Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln

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1 Aus dem Zentrum Physiologie und Pathophysiologie der Universität zu Köln Institut für vegetative Physiologie Geschäftsführende Direktorin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. G. Pfitzer Die camp-effektoren Proteinkinase A und Exchange Protein directly activated by camp beschleunigen die Relaxation der Gefäßmuskulatur und hemmen die Calciumsensitivierung in unterschiedlicher Weise Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Hendrik Rudolf Drinhaus aus Bonn promoviert am 29. Januar 2014

2 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2014

3 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. G. Pfitzer 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. St. Baldus Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von Frau Universitätsprofessor Dr. med. G. Pfitzer erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin /eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den

4 Die in dieser Arbeit angegeben Experimente sind nach Anleitung durch Herrn Dr. med. Axel Neulen und Herrn Lubomir Lubomirov, PhD von mir selbst ausgeführt worden. Bei Teilschritten der Aufbereitung einzelner Gewebeproben zur Verwendung zur Gelektrophorese und Western Blot habe ich Unterstützung von Frau Cornelia Kock-Hauser erhalten.

5 Danksagung Zunächst gilt mein Dank Frau Univ.-Prof. Dr. med. Gabriele Pfitzer für die Überlassung des Themas und die Möglichkeit, an ihrem Institut diese Doktorarbeit anfertigen zu können, sowie für ihre Diskussionsbereitschaft und ihre Betreuung und Unterstützung bei der Entstehung dieser Arbeit. Besonders danken möchte ich Herrn Dr. med. Axel Neulen und Herrn Lubomir Lubomirov, PhD für die Einführung in das Thema und die experimentellen Methoden. Den technischen Assistentinnen und Assistenten des Instituts, insbesondere Frau Doris Metzler und Frau Cornelia Kock-Hauser, danke ich für ihre Hilfe bei der Laborarbeit. Auch die Unterstützung durch die Mitarbeiter des Tierstalls, der Werkstätten, der EDV- Abteilung und des Sekretariats des Instituts war für das Entstehen dieser Arbeit unabdingbar. Für ihre Begleitung und Unterstützung während meines Studiums und meiner Doktorarbeit möchte ich insbesondere meiner Familie und Aggeliki Stratogianni danken.

6 Gliederung der Arbeit Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung Aufbau und Bestandteile der glatten Muskulatur Morphologie der glatten Muskulatur Filamenttypen der Muskelzellen Mechanismus der Kontraktion und Relaxation Grundlegende Prinzipien Phosphorylierungsabhängige Mechanismen Phosphorylierungsunabhängige Mechanismen Modulation des myozellulären Calciumgehalts 8 und des Muskeltonus Elektromechanische Kopplung Pharmakomechanische Kopplung Enzyme zur Regulation des Muskeltonus Myosinleichtkettenkinase Myosinleichtkettenphosphatase Regulation der Aktivität der 12 Myosinleichtkettenphosphatase 1.3. Rho/Rho-Kinase und ihre pathophysiologische Bedeutung 14 in der Gefäßmuskulatur 1.4. Relaxation durch cyclische Nukleotide Urocortin EPAC: exchange protein directly activated by camp camp-analoga zur selektiven Aktivierung von PKA und EPAC Zielsetzung 20

7 2. Materialien und Methoden Versuchstiere Präparation der Mausschwanzarterie Permeabilisierung der Zellmembran Alpha-Haemolysin Beta-Escin Isometrische Kraftmessungen der Arterienpräparate Phosphorylierungsanalyse der Arterienpräparate Probengewinnung SDS-PAGE Western Blot Lösungen Bezugsquellennachweis Datenanalyse und Statistik Ergebnisse Aktivierung von PKA und EPAC nach Calciumsensitivierung Wirkung von PKA und EPAC auf die maximale Kraftentwicklung, die 41 Kontraktions- und Relaxationskinetik und die MLC 20 -Phosphorylierung 3.3. Modulation der agonisteninduzierten 51 Calciumsensitivierung durch PKA und EPAC Calciumsensitivierung mit dem alpha 1-53 Sympathomimetikum Phenylephrin Calciumsensitivierung mit dem 56 Thromboxananalogon U Wirkung der camp-analoga auf 58 die Phosphorylierung von MYPT1 und VASP

8 3.4. Hemmbarkeit des Effekts von Bnz-cAMP und pcpt-camp 64 durch den PKA-Inhibitor PKI Diskussion PKA und EPAC reduzieren die agonisteninduzierte Kraft PKA und EPAC senken die maximale Kraft durch 67 Reduktion der MLC 20 -Phosphorylierung 4.3. PKA, nicht aber EPAC, verzögert die Kontraktionskinetik PKA und EPAC beschleunigen die Relaxation durch 69 Aktivierung der MLCP 4.5. PKA und EPAC beeinträchtigen die 71 Calciumsensitivierung durch Phenylephrin 4.6. PKA, nicht jedoch EPAC, beeinträchtigt die 73 Calciumsensitivierung durch U Die Wirkung von PKA und EPAC auf 74 die Phosphorylierung von MLC 20, MYPT1und VASP 4.8. Der PKA-Inhibitor PKI 5-24 beeinträchtigt 76 die Wirkung von PKA- und EPAC-Aktivatoren 4.9. Gedanken zur möglichen Rolle verschiedener G-Protein- 80 Signalwege und Ausblick auf mögliche Folgeuntersuchungen 5. Zusammenfassung Literaturverzeichnis Vorabveröffentlichungen von Ergebnissen Lebenslauf 104

