Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica in niedersächsischen Ziegenbeständen

Transkript

1 Universität Leipzig Veterinärmedizinische Fakultät Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica in niedersächsischen Ziegenbeständen Thorsten Arnold

2 Y. enterocolitica Gemeldete Enteritis infectiosa Erkrankungen beim Menschen (2002) Salmonella S. Enteritidis S. Typhimurium weitere Serovare Campylobacter Yersinia Reservoir-Tier: Schwein Problematisch: Rohe Schweinefleischprodukte z.b. Rohwürste, Hackfleisch 1 Infektionsepidemiologisches Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten für 2002,

3 Fragestellungen Kann man in Deutschland Y. enterocolitica-isolate aus Ziegenkotproben isolieren? Wenn ja mit welcher Herden-Prävalenz bzw. mit welcher Einzeltier- Prävalenz treten Y. enterocolitica-isolate auf? Welche Biovare und Serovare spielen eine Rolle? Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Bestandshygiene und dem Nachweis von Y. enterocolitica im Kot? Besteht eventuell ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Bestandsproblemen und dem Nachweis von Y. enterocolitica? Treten humanpathogene Bioserovare auf und ergibt sich daraus eine Gefahr für den Verbraucher?

4 Übersicht über den Nachweis von Y. enterocolitica bei Ziegen und in Ziegenmilch iegen rogstad (1972) Norwegen positiv (3.1 % Kotproben (Serovar O:2) uddle et al. (1987) Nord-Island positiv (6,17 % verendete Ziegen (Biotyp 5) lee et al. (1990) Victoria verschiedenste 5 positiv Australien Ziegenproben (Bioserovar 5, O:2,3 iegenmilch ensen et al. (1980) New South Wales positiv Australien Milchproben (Serovar O:16) ale et al. (1991) Somerset 1 1 positiv England Milchprobe (Bioserovar 2/O:9) oberts (1984) London positiv England Milchproben (Serovar O:6,30/O:7)

5 Denkbarer Eintrag von Y. enterocolitica-isolaten aus Ziegenbeständen in die Lebensmittelkette Ziegenbestände Prävalenz? Faeces Mangelhafte Melkhygiene z.b. Melkstand auf der Weide Rohmilch Anreicherung bei Kühlung möglich Verarbeitung Kreuzkontaminationen Produkte, z.b. Rohmilchkäse Infektionsdosis für den Menschen KBE? Enteritis infectiosa beim Menschen möglich??

6 Untersuchungsmaterial Untersuchungsregion: Niedersachsen Untersuchungszeitraum: März 2001 August 2001 Untersuchte Betriebe: 24 Betriebsgrößen: 5-60 Tiere Produktionsformen: Milch & Fleischproduktion Niedersachsen Probenanzahl: 575

7 Kulturelle Diagnostik von Y. enterocolitica Unterschiedlichste kulturelle diagnostische Verfahren sind beschrieben: z.b. Kälteanreicherung als eine Form der Selektivanreicherung, Selektivanreicherungen, Nicht-Selektive Anreicherungen usw. Internationaler Standard ISO Problematik: stark variierende Untersuchungsergebnisse bei unterschiedlichen Kulturverfahren Isolierungsrate stark abhängig von der Begleitflora des Untersuchungsmaterials Identifizierung, Biotypisierung, Serotypisierung ist aufwendig, methodisch schwierig und oft nicht eindeutig 1 Microbiology General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica

8 Untersuchungsschema I Einwaage von 5g Probe in 45 ml PSB-Bouillon Ausstreichen der Proben auf CIN-Agar-Medium 72 h aerobe Inkubation bei 25 C in Kolben unter langsamen Schütteln h aerobe Inkubation bei 25 C Kulturmorphologische Beurteilung unter Stereomikroskop Phänotyp typische Kuhaugenform

9 Kulturmorphologie der Begleitflora auf CIN-Agar-Medium Enterobacter Citrobacter Providencia Serratia

10 Kulturmorphologische Unterschiede von Y. enterocolitica-serovaren O:3 O:9 Citrobacter Serratia O:8 O:6

11 Untersuchungsschema II Einwaage von 5g Probe in 45 ml PSB-Bouillon Austreichen der Proben auf CIN- Agar-Medium Kulturmorphologische Beurteilung unter Stereomikroskop 72 h aerobe Inkubation bei 25 C in Kolben unter langsamen Schütteln h aerobe Inkubation bei 25 C Phänotyp typische Kuhaugenform Kulturen werden auf Blut-Agar-Medium überimpft und für 24 h aerob bei 25 C inkubiert API 20E Goldstandard Yersinia Identifizierungs- System Auf dem 16S rrna- Gen basierende PCR 16S rrna-pcr + Sequenzierung PCR Yad, yopt

12 Yersinia Identifizierungs-System (Merlin, Bornheim-Hersel) Halbautomatisches System zur Biotypisierung von Yersinia Isolaten. Entwicklung und Evaluierung erfolgte anhand von 250 Yersinia-Reinkulturen (Neubauer et al., 2000). Basiert auf 38 biochemischen Reaktionen. Jeweils zwei Isolate können auf einer 96 Well-Platte biotypisiert werden. Auswertung der 96 Well-Platten erfolgt mittels Photometer.

