DEARGINOPROTEIN. (Aus dem biochemischen Institut der Kaiseriichen Universitut zu Tokyo. Vorstand: Prof. Dr. S. Kakiuchi.)

Transkript

1 UBER DEARGINOPROTEIN. VON SHOYO SAKAGUCHI. (Aus dem biochemischen Institut der Kaiseriichen Universitut zu Tokyo. Vorstand: Prof. Dr. S. Kakiuchi.) (Eingegangen nm 20. Marz 1925) Bis jetzt gibt es viele Untersuchungen fiber die Einwirkung von Natriumhypochlorit resp. bromit auf Aminosauren oder Proteinstoffe. Aber die meisten Autoren haben ihre Arbeit beim Abschluss von freiem Alkali ausgefiihrt oder dabei den Einfluss von Alkali vernaeblassigt. Nach Langheld (1909), der das Hypochlorit auf Aminosaure moglichst inter Vermeidung von freiem Alkali einwirken liess, soil zuerst Monochloraminosaure gebildet werden, welche demnilchst Stickstoff abspaltend in Alde hyd oder Ketone sich zersetzt. Die Umsetzimg geht aber bei der Gegenwart von Alkali ganz anders vor sich. Schon vor zwei Dezennien hat J. Stuchetz((1906) angegeben, dass die Aminosaure wie Glykokoll, Alanin, Leucin, Glutaminsaure, Tyrosin, Lysin mit Bromlauge kein N-Gas entwickelt und nur das Arginin etwa ein Drittel davon abgibt. Das Stickstoffgas muss also hier nicht dem ƒ -Aminostickstoff der gewohnlichen Aminosauren, sondern dem Guanidin-N des Arginins entstammen. Man muss also bei der Ausfuhruug meiner Eiweissfarbenreaktion, welche durch das Vor haudensein des Argininmolekiils und zwar des intakten Guaui dinrestes bedingt ist, den Uberschuss von Hypochloritlosung vermeiden, damit das Guanidin dadurch nicht zersetzt wird. Als ich das Eiweiss bei stark alkalischer Reaktion solange mit Natriumhypochlorit (resp. bromit) versetzte, bis meine Eiweiss farbenreaktion negativ ausfiel, wollte ich untersuehen, wieweit eigene Peptidbindtmg im Proteinkorper noch erhalten bleibt. Ich fand dabei einen Korper, der in schwach angesiuertem Wasser ganz unloslich ist and Argininfarbenreaktion nicht mehr gibt. 143

2 144 S. Sakaguchi: Diesen durch Desamidierung des Argininteils entstandenen Korper will ich Dearginoprotein nennen. I. DEARGINOBASEIN. Dearginokasein wurde in folgender Weise durch Einwirkung von NLatriurnhypochlorit auf Kasein dargestellt. Darstellung. 50 g Kasein wird zuerst mit Hilfe von wenig Alkali in 500 ccm Wasser gelost. Zu dieser Losung fugt man enter Eiskiihlung 200 ccm 30 proz. Natronlauge and portionsweise soviel Natrium hypochloritlosung, welche 6 proz. NaOCl in sich enthalt, bis die Flussigkeit meiner Farbenreaktion gegenuber vollkommen negativ ausfallt, indem man einen kleinen Teil davon mit Schwefel saure schwach ansauert und die dabei abgeschiedene Masse zur Untersuchung nimmt. Bei negativem Ausfall der Farbenreaktion wird weiterer Zusatz von Hypochlorit aufgehort. Dazu wird gewohnlich 600 ccm Natriumhypochloritlosung gebraucht. Bei diesem Verfahren beobachtet man, dass die Eiweisslosung unter der starken Stickstoff und W irmeentwicklung zuerst gallertartig und dann wieder fliissig wird. Der Zusatz von Ather oder Alkobol schutzt vor Schaumbildung. Zunachst wird die Flussigkeit nach dem Zusatz von Natriumbisulfit mit 30 proz. Essigsaure schwach alkalisch oder neutral gemacht und einige Tage lang gegen Lei tungswasser dialysiert. Das Dialysat wird dann mit Wasser vielfach verdiinnt und mit verdiinnter Schwefelsaure angesauert. Der dabei ausgefallte Niederschlag wird durch Ammoniak oder Alkalizusatz in Wasser gelost, urn wieder mit Schwefelsaure gefallt zu werden. Das Auflosen und die Fallung werden noch zweimal wiederholt. Endlich wird der Niederschlag mit Wasser bis zum Verschwinden der Sulfatreaktion gewaschen und danach in einem Becherglase mit Ather zusammengemischt, wobei er allmahlich zusammen ziehend Wasser abpresst. Die moglichst von Wasser befreite Substanz wird pulverisiert und an der Luft getrocknet. Die Ausbeute ist ungefahr 6-7% des angewandten Kaseins. Das so

