Spezifische Detektion plasmidtragender (pyv + ) Yersinia enterocolitica-isolate mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR)

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1 Spezifische Detektion plasmidtragender (pyv + ) Yersinia enterocolitica-isolate mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 1

2 Klassifizierung: Familie: Enterobacteriaceae Genus: Yersinia (Y.) Spezies: Y. enterocolitica (pyv + ) 1. Allgemeines Yersinia (Y.) enterocolitica steht mit 6571 nach dem Infektionsschutzgesetz für 2003 gemeldeten Enteritis infectiosa Fällen nach wie vor hinter den Salmonellen und Campylobacter Infektionen an dritter Stelle der wichtigsten humanen Durchfallerreger (RKI, 2004). Neben weiteren Eintragsquellen scheint dem Schlachtschwein eine entscheidende Rolle beim Eintrag dieses Erregers in die Nahrungsmittelkette zuzukommen. Aufgrund dessen ist eine an das Schwein adaptierte schnelle und spezifische Diagnostik insbesondere der hochpathogenen Isolate, von besonderem Interesse für den gesundheitlichen Verbraucherschutz. Denn speziell die kulturelle Diagnostik pathogener Y. enterocolitica-isolate ist bis heute mit hohem zeitlichen Aufwand verbunden und mögliche Diagnosen können teilweise aufgrund mangelnder Spezifität und Sensitivität, der zur Zeit verfügbaren kulturellen Testsysteme immer nur unter Vorbehalt gestellt werden oder bedürfen in ihrer Interpretation eines hohen Maßes an Expertise. Bis heute ist trotz der zoonotischen Bedeutung des Erregers neben der ISO (ANONYMUS, 1994) keine allgemeingültige Methode zum bakteriologischen Nachweis pathogener Y. enterocolitica-isolate beschrieben. Erschwerend kommt hinzu, dass allein die Vielzahl der bis heute beschriebenen Verfahren in vergleichenden Untersuchungen zu widersprüchlichen Ergebnissen führt. Dazu zählt auch die standardisierte Methode nach ISO zum Nachweis pathogener Y. enterocolitica-isolate. Allen Verfahren ist der erhebliche Zeitbedarf des Nachweises gemeinsam, der bis zu 10 Tage betragen kann. Hinzu kommt noch, dass die wesentlichen Pathogenitätsdeterminanten von humanpathogenen Yersinien extrachromosomal auf Virulenzplasmiden lokalisiert sind (HEESEMANN, 1994). Alle Y. enterocolitica-stämme mit voller Virulenz besitzen ein Plasmid von 70 kb Größe. Dieses Virulenzplasmid wird mit pyv (plasmid for Yersinia virulence) abgekürzt. Es ist zwingend für die volle Pathogenität eines Y. enterocolitica-isolates erforderlich (CORNELIS et al., 1998). Diese AVID-Anweisung beschreibt eine PCR-Methode, die anhand von definiertem Probenmaterial aus verschiedensten Infektionsversuchen sorgfältig an den Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica-stämmen in verschiedensten Gewebematerialien vom Schwein adaptiert wurde. Dazu wurde, basierend auf Datenbankanalysen, als Zielgen für den PCR-Nachweis der plasmid-kodierte Virulenzmarker yopt verwendet. Eine Gensequenz des Virulenzplasmids wurde ausgewählt, da insbesondere plasmidtragenende Y. enterocolitica-isolate volle Pathogenität besitzen. Die Methode soll helfen die Diagnostik von pathogenen (plasmidtragenden) Y. enterocolitica- Isolaten zu verbessern. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 2

