Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Ralf H. Wittenberg Dienstort: St. Elisabeth-Hospital Herten Orthopädische Abteilung

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1 Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Ralf H. Wittenberg Dienstort: St. Elisabeth-Hospital Herten Orthopädische Abteilung Inhibition der Cyclooxygenase bei destruktiven Gelenkerkrankungen Effekte von Lumiracoxib, Diclofenac, Celecoxib und SC-560 auf die Prostanoidfreisetzung aus entzündeter Synovialis und Bursa subacromialis in vitro Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Ida Sibylle Haußleiter aus Münster 2004

2 Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. med. R. H. Wittenberg Prof. Dr. med. J. Krämer Tag der Mündlichen Prüfung:

3 meiner Familie

4 Diskobolische Marmorkopie der Bronzestatue von MYRON (50 v. Chr.); Rom Museo Nazionale

5 Inhaltsverzeichnis Theoretischer Teil 1. Grundlagen Entzündung Enzyme und Botenstoffe Cyclooxygenase (COX) Struktur und Isoformen Lokalisation und Effekte 8 Inflammatorisch 9 Zentralnervös 10 Kardiovaskulär 11 Gastrointestinal 12 Urogenital Prostaglandine (PG) Cytokine Pharmakologische Intervention Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAID) selektive COX-1-Inhibitoren selektive COX-2-Inhibitoren Nebenwirkungen der selektiven COX-2-Inhibitoren Chronisch-entzündliche Gelenkerkrankungen Impingement - Syndrom der Schulter Osteoarthrose des Knies 30 Experimenteller Teil 2. Versuchsdesign Methodik Pilotexperiment Kurzeitinkubation Langzeitinkubation Material 35

6 2.2.1 Gewebe Pharmaka-Lösungen Procedere biometrische Verfahren Radioimmunoassay (RIA) Enzymelinked Immuno-sorbent Assay (ELISA) Statistik verwendete Substanzen Ergebnisse Pilotexperiment Endgültige Analyse 56 Auswertung 4. Diskussion Zusammenfassung 100 Literaturverzeichnis 102 Danksagung Lebenslauf

7 Verzeichnis der Abkürzungen COX Cyclooxygenase Cl - Chlorid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA Enzymelinked Immuno Sorbent Assay FG Feuchtgewicht IL 1β Interleukin 1β IL 4 Interleukin 4 6-Keto-PGF 1α 6-Keto-Prostaglandin F 1α kb Kilo Basenpaar; molekularbiologische Maßeinheit kd Kilo Dalton; chemische Masseinheit mrna messenger Ribonukleinsäure Na + Natrium NSAID Nicht-steroidale Antiphlogistika PBS Phosphatsäure-gepufferte Saline PG Prostaglandine RIA Radioimmunoassay RT-PCR Reverse-Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion TBX Thromboxan TNF α Tumor Nekrose Faktor α ZNS Zentrales Nervensystem

8 Theoretischer Teil 1. Grundlagen Zur Therapie rheumatischer Schmerzen verwendeten schon die Ägypter vor 3500 Jahren einen Aufguss aus getrockneten Myrte-Blättern. Rund tausend Jahre später empfahl HIPPOKRATES den Saft der Pappel bei Augenentzündungen und den Einsatz von Weidenrinde, um Geburtsschmerz und Fieber zu lindern. Alle diese Heilmittel enthalten Salicylate. CELSIUS beschrieb 30 v.chr. Rubor (Rötung), Calor (Wärme), Dolor (Schmerz) und Tumor (Schwellung) als Charakteristika der Entzündung und therapierte sie mit Extrakten aus Weidenblättern. Im Römischen Reich - zu Zeiten von PLINIUS dem Älteren, DIOSCORIDES und GA- LEN - wurde der Einsatz salicylathaltiger Pflanzen weiterentwickelt und die Weidenrinde bei leichten bis mittleren Schmerzen als Therapie der Wahl empfohlen. Auch in China und anderen Gebieten Asiens wurden salicylathaltige Pflanzen therapeutisch angewandt. Im Mittelalter wurden Salicylate als Wundpflaster oder systemisch bei Dysenterie und menstruellen Schmerzen eingesetzt. Der erste dokumentierte, klinische Einsatz der Weidenrinde fand 1763 in England statt. Mit 1.8g getrockneter, zermahlener Weidenrinde therapierte Reverend STONE aus Oxfordshire erfolgreich das Fieber von über 50 Patienten. Er schloss seine Publikation mit dem Wunsch, dass diese potente Substanz umfassend eingesetzt und getestet würde und die Welt einen großen Nutzen aus der Wirkung ziehe [STONE 1763]. Die derzeitig weltweite Produktion von Tonnen Aspirin im Jahr und ein durchschnittlicher Verbrauch von 80 Tabletten pro Person übersteigen seine Vorstellungen sicherlich wurde erstmals Salicylsäure synthetisch in Deutschland hergestellt. Der Vater von Felix HOFFMAN, einem jungen Chemiker der Bayer AG, drängte seinen Sohn, eine schmackhaftere Form des sehr bitteren Salicylates zu entwickeln, um sein Rheuma zu therapieren wurde Aspirin als praktische Möglichkeit präsentiert, den Organismus mit der aktiven Substanz Salicylat zu versorgen [DRESER 1899]. Beinahe ein Jahrhundert später, am 10. Dezember 1980, erhielt Sir John VANE den medizinischen Nobelpreis für die Erforschung des Wirkmechanismus von Aspirin auf das Enzym Cyclooxygenase. Heute nimmt VANE aufgrund einer koronaren Herzerkrankung selbst regelmäßig das Medikament ein, dessen Effekte er vor 23 Jahren erfolgreich beschrieb. 1

9 1.1 Entzündung Unsere Umwelt enthält eine Vielzahl mikrobiologischer, chemischer und physikalischer Faktoren, die eine Gewebeschädigung provozieren können. Ihre Abwehr geschieht über die angeborene, unspezifische und die erworbene, spezifische Immunität. Dies ist ein wichtiger Schutzmechanismus unseres Organismus zur Erhaltung der funktionellen und morphologischen Integrität. Eine Entzündung ist der örtlich begrenzte Abwehrprozess einer Gewebeschädigung und besteht aus einer komplexen Reaktion des gefäßführenden Bindegewebes, der Blutzellen und des Blutplasmas. Die schädigende Noxe führt zu einer Alteration des Gewebes und zur Freisetzung von Substanzen, die die entzündliche Reaktion auslösen und so zur Kardinalsymtomatik führen: Rötung durch Vasodilatation, Gewebsschwellung durch entzündliches Exsudat, Erwärmung aufgrund vermehrter Gewebsdurchblutung und letztlich Schmerz durch Nervenreizung [CELSIUS / GALEN]. VIRCHOW ( ) fügte die gestörte lokale Funktionsfähigkeit als fünftes Symptom hinzu. Bakterien Noxen Ischämie Anaphylaxie Gewebeschädigung Entzündungsmediatoren Akute Entzündung Chronische Entzündung vaskuläre & zelluläre Reaktion Ödem zelluläre Reaktion Exsudat Lyse des Exsudats Granulationsgewebe & Fibrose Regeneration des Parenchyms Restitutio ad integrum Narbe Abb. 1.1 akute und chronische Entzündung [nach BÖCKER et al. 1997] 2