9 Abkürzungsverzeichnis α 1 -AR AA AC ADP ATP ß 2 -AR BSA [Ca 2+ ] cyt Ca 2+ /CaM CaM camp cgmp CPI 17 CRF 2 DAG DMSO DTT ECL EDTA EPAC GAP GC GDI GDP GEF GTP HSP ILK IP 3 M MHC α 1 -Adrenorezeptor Arachidonsäure Adenylatcyclase Adenosindiphosphat Adenosintriphosphat ß 2 -Adrenorezeptor bovines Serumalbumin intrazelluläre Calciumkonzentration [Ca 2+ ] 4 -Calmodulin-Komplex Calmodulin zyklisches Adenosinmonophosphat zyklisches Guanosinmonophosphat protein-kinase C-potentiated myosin phosphatase inhibitor Corticotropin releasing factor 2 Rezeptor 1,2-Diacylglycerol Dimethylsulfon Dithiotritol enhanced chemiluminescence Ethylendiamintetraacetat Exchange Protein directly activated by camp GTPase-aktivierendes Protein Gunaylatcyclase Guanosinnukleotiddissoziationsinhibitor Guanosindiphosphat Guanosinnukleotidaustauschfaktor Guanosintriphosphat Hitzeschockprotein integrin linked kinase Inositol-1,4,5-triphosphat mol pro Liter schwere Kette des Myosins II (myosin heavy chain) 1

10 MLC leichte Kette des Myosins II (myosin light chain) MLC 20 regulatorische leichte Kette des Myosin II MLCK Myosinleichtkettenkinase MLCP Myosinleichtkettenphosphatase MYPT1 regulatorische Untereinheit der MLCP NO Stickstoffmonoxid p(x) phosphorylierte (X) (z.b. MYPT1, MLC 20 ) P (i) PAK PBS pca ph PCR PIP 2 PKA PKC PLC PSS ROCK RyR S / Ser SEM SR T / Thr TBS TBST TCA TXA2-R anorganisches Phosphat P21-aktivierte Kinase phosphate buffered saline negativer dekadischer Logarithmus der freien Ca 2+ -Konzentration negativer dekadischer Logarithmus der H + -Konzentration Polymerase-Ketten-Reaktion Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat Proteinkinase A Proteinkinase C Phospholipase C Physiologische Salzlösung Rho-Kinase Ryanodinrezeptor Serin Standardfehler des Mittelwerts Sarkoplasmatisches Retikulum Threonin Tris-buffered saline Tris-buffered saline + Tween Trichloressigsäure Thromboxanrezeptor UCN Urocortin 1 v/v Volumen pro Volumen VASP vasodilatator-stimulated phosphoprotein w/v Gewicht pro Volumen ZIPK Zipper-interagierende Kinase 2

11 1. Einleitung 1.1 Aufbau und Bestandteile der glatten Muskulatur Morphologie der glatten Muskulatur Glatte Muskulatur ist der in Hohlorganen, etwa des Kreislauf- oder Verdauungssystems, sowie unter Anderem im Auge und an Haarbälgen anzutreffende Muskeltyp. Die mononukleären fusiformen Zellen haben einen Durchmesser von ca µm bei sehr variabler Länge von ca. 15µm in kleinen Blutgefäßen bis zu 800µm im graviden Uterus. Da Aktin- und Myosinfilamente nicht zu Sarkomeren angeordnet, sondern unregelmäßig, meist schräg zur Längsachse der Zelle, ausgerichtet sind, bildet der glatte Muskel nicht die für den Skelettmuskel charakteristische und namensgebende, lichtmikroskopisch erkennbare Querstreifung aus. Vielmehr imponiert seine Binnenstruktur homogen, so dass sich die Bezeichnung als glatter Muskel etablierte. Die dünnen Aktinfilamente sind deutlich zahlreicher, etwa zehn bis fünfzehn mal [RÜEGG 1996], als die dicken Myosinfilamente vorhanden, daneben finden sich Intermediärfilamente vom Desmin- und Vimentintyp. An den Analoga zu den Z-Streifen der Rhabdomyozyten, den Verdichtungszonen dense bodies sind Aktin- und Intermediärfilamente miteinander verknüpft. Liegen diese Verknüpfungen an der Zellmembran, so werden sie als Anheftungsplaques ( dense plaques ) bezeichnet (Abb.1). Anders als die quergestreifte Muskulatur enthält die glatte Muskulatur kein Troponin, wohl aber Tropomyosin. Anstelle der T-Tubuli finden sich in der glatten Muskulatur Einbuchtungen der Membran, sogenannte Caveolae. Auch das sarkoplasmatische Retikulum und die Mitochondriendichte sind gegenüber denen der quergestreiften Muskulatur nur schwach entwickelt. Das Mengenverhältnis von Aktin und Myosin ist gegenüber dem Verhältnis im quergestreiften Muskel deutlich zum Aktin verschoben. Die glatten Muskelzellen des single-unit-typs sind untereinander durch gap junctions zu einem funktionellen Synzytium verbunden. Dieser Typ findet sich v. a. in Hohlorganen und weist eine spontane basale rhythmische Aktivität auf, die als myogener Tonus bezeichnet wird. Durch Dehnung des Muskels (BAYLISS-Effekt) oder das vegetative Nervensystem kann diese basale Aktivität modifiziert werden. Der z. B. in Ziliarmuskeln und Pilomotoren vorherrschende multi-unit-typ, welcher reichlich innerviert ist, ist nicht spontan aktiv. [LINKE & PFITZER 2007, LÜLLMANN-RAUCH 2003] 3