3 2. Untersuchungsmaterial Die vorliegende Methode ist an verschiedenste Gewebe vom Schlachtschwein (Tabelle 1) und Kot vom Schwein adaptiert. Darüber hinaus kann man mit dieser molekularbiologischen Methode die Pathogenität von Y. enterocolitica-isolaten, die klassisch kulturell isoliert wurden, bestimmt werden. Tabelle 1. Gewebeproben zur Y. enterocolitica (pyv + ) Diagnostik in Schlachtschweinen. Gewebeproben Tonsille Mandibularlymphknoten Gallenflüssigkeit Milz Jejunum + Inhalt Ileum + Inhalt Colon + Inhalt Caecum + Inhalt Lnn. Ileocolici Jejunal-Lymphknoten Colon-Lymphknoten Muskulatur Besonders geeignet für den Nachweis einer Y. enterocolitica-infektion am Schlachtschwein ist Probenmaterial der Tonsille und des Colonlymphknotens. Durch Untersuchungen anhand von gezielt kontaminierten Kotproben und Lymphgewebe konnte eine Nachweisgrenze für Kotproben von 10 2 Keimen/g Kot und für Lymphgewebe von 10 1 Keimen/g Lymphgewebe bestimmt werden. 3. Untersuchungsgang 3.1 Kulturelle Voranreicherung Das Organmaterial sollte möglichst steril entnommen werden und im Labor in Spiritus getaucht, äußerlich über einem Bunsenbrenner abgeflammt und jeweils 5 g in 25 ml YPCE (Yersinia PCR Compatible Enrichment)-Bouillon (KNUTSSON et al., 2002) eingewogen werden. Die Zusammensetzung dieser Bouillon entnehmen sie bitte dem Anhang. Anschließend wird das Material bei höchster Stufe für 2 min im Stomacher 400 (Fa. Seward, London, UK) in einem Stomacherbeutel (Fa. Seward, London, UK) homogenisiert und dann bei 28 C für 24 Stunden im Beutel aerob bebrütet. Kotproben werden ebenfalls zu 5 g in 25 ml YPCE-Bouillon eingewogen und dann wie die Organproben (s.o.) weiterbehandelt. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 3

4 3.2 DNA-Extraktion aus dem Voranreicherungsmedium (YPCE-Bouillon) 1 ml angereicherte YPCE-Bouillon wird für 3 min bei 300 x g in einem 1,5 ml Eppendorf- Reaktionsgefäß zentrifugiert, der Überstand wird in ein neues Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und das Pellet verworfen Der Überstand wird bei x g für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert und dann erneut bei xg (5 min) zentrifugiert Pellet wird in 200 µl Lysis-Puffer (siehe Anhang) mit ProteinaseK resuspendiert und bei 56 C für 1 h inkubiert Erhitzung des Reaktionsgefäßes auf 94 C für 10 min zur Inaktivierung der ProteinaseK Zentrifugation bei x g für 5 min und Einsatz von 10 µl Überstand im 50 µl PCR- Ansatz Abbildung 1. Schrittdiagramm für die DNA-Extraktion aus Gewebeproben vom Schwein nach vorangegangener kultureller Anreicherung. Die Abbildung zeigt verschiedene Zentrifugationschritte mit abschließendem ProteinaseK Verdau zur DNA-Extraktion für den Einsatz in der PCR-Diagnostik. 3.3 Oligonukleotide/Primer Mit Hilfe eines neu konstruierten Oligonukleotidpaares/Primerpaares (Arnold et al., 2001) kann ein spezifisches, 485 bp großes Produkt des yopt-gens auf dem Virulenzplasmid von pathogenen Y. enterocolitica amplifiziert werden. Die entsprechenden Primersequenzen entnehmen sie bitte Tabelle 2. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 4

5 Tabelle 2. Oligonukleotidsequenzen/Primersequenzen für die Y. enterocolitica (pyv + )-Diagnostik Oligonukleotid Oligonukleotid-Sequenz Zielgen Referenz yopt-fw1 5 -TAT GTG CAC ATT GGA TTT-3 yopt-r1 5 -AAT GAT ACA TAG AAT TTT- 3 } yopt } ARNOLD et al. (2001) 3.4 PCR-Mastermix Alle Reaktionen werden in einem Volumen von 50 µl pro PCR-Ansatz in 200 µl PCR- Reaktionsgefäßen (Fa. Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) durchgeführt. Jeder PCR-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen: 18 µl ddh 2 O 20 µl Eppendorf Mastermix 2,5 fach konzentriert (Fa. Eppendorf, Hamburg) 1 µl Primer yopt-fw1 (µm pro Ansatz) 1 µl Primer yopt-r1 (0,5 µm pro Ansatz) 10 µl aufbereitete Probe (DNA) alternativ 13 µl ddh 2 O 25 µl peqgold PCR-Master-Mix S 2 x Konzentriert (Fa. Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) 1 µl Primer yopt-fw1 (0,5 µm pro Ansatz) 1 µl Primer yopt-r1 (0,5 µm pro Ansatz) 10 µl aufbereitete Probe (DNA) Bei den hier angegebenen kommerziellen Mastermix-Ansätzen handelt es sich nur um Empfehlungen aus eigener Erfahrung heraus. Selbst zusammengestellte Reaktionsansätze mit Reagenzien von unterschiedlichen Herstellern wurden auch ausprobiert und ergaben ebenfalls sensitive sowie spezifische Ergebnisse. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 5