10 Das Bindeglied zwischen Gewebeschädigung und entzündlicher Reaktion stellt eine Gruppe von chemischen Substanzen dar, die als Entzündungsmediatoren bezeichnet werden. Sie regulieren in Abhängigkeit von Art und Intensität der Schädigung alle entzündlichen Reaktionen. Sie steuern zu Beginn der Entzündung die vaskuläre Reaktion und modifizieren später auch die zelluläre Phase mit der Emigration von Phagozyten. Viele der Entzündungsmediatoren werden von den am inflammatorischen Geschehen beteiligten Zellen freigesetzt. Die zellulären Mediatoren liegen entweder präformiert in zytoplasmatischen Vakuolen vor oder sie werden auf den Entzündungsreiz hin in entsprechenden Enzymkaskaden neu synthetisiert [BÖCKER et al. 1997]. 1.2 Enzyme und Botenstoffe Cyclooxygenase (COX) Das COX-Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen und Thromboxan [VANE 1971]. Gemeinsam mit der Peroxidase, die der weiteren Prostanoid-Verarbeitung dient, bildet sie die Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase (PGHS) [HEMLER und LANDS 1976]. Lange Zeit nahm man an, es gäbe nur eine Form der COX, deren Produkte sowohl für die physiologische Homöostase, als auch für die Vermittlung akuter Entzündung verantwortlich seien. Diese heutige COX-1-Form wurde 1976 erstmals isoliert [HEMLER und LANDS] und zwölf Jahre später erfolgreich geklont [DE WITT und SMITH 1988]. Es wurde angenommen, dass in den einzelnen Geweben eine konstante Menge dieser COX ausgeschüttet wurde und im Entzündungsfall vermehrt Vorstufen von Prostaglandinen freigesetzt würden. Zwei experimentelle Beobachtungen widerlegten jedoch dieses Konzept: Nicht die Menge an PG-Vorstufen stieg im entzündlichen Geschehen an, sondern der Gehalt an COX. Zudem ließ sich diese Zunahme durch Kortikosteroide verhindern [FU et al / MASFERRER et al / O BANION et al. 1991]. Den induzierbaren Charakter des Isoenzyms und damit die Existenz einer COX-2 zeigten RAZ et al., als sie durch IL 1β -Stimulation in Fibroblasten [1989] und durch Endotoxin in Monozyten eine Aktivitätszunahme der COX hervorriefen [1990]. Im gleichen Jahr demaskierte MASFERRER durch eine Adrenalektomie die COX-Aktivität in vivo. XIE und KUJUBU fanden mit einem Molekularprogramm, das induzierbare Frühe- Phase-Gene identifiziert [1991], ein Gen, dessen Sequenz mit dem bekannten COX-1- Enzym im Wesentlichen übereinstimmte und klonten erfolgreich die COX-2-Isoform. 3

11 Struktur und Isoformen Isoenzyme sind Enzyme unterschiedlicher Aminosäuresequenz, die dieselbe Reaktion katalysieren. In der Natur sind sie weit verbreitet. Sie setzen die gleichen Substrate um, jedoch mit unterschiedlicher Aktivität. Unterschiedlich ist auch ihr Verhalten gegenüber Aktivatoren, Inhibitoren, und Substratanaloga [LÖFFLER 1999]. Die Isoenzyme der COX weisen ein unterschiedliches genetisches Expressionsprofil auf, deutlich divergierende kinetische Eigenschaften, eine variierende Lokalisation in subzellulären Kompartimenten und abweichende Interaktionen mit anderen Enzymen [SMITH et al / FITZPATRICK und SOBERMAN 2001]: Tab. 1.1 Struktur, Distribution und Regulation der COX-Isoformen [nach PAIRET und ENGELHARDT 1996 / O BANION 1999] COX-1 COX-2 DNA Chromosome 9 / 22 kb Chromosome 1 / 8,3 kb mrna 2,8 kb 4,5 kb Protein 72 kd / 599 Aminosäuren 72 kd / 604 Aminosäuren Homologie Regulation subzelluläre Lokalisation gewebliche Lokalisation Unterschiede 75% Homologie im Menschen: Konservierung der Hämoglobin-Bindungsstelle, des aktiven Zentrums und der Glykosylierungsseiten vorwiegend konstitutiv vorwiegend induziert, aber auch konstitutiv 2-4facher Anstieg durch Stimuli 10-20facher Anstieg durch Stimuli Lumenseite des Endoplasmatischen Lumenseite der perinukleären Membran Retikulums in den meisten Geweben, vor allem konstitutiv in ZNS, Nieren, Hoden, Trachea in Thrombozyten, Endothelzellen, inflammatorisch induziert in Makrophagen / Magen und Niere Monozyten, Synoviozyten, Chondrozyten, Fibroblasten, Endothelzellen Das aktive Zentrum der COX-2 ist größer als das der COX-1. Glukokortikoide hemmen die Expression von COX-2, nicht aber von COX-1. Die Gene für COX-1 und COX-2 sind auf den menschlichen Chromosomen 9 bzw. 1 lokalisiert [KRAEMER et al / FLETCHER et al. 1992] Die Anordnung von Introns und Exons ist bei beiden Genen identisch, lediglich die Exons 1 und 2 der COX- 1, die den Startpunkt für die Translation sowie das Signalpeptid enthalten, sind bei COX-2 in einem Exon kondensiert. Das COX-2-Gen hat insgesamt kleinere Introns und ist nur 8kb groß, im Vergleich zu 22kb der COX-1. Das Merkmal der kleineren Introns 4

12 ist typisch für Akute-Phase-Gene und passt zu einer schnellen Transkription und mrna-verarbeitung [CROFFORD 1997]. Abb. 1.2 Struktur der COX-Gene [nach CROFFORD 1997] Auch die Promoterregion der beiden Gene unterscheidet sich signifikant und spiegelt den physiologischen Zustandsbereich der beiden Isoformen auf molekularbiologischer Ebene wieder: Typisch für ein so genanntes Housekeeping Enzyme, enthält der Promoter der COX-1 keine TATA-Box und auch keine nachweisbaren Regionen für induzierbare Transkription [SMITH et al. 1995]. Der COX-2-Promoter hingegen beinhaltet eine TATA-Box, sowie einige Transkriptions-Elemente, die bei hoch regulierbaren Genen üblich sind. Während Lipopolysaccharide, Wachstumsfaktoren und proinflammatorische Cytokine (IL 1β, TNF α ) im Akutfall COX-2 induzieren, bremsen Glukokortikoide, IL 4, IL 13 und IL 10 die Genexpression. [APPLEBY et al / LEE et al / ONOE et al / NIIRO et al / XIE et al / KUJUBU et al. 1992]. Die Induktion durch Tumor-Promoter verdeutlicht die Relevanz der COX-2 in der Kanzerogenese. [SHENG et al. 2000] Abb. 1.3 Struktur der COX-Promoter [nach CROFFORD 1997] Im Unterschied zur mrna der COX-1 enthält die COX-2-mRNA am 3 Ende ihrer Sequenz eine repetitive Region, die in der Translationsphase nicht übersetzt wird. Vermutlich destabilisiert sie die mrna, inhibiert die Translation und degradiert rapide das Transkript [RISTIMAKI et al / DIXON et al. 2000]. Ein Verlust dieser Region 5