12 Abb. 1: Schematische Abbildung einer Zelle der glatten Muskulatur (nach Linke & Pfitzer) Filamenttypen der Muskelzellen Myosin: Protein der dicken Filamente Das Myosin der glatten Muskulatur wird der Myosin-II-Klasse zugeordnet. Ein Myosinmolekül (Gesamtgewicht ca. 470 kda) setzt sich aus zwei schweren (MHC, 200/204 kda) sowie zwei regulatorischen (MLC 20, 20 kda) und zwei essentiellen (MLC 17kDa) leichten Ketten zusammen. Die beiden schweren Ketten, welche aufgrund alternativen Splicings als SM1 mit 204 kda oder SM2 mit 200 kda vorliegen können, winden sich in ihrem ca. 150 nm langen Schwanzbereich umeinander, so dass eine filamentöse Struktur mit einem Durchmesser von 12-18x10-9 m entsteht. Aminoterminal liegt der globuläre, piriforme sogenannte Myosinkopf, der die magnesiumabhängige Myosin-ATPase sowie die Aktinbindungsstelle enthält. Jedem Myosinmolekül liegen am Übergang zwischen Kopf- und Schwanzbereich eine regulatorische und eine essentielle leichte Kette an [CRAIG et al. 2006]. Aktin: Protein der dünnen Filamente Die Aktinfilamente (F-Aktin, Durchmesser 5-8x10-9 m) sind helikale, filamentöse Polymere einzelner Moleküle des globulären Aktins (G-Aktin, 42 kda), die bei physiologischen Salzkonzentrationen aufgrund hydrophober Wechselwirkungen in Form einer Doppelhelix angeordnet sind. Es werden die drei Isoformen alpha (welche wiederum in drei Subtypen existiert), beta, gamma unterschieden, die gewebsspezifisch exprimiert sind. Beta-Aktin, dem eine Rolle bei der Bildung des Zytoskeletts zugeschrieben wird, ist Bestandteil aller glattmuskulärer Zellen [NORTH et al. 1994]. In vaskulärer Muskulatur findet sich zusätzlich alpha-aktin, wohingegen in der Muskulatur der Viszeralorgane auch gamma-aktin vorzufinden ist [FATIGATI et al. 1984]. 4

13 Den Aktinfilamenten liegt Tropomyosin an, das aus zwei in Form einer alpha-helix angeordneten Polypetidketten von 36 und 39 kda besteht. Durch Konformationsänderung des Tropomyosins können Myosinbindungstellen an den Aktinfilamenten freigelegt beziehungsweise verdeckt werden. Des Weiteren scheint Tropomyosin die Wirkung des Caldesmons zu regulieren [MORGAN et al. 2001]. Die Intermediärfilamente: Die wegen ihres zwischen dem der Myosin- und Aktinfilamente liegenden Durchmessers von ca. 10x10-9 m so genannten Intermediärfilamente, allen voran Vimentin und Desmin, sind Bestandteile des Zytoskeletts. An der Kontraktion und Relaxation der Muskelzelle nehmen sie nicht teil. Sie vernetzen die dense bodies und dense plaques, an denen die Aktinfilamente fixiert sind, und verankern die Muskelzelle mit benachbarten Zellen [PAVAALKO et al. 1995, SJUVE et al. 1998]. 1.2 Mechanismus der Kontraktion und Relaxation Wie im Skelettmuskel erfolgt die Kontraktion auch im glatten Muskel gemäß der Gleitfilamenttheorie, also einem Aneinandergleiten der Myosin- und Aktinfilamente [HUXLEY & NIEDERGERKE 1954, HUXLEY & HANSON 1954]. ADP-Pi-gebundene Myosinköpfe heften sich an Aktinfilamente und verändern ihre Konformation, so dass das Aktinfilament schrittweise gezogen wird. Pi und danach ADP verlassen sodann den Myosinkopf, neues ATP wird gebunden und durch dessen Hydrolyse wieder die energiereiche Konformation erreicht, so dass der Zyklus von neuem beginnen kann. Aufgrund des niedrigen Myosinanteils, größerer Länge der Sarkomeräquivalente und langsamerer ATPase-Rate etwa 0,5-1 Querbrückenzyklen pro Sekunde [RÜEGG 1996] - ist der Energieaufwand der glattmuskulären Kontraktion weit geringer als der einer vergleichbaren Kontraktion im Skelettmuskel. Diese eine hohe Effizienz bewirkenden Charakteristika der glatten Muskulatur bedingen andererseits eine Einschränkung der glattmuskulären Verkürzungsgeschwindigkeit, verglichen mit der des quergestreiften Muskels. Ein Absinken der intrazellulären, zytoplasmatischen Calciumkonzentration [Ca 2+ ] zyt sowie eine Desensitivierung der Myofilamente gegenüber Calcium (siehe Kapitel ) führen zur Relaxation des Muskels. 5