6 3.5 DNA-Amplifikation Thermocycler: I. Perkin Elmer GeneAmp 2400 Thermocycler II. Eppendorf Mastercycler oder vergleichbare Geräte Amplifikationsprotokoll 1 94 C 5 min 2 94 C 60 sec 3 43 C C 72 C 60 sec 10 min 40 sec 35 Zyklen 1. Initiale Denaturierung 2. Denaturierung 3. Annealing 4. Extension } 5. Finale Extension 35 Zyklen 3.6 Kontrollen Bei jeder durchzuführenden PCR sind eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mitzuführen. Als Positivkontrolle wird in ein PCR-Tube anstatt DNA einer aufbereiteten Probe 10 µl DNA des Referenzstammes Y. enterocolitica DSM (pyv+) einpipettiert. Ebenfalls gut geeignet als Positivkontrolle ist eine Probe, die bekanntermaßen Y. enterocolitica (pyv+) positiv ist und die genau wie die zu testenden Proben durch das Procedere der DNA-Aufbereitung mitgeführt wird und dann als Template in der PCR eingesetzt wird. Als Negativkontrolle dient ein Ansatz, in dem anstatt DNA lediglich 10 µl ddh 2 0 mitgeführt werden. Aber auch hier eignet sich ebenfalls eine bekanntermaßen Y. enterocolitica (pyv+) negative Probe, die auch durch das Prozedere der DNA- Aufbereitung mitgeführt wird, um dann als Template in der PCR eingesetzt zu werden. Nur ein PCR-Lauf, in dem die Positivkontrolle positiv und die Negativkontrolle negativ ist, ist als auswertbar anzusehen. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 6

7 3.7 Elektrophorese und DNA Detektion Pro PCR-Probe werden 10 µl des Amplifikates mit 2 µl DNA-Auftragspuffer (Fa. Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) vermischt und in die Taschen eines 2 % igen Agarose-Gels überführt und 30 min bei einer Spannung von 140 V aufgetrennt. Danach wird das Agarosegel im Ethidiumbromid-Bad (0,25 µg Ethidiumbromid (Fa. Amresco, Solon, Ohio, USA) pro Milliliter Aqua bidest.) für 15 min gefärbt und anschließend in Aqua bidest. für 10 min gewässert und die DNA- Fragmente mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm in einem Geldokumentationssystem (Gel Doc 2000 der Fa. Biorad, München) sichtbar gemacht und dokumentiert. Die Länge des DNA-Fragmentes (485 bp) aus der PCR wird durch den Vergleich mit einem 100 bp-längenstandard bestimmt. Beispiel: Gewebeprobe LS + - To Maly Ge Le Gf Je Il Co Ca Luly Icly Jely Coly Mus bp Abbildung 2. Detektion pathogener Y. enterocolitica in Gewebeproben von einem experimentell mit Y. enterocolitica 4/O:3 infizierten Hybridschwein mittels yopt-pcr- Methode. Der spezifische Nachweis war in den Organen Tonsille, Jejunum, Ileum, Colon und Lnn. ileocolici, diese Organe sind in der Beschriftung hervorgehoben. In Spur eins ist der Längenstandard (LS), in Spur zwei die Positiv-Kontrolle (+) und in Spur drei die Negativ- Kontrolle (-) aufgetragen. To, Tonsille; Maly, Mandibularlymphknoten; Ge, Gehirn; Le, Leber; Gf, Gallenflüssigkeit; Je, Jejunum; IL, Ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, Colonlymphknoten; Mus, Muskulatur. 3.8 Spezifitätsprüfung Die Spezifitätsprüfung des spezifischen 485 bp großen Amplifikates erfolgt durch Restriktionsverdau mittels der Restriktionsendonuklease Bcl I (Tabelle 3). Der 20 µl Ansatz für den Restriktionsverdau setzt sich jeweils aus 1 µl Bcl I (10u/µl) (Fa. Fermentas, St. Leon Rot), 2 µl Puffer G + (Fa. Fermentas, St. Leon Rot), 5 µl PCR- Produkt und 12 µl Aqua bidest. zusammen. Der Ansatz wird bei 55 C für 1,5 Stunden in einem 200 µl PCR-Reaktionsgefäß im Thermocycler inkubiert. Der sich anschließende Nachweis der Produkte wird in einem 2 %igen (v/v) Agarose-Gel elektrophoretisch mit anschließender Ethidium-Bromid-Färbung geführt. Die Restriktonsendonuklease spaltet das spezifische Produkt von 485 bp in zwei Produkte mit einer Größe von 362 bp und 123 bp. PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 7