3 Uber Dearginoprotein. 145 dargestellte Praparat bezeichne ich unten als Praparat A. Als ich dieses Praparat, wie unten erwahnt, weiter mit einer grossen Menge von Hypochlorit behandelte, erhielt ich wieder einen Korper, der anscheinend mit ihm identisch war. 50g Prap. A wurden mit 500 cem Wasser, 200 ccm Natron lauge (10%) und 500 ccm 6 proz. Natriumhypochloritlosung be handelt und weiter wie bei Prap. A ausgefuhrt. Auf these Weise erhielt ich eine dem Prap. A ahnliche Substanz, welehe ich unten als Prap. B bezeichne. Diese Ausbeute betrug dabei ungefahr 1/3 des angewandten Materials. Eine dem Prap. A ahnlicbe Substanz kann auch bei der Anwendung von Natriumhypobromit dargestellt werden. Mit letz terem Reagens dargestelltes Praparat bezeichne ich unten als Prap. C. Zusammensetzung der einzelnen Praparate. Praparat A. 0,9412g Substanz gaben beim Verbrennen 0,0019g Ruckstand, mithin 0,202% Asche. Ausserdem wurde die elementare Analyse an dieser Substanz ausgefuhrt und die Resultate sind auf aschefreie Substanz berechnet. I. Die elementare Zusammensetznng des Praparates A.

4 146 S. Sakaauchi: Prdparat B. 1,1021g Substanz gaben beim Verbrennen 0,0021g Ruckstand, within 0,191% Asche. Die Untersuchungsresultate caber die elementare Zusammensetzung sind in folgender Tabelle angegeben. II. Die elementare Zusammensetzung des PrKparates B. Prc parat C. 1,1219g Substanz gaben beim Verbrennen 0,0024g Ruckstand, mithin 0,214% Asche. Die Uutersuchungsresultate fiber die ele mentare Zusammensetzung sind in folgeuder Tabelle angegeben. III. Die elementare Zusammensetzung des Praparates C.

5 Uber Dearginoprotein. 147 Aus den Tabellen ersieht man, dass die Zusammensetzung von Praparat A und B sehr ahnlich ist und auch das Prapa rat C nur dadurch sich von den beidea andern unterscheidet Brom statt Chlor enthalt. Eigenschaften., dass es Die 3 erw ihnten Praparate besitzen miteinander analoge Eigenschaften. Dearginokasoin stellt ein strohgelb gefarbtes Pul ver dar, welches in Wasser schwer loslich und in absolutem Alkohl wie Ather unloslich ist. In frisch gefalltem Zustande lost es sich etwas in wasserhaltigem Alk.ohole. Die Substanz besitzt einen sauren Charakter und bildet mit Ammoniak, Alkali und Erdalkali in Wasser losliche Salze. Diese Losungen difundieren nicht durch das Membran und erzeugen mit den Schwermetallsalzen einea voluminosen Niederschlag. Was die Farbenreaktionen des Eiweisskorpers anbetrifft, ver halt die Substanz sich wie folgt: 1. Biuretreaktion ist positiv, doch verfarbt. 2. Millon sche Reaktion. Mit diesem Reagens gibt sie einen weisslichen Niederschlag, welcher beim Koclien sehr wenig braunlich sich farbt. 3. Xanthoproteinreaktion. Sie wird beim Kochen mit Salpe teraaure schwach gelb, aber bei Zusatz von Ammoniak nicht orange. 4. Adamkiewiczsche Reaktion sowie Hopkin-Colesche Reaktion sind vollig negativ. 5. Pauly sche Diazoreaktion ist positiv. 6. Schwefelbleireaktion ist negativ. 7. Reakt ion von Molisch ist negativ. 8. Meine Farbenreaktion ist fast negativ. Weil das vorliegende Protein von dem naturlichen ziemlich stark verscbieden zu sein scheint, so wird es eine interessante Frage sein, wie es durch Verdauungsfermente abgespalten wird. Ich habe also folgende Untersuchungen ausgefiihrt. Pepsinverdaung, 0,5g Dearginokasein (Prap. A.) warden in

