.

141 Ergebnisse Zusammenhang zwischen der Seropositivität für N. caninum und für T. gondii Von den 292 auf N.-caninum-Antikörper untersuchten Seren wurden 284 auch auf T.-gondii-Antikörper untersucht. Die Abb zeigt den Prozentsatz negativer und positiver Hunde in Abhängigkeit von der Beurteilung der Seren bezüglich T. gondii. Von den 284 auf beide Parasiten getesteten Seren waren 13 (4,58 %) positiv für N. caninum, 88 (30,99 %) positiv für T. gondii, und sechs Seren (2,11 %) reagierten positiv in beiden Untersuchungen. Es gab keinen signifikanten Zusammenhang zwischen T.-gondii- und N.-caninum-positiven Seren in Fisher s exaktem Test. Die genauen statistischen Ergebnisse finden sich im Anhang 9.8. Relative Häufigkeit (%) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 96,36 96,77 3,64 3,23 93,18 negativ fraglich positiv n=165 n=31 n=88 58,10 % 10,92 % 30,99 % Beurteilung bezüglich T. gondii Anzahl (n) Relative Häufigkeit (%) 6,82 negativ positiv Abb Verteilung positiver und negativer Seren in Abhängigkeit von der Beurteilung bezüglich T. gondii Zusammenhang zwischen der Seropositivität und dem Ergebnis der Kotprobenuntersuchung Von 137 Hunden lagen sowohl eine Serum- als auch eine Kotprobe vor. Von diesen Kotproben war keine positiv für N. caninum. Sieben Kotproben (5,11 %) waren positiv für andere Endoparasiten. Die Hunde der positiven Kotproben wiesen im Serum einmal einen N.-caninum-Titer von 1:25 auf, zweimal wurden Seren der kotprobenpositiven Hunde als trace bei 1:50, dreimal als trace bei 1:25 und einmal

142 4. Ergebnisse 139 als negativ beurteilt. Da kein Hund einen positiven Kotbefund für N. caninum hatte, wurde auf Signifikanzprüfung verzichtet Versuche zur Optimierung der Untersuchung der Kotproben auf Oozysten von N. caninum Die Ergebnisse der Versuche zur Optimierung der Untersuchung der Kotproben auf N.-caninum-Oozysten sind in Tab dargestellt. Allgemein fiel bei diesen Versuchen folgendes auf: Zwischen der Flotation mit Zentrifugation und der Flotation im Ovassay ließen sich keine deutlichen Unterschiede im Ergebnis feststellen, so dass die Entscheidung aus Gründen der Praktikabilität in der Tierarztpraxis für den Ovassay ausfiel. Je höher die Dichte der Flotationslösung (Zinksulfatlösung > Kochsalz-Zucker-Lösung > Kochsalzlösung > Zuckerlösung) war, desto mehr Kotpartikel behinderten die mikroskopische Untersuchung auf Oozysten. Je zäher die Flotationslösung (Zuckerlösung > Kochsalz-Zucker-Lösung > Zinksulfatlösung, Kochsalzlösung) war, desto dicker war die Schicht unter dem Deckgläschen im Ovassay und desto unübersichtlicher war das Präparat. Aufgrund dieser Versuche wurden die Kotproben im Ovassay mit gesättigter Kochsalzlösung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass mit dieser Methode sicher 3 x 10 2 Oozysten in etwa 2 g Kot nachgewiesen werden können.

143 Ergebnisse Tab Ergebnisse der Versuche zur Optimierung der Untersuchung der Kotproben auf N.-caninum-Oozysten Eingesetzte Oozystenzahl Flotationslösung a Oozystenzahl pro Deckglas b (n) (n) 1. Ansatz c 2. Ansatz c 3. Ansatz c Arithmetischer Mittelwert c Zentrifuge Ovassay Zentrifuge Ovassay Zentrifuge Ovassay Zentrifuge Ovassay 1 x 10 4 Gesättigte Zinksulfatlsg ,33 8,67 Gesättigte Kochsalzlsg ,33 239,33 Zuckerlsg ,67 49,33 Kochsalz-Zucker-Lsg ,33 76,67 1 x 10 3 Gesättigte Zinksulfatlsg ,33 0,00 Gesättigte Kochsalzlsg ,00 11,33 Zuckerlsg ,00 3,33 Kochsalz-Zucker-Lsg ,00 17,00 5 x 10 2 Gesättigte Zinksulfatlsg ,00 0,00 Gesättigte Kochsalzlsg ,67 6,00 Zuckerlsg ,67 6,00 Kochsalz-Zucker-Lsg ,33 0,33 3 x 10 2 Gesättigte Zinksulfatlsg ,67 0,00 Gesättigte Kochsalzlsg ,33 5,67 Zuckerlsg ,33 5,00 Kochsalz-Zucker-Lsg ,00 2,33 1 x 10 2 Gesättigte Zinksulfatlsg ,00 0,00 Gesättigte Kochsalzlsg ,00 0,67 Zuckerlsg ,33 0,00 Kochsalz-Zucker-Lsg ,00 0,00 a, Lsg.: Lösung; b, je Ansatz wurde die Oozystenzahl unter einem Deckgläschen ausgezählt; c, Zentrifuge: Flotation mit Zentrifugation, Ovassay: Flotation im Ovassay

144 4. Ergebnisse Untersuchung von Kotproben Insgesamt wurden 154 Kotproben untersucht. Alle Kotproben waren negativ für N. caninum. Von den Kotproben enthielten zwölf Proben (7,79 %) Parasitenstadien. Es konnten folgende Parasiten nachgewiesen werden: Oozysten von Isospora-Arten (acht Proben, 5,19 %), Eier von Toxocara canis (drei Proben, 1,95 %), Eimeria-Oozysten (eine Probe, 0,65 %), Eier von Toxascaris leonina (eine Probe, 0,65 %), Trichuris vulpis (eine Probe, 0,65 %), Uncinaria stenocephala (eine Probe, 0,65 %) und Ancylostoma caninum (eine Probe, 0,65 %). Zwei der positiven Kotproben enthielten Eier oder Oozysten verschiedener Arten: Eine Kotprobe enthielt sowohl Oozysten vom Isospora-Typ als auch Eier von T. canis und von A. caninum. Die zweite Kotprobe enthielt Oozysten vom Isospora-Typ, Eier von T. canis und von T. vulpis Die restlichen Kotproben waren nur für einen Parasiten positiv. Die in Abb dargestellten unsporulierten Oozysten im Kot eines Hundes dieser Studie enthielten nach der Sporulation 4 Sporozysten mit je zwei Sporozoiten und konnten so der Gattung Eimeria zugeordnet werden. Die Kotprobe dieses Hundes wurde in Bezug auf Endoparasitenbefall des Hundes als negativ bewertet, weil es sich bei Eimerien nicht um Endoparasiten des Hundes handelt. Somit gab es 7,14 % Kotproben, die auf einen Endoparasitenbefall des Hundes schließen ließen. Abb Eimeria-Oozysten im Kot eines Hundes.