13 aufgrund von Mutationen oder Konformationsänderungen führt zu einer Überexpression der COX-2 und wird als maßgeblicher Faktor in der Kanzerogenese von malignen Kolon-Erkrankungen diskutiert [TSUJII et al. 1998]. Obwohl auf DNA- und RNA-Ebene deutliche Unterschiede in Struktur und Regulation der COX-Gene auffallen, sind Proteinstruktur und enzymatische Funktion der beiden Formen erstaunlich ähnlich. Das Proteinprodukt zeigt Abweichungen im Bereich des N- terminalen Signalpeptides und eine Insertion von 18 Aminosäuren am C-terminalen Ende des COX-2-Polypeptides. Die übrige Kernsequenz ist jedoch zu 75% identisch und alle Anteile, die als essentiell für die katalytische Aktivität angesehen werden, sind konserviert [SMITH und DEWITT 1995]. Die allgemeine Struktur besteht aus drei großen Domänen, die auch als folding units bezeichnet werden: Am N-terminalen Ende des Enzymes befindet sich die Bindungsstelle für diverse Wachstumsfaktoren, die epidermal growth factor-like domain. Anschließend befindet sich das membrane-binding motif, ein Membran-Bindungs- Bereich und schließlich am C-terminalen Ende die enzymatic domain, die das aktive Zentrum mit COX- und Peroxidase-Aktivität enthält. [PICOT et al. 1994] Diese beiden katalytischen Regionen sind im selben dimeren Proteinmolekül vereint [VANE et al / SMITH et al. 2000], aber räumlich deutlich voneinander getrennt [EVERTS 2000]. Beide Isoenzyme sind membranassoziiert, so dass aus beschädigten Membranen freigesetzte Arachidonsäure an der membranseitigen Öffnung des größtenteils hydrophoben Enzymkanals angesaugt und um die Haarnadelkurve gedreht werden kann [HAWKEY 1999]. Generell binden alle Substrate an eine Bindungsstelle im mittleren Teil des langen Kanals zwischen Membran-Verbindung und Protein-Innerem. Hier werden zwei Sauerstoffmoleküle eingefügt und ein freies Radikal freigesetzt, wodurch der für die PG charakteristische Ring aus fünf Kohlenstoffatomen entsteht. Dieser chemische Vorgang hat den Enzymnamen der Cyclo-oxy-genase geprägt. COX-1 und COX-2 haben eine vergleichbare Umsatzgeschwindigkeit V max und Michaelis-Konstante K m für Arachidonsäure (20:4 ω6); die COX-2 ist jedoch durch ihren flexibleren Kanal effizienter bei alternativen Substraten [SMITH und DEWITT 1995]. Der Einsatz fluoreszierender Arachidonsäure zeigte, dass NSAID die COX-1 etwa in der Mitte des Kanals blockieren [LANZO et al. 1998]. Die Aminosäuren Arginin (an Position 120), Tyrosin (355) und Glutamat (524) markieren diese Bindungsstelle, wobei Tyrosin sterisch den Zugang zum aktiven Zentrum behindert [KURUMBAIL et al

14 / LOLL et al. 1996]. Pharmakologisch interessant ist das Arginin, das die einzig positiv geladene Komponente im Bindungskanal ist. Die Röntgenkristallographie der dreidimensionalen Struktur lässt darauf schließen, dass sowohl Arachidonsäure, als auch Carboxylat-haltige NSAID, über Wasserstoffbrücken an dieses polare Arginin binden und so eine Blockade bewirken [PICOT et al / LUONG et al. 1996]. Abb. 1.4 Schematische Darstellung der hydrophoben Bindungskanäle von COX-1 (links) und COX-2 (rechts) mit den gebundenen Inhibitoren Aspirin bzw. Celecoxib [LOLL et al / KURUMBAIL et al / FITZGERALD 2003] Der COX-Bindungskanal enthält eine so genannte Seitentasche, die bei den beiden Isoformen durch unterschiedliche Aminosäuren begrenzt wird: Bei der COX-2 handelt es sich um Valin (523), Arginin (513) und Valin (434). Valin (523) bindet an eine Schwefelgruppe der selektiven COX-2-Inhibitoren und ermöglicht so die spezifische Inhibition von nur der COX-2. Bei der COX-1 sind an entsprechenden Positionen die Aminosäuren Isoleucin (523), Histidin (513) und Isoleucin (434) positioniert [WONG et al / GUO et al / KURUMBAIL et al. 1996]. Das Isoleucin (523) ist um eine Methylgruppe größer, als das entsprechende Valin (523) der COX-2, und kann somit den Zugang zur Seitentasche zu versperren [GARAVITO und DEWITT 1999]. Der gezielte Ersatz einer einzigen Aminosäure bewirkt also den kritischen Unterschied für die Selektivität pharmakologischer Inhibitoren [LUONG et al / GIERSE et al. 1996]. 7

15 Lokalisation und Effekte Arachidonsäure COX-1 Homöostase: Schleimhaut-Schutz Plättchen-Aggregation Renaler Blutfluss Cyclooxygenase Prostaglandin G 2 Peroxidase COX-2 Pathophysiologie: Adaptation: Entzündung, Fieber Renale Renin-Sekretion Schmerz Wund- & Ulkusheilung Ischämie Weibliche Reproduktion M. Alzheimer Knochen-Metabolismus Kanzerogenese Gefäß-Schutz Prostaglandin H 2 Prostglandine Prostacyclin Thromboxane Abb. 1.5 Rolle der COX-Enzyme [nach HINZ und BRUNE 2002] Trotz vieler struktureller Gemeinsamkeiten scheinen COX-1 und COX-2 als zwei separate Enzymsysteme zu funktionieren: Während die COX-1 im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, wird die COX-2 sowohl dort, als auch in der Kernmembran exprimiert [MORITA et al. 1995]. Verallgemeinert gesagt, handelt es sich bei der COX-1 um ein konstitutiv vorhandenes Housekeeping Enzyme, das in fast allen Geweben des menschlichen Organismus vorkommt und physiologische Reaktionen vermittelt. Die COX-2-Isoform wird hingegen von Zellen exprimiert, die am Entzündungsgeschehen beteiligt sind und katalysiert die Synthese von Prostanoiden bei pathologischen Vorgängen. Heute weiß man jedoch, dass die These von der guten COX-1 und der schlechten COX-2 die Vorgänge in vivo nur unzureichend wiedergibt [FITZGERALD und PATRONO 2001]. Während die COX-2 zu Beginn der 90er Jahre ausschließlich als Produzent pathologischer Prostanoide angesehen wurde, belegen neuere Studien, dass die COX-2 auch eine bedeutende Rolle in diversen physiologischen Prozessen spielt [VANEGAS und SCHAIBLE 2001 / O BANION 1999]. Ebenso wurde eine vermehrte COX-1-Expres- 8