6 148 S. Sakaauchi: 50 ccm-messkolben mit 40 ccm Pepsinlosung (0,2g Pepsin in 100 ccm 0,1n-Salzsaure) unter dem Toluolzusatz 5 Tage lang bei 37 Ž digeriert. Obwohl die Mischuug inzwischen mehrmals geschuttelt wurde, so blieb das Protein grosstenteils ungelost. Nachdem esbis zur Marke gefullt war, wurde die Flilssigkeit abfiltriert und 2 ccm davon zur Amino-N-Bestimmung nach Van Slyke gebraucht. Andererseits wurden 0,5g Kasein als Kontrolle ganz gleich behaudelt und ausserdem nosh Arnino-N-Menge von 2 cem verdiinnter Pepsinlosung, welche durch Verdiinnen von 40 ccm originaler Losung zu 50 ccm hergestellt wurde, ebenso bestimmt. (Tabelle IV.) Trypsinverdauung. 0,5g Dearginokasein (Prap. A) resp. als Kontrolle 0.5g Kasein wurden in 50 ccm-messkolben mit 40 ccm Trypsinlosung (0,1g Pankreatin mit 0,5g Soda in 100 ccm Wasser) outer dem Toluolzusatz 5 Tage lang bei 37 Ž verdant. Mit dem Wasser bis zur Marke gefullt, wurde die Mischung filtriert und 2 ccm des Filtrates zur Bestimmurg von Amino-N genommen. (Tabelle IV.) IV.

7 Ubor Dearginoprotein, 149 Wie die Tabelie zeigt, ist die Amiuosti.ckstoffmenge, welche aus der mit Pepsin resp. Trypsin verdauten Eiweissfliissigkeit erhalten wird, beim Dearginokasein bedeutend geringer als beim Kasein. Base nbindungsvermogen. Wie bekannt verhalt sich das Kasein gegeniiber den Alkalien wie eine Sauce. Nach Laqueur und Sackur (1902) ist das Basen bindungsvermogen von 1 g Kasein 8,81 corn n/10-natronlauge. Dasjenige von Dearginokasein wird wohi nosh grosser sein, weil der basisch reagierende Guanidinrest des Arginins bei diesem fehlt. Um zu wissen, wie die Sache in Wirklichkeit sich verhalt, habe ich im folgenden Versuche das Basenbindungsvermogen dieses Proteinkorpers bestimmt. Dazu wurde ein Teil der frisch gefallten, gut ausgewaschenen Substanz in Wasser suspendiert und wit n/10-baryt titriert, indem Phenolphtalein dabei als Indikator gebraucht wurde. Andererseits wurde der N-Gehalt der Suspension nach Kjeldahl ermittelt und daraus der Eiweissgehalt berechnet. V.

8 150 S. Sakauuchi: Man ersieht aus der Tabelle, dass alle Praparate annahernd eine gleiche Aciditat haben. Praparat B ist jedoch etwas starker als Praparat A und C. Vergleicht man nun diesen Wert mit dem von Laqueur und Sackur an Kasein erhaltenen, so wird man finden, dass dieser 2.1 mal grosser ist, als jener. N-Verteilung der charakteristischen Atomgruppen der hydrolytisch gespaltenen Produkte. Da Praparat A, B and C annahernd gleiche Eigenschaften und Zusammensetzung haben, so wollte ich ihre hydrolysierten Produkte naher vergleichend untersuchen. 2,5g zu untersuchende Substanz wurden mit 30 ccm einer 20 proz. Salzsaure 24 Standen gekocht und die N-Verteilung der charakteristischen Atomgruppe nach van Slyke untersucht. In folgender Tabelle ist eine Mittelzahl aus Doppelversuchen ange geben. VI. Wie aus der Tabello ersichtlich ist, stimmeu die Stickstoffwerte von drei Praparaten miteinander ziemlich gut iiberein, wahrend sie von denen des Kaseins, besonders in Bezug auf Argininstickstoff