14 1.2.1 Grundlegende Prinzipien der Regulation der Kontraktion Prinzipiell können zwei verschiedene Prinzipien der Tonusregulation voneinander unterschieden werden. Bei den sogenannten phosphorylierungsabhängigen Mechanismen reguliert der Phosphorylierungszustand der regulatorischen leichten Ketten des Myosins (MLC 20 ) den Muskeltonus. Unter den phosphorylierungsunabhängigen Mechanismen werden verschiedene Phänomene zusammengefasst, welche eine Entkopplung von MLC 20 - Phosphorylierung und Muskeltonus gemeinsam haben. Insbesondere die phosphorylierungsunabhängigen Mechanismen sind bisher noch unvollständig erforscht Phosphorylierungsabhängige Mechanismen Steigt die cytoplasmatische Calciumkonzentration [Ca 2+ ] cyt von ca mol/l im relaxierten Zustand auf ca mol/l, so werden die vier Calciumbindungsstellen des Calmodulins (CaM, MW: 17 kda) mit Calcium gesättigt und Ca 2+ 4-CaM bildet ein Holoenzym mit der Myosinleichtkettenkinase (MLCK), die es dadurch aktiviert. MLCK-Ca 2+ 4-CaM phosphoryliert nun MLC 20 vornehmlich an der Position Serin 19, bei starker Stimulation auch Threonin 18 [COLBURN et al. 1988]. Dies bewirkt eine Konformationsänderung des Myosins [SWEENEY et al. 1994] und aktiviert die Myosin-ATPase, wodurch der Querbrückenzyklus in Gang gesetzt wird. Im Gegenzug lösen sich bei Absinken der [Ca 2+ ] cyt die Calciumionen von Calmodulin, MLCK wird inaktiv und phosphoryliert MLC 20 nicht mehr. Das resultierende Übergewicht der Aktivität der die MLC 20 dephosphorylierenden Myosinleichtkettenphosphatase führt zur Dephosphorylierung und Inaktivierung von MLC 20 ; der Querbrückenzyklus sistiert. Unabhängig von Änderungen der intrazellulären Calciums können Modulationen der Aktivität der antagonistischen Enzyme Myosinleichtkettenkinase und Myosinleichtkettenphosphatase den Phosphorylierungszustand der regulatorischen leichten Myosinketten und somit den Tonus des Muskels modulieren. Diese Vorgänge werden als Calciumsensitivierung (Krafterhöhung bei konstantem Calciumspiegel) und Calciumdesensitivierung (Kraftminderung bei konstantem Calciumspiegel) bezeichnet [KITAZAWA et al. 1990]. Neben der MLCK, die als dominante Kinase der Myosinphosphorylierung gilt, und, wie die Rho-Kinase, präferentiell Serin 19 phosphoryliert, sind weitere Proteine bekannt, die die MLC 20 an den Aminosäureresten Serin 19 und Threonin 18 gleichermaßen phosphorylieren. Hierzu gehören unter anderem die die ZIP- 6

15 Kinase, die p21-aktivierte Kinase und die Integrin-linked-Kinase [HIRANO et al. 2003]. Die Phosphorylierungsaktivität dieser Kinasen am Myosin wird, anders als im Fall der MLCK, nicht durch den intrazellulären Calciumspiegel reguliert. Die phosphorylierungsabhängige Regulation ist wohl als der dominante, jedoch nicht als der ausschließliche Mechanismus zur Regulation der glattmuskulären Kontraktion zu betrachten Phosphorylierungsunabhängige Mechanismen Beobachtungen einer Krafterhöhung ohne begleitenden Anstieg der MLC 20 -Phosphorylierung [WAGNER et al. 1986] sowie Kraftabnahmen ohne begleitende Verminderung der MLC 20 - Phosphorylierung [PFITZER et al. 1993] lassen die Existenz einer phosphorylierungsunabhängigen Regulation des glattmuskulären Tonus annehmen. In Anlehnung an den Sperrtonus der Muschel wurde ein Modell für den sogenannten latchstate der Kontraktion entwickelt, der eine anhaltende Kontraktion bei sehr geringem Energieaufwand gestattet. Nach calciuminduzierter Phosphorylierung und Querbrückenbindung postuliert dieses Modell eine stark verzögerte Dissoziation von Aktin und Myosin nach Dephosphorylierung der MLC 20, so dass diese bereits dephosphorylierten Querbrücken weiterhin zum muskulären Tonus beitragen [HAI & MURPHY 1988, 1989]. Eine neuere Hypothese geht zudem von einer Beteiligung nichtmuskulären Myosins an der Entstehung des latch-state aus [Übersicht bei OGUT et al. 2008]. Das Hitzeschockprotein HSP20 in seinen Isoformen 3 und 8 kann infolge camp- oder cgmp-erhöhung am Serinrest 16 phosphoryliert werden [BEALL et al. 1997, 1999]. Diese Phosphorylierung korreliert mit einer Relaxation, die jedoch nicht mit einer Dephosphorylierung der MLC 20 einhergeht [REMBOLD et al. 2000]. Dieser Mechanismus wird für die späte Phase der durch zyklische Nukleotide induzierten Relaxation postuliert [REMBOLD et al. 2001]. Eine solche, als force suppression bezeichnete, phosphorylierungsunabhängige Relaxation wird durch eine Inhibition der Bindung phosphorylierter Myosinköpfe ( crossbridges ) an Aktinfilamente erklärt [MEEKS et al. 2005, REMBOLD 2007]. Das 87 kda schwere, Aktin-assoziierte Protein Caldesmon inhibiert die Myosin-ATPase [NGAI et al. 1984, CLARK et al. 1986]. Eine Phosphorylierung von Caldesmon, welche durch verschiedene Kinasen, unter anderem MLCK [SOBIESZEK et al. 2010], möglich ist, mindert seine inhibitorische Wirkung. Eine ähnliche Funktion nimmt das Calponin ein; es hemmt ebenfalls die Myosin-ATPase und büßt diese Fähigkeit nach Phosphorylierung durch CaM-Kinase oder PKC ein 7