16 sion in nicht physiologischen Situationen, wie z.b. nach Läsion eines Nerven, beobachtet [TO et al / HARTNER et al / SCHWAB et al. 2000]. Die beiden Isoenzyme greifen auf getrennte Arachidonsäure-Reserven zurück, die in Antwort auf unterschiedliche zelluläre Stimuli mobilisiert werden [REDDY und HERSCHMAN 1994 / MURAKAMI et al. 1994]. Die von der COX-2 produzierten Stoffwechselprodukte regulieren über eine rückkoppelnde Schleife und Interaktion mit nukleären Rezeptoren die Expression des Enzymes [FORMAN et al / DEV- CHAND et al / HINZ et al. 2000]. Inflammatorisch: Das Tiermodell der inflammatorischen Arthritis gibt Aufschluss über die Expression von COX-2 bei akuter und chronischer Entzündung [SANO et al. 1992]. Immunohistochemisch ließen sich Synoviozyten des Gelenkinnenraums, vaskuläre Endothelzellen, infiltrierende Monozyten, Chondrozyten, subchondrale Osteoblasten und angrenzendes Knochenmark anfärben. Eine Behandlung des Gewebes mit Dexamethason senkte erwartungsgemäß die COX-Expression. Ein Anstieg der COX-1-mRNA konnte durch RT-PCR-Analysen nicht festgestellt werden [SANO et al. 1992]. Beide Beobachtungen belegen, dass die angestiegene Expression in vivo überwiegend auf eine vermehrte COX-2-Freisetzung zurückzuführen ist. Im Tiermodell der adjuvant induzierten Arthritis stieg die mrna von COX-2 - nicht aber von COX-1 - zeitgleich mit der klinisch nachweisbaren Pfotenschwellung an. Ein verabreichter selektiver COX-2-Inhibitor verhinderte das Pfotenödem zu % und Dexamethason zu % [ANDERSON et al. 1996]. In explantiertem humanem Synovialisgewebe konnte ebenfalls die Regulation der COX-Enzyme durch physiologische Faktoren nachgewiesen werden: Grundsätzlich wurden beide COX-Isoformen exprimiert. Der Zusatz von IL 1β oder Phorbolester stimulierte die COX-2-Expression, Dexamethason und IL 4 antagonisierten diese Entwicklung und inhibierten die spontane PGE 2 -Produktion in den frisch isolierten Synoviozyten. Dieselbe Behandlung hatte keinerlei Einfluss auf den COX-1-Spiegel im Gewebe [SU- GIYAMA et al / CROFFORD et al / HULKOWER et al. 1994]. Die Wirkung von IL 1β und IL 4 verdeutlichte die Rolle anti-inflammatorischer Cytokine als regulierende Faktoren der Genexpression [ONOE et al. 1996]. In menschlichem Gewebe war die COX-2 ebenso in verschiedenen Zelltypen des Gelenkbereiches nachweisbar, wie im Tiermodell. Die Expression schien einheitlichen 9

17 Regulationsmechanismen zu unterliegen [RISTIMAKI et al / O SULLIVAN et al / WILBORN et al / GENG et al / ONOE et al. 1996]. Bei der Untersuchung von rheumatisch, osteoarthrotisch oder traumatisch verändertem humanem Synovialisgewebe fand sich ein deutlicher COX-2-Gehalt im rheumatischen Gewebe. Das Gewebe der Osteoarthrose-Patienten zeigte eine Immunoreaktivität mit leicht schwächerem Signal; in der traumatischen Kontrollgruppe war die Färbung jedoch nur sehr gering ausgeprägt. Ausmaß und Intensität der Anfärbung korrelierten mit dem Grad der monozytären Gewebsinfiltration, die als Maß für die synoviale Entzündung galt [SANO et al. 1992]. Zentralnervös: Eine Entzündung sorgt am Ort ihrer Entstehung für eine gesteigerte Expression von COX-2 und durch ihre Syntheseprodukte zu einer Stimulierung der peripheren nozizeptiven Nervenenden, sowie zu einer lokalen Schmerz-Hypersensitivität. Im zentralen Nervensystem sind basal beide Isoformen nachweisbar: COX-1 und COX- 2 können augenblicklich auf eine Freisetzung von Transmittern reagieren und zentral Prostanoide synthetisieren [YAKSH et al / TEGEDER et al. 2001]. In den vergangenen Jahren wurde immer deutlicher, dass die PG nicht nur periphere Nozizeptoren erregen, sondern auch im ZNS agieren und eine Hyperalgesie verursachen können. Die experimentelle zentrale Administration von COX-Inhibitoren zeigte, dass diese Substanzen vor allem im Hinterhorn wirkten und so eine Analgesie hervorriefen [TASSO- RELLI et al. 2003]. Im Hinterhorn des Rückenmarks werden die nozizeptiven Signale auf das zweite Neuron übertragen und anschließend an höhere Zentren des ZNS weitergegeben. Die Schmerzempfindung geht dann gesammelt im Kortex ein. COX-2 ist konstitutiv im Hinterhorn vorhanden und wird bei traumatischer oder inflammatorischer Belastung in den entsprechenden sensorischen Segmenten hoch reguliert. Diese Induktion erleichtert die Übertragung des nozizeptiven Inputs. Auf Rückenmarksebene erzeugtes PGE 2 spielte eine wesentliche schmerzvermittelnde Rolle, indem es die spinalen Neurone direkt depolarisierte und so die Erregung bildete [BABA et al. 2001]. Dass es sich bei den beschriebenen zentralen Vorgängen um ein COX-2-vermitteltes Geschehen handelte, wurde 1998 durch eine Studie belegt, in der der selektive COX-2-Inhibitor Celecoxib den inflammatorisch erhöhten PG-Spiegel in cerebrospinaler Flüssigkeit deutlich senkte, während der COX-1-selektive Inhibitor SC-560 keine signifikante Wirkung zeigte [SMITH et al.]. Diese Beobachtungen wurden durch SAMAD et al. unter- 10

18 mauert, die zeigten, dass nach peripherer Entzündung die COX-2-Expression in Neuronen des Rückenmarks und anderen Teilen des ZNS großflächig induziert wurde [2001]. Als Folge der peripheren Entzündung induzierte vor allem das in diesem Zusammenhang sekretierte IL 1β die zentrale COX-2. Entsprechend agierende Hemmstoffe - wie ein Inhibitor des Interleukin-Converting-Enzyms oder ein selektiver COX-2-Inhibitor - verminderten sowohl die zentrale PGE 2 -Induktion, als auch die mechanische Hyperalgesie [SAMAD et al. 2001]. Kardiovaskulär: Ebenso wie in der Synovialis entzündlicher Gelenke, werden auch in artherosklerotischen Plaques sowohl COX-1 als auch COX-2 exprimiert [CROFFORD et al / SCHONBECK et al. 1999]. Im Gefäßendothel wirkt die COX durch die Produktion von Prostacyclin anti-thrombogenetisch und vasodilatatorisch. Prostacyclin hemmt zudem die Aktivierung und Aggregation von Leukozyten. Als Gegenspieler führt das in den Thrombozyten produzierte Thromboxan A 2 zu einer Thromboaggregation und Vasokonstriktion [FUNK et al / WHITTLE et al /MONCADA et al. 1976]. Adventitia Vasodilatation Muskularis Endothel Vasokonstriktion PKA camp AC G IP _ + PGI 2 TXA 2 Ca 2+ IP 3 PLC TP G Abb. 1.6 Regulation des peripheren Gefäßtonus durch Prostacyclin PGI 2 und Thromboxan TXA 2 [nach HINZ und BRUNE 2002] Die vaskuläre Protektion durch die COX-2 scheint ein adaptiver Prozess zu sein, denn laminäre Scheerkräfte im Gefäß und Komponenten der artherogenen Lipoproteine führten zu einer Hochregulierung des Isoenzyms [TOPPER et al / ZEMBOWICZ et al. 1995]. Die genaue Rolle der COX-2 in der Artherosklerose ist jedoch immer noch 11