9 Uber Dearginoprotein. 151 wie auf Ammoniakstickstoff u. a., deutlich abweichen. Der Am moniakstickstoff-gehalt des Dearginokaseins ist ungefahr zweimal so gross als der des Kaseins. Dleser Stickstoff soil bei natiirlichen Proteinstoffen mit der Karboxylgruppe von gewisser Aminosaure saureamidartig gebunden sein. Osborne, Leavenworth und Brautlecht (1908) betonen, dass die Menge von Ammoniak, das bei der Hydrolyse eines Proteinstoffes frei wird, zum Gehalt an Asparaginsaure und Glutaminsaure in Beziehung steht. Aber bei Dearginokasein muss der Ammoniakstickstoff zum Teil anderen Ursprung haben, da die Dikarbonsaure bei diesen nicht in grosserer Menge vorhanden ist, wie es im folgenden bezeichnet werden soil. Die bei der Hydrolyse entstehenden Aminosauren. Die Hydrolyse wurde teils durch Schwefelsaure, teils durch Salzsaure ausgefiihrt. Dazu wurde nur Praparat A angewandt. Hydrolyse mit Schwefelsaure. 30g Dearginokasein wurden mit 30 pron. Schwefelsaure 14 Stunden lang gekocht und die Bestimmung der Diaminosaure nach Kossel ausgefiihrt. VII. Bei Histidinfraktion wurde die Pauly sche Diazoreaktion merkwurdigerweise fast vermisst. Man kann also sagen, dass das intakte Histidin in dieser Fraktion fehlt. Argininfraktion. Obwohl these Fraktion meiner Farbenreak tion gegeniiber nicht ganz negativ war, so muss ihre Menge

10 152 S. Sakaguchi: hochstens 0,05 oder 0,1% betragen, wenn man sie nach der Intensitat meiner Farbenreaktion mutmasst. Hieraus folgt, dass die oben anseinandergesetzte Stickstoffinenge der Histidin und Argininfraktion keineswegs die echte Menge von den genaunten Aminosauren angibt. Aus Lysinfraktion konnte ich 2,75g Pikrat darstellen, woraus 3,87% Lysin sich berechnen lassen. Hydrolyse mit rauchender Salzsdure. 300g Dearginokasein wurden mit 3 fachen Vol. rauchender Salzsaure 8 Stunden lang erhitzt. Im Hydrolysat bestimmten wir die einzelne Aminosaure mit Hilfe der Fische rschen Ester methode und folgende Aminosaure waren isoliert und identifiziert wurden: Alanin, Valin, Leucin, Prolin Asparaginsaure, Glutamin saure und Phenylalanin. Der Gehalt der einzeluen Aminosaure stimmte im grossen und ganzen mit dem von Fischer angegebenen ilberein. Man wird ersehen, dass die in Kasein enthaltene Aminosaure grosstenteils noch in diesem Dearginokasein gefunden wird. Hier aus kann man schliessen, dass das Dearginokasein ein unmittelbares Umwandlungsprodukt des urspriinglichen Kaseins ist. Nur einige Aminosauren darin wie Arginin, Histidin, Tryptophan und Tyrosin sind sehr stark angegriffen. Dearginoprotein kann man auch aus anderen Proteinstoffen darstellen. Nur Dearginoglutin, das aus Gelatine durch Einwirkung von Natriumhypochlorit dargestelit wird, hat eine etwas andere Eigenschaft. Es wird aus seiner Losung durch Ansauerung mit Schwefelsaure nicht gefallt. Im folgenden will ich memo Unter suchungsresultate fiber Dear oinoedestin und Dearginoovalbumin mitteilen., II. DEARGINOEDESTIN. Darstellung. 50g Edestin wurden mit 500 ccm Wasser, 200 ccm 30 proz.