16 [WINDER et al. 1990]. In Muskelzellen des Urogenitaltrakts konnte eine durch Rho-Kinase vermittelte phosphorylierungsunabhängige Kontraktion beobachtet werden, die sich in Zellen der Gefäßmuskulatur nicht finden ließ [WALSH et al. 2011] Modulation des myozellulären Calciumgehalts und des Muskeltonus Die Regulierung der myozellulären cytoplasmatischen Calciumgehalts und damit des Tonus der glatten Muskelzelle kann über zwei Wege, die elektromechanische und die pharmakomechanische Kopplung verursacht werden, die in vivo freilich meist gemeinsam ablaufen Elektromechanische Kopplung Bei Depolarisation des in Ruhe um 40 bis 70 mv liegenden Membranpotentials [SOMLYO & SOMLYO 1994] werden spannungsabhängige Calciumkanäle geöffnet, die einen Influx von extrazellulärem Calcium ins Zytosol des Myozyten gestatten [GANITKEVICH & ISENBERG 1991]. Experimentell wird diese Depolarisation durch Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration erreicht [RATZ et al. 2005]. Nach Bindung an ihren Rezeptor bewirken auch rezeptorgekoppelte Agonisten wie etwa Noradrenalin eine Depolarisation der Membran. Die hieraus resultierende Kontraktion fällt meist stärker aus als bei gleicher Potentialänderung durch K + [NELSON et al. 1988], da zusätzlich zur Membrandepolarisation eine Calciumsensitivierung stattfindet Pharmakomechanische Kopplung Die Kontraktion wird hier ohne Änderung des Membranpotentials ausgelöst. Dies geschieht über: 1) Freisetzung von Calcium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 2) Influx von extrazellulärem Calcium 3) Calciumsensitivierung 8

17 Ad 1) alpha1-adreno- und muskarinerge Rezeptoren aktivieren nach Bindung eines Agonisten die Phospholipase C (PLC), die das Membranlipid Phosphoinositoldiphosphat (PIP 2) zu Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) hydrolysiert. Nach Diffusion und Bindung an die Membran des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR) öffnet IP 3 dort Ca 2+ - Kanäle, so dass [Ca 2+ ] steigt. Durch die schnelle Inaktivierung des IP 3 und die Inaktivierung der Ca 2+ -Kanäle bei [Ca 2+ ] = 5*10-7 M ist diese Calciumfreisetzung selbstlimitierend und wohl nur in der initialen Phase der agonisteninduzierten Kontraktion relevant [RÜEGG 1996, SOMLYO et al. 1988, ELORRIAGA et al. 1996). Das Ausmaß und die Bedeutung der Calciumfreisetzung aus dem SR über Ryanodinrezeptoren (RyR) ist für die glatte Muskulatur nicht abschließend geklärt [SOMLYO & SOMLYO 1994], wobei Überlappungen zwischen dem IP3- und dem RyR-Mechanismus angenommen werden [MCGEOWN et al. 2004]. Auch eine Amplifikation des RyR-Influx über IP 3 wird vermutet [URENA et al. 2007]. Ad 2) Bestimmte Agonisten, wie Noradrenalin, modulieren die Offenwahrscheinlichkeit spannungsabhängiger L-Typ-Calciumkanäle [NELSON et al. 1988]. Postuliert wird, dass dieser Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Kontraktion nach der nur vorübergehenden IP 3 -Wirkung beiträgt [PUTNEY & BIRD 1993] Ad 3) Unter dem Begriff der Calciumsensitivierung wird eine Tonuserhöhung ohne begleitende Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels verstanden. Diesem Phänomen liegt eine calciumunabhängige, G-Protein-abhängige Modulation der jeweiligen Aktivitäten der als Gegenspieler fungierenden Enzyme MLCK und MLCP (siehe auch Kapitel 1.2.3) zugrunde, wobei die Modulation der MLCP-Aktivität den größeren Anteil hat. Sinkt die relative Aktivität der MLCP, so wird mehr Myosin phosphoryliert, wodurch der Muskeltonus steigt. Überwiegt die relative Aktivität der MLCP, so nehmen Myosinphosphorylierung und konsekutiv Muskeltonus bei gleichbleibendem Calciumspiegel ab, was als Calciumdesensitivierung bezeichnet wird [KITAZAWA et al. 1990, SOMLYO & SOMLYO 2003, PÜTZ et al. 2009]. 9

18 1.2.3 Enzyme zur Regulation der Kontraktion und Relaxation Zwei Enzyme, welche sich als Gegenspieler gegenüberstehen, bestimmen durch Phosphorylierung respektive Dephosphorylierung der regulatorischen leichten Ketten des Myosins (MLC 20 ) den Kontraktionszustand des glatten Muskels über die phosphorylierungsabhängigen Wege Myosinleichtkettenkinase Die Myosinleichtkettenkinase (MLCK) ist, wie oben beschrieben, verantwortlich für die aktivierende Phosphorylierung von MLC 20. MLCK selbst kann in Nachbarschaft zur Calmodulin bindenden Region phosphoryliert und damit inhibiert werden. Diese Phosphorylierung konnte in vitro für PKA, P21-aktivierte Proteinkinase (PAK) und CaM- Kinase II [TANSEY et al. 1992] demonstriert werden. In vivo jedoch konnte dies für PKA nicht reproduziert werden, wohingegen CaM-Kinase-Inhibitoren in der Trachealmuskulatur die MLCK-Phosphorylierung zu hemmen vermochten (MILLER et al. 1983, TANSEY et al. 1994). Auch für die P21-aktivierte Proteinkinase konnte im permeabilisierten glatten Muskel eine wahrscheinlich durch inhibitorische MLCK-Phosphorylierung vermittelte Kontraktionsminderung demonstriert werden [WIRTH et al. 2003] Myosinleichtkettenphosphatase Die Myosinleichtkettenphosphatase (MLCP oder SMPP-1) ist ein heterotrimeres Enzym, bestehend aus der katalytischen Untereinheit PP1C, einer 20-kDa-Unterheinheit (M 20 ) und einer regulatorischen myosinbindenden Untereinheit (MYPT1) (Abb. 2). PP1C ist am N- Terminus, M20 am C-Terminus von MYPT1 lokalisiert [ITO & HARTSHORNE, 2004]. M 20 : Die Untereinheit M 20 ist in zwei Spleißvarianten, M 18 mit 161 Aminosäuren und 18 kda Molekulargewicht, und M 21 mit 186 Aminosäuren und 21 kda Molekulargewicht kloniert worden. Die Expression der beiden Isoformen ist gewebsspezifisch [MABUCHI & ITO 1999]. Über die Funktion von M 20 besteht keine Klarheit, ihre Bindung an MYPT1 beeinflusst die Phosphataseaktivität nicht [HARTSHORNE et al. 1998]. 10