19 nicht geklärt. PRATICO et al. zeigten im Tiermodell, dass die Inhibition beider Isoenzyme das Auftreten einer Artherosklerose verzögerte [2001]. Auch COX-1-stämmige PG trugen also offensichtlich zur artherosklerotischen Genese bei. Konsequenterweise sollte der Einfluss von NSAID auf die Progression von Plaques im Menschen evaluiert werden. In klinischen Studien an gesunden Probanden führten selektive COX-2-Inhibitoren zu einer verminderten systemischen Produktion von Prostacyclin [CATELLA-LAWSON et al / McADAM et al. 1999]. Die COX-1- vermittelte Thromboxansynthese wurde dadurch nicht tangiert und es kam zu einem unvorteilhaften Gleichgewicht der beiden Vasomodulatoren. Publizierte klinische Studien divergieren in diesem Zusammenhang: Während in der CLASS-Studie (Celecoxib Long-Term Arthritis Safety Study) keine Differenz im Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse unter Celecoxib oder NSAID (Ibuprofen und Diclofenac) beobachtet wurde [SILVERSTEIN et al. 2000], hatten die Patienten in der VIGOR-Studie (Vioxx Gastrointestinal Outcome Research) unter Rofecoxib ein vierfach erhöhtes Risiko, einen Myokardinfarkt zu erleiden, als die Kontrollgruppe unter Naproxen [BOMBARDIER et al. 2000]. Da jedoch beide COX-2-selektiven Komponenten eine vergleichbare Hemmung der Prostacyclin-Synthese bewirken sollen, ohne dabei die Produktion von Thromboxan zu beeinflussen, basiert die Diskrepanz der kardiovaskulären Endpunkte vermutlich auf dem Einsatz unterschiedlicher Studienprotokolle und NSAID [FITZGE- RALD et al. 2000]: VIGOR wurde an Patienten mit rheumatischer Arthritis durchgeführt, die nachgewiesenermaßen ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse haben, während CLASS ausschließlich Osteoarthrose-Patienten einbezog, deren kardiovaskuläres Risikoprofil sich nicht signifikant von dem der Normalbevölkerung unterscheidet [MUKHERJEE et al. 2001]. Gastrointestinal: Die Aufgaben der beiden Isoenzyme im Gastrointestinaltrakt lassen sich grob drei Bereichen zuordnen: Physiologischer Normalzustand, Inflammation und Ulkus. Sowohl in Ruhe, als auch im Entzündungsfall, stimuliert die COX-1 als Housekeeping Enzyme die Sekretion von Schleim und Bikarbonaten [WALLACE et al. 1999]. Prostaglandine, die von diesem Isoenzym synthetisiert werden, werden als hauptverantwortlich für die Zytoprotektion im Gastrointestinaltrakt angesehen, obwohl auch die COX-2 physiologisch in Magenmukosa [ZIMMERMANN et al / ISEKI 1995]. Die COX-2 ver- 12

20 mittelt bei Entzündung ebenfalls eine adaptive Zytoprotektion, so dass die betroffenen Zellen besser topischen Irritationen widerstehen können [WALLACE et al. 1999]. Mit diesem Konzept stimmen die Beobachtungen der CLASS- und VIGOR- Studiengruppen überein, in denen die beiden selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib und Rofecoxib signifikant weniger Nebenwirkungen - wie Perforationen, Ulkus und Blutungen - im oberen Gastrointestinaltrakt hervorriefen, als konventionelle NSAID [SILVERSTEIN et al / BOMBARDIER et al. 2000]. Die Daten weisen auf ein deutlich verbessertes Risiko-Nutzen-Profil der selektiven COX-2-Inhibitoren bezüglich gastrointestinaler Sicherheit hin und machen das Auftreten eines Ulkus oder die daraus resultierenden Komplikationen weniger wahrscheinlich. Dennoch sind die neuen Substanzen immer noch mit einer möglichen Dyspepsie assoziiert, die zwar seltener auftritt, als bei den NSAID, aber dennoch signifikant häufiger als unter Placebo [LANGMAN et al. 1999]. Eine weitere bedeutende Entdeckung der letzten Jahre war die Beobachtung, dass COX- 2 die Heilung gastrointestinaler Ulzera beeinflusst. Im Falle eines Magengeschwürs übernahm die COX-2 eine reparierende Funktion und erreichte durch Stimulation von Angiogenese, Zellproliferation und Granulationsbildung eine schnellere Wundheilung [WALLACE et al. 1999]. Übereinstimmend damit wurde eine induzierte COX-2- Expression am Rand von ulzeriertem Gewebe nachgewiesen [MIZUNO et al. 1997]. Selektive COX-2-Inhibitoren verzögerten im Tiermodell deutlich die Abheilung von Ulzera [SCHMASSMANN 1998]. Konsequenterweise muss untersucht werden, ob in Patienten mit einem Ulkus durch NSAID eine effektive Ulkus-Abheilung erfolgt, wenn sie auf selektive COX-2-Inhibitoren umgestellt werden. JONES et al. zeigten, dass sowohl selektive COX-2-Inhibitoren, als auch non-selektive NSAID die Angiogenese durch einen direkten Effekt auf die Endothelzellen hemmen [1999]. Auch beim Heliobacter-Pylori-verursachten Ulkus stieg der Gehalt an COX-2 und sank nach erfolgreicher Eradikation wieder ab. Der erhöhte COX-2-Gehalt schien also eine direkte Antwort auf die bakterielle Infektion zu sein [McCARTHY et al. 1999]. Urogenital: HARRIS et al. belegten die Existenz der COX-Isoformen in den Nieren erwachsener Ratten [1994]. Generell nahm der COX-2-Gehalt mit zunehmendem Alter ab [NANTEL et al. 1999]. 13

21 Die COX-2-Form scheint einen Einfluss auf den Salzhaushalt des Organismus zu haben, da sie in Strukturen exprimiert wird, die den renalen Blutfluss und die Freisetzung von Renin regulieren, wie die Macula densa des juxtaglomerulären Apparates und die aufsteigende Henle-Schleife [HARRIS et al. 1994]. Das zirkulierende Blutvolumen und die Gefäßkontraktilität beeinflussten die Expression der COX-2 und nach Salzrestriktion stieg der Gehalt an COX-2-Protein und mrna in der Macula densa deutlich an [HARRIS et al. 1994]. Zusätzlich zu den renovaskulären Effekten verminderte das produzierte PGE 2 in der aufsteigenden HENLE-Schleife die Rückresorption von Natrium und Chlorid. Zudem senkte es die osmotische Wirkung von Vasopressin in den Sammelgängen, so dass es zu einem gesteigerten Urinfluss kam [STOKES 1979 / ORLOFF und ZUSMAN 1978]. Eine pharmakologische Inhibition des Angiotensin Converting Enzymes (durch ACE- Hemmer), sowie des Angiotensin-II-Rezeptors (durch AT II -Rezeptorblocker) führte ebenfalls zu einer gesteigerten COX-2-Expression, sowohl in Tieren mit Salzrestriktion, als auch in der Kontrollgruppe [HARRIS et al. 2000]. Die Einnahme selektiver COX-2- Inhibitoren ging mit einer verminderten Sekretion von Renin einher [HARRIS 2003 / TRAYNOR et al. 1999]. Die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems schien also die COX-2-Expression in der Nierenrinde zu hemmen. Klinische Studien zeigten, dass auch selektive COX-2-Inhibitoren durch Hemmung der renalen Wasserund Salzausscheidung periphere Ödeme verursachten und beim Risikopatienten einen Hypertonus provozierten bzw. verschlechterten [WHELTON et al / CATELLA- LAWSON et al / ROSSAT et al.1999]. Da beide Isoformen im renalen Gefäßsystem vorkommen, stellte sich die Frage, welche für die gesteigerte Produktion gefäßerweiternder PG bei Volumenmangel zuständig ist und so den renalen Blutfluss gewährleistet [PATRONO und DUNN 1987]. Auch wenn die Salz-Restriktion selektiver COX-2-Inhibitoren und traditioneller NSAID in gesunden Probanden vergleichbar war, führten in klinischen Studien bisher nur NSAID zu einer signifikanten Senkung der glomerulären Filtrationsrate [CATELLA-LAWSON et al. 1999]. Ebenso wie NSAID verursachten allerdings auch die neuen selektiven COX- 2-Inhibitoren eine signifikante Hyperkaliämie [BRATER et al / WHELTON 2000 / WHELTON 1999] Insgesamt lässt sich sagen, dass auch die neue Generation der COX-2-Inhibitoren die Niere nicht mit Nebenwirkungen verschont und deshalb bei prädisponierten Patienten vorsichtig eingesetzt werden sollte. 14