11 Uber Dearginoprotein. 153 Natronlauge und 800 ccm 6 proz. Natriumhypochloritlosung ver setzt. Die Ausbeute war 5-7% des Ausgangsmaterials. Die Eigenschaften Bind ganz dieselben wie bei Dearginokasein. Zusammensetzung. 0,9920g Substanz gaben beim Verbrennen 0,0021g Riickstand, within 0,212% Ascbe. Die Untersuchnngsresultate der Elementar analyse, welche auf aschefreie Substanz berechnet wurde, rind in folgender Tabelle angegeben. VIII. Basenbindungsvermogen. Die Bestimmung wurde wie bei Dearginokasein ausgefiihrt. IX.

12 154 S. Sakaguchi: N-Verteilung der charakteristischen Atomgruppen der hydrolytisch gespaltenen Produkte. Die Bestimniung wurde wie bei Dearginokasein ausgefiihrt. X. III. DEARGINOOVALBUMIN. Es wurde aus dem ammonsalzfreien, reinen Ovalbumin nach oben erwahnter Weise dargestellt. Die Eigenschaften sind dieselben wie bei Dearginokasein. Zusammonsetzung. 1,2021g Substanz gaben beim Verbrennen 0,0026g Riickstand, mithin 0,216% Asche. Das Resultat der Elementaranalyse ist tabellarisch verzeichnet. XI.

13 Uber Dearginoprotein. 155 ausgefuhrt. Basenbindungsvermogen. Die Bestimmung wurde wie bei den vorangehenden Versuchen XII. N-Verteilung der charakteristischen Atomgruppen der hydrolytisch gespaltenen Produkte. Die Bestimmung wurde wie oben erwahnt ausgefiihrt. XIII.

14 156 S. Sakaguchi: VI. SCHLUSS. 1. Dearginoprotein wird durch Einwirkung von Natrium hypochlorit auf den Proteinstoff bei Gegenwart von uberschussigem freien Alkali dargestellt. Uberschuss von Hypochlorit scheint dabei auf seine Besehaffenheit und Zusammensetzung keinen Einfluss zu haben. 2. Dearginoproteine, die aus Kasein, Ovalbumin, Edestin u. a. dargestellt wurden, haben gemeinsame Eigenschaften. Charak teristisch ist, Bass sie in angesauertem Wasser unloslich sind und die jedem Eiweissstoffe nicht fehlende Farbenreaktion, wie Biuretreaktion, meine Farbenreaktion etc. fast negativ ausfallen. Ausserdem werden these Proteinstoffe dureb Pepsin schwer und durch Trypsin etwas leichter verdant. mensetzung. 3. Die untersuchte Dearginoproteine haben folgende Zusam 4. Das Baseubindungsvermogen der Dearginoproteine ist wie folgt: 1g Protein verbraucht zum Neutralpunkt gegen Phenolphtalein bei Dearginokasein 21,08 ccm n/10-ba(oh)2, bei Dearginoedestin 24,48 ccm n/10-ba(oh)2, bei Dearginoovalbumin 21,91 ccm n/10-ba(oh)2, 5. Bei der Hydrolyse des Dearginokaseins wurden Alanin, Valin, Leucin, Prolin, Phenylalanin, Asparaginsaure, Glutaminsaure und Lysin nachgewiesen.

15 Uber Dearginoprotein. 157 LITERATUR. Langheld (1909): Uber den Abbau der a-aminosauren zu fatten Aldehyden mittelst Natriumhypochlorit. Berichte d. Deutsch. chem. Gesellschaft. 42, Laqueur u. Sackur (1902): Uber die Saureeigenschaften und das Molekul argewicht des Kaseins und seine Spaltung beim Trocknen. Beitr. chem. Physiol. u. Path., 3, 193. Osborne, Leavenworth und Brautrecht, (1908): Different Forms of Nitrogen in Proteins., Amer. Journ. of Physiol., 23, 180. Stuchetz, (1906): Uber die Einwirkung von Natriumhypobromit auf einige Aminoverbindungen., Monatsh. f. Chem., 27, 603.