19 PP1C: Die MLCP ist eine Typ1-Phosphatase von 38 kda und 330/331 Aminosäuren. An MYPT1 bindet die Isoform PP1c δ (synonym PP1C β) [ERDÖDI et al. 1996]. Bezüglich der Bindungsstellen zwischen MYPT1 und PP1C bestehen widersprüchliche Theorien. Während zunächst der C-terminale Bereich der PP1C als Bindungsstelle betrachtet wurde [TERRAK et al. 2004], postuliert eine neuere Arbeit eine Bindung im zentralen Bereich der PP1C (Aminosäuren ) [SCOTTO-LAVINO et al. 2010]. MYPT1: Die myosinbindende Untereinheit (myosin phosphatase targeting subunit, MYPT) besteht aus etwa 1030 Aminsäuren, hat ein Molekulargewicht von 110 kda und wird in zahlreichen Geweben exprimiert. Es existieren mehrere Isoformen, wobei im glatten Muskel hauptsächlich MYPT1 exprimiert wird [OKUBO et al. 1994]. MYPT1 selbst hat wiederum vier verschiedene Spleißvarianten. Die Phosphorylierung von MYPT1 durch verschiedene Kinasen spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation der MLCP-Aktivität, worauf im Kapitel separat eingegangen wird. Im aminoterminalen Bereich (Aminosäuren 39 bis 296 in MYPT1) liegen Ankyrin Repeat Motive, am Carboxy-Terminus (Aminosäuren 1007 bis 1030) befindet sich bei den Isoformen MYPT1, MYPT2 und MBS85 (myosin binding subunit 85) ein Leuzin-Zipper-Motiv, welches den Isoformen MYPT3 und TIMAP (TGF-inhibited membrane-associated protein) fehlt [ITO et. al. 2004]. Das Leuzin-Zipper-Motiv ist notwendig für eine Aktivierung von MYPT1 durch Proteinkinase G [SURKS et al. 1999, HUANG et al. 2004]. Es kann in einer Spleißvariante von MYPT1 fehlen, die bei Herzinsuffizienz stärker exprimiert wird [KARIM et al. 2004]. Dieser Isoformenwechsel kann durch Inhibitoren des Angiotensin Converting Enzymes ( ACE-Hemmer ) verringert werden, was zum klinischen Wirkprofil dieser Substanzen beitragen könnte [CHEN et al. 2006]. Die Erforschung der Funktion von MYPT3, MBS85 und TIMAP steht erst am Anfang; erste Untersuchungen zur Rolle von TIMAP legen eine Beteiligung an der Regulation der endothelialen Barrierefunktion nahe [CSORTOS et al. 2008]. Gegensätzlich zu den anderen MYPT1-Isoformen inhibiert MYPT3, welche in Herz, Niere und Gehirn hoch exprimiert vorliegt, die Aktivität des MLCP-Holoenzyms [SKINNER et al. 2001]. PKA kann MYPT3 an Serin 353, 340 und 341 aktivierend phosphorylieren [YONG et al. 2006]. 11

20 Abb. 2: schematische Darstellung der MLCP mit MYPT1, PP1C und M20 Untereinheit (modifiziert nach ITO 2004) Regulation der Aktivität der Myosinleichtkettenphosphatase Nachdem die Myosinleichtkettenphosphatase zunächst als spontan und konstitutiv aktives Enzym betrachtet wurde [DISALVO et al. 1983], gab es bald Hinweise darauf, dass die MLCP als reguliertes Enzym an der Modulation der glattmuskulären Kontraktilität antagonistisch zu MLCK beteiligt ist [KITAZAWA et al. 1991, HARTSHORNE et al. 1998]. Mittlerweile werden drei grundlegende Mechanismen zur Regulation der MLCP-Aktivität postuliert [HIRANO et al. 2003]: 1) Veränderung der Quarternärstruktur des heterotrimeren Enzyms 2) Hemmung durch inhibitorische Proteine 3) Regulation durch Phosphorylierung von MYPT1 Ad 1) Phenylephrin-induzierte Kontraktion geht mit einer Dissoziation von PP1C und MYPT1 einher, deren physiologische Bedeutung allerdings angezweifelt wird [HIRANO et al. 2004]. In Muskelzellen aus der Vena portae des Frettchens konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation mit PGF2alpha die in unstimulierten Zellen kolokalisierten MLCP- Untereinheiten MYPT1 und PP1C räumlich dissoziieren. PP1C migriert ins Innere der Zelle, wohingegen MYPT1 im Bereich der Zellmembran verbleibt. Dies wird begleitet von einer reduzierten Dephosphorylierung der MLC20 [SHIN et al. 2002]. Hohe Konzentrationen von Arachidonsäure (>30 µmol/l) verursachen in Femoralarterien des Kaninchens eine Senkung der Aktivität der MLCP und bewirken eine Dissoziation der Untereinheiten aufgereinigter MLCP [GONG et al. 1992]. Ad 2) Hier ist die Inhibition von MLCP durch CPI-17 zu nennen. Seine inhibitorische Funktion übt das 147 Aminosäuren große, 17 kda schwere Protein CPI-17 nach Phosphorylierung an Threonin 38 aus. Es interagiert dabei sowohl mit dem Holoenzym als 12