8 Tabelle 3. Restriktionsendonuklease Enzym Schnittstelle Aktivitätstemperatur Bcl I (Fa. Fermentas, St. Leon-Rot) 5 T GATCA 3 3 ACTAG T 5 55 C 4. Validierung der PCR-Methode Zur Spezifitätsprüfung, der für pathogene Y. enterocolitica-isolate spezifischen Oligonukleotide/Primer, wurden insgesamt 196 Yersinia-Stämme getestet. Weiterhin wurden 14 Nicht-Yersinia-Stämme, die in Proben aus Schweinen eine Rolle spielen können bzw. als mögliche Kontaminationen der Proben von Bedeutung sind, geprüft. Bei diesen Untersuchungen konnte eine 100 %ige Spezifität der vorliegenden PCR- Methode gezeigt werden (Arnold et al., 2001). Die Validierung der Kombination aus Voranreicherung in YPCE-Bouillon und anschließender yopt-pcr für die Detektion von pathogenen Y. enterocolitica- Isolaten erfolgte anhand von definiertem Probenmaterial aus einem Infektionsversuch, der am Institut für Tierhygiene und öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig durchgeführt wurde. Insgesamt standen 243 Gewebeproben aus einem mit Y. enterocolitica 4/O:3 (DSM 13030) im Schwein durchgeführten Versuch zur Verfügung Arnold et al. (2003). Im Vergleich zum Goldstandard der kulturellen Untersuchung nach ISO (Anonymus, 1994) konnte eine 100 %ige Sensitivität errechnet werden. Ein Verlust des Virulenzplasmides, wie häufig in der Literatur beschrieben, konnte weder bei den getesteten Reinkulturen noch im Verlaufe des Infektionsversuches beobachtet werden und führte in unseren Untersuchungen zu keiner Zeit zu falsch negativen Ergebnissen im Vergleich zur kulturellen Diagnostik (ISO 10273). 5. Problematik beim Nachweis von Yersinien mittels PCR-Methode Die Arbeitsgruppe um NAKAJIMA (1994) berichtete, dass sie PCR-Produkte von Y. enterocolitica nach einer Lagerung bei 4 C über Nacht nicht mehr nachweisen konnten, wenn sie lediglich aufgekochte Y. enterocolitica Bakteriensuspensionen als Template einsetzten. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass nach Zugabe eines PCR-Ansatzes inklusive PCR-Produkt von Y. enterocolitica nach durchlaufenen PCR-Zyklen zu einem weiteren PCR-Produkt von Y. pseudotuberculosis innerhalb von zwei Stunden beide Produkte abgebaut wurden. Durch einen zusätzlich eingeführten Schritt des ProteinaseK-Verdaus der Bakteriensuspension vor dem Einsatz als Matritze in der PCR-Reaktion konnte ein Abbau des Produktes verhindert werden. Das spezies-spezifische Vorkommen einer thermostabilen Desoxyribonuklease (DNase) bei Y. enterocolitica, die 25 und mehr PCR-Zyklen überstehen kann, konnte bereits festgestellt werden (NAKAJIMA et al., 1994). Somit besteht prinzipiell immer PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 8