22 1.2.2 Prostaglandine (PG) PG sind Derivate der Arachidonsäure und äußerst wirksame zelluläre Entzündungsmediatoren. Sie werden bei Schädigung in praktisch allen kernhaltigen Zellen gebildet. Sie leiten sich aus hoch ungesättigten, langkettigen C 20 -Fettsäuren ab, die in großen Mengen in den Phospholipiden der Zellmembran vorkommen. Inzwischen ist der Stoffwechselweg, der zur Generation von PG führt, bis ins kleinste Detail beleuchtet worden. Phospholipid-Membran Phospholipase A 2 COOH CH 3 Arachidonsäure Cyclooxygenase PGG 2 PGH 2 O COOH Isomerasen O COOH O OH CH 3 HO PGI 2 TXA 2 PGD 2 PGF 2a PGE 2 OH CH 3 Niere Gehirn Thrombozyten Endothelium Niere Thrombozyten Makrophagen vaskuläre Muskulatur Gehirn Atemwege Mastzellen Lymphozyten Eosinophile Gehirn Niere vaskuläre Muskulatur Thrombozyten Uterus Atemwege vaskuläre Muskulatur Auge Abb. 1.7 Prostanoid-Biosynthese [nach FITZGERALD und PATRONO 2001] Der initiale Schritt in der Produktion von PG wird von der Phospholipase A 2 katalysiert, die Arachidonsäure aus Membranlipiden freisetzt. Die Phospholipasen A sind eine Großfamilie diverser Enzyme mit mehr als dreizehn aktiven Isoformen. Sie unterscheiden sich in Substratspezifität, ph-sensitivität, Expressionsmuster, Regulierung und subzellulärer Lokalisation and werden gemäß ihrer Struktur und ihres Calciumbedarfs klassifiziert [SIX und DENNIS 2000]. Von besonderer Bedeutung sind die sekretorischen Phospholipasen, die experimentell und bei entzündlichen Erkrankungen rapide freigesetzt werden können [TOUQUI und ALAOUI-EL-AZHER 2001]. 15

23 Im Verlauf der Prostanoid-Synthese wird die freigesetzte Arachidonsäure alternativ über die Lipoxygenase oder die Cyclooxygenase verstoffwechselt. Hierbei entstehen Leukotriene bzw. PG, Prostacyclin und Thromboxan. Das erste Reaktionsprodukt der Cyclooxygenase COX bzw. der Prostaglandin-Endoperoxid-H 2 -Synthetase (PGHS) ist das PGH 2, das dann von gewebsspezifischen Enzymen in Prostacyclin PGI 2, die Prostaglandine PGE 2, PGD 2 und PGF 2 sowie Thromboxan TXA 2 umgewandelt wird [SMITH et al / GARAVITO und DeWITT 1999]. Es entsteht so eine Reihe bioaktiver Komponenten, die dann ihre biologische Wirkung über spezifische Rezeptoren ausüben. Die Rezeptoren bestehen aus sieben transmembranösen Domänen und werden - gemäß dem zugehörigen prostanoiden Liganden - als DP-, EP-, FP-, IP- und TP- Rezeptoren klassifiziert [MINAMI et al / NARUMIYA et al / SUGIMOTO 2000 / BREYER et al. 2001]. Die Rezeptoren sind über G-Proteine an Effektoren wie die Adenylatzyklase oder Phospholipase C gekoppelt [GOETZL et al / COLE- MAN et al. 1994]. Die enzymatische Metabolisierung der Arachidonsäure durch die COX produziert mehrere Komponenten, die in ihrer Gesamtheit als Prostanoide bezeichnet werden. Sie umfassen in ihrer Länge 20 Kohlenstoffatome ( Eicosanoide ) und werden bei einer Fünfring-Struktur Prostaglandine und bei einem Sechsring Thromboxane genannt. Die numerische Ergänzung 2 bezieht sich auf die beiden Doppelbindungen in den Seitenketten. Eicosanoide haben eine kurze Halbwertzeit und übernehmen als lokale Hormone oder Mediatoren wichtige Funktionen unter physiologischen, sowie unter pathologischen Bedingungen [McGEER et al. 1996]. Sie vermitteln Schlüsselfunktionen in vielen Prozessen, inklusive der zellulären Antwort auf Verletzung und entzündungsfördernde Cytokine, der Fiebergenese, der Modulation der Stressreaktion, des Schlaf-Wach- Rhythmus, der Regulation des zerebralen Blutflusses, sowie der peripheren und zentralen Kontrolle der Schmerzwahrnehmung [O BANION 1999]. In der Zelle wirken PG und Leukotriene als second messenger und vermitteln die Aktivierung von Kalium- Kanälen, Makrophagen oder die Adhäsion. Im Gewebe halten sie homeostatische Funktionen wie die Zytoprotektion der Magenschleimhaut und den renalen Gefäßtonus aufrecht [DI MARZO 1995]. Eine konstante Neusynthese von PG durch die konstitutiv exprimierte COX ist in vielen Geweben für die Homöostase notwendig. Bei entsprechender inflammatorischer Stimulation kann die PG-Synthese innerhalb von Minuten hoch reguliert werden [FUNK 2001]. Pro-inflammatorische Signale greifen hierbei 16