21 auch mit PP1C alleine [ETO et al. 1995, 1997, 2001, SENBA et al. 1999]. Mehrere Kinasen, insbesondere Proteinkinase C, Rho-Kinase und ZIP-Kinase, katalysieren diese Phosphorylierung [HIRANO 2007]. Besonders stark ist CPI-17 in der vaskulären glatten Muskulatur exprimiert [WOODSOME et al. 2001]. Die physiologische Relevanz der Inhibition von MLCP durch CPI-17 wird gemeinhin als hoch eingeschätzt. Dies wird unterstrichen durch Befunde an CPI-17-defizienten Hühnern, in denen kontraktile Agonisten nur eine minimale Calciumsensitivierung bewirkten [KITAZAWA et al. 2004]. Ad 3) Die myosinbindende Untereinheit der MLCP, MYPT1, besitzt mehrere phosphorylierbare Aminosäurereste, deren Phosphorylierung durch verschiedene Kinasen geschieht. Einige dieser Phosphorylierungsstellen tragen in phosphoryliertem Zustand zu einer verstärkten, andere zu einer verminderten Aktivität der Myosinleichtkettenphosphatase bei (Abb. 3). Eine Phosphorylierung von MYPT1 an den Stellen Threonin 696 und Threonin 853 (humane Sequenz; T695 und T850 in der Hühnersequenz) vermindert die MLCP- Aktivität [SOMLYO & SOMLYO 2003]. Eine besondere Rolle bei der Phosphorylierung dieser inhibitorischen Aminosäurereste kommt der Rho-Kinase [FENG et al. 1999] zu, doch auch andere Kinasen sind beteiligt, darunter ZIP-Kinase und PAK [HIRANO 2007]. Es konnte eine Präferenz der Rho-Kinase zur T853-Phosphorylierung, und der ZIP-, ILK- und anderer Kinasen zur T696-Phosphorylierung gezeigt werden [HAGERTY et al. 2007, MURANY et al. 2005]. Eine Phosphorylierung des Serinrestes 472 (Rattensequenz) durch Rho-Kinase soll die Bindung des Proteins ermöglichen, welche zu einer Verringerung der Aktivität der Myosinleichtkettenphosphatase und eine Dissoziation derselben von Myosin führt [KOGA et al. 2008]. Der Mechanismus der MLCP-Inhibition über MYPT1-Phosphorylierung ist bisher nicht endgültig geklärt. Diskutiert wird eine durch Konformationsänderung bedingte Autoinhibition der MLCP, bei der die phosphorylierten MYPT1 Aminosäurereste T696 und T853 sich an das aktive Zentrum der PP1C anlegen und diese damit hemmen [KHROMOV et al. 2009]. Neben der erläuterten inhibitorischen Phosphorylierung von MYPT1 werden weitere Aminosäurereste beschrieben, deren Phosphorylierung MLCP aktiviert, beziehungsweise ihre Inhibition verhindert. Dies sind zum einen Serin 432, das, wenn es während der Mitose phosphoryliert wird, MYPT1 aktiviert [TOTSUKAWA et al. 1999], und zum anderen Serin 695, das, nach Phosphorylierung durch PKA oder PKG, eine inhibitorische Phosphorylierung des benachbarten Threonin 696 ausschließt und auf diese Weise MYPT1 disinhibiert [WOOLRIDGE et al. 2004]. Eine derartige letztendlich 13

22 aktivierende Phosphorylierung von MYPT1 könnte eine Erklärung für den leichten blutdrucksenkenden Effekt des Antidiabetikums Pioglitazon sein [ATKINS et al. 2009]. Auch die vaso- und bronchodilatative Wirkung der volatilen Anästhetika beruht unter anderem auf einer Erhöhung der MYPT1-Aktivität [HANAZAKI et al. 2001, QI et al. 2009]. Abb. 3: regulatorische Phosphorylierungsstellen von MYPT1 und ihre Kinasen/Auslöser. (modifiziert und erweitert nach ITO 2004) 1.3. Rho/Rho-Kinase und ihre pathophysiologische Bedeutung in der Gefäßmuskulatur Monomere GTPasen der Rho-Gruppe stellen eine Untergruppe der rat sarcoma (Ras) Familie dar. In GTP-gebundener Form aktivieren GTPasen ihre jeweiligen Effektoren, im GDPgebundenen Zustand sind sie inaktiv. Guanosinnukleotidaustauschfaktoren (GEFs), wie beispielsweise Arhgef1 und LARG führen zur Aktivierung der GTPasen. GTPaseaktivierende Proteine (GAPs) katalysieren die Hydrolyse des an Rho gebundenen GTP zu GDP, wodurch Rho von der aktiven, GTP-gebunden Form, in die inaktive, GDP-gebundene Form, transformiert wird. Guanosinnukleotiddissoziationsinhibitoren (GDIs) binden GTPasen wie Rho in ihrer GDP-gebundenen, inaktiven Form. Auch räumliche Translokation ist für die Aktivität entscheidend; Rho-GTP findet sich komplex gebunden im Membranbereich, Rho- GDP ist vorwiegend im Cytosol lokalisiert [SOMLYO & SOMLYO 2003, PÜTZ et al. 2009]. Bindung von Agonisten an G 12 -G 13 G-Protein gekoppelte Rezeptoren führt vornehmlich zur Aktivierung von RhoA [GOHLA et al. 2000]. Rho-Kinase (ROK/ROCK) ist eine in zwei Isoformen, ROCK1 und ROCK2, vorkommende Serin/Threonin-Kinase aus ca Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von ca. 160 kda [MATSUI et al. 1996]. Sie wird aktiviert von der namensgebenden kleinen GTPase RhoA, die über G-Proteingekoppelte, membranständige Rezeptoren aktiviert wird, und weiteren Substanzen wie src- 14