9 die Notwendigkeit eines vorhergehenden ProteinaseK-Verdaus, wenn man Y. enterocolitica-isolate zweifelsfrei mit der PCR-Methode nachweisen will. Die Erfahrungen dieser Arbeitsgruppe konnten in eigenen Untersuchungen bestätigt werden (Arnold, 2002). Aus diesem Grund ist der Proteinase K-Verdau (s.o.) vor dem Einsatz der DNA als Template in der PCR als unbedingt erforderlich anzusehen. Aber auch bei einem vorhergehenden Proteinase K-Verdau sollte nach Möglichkeit verhindert werden, dass PCR-Produkte von Y. enterocolitica über einen längeren Zeitraum bei 4 C gelagert werden, wie es z.b. der Fall ist, wenn man einen PCR- Ansatz über Nacht angesetzt hat. 5. Literatur 1. Anonymus (1994): Microbiology-General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica. International Organization for Standardization, ISO 10273, Genf, Schweiz. 2. Arnold, T., Hensel, A., Hagen, R., Aleksic, S., Neubauer, H., Scholz, H. C. (2001): A highly specific one-step PCR-assay for the rapid discrimination of enteropathogenic Yersinia enterocolitica from pathogenic Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis. Syst. Appl. Microbiol. 24, Arnold, T. (2002): Nachweis von Salmonella und Yersinia enterocolitica im persistent infizierten Schwein. Universität Leipzig, Dissertation, 4. Arnold, T., H. Scholz und A. Hensel (2003): Validierung einer PCR zum Nachweis von Yersinia enterocolitica beim Schwein. AVID-Mitteilungen der 22. Arbeits- und Fortbildungstagung des AVID (Arbeitskreis für Veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik), September, Kloster Banz, Staffelstein. 5. Cornelis, G. R., Boland, A., Boyd, A. P., Geuijen, C., Iriarte, M., Neyt, C., Sory, M. P., Stainier, I. (1998): The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, Heesemann, J. (1994): Die Gattung Yersinia, Yersiniosen. In: Brandes, H., Köhler, W., Eggers, H. J., Pulverer G. (Hrsg.): Lehrbuch der Medizinische Mikrobiologie, Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, Knutsson R, Blixt Y, Grage H, Borch E, Radstrom P. (2002): Evaluation of selective enrichment PCR procedures for Yersinia enterocolitica. Int. J. Food Microbiol. 25, Nakajima, H., Itoh, K., Arakawa, E., Inoue, M., Mori, T., Watanabe, H. (1994): Degradation of a polymerase chain reaction (PCR) product by heat-stable deoxyribonuclease (DNase) produced from Yersinia enterocolitica. Microbiol. Immunol. 38, RKI (2004): Infektionsepidemiologisches Jahrbuch meldepflichtiger Krankheiten für ISBN , Berlin, 2004 PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 9

10 6. Sachbearbeiter Alle Arbeiten, die es ermöglichten diese AVID-Anweisung zu erstellen, wurden im Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig, An den Tierkliniken 1, Leipzig unter der Leitung von Herrn Professor Dr. Dr. Andreas Hensel und Herrn Professor Dr. Uwe Truyen durchgeführt. Darüber hinaus wurden die Arbeiten in Teilen durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Graduiertenkollegs Schlachttierbelastung und Produktsicherheit (GRK-39/2) gefördert. Korrespondenzadresse des Sachbearbeiters: Dr. Thorsten Arnold Veterinärlabor Ankum Grüner Weg Ankum Tel.: Fax: vet-labor-dr.arnold@t-online.de oder Dr.ThorstenArnold@t-online.de PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 10

11 Anhang Voranreicherung YPCE (Yersinia PCR Compatible Enrichment) Bouillon (Knutsson et al. 2002) Tryptone (Fa. Merck, Darmstadt, Katalog-Nr ) 10 g/l MOPS (3-[N-Morpholino]propaneselfonic Acid) (Fa. Sigma, Aldrich) 2,75 g/l D-Sorbitol (Fa. Sigma, Aldrich) 20 g/l Autoklavieren der Bouillon für 15 min bei 121 C, dann Abkühlen lassen auf 25 C, davon werden 983 ml in ein neues steriles Gefäß überführt. Daraufhin werden dann noch folgende Inhaltsstoffe dazugegeben: 2 Gefäße Yersinia Selective Supplement (Cefsulodin-irgasan-novobiocin, CIN) (Fa. Merck, Darmstadt Katalog-Nr ) Das Lyophilisat wird in diesem Fall in sterilem, destilliertem Wasser aufgelöst. 5ml 0.8 M sterilisierter potassium chlorate Solution (10g KClO 3 (Fa. Merck, Damstadt) gelöst in 100 ml H 2 O Die fertige Bouillon wird dann durch Zugabe von steriler KOH-Lösung (max. 10ml) auf einen ph-wert von 8.2 +/- 0,1 eingestellt. Gebrauchslösungen für die DNA-Extraktion Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), 0,15 M, ph 7,4 NaCl 85,0 g Na 2 HPO 4 (x 2H 2 O) 14,8 g (18,56) KH 2 PO 4 3,45 g Aqua bidest. ad 1 Liter Diese Stocklösung 1:10 in Aqua bidest. verdünnt ergibt die Gebrauchslösung mit ph-wert 7,2-7,4. Die Gebrauchslösung ist vor ihrem Einsatz zu autoklavieren. Lysis-Puffer mit ProteinaseK ProteinaseK 2 mg Tween 20 (0,5 % Lösung) 50 µl Aqua bidest. ad 10 ml PCR/Yersinia enterocolitica (pyv + ) 11