24 transkriptionell und post-translationell in den Metabolismus ein und führen so zu einem frühen, massiven und anhaltendem Anstieg des Prostanoid-Gehaltes. Schon bald nach der initialen Isolierung von Prostanoiden wurde gezeigt, dass diese Substanzen inflammatorische und immunologische Reaktionen des Organismus beeinflussen und dass sich durch ihren künstlichen Zusatz die Kardinalzeichen der Entzündung, sowie ein gesteigertes Schmerzempfinden, reproduzieren lassen. Eine periphere Inflammation erhöht den lokalen Prostanoid-Spiegel und trägt damit direkt zur Entzündung- und Schmerzentstehung bei [TILLEY 2001]. Es zeigte sich jedoch, dass durch die periphere Entzündung auch der zentrale Prostanoid-Gehalt erhöht wird und so wesentlich weitreichendere Änderungen in der Schmerzwahrnehmung bewirkt werden [DIRIG und YAKSH 1999 / VANEGAS und SCHAIBLE 2001]: Durch die periphere Aktivierung des Rezeptors von PGE 2 kommt es zu einer Proteinkinase-A-vermittelten Phosphorylierung von Natriumkanälen und anderen Rezeptoren in den terminalen Bereichen nozizeptiver Fasern. Die Erregbarkeit der Nozizeptoren steigt, die auslösende Schmerzschwelle sinkt und die Wirkung schmerzerzeugender Stimuli wird verstärkt [KHASAR et al. 1998]. Damit spielen die Prostanoide eine wesentliche Rolle in der Generierung einer peripheren Sensibilisierung. PGE 2 verursacht auf Gewebe-Ebene eine Hyperalgesie und erhöhte Vasopermeabilität und agiert so synergistisch mit anderen inflammatorischen Mediatoren wie Bradykinin, Histamin und Leukotrien B 4. Diese Effekte tragen zur initialen hyperämischen Phase der Entzündung bei. Zentral applizierte Prostanoide rufen eine deutliche Veränderung im Schmerzverhalten hervor; die Antwort auf Noxen ist gesteigert und Schmerzreaktionen auf normalerweise nicht-schädliche Stimuli treten auf [MINAMI et al. 1994]. Auf zellulärer Ebene des Rückenmarks erhöht PGE 2 die Erregbarkeit in schmerzvermittelnden neuronalen Stoffwechselwegen: Es kommt zu einer gesteigerten Freisetzung von Transmittern aus den Endkolben zentraler Schmerzfasern [MALMBERG et al. 1995], zu einer direkten Depolarisation der Rückenmarks-Neuronen durch Aktivierung eines nicht-selektiven Kationen-Kanals [BA- BA et al. 2001] und zu einer Reduktion der zentralen Inhibition durch Glycin [AHMA- DI et al. 2002]. Die Therapie inflammatorischer Zustände sollte strategisch auf die Linderung von Entzündung und Schmerz und auf das Erreichen allgemeinen Wohlbefindens des Patienten abzielen. Da die Prostanoide in all diese Bereiche verwickelt zu sein scheinen, stellt sich nun die Aufgabe, die Synthese der Prostanoide effektiv zu blockieren, ohne allzu viele unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen. 17

25 Tab. 1.2 Profil ausgewählter Prostanoide Name: PGE 2 Strukturformel: O COOH CH 3 O OH Profil: - dilatiert die Mikrovaskulatur und erhöht die Permeabilität der Gefäße - wirkt pyrogen und hyperalgetisch, provoziert das inflammatorische Erythem - unterdrückt die Freisetzung lysosomaler Enzyme - unterdrückt die Synthese von Interleukin 2 und Interferon γ durch T-Lymphozyten - schwächt die Migration von T-Helferzellen und unterstützt die Proliferation von T-Suppressorzellen - stimuliert die Aktivität von Osteoklasten und Knochenresorption in Synovialis - inhibiert die Proliferation von Knochenzellen in Synovialis - diuretisch und natriuretisch; induziert die Freisetzung von Renin - reduziert die Produktion von Magensäure, fördert die Freisetzung von Magenschleim - stimuliert die duodenale Sekretion von Bikarbonaten - fördert die Kontraktion des Uterus Name: PGI 2 Strukturformel: O COOH HO OH CH 3 Profil: - 6 Keto PGF 1α ist der stabile - und somit messbare - Metabolit von Prostacyclin - vasodilatativ - unterdrückt die Adhärenz und Aggregation von Thrombozyten - hemmt die Aktivierung und Adhäsion von Leukozyten - wirkt pyrogen und hyperalgetisch - induziert die Freisetzung von Renin - reduziert die Produktion von Magensäure, fördert die Freisetzung von Magenschleim - stimuliert die duodenale Sekretion von Bikarbonaten 18

26 1.2.3 Cytokine Mittlerweile ist eine Vielzahl löslicher Faktoren bekannt, die unter dem Begriff Cytokine zusammengefasst werden und modulierend auf ihre Zielzellen einwirken. Sie vermitteln in einem komplexen Netzwerk hochspezifisch zwischen den einzelnen Immunzellen einerseits und zwischen Immun- und Gewebezellen andererseits. Zur Gruppe dieser Mediatoren gehören Lymphokine, Interleukine und Chemokine. Die Synthese von Cytokinen kann in diversen Leukozyten induziert werden, einige werden allerdings auch konstitutiv synthetisiert. Hierbei haben endogene Mechanismen, wie der zirkadiane Rhythmus und das Lebensalter, und pathologische Zustände, wie Infektionen oder Neoplasien einen Einfluss. Aktivierte Zellen produzieren häufig mehrere Cytokine gleichzeitig [BÖCKER et al. 1997]. Die immunologische Mastzelle exprimiert sowohl multifunktionelle Cytokine, wie TNF α und IL 1β, als auch profibrotische und anti-inflammatorische Cytokine wie IL 4. Zusätzlich ist sie fähig, membranständiges TNF α freizusetzen und gewinnt damit eine große funktionelle Bedeutung im entzündlichen Geschehen der Gelenkerkrankung [McNEIL 1996 / GOTIS-GRAHAM et al. 1998]. Inflammatorische Interleukine, wie TNF α und IL 1β, verstärken die entzündliche Reaktion, indem sie in vielen humanen Zellen die Expression von COX-2-mRNA und Protein stimulieren [STICHTENOTH et al / CROFFORD 1997]. IL 1β fördert außerdem die Expression verschiedener Prostanoide und induziert gemeinsam mit ihnen die Angiogenese in entzündlichem Gewebe in vitro und in vivo. Der Zusatz selektiver COX-2-Inhibitoren unterdrückt diesen Effekt und belegt somit die Schlüsselrolle von COX-2 und diversen Prostanoiden in der IL 1β -induzierten Angiogenese [KUWANO et al. 2004]. Die klinische Erfahrung zeigt, dass Cytokine eine wesentliche Rolle in der Pathogenese von Gelenkerkrankungen, einschließlich der Osteoarthrose und der rheumatischen Arthritis, spielen [PELLETIER 1996 / CHU et al. 1992]. Proinflammatorische Cytokine sind wichtige Mediatoren von Entzündung, Immunität, Proteolyse, Zellrekrutierung und Proliferation. TNFα und IL-1β, die von aktivierten Makrophagen produziert werden, verursachen zudem vermutlich zelluläre Interaktionen, die in einer Ereignisabfolge zur Zerstörung des Gelenkknorpels führen. [MASTBERGEN et al / HARDINGHAM et al / DINGLE 1991] 19

27 1.3 Pharmakologische Inhibition der Prostanoid-Biosynthese Die Entdeckung von zwei unterschiedlichen COX-Isoenzymen und das darauf folgende Klonen und Exprimieren dieser Isoformen hat die Entwicklung einer neuen Klasse von diarylheterozyklischen Inhibitoren ermöglicht, die COX-2-selektiv wirken [GANS et al / FUTAKI et al / PENNING et al / RIENDEAU et al / CHAN et al. 1999]. Die Hemmung der COX-Enzyme durch traditionelle NSAID lässt sich generell einem der folgenden Mechanismen zuordnen: Einfache reversible Hemmung, wie durch I- buprofen [ROME und LANDS 1975], zeitabhängige reversible Hemmung wie durch das schwach bindende Naproxen [GIERSE et al. 1999] oder das fest bindende Indomethacin [ROME und LANDS 1975], und letztendlich irreversible kovalente Inhibition, wie im Falle des Aspirins [VAN DER OUDERAA et al. 1980]. Fluoreszenz-Untersuchungen des Bindungsverhaltens von selektiven COX-2- Inhibitoren haben für die Assoziation an die COX-2 einen dreischrittigen Kinetikprozess herausgestellt, während die Bindung an COX-1 auf zwei unterschiedlichen Teilschritten basiert, und nicht nur, wie bisher berichtet, auf einer kompetitiven Hemmung [LANZO et al. 2000]. Die Existenz eines langsamen, irreversiblen Teilschrittes bei der Hemmung der COX-2, nicht aber der COX-1, ist vermutlich für die Potenz und Selektivität der neuen diarylheterozyklischen selektiven COX-2-Inhibitoren verantwortlich [WALKER et al / RIENDEAU et al / GIERSE er at. 1999]. ROME und LANDS erkannten bereits 1975 den bedeutsamen Zusammenhang zwischen der zeitlichen Komponente der COX-Inhibition und der Potenz der verwendeten pharmakologischen Substanz. Kinetische Modelle zur Analyse der zeitabhängigen Hemmung setzen sich üblicherweise aus einer schnellen, reversiblen Reaktion zweiter Ordnung und einer darauf folgenden langsamen, irreversiblen Reaktion erster Ordnung zusammen: k 1 k inact E + I [EI] EI * k -1 Abb. 1.8 Zweischrittige irreversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001] 20