13 Ergebnisse (Kultur, Serotypisierung, Biotypisierung) Bestand Anzahl der Isolate Biovar Serovar 1 F2 1 x Y. frederiksenii F6 1 x Y. enterocolitica 2 1A - F7 2 x Y. enterocolitica 2 1A 1xO:1/O:2 1xO:8 F8 12 x Y. enterocolitica 2 1A 3 x O:8 F18 1 x Y. enterocolitica 2 1A - F37 1 x Y. enterocolitica 2 1A - Herdenpravälenz von 21 % Einzeltierprävalenz von 3 % 1 Objektträgerschnellagglutination mittels Antiseren gegen O:1/O:2, O:3, O:5, O:6, O:8, O:9 (Innogenetics, Heiden und Sifin, Berlin) 2 Abklärung über Teilsequenzierung der 16S rrna

14 Ergebnisse (Molekularbiologie) I. 16S rrna PCR-Methode zur Bestimmung von Y. enterocolitica innerhalb der Spezies Yersinia Erkannte alle 17 Y. enterocolitica-isolate, die vorher biotypisiert waren richtig. Y.frederiksenii wurde nicht erkannt. Problematik: Positive Ergebnisse bei Serratia spp. und Citrobacter spp. Sehr gute Methode zur Abklärung bereits biotypisierter Isolate! II. yada- und yopt-pcr zur Pathogenitätsprüfung der Isolate Keine positiven Befunde bei den 17 Isolaten! Bestätigung der Annahme, das Y. enterocolitica 1A Isolate keine Virulenzplasmide besitzen! pyv 70 kb

15 Ergebnisse (Bestandsaufnahme) Bestand Haltungsform Hygienestatus 1 Tierarten Bestandsproblem F2 (n=21) Stall mit Auslauf sehr gut Hd. Ektoparasiten F6 (n=62) Stall/Weide mit schlecht Schf., Hd., Lämmer- Melkstand Ktz., Gefl. Erkrankungen F7 (n=30) Stall/Weide mit schlecht Schf., Hd., Endoparasiten Melkstand Ktz., Gefl. F8 (n=38) Stall/Weide mit gut Schf., Hd., Lämmerdurchfall Melkstand Ktz., Gefl., Kälber F18 (n=11) Stallhaltung sehr gut Hd. keine F37 (n=15) Stall/Weide mit schlecht Hd. Listerien, Mastitis Melkstand Endoparasiten 1 Einteilung des Hygienestatus erfolgte in sehr gut, gut, mäßig und schlecht

16 Zusammenfassung und Bewertung der Ergebnisse Die Isolierung von Y. enterocolitica aus Ziegenkotproben war mit einer Einzeltier-Prävalenz von 3 % und einer Herden-Prävalenz von 21 % möglich. Es konnten nur Y. enterocolitica-isolate vom Biotyp 1A nachgewiesen werden. Die Serotypen variierten. Ein Signifikanter Zusammenhang zwischen dem Hygienestatus, etwaigen Bestandsproblemen und dem Nachweis von Y. enterocolitica konnte nicht gezeigt werden. Klassische humanpathogene Isolate sowie Isolate mit Virulenzplasmid konnten nicht nachgewiesen werden Allerdings sind insbesondere bei immunsuppremierten Patienten Erkrankungsfälle durch Y. enterocolitica 1A beschrieben.

17 Danksagung Technische Kräfte: Evelin Brumme, Dana Rüster, Carola Wilke, Csilla Lodri und Robert Schneider Prof. Dr. Martin Ganter, Klinik für kleine Klauentiere, Hochschule Hannover Dr. Heinrich Neubauer, Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München Dr. Uwe Rösler, Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, Leipzig Prof. Dr. Dr. Andreas Hensel, Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin Diese Arbeit wurde in Teilen durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft unterstützt: Graduiertenkolleg Schlachttierbelastung und Produktsicherheit (Deutsche Forschungsgemeinschaft, GRK-39/2)

18 Ich freue mich auf Ihre Fragen