28 Bei der Analyse der zeitabhängigen Inhibition durch SC-560 beobachteten WALKER et al. nach der ersten rapiden Gleichgewichtseinstellung einen weiteren, langsamen und reversiblen Reaktionsschritt [2001]: k 1 k 2 E + I [EI] [EI * ] k -1 k -2 Abb. 1.9 Zweischrittige reversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001] Während initial binäre Komplexe mit beiden Isoformen gebildet wurden, verhielt sich SC-560 in dieser zweiten Reaktion rund 20fach selektiver gegenüber COX-1 Offensichtlich ereignen sich in den jeweiligen aktiven Zentren der Enzyme individuelle Interaktionen, die eine Unterscheidung zwischen den beiden Isoformen - unabhängig von den Vorgängen in der hydrophoben Seitentasche - möglich machen [WALKER et al. 2001]. Auf der Basis kinetischer und struktureller Beobachtungen entwarfen LANZO et al. ein neues Arbeitsmodell für die Inhibition der Cyclooxygenase [2000], welches das inhibitorische Verhalten der meisten NSAID gegenüber sowohl COX-1, als auch COX-2 befriedigend erklärt. Kinetische Daten der Steady-State- und zeitabhängigen Inhibition von COX-1 und COX-2 durch eine Serie diarylheterozyklischer Inhibitoren belegen das dreischrittige, reversible Inhibitionsmodell [WALKER et al. 2001]: k 1 k 2 k inact E + I [EI] k -1 k -2 [EI * ] EX Abb Dreischrittige irreversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001] Beim ersten Schritt handelt es sich um eine Reaktion zweiter Ordnung, in der der Inhibitor in der Lobby-Region [MARNETT und KALGUTKAR 1999 / LANZO et al. 2000] nahe dem Zugang zum hydrophoben Kanal [KURUMBAIL et al / PICOT et al. 1994] an das Enzym bindet. Der zweite Reaktionsschritt korrespondiert mit der Verlagerung des Inhibitors entlang dieses Kanals und seiner Bindung im aktiven Zentrum der COX. Diese beiden ersten Schritte sind vermutlich für beide COX-Isoformen bei der 21

29 Hemmung durch die meisten NSAID gleich. Abhängig von pharmakologischen Eigenschaften wie Selektivität und Potenz der eingesetzten Substanz können die Schritte jedoch nicht voneinander trennbar erscheinen, wie im Fall von Valdecoxib [WALKER et al. 2001]. Der dritte, irreversibel erscheinende, kinetische Vorgang wird nur beobachtet, wenn die COX-2 durch phenylsulphonamid- oder -sulphonhaltige Diarylheterozyklen inhibiert wird. Dieser Prozess wird interpretiert als die Formation des fest gebundenen Enzym-Inhibitor-Komplexes; dies beinhaltet die Optimierung der Konformationsänderungen von Inhibitor und Protein im aktiven Zentrum und der Seitentasche des Enzyms [COPELAND et al. 1994] Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAID) Tab. 1.3 Profil von Aspirin und Diclofenac [nach WÖRZ 2001] Name: Aspirin (2-(Acetyloxy)benzoesäure) Strukturformel: COOH O C CH 3 O Profil: - Salicylat - Pharmakokinetik: geringe Potenz, schnelle Elimination - Orale Bioverfügbarkeit: dosisabhängig bis 50% - Eliminations-Halbwertszeit t 1/2 β: 15 min - Einzeldosis bei Erwachsenen: g (50-100mg hemmen die Thrombozyten-Aggregation, mg wirken analgetisch) - maximale Tagesdosis: ca. 6g Name: Diclofenac ([2-(2,6-Dichloranilino)phenyl]essigsäure Strukturformel: Cl H N Cl CH 2 COOH Profil: - Aryl-Essigsäure - Pharmakokinetik: hohe Potenz, schnelle Elimination - Orale Bioverfügbarkeit: dosisabhängig bis 50 % - Eliminations-Halbwertszeit t 1/2 β: 1-2 h - Einzeldosis bei Erwachsenen: mg - maximale Tagesdosis: ca. 150 mg 22

30 Die Entdeckung des Aspirins als analgetische, anti-inflammatorische und antipyretische Substanz vor rund 100 Jahren markierte den Beginn der modernen Arzneimittel-Forschung [HEDNER und EVERTS 1998]. Salicylsäure und Acetylsalicylsäure wurden die Prototypen der NSAID, die heutzutage eine der klinisch am häufigsten eingesetzten Medikamentenklassen bilden. Obwohl der klinische Nutzen der NSAID schon früh etabliert wurde [HEDNER und EVERTS 1998], dauerte es weitere 70 Jahre, bis VANE den Wirkmechanismus von Aspirin entdeckte und dafür den medizinischen Nobelpreis erhielt [1971]. Heute weiß man, dass sowohl die therapeutischen, als auch die unerwünschten Wirkungen der NSAID auf ihrer Fähigkeit beruhen, die COX-abhängige PG-Synthese reversibel zu hemmen [VANE 1994 / SMITH 1989 / HIGGS 1986/ NEEDLEMAN et al. 1986]. Rund ein Jahrhundert nach der ersten Entdeckung der Salicylsäure, ergeben sich jedoch noch immer neue therapeutische Nischen für den Einsatz von NSAID, wie kolorektale Tumorerkrankungen [CHAN 2003 / GASPARINI et al / HULS et al. 2003] und M. Alzheimer [PASINETTI und POMPL 2002 / GIOVANNINI et al / HOOZEMANS et al. 2003]. Neben den beiden oben dargestellten Vertretern gehören auch Ibuprofen, Indomethacin, Naproxen, und viele andere pharmakologisch in die Klasse der NSAID selektive COX-1-Inhibitoren Dieser COX-1-selektive Inhibitor unterscheidet sich nur durch den Austausch einer Seitengruppe vom COX-2-selektiven Inhibitor Celecoxib. Im Tierversuch ist für SC-560 generell eine Bioverfügbarkeit in vivo nachgewiesen worden, die der von Indomethacin entsprechen soll [MASFERRER et al. 1994]. Die geringe Wasserlöslichkeit von SC-560 ist für den biochemischen Aktionseintritt und die Dauer der hervorgerufenen Wirkung von ganz entscheidender Bedeutung [DAVIES et al. 2000]; aufgrund des lipophilen Charakters wird SC-560 bevorzugt in Fettgewebe und Gehirn aufgenommen und angereichert. SC-560 wird vielfach in experimentellen Studien als selektiver COX-1-Inhibitor eingesetzt und mit klinisch relevanten NSAID oder selektiven COX-2-Inhibitoren verglichen [LOFTIN et al / TANAKA et al / GRETZER et al / WALLACE et al. 2000]. 23