23 Kinase [KNOCK et al. 2008], Arachidonsäure [ARAKI et al. 2001] oder Sphingosine Phosphorylcholin (SPC) [SHIRAO et al. 2002]. Inhibiert wird ROCK durch RhoE, das an die Kinase-Domäne der N-terminalen Region bindet [RIENTO et al. 2003] sowie die kleinen G- Proteine Gem und Rad [WARD et al. 2002]. Mehrere Substrate der Rho-Kinase sind entscheidend an der Regulation der glattmuskulären Kontraktion beteiligt. Es handelt sich um MYPT1 [KIMURA et al. 1996], CPI-17 [KITAZAWA et al. 2000, BAEK et al. 2009], MLC 20 [AMANO et al. 1996] und Calponin [KANEKO et al. 2000]. Weitere, für die Kontraktion der glatten Muskulatur weniger bedeutende, Substrate der Rho-Kinase sind beschrieben [Übersicht bei LOIRAND 2006]. Es bestehen Hinweise darauf, dass der Wirkungsmechanismus von ROCK auf die Gefäßmuskulatur isoformspezifisch sein könnte, wobei wahrscheinlich ROCK2 die Hauptwirkung auf MYPT1 ausübt [WANG et al. 2009]. Rho-Kinase reguliert Kontraktion, Differenzierung, Proliferation und Migration der Gefäßmuskulatur und sensitiviert die Gefäßmuskulatur gegenüber Calcium [UEHATA et al. 1990]. Die durch sie vermittelte inhibitorische Phosphorylierung von MYPT1 T853 ist an der myogenen Kontraktion zur arteriellen Autoregulation beteiligt [JOHNSON et al. 2009]. Ihre Überaktivität wird mit der Pathogenese multipler Gefäßerkrankungen, wie Atherosklerose, arterieller und pulmonaler Hypertonie [GUILLUY et al. 2009, DOE et al. 2009] oder koronarem und zerebralem Vasospasmus in Verbindung gebracht [LOIRAND 2006, FESKE et al. 2009]. Inhibition von ROCK konnte in Modellen dieser Krankheiten die pathologische Vasokonstriktion und atherosklerotische Plaquebildung verhindern [WU et al. 2009]. Die Leukozyten von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz weisen eine gesteigerte Aktivität der Rho-Kinase mit erhöhter Phosphorylierung der MLCP auf, deren pathophysiologische Bedeutung bisher noch nicht geklärt ist [OCARANZA et al. 2011]. Im Einklang hiermit konnte Inhibition der Rho-Kinase im Rattenmodell einer Herzinsuffizienz hinsichtlich hämodynamischer und histologischer Parameter eine Besserung erwirken [WANG et al. 2011]. In einem Rattenmodell des metabolischen Syndroms konnte der Rho-Kinase Inhibitor Fasudil den Blutdruck reduzieren und die gestörte Insulinempfindlichkeit verbessern [KANDA et al. 2005]. Erste Versuche zum Einsatz von Fasudil an Patienten mit pulmonalarterieller Hypertonie [ISHIKURA et al. 2006] und Kindern mit shuntbedingter pulmonaler Hypertonie [LIF et al. 2009] zeigten eine Senkung des pulmonalvaskulären Widerstands durch die Therapie. In der Behandlung des zerebralen Vasospasmus nach Subarachnoidalblutung kommen Rho-Kinase-Inhibitoren bereits vereinzelt klinisch zum Einsatz [IWABUCHI et al. 2011]. RhoA trägt, vermittelt über eine Aktivierung des Rho-GEF 15

24 Arhgef1, zur vasokonstriktiven Wirkung des Angiotensin II bei [GULILLUY et al. 2010]. Auch der atherogene Effekt der Hyperlipoproteinämie wird in Teilen mit verstärkter Calciumsensitivierung über den SPC-ROCK-Signaltransduktionsweg erklärt [MORIKAGE et al. 2006]. HmgCoA-Reduktase-Inhibitoren, sogenannte Statine, reduzieren unabhängig von ihrer cholesterinsenkenden Wirkung die Aktivität von Rho in vitro [LAUFS et al. 2002, ZHOU et al. 2009] und in vivo beim Menschen [NOHRIA et al. 2009, RAWLINGS et al. 2009, LIU et al. 2009], und wirken wohl auch über diesen Mechanismus als Bestandteil der sogenannten pleiotropen Effekte dieser Substanzklasse therapeutisch. Abseits der glatten Muskulatur scheint eine statinbedingte ROCK-Inhibition auch das Zellwachstum in einem Modell des hepatocellulären Carcinoms zu bremsen [RELJA et al. 2011]. 1.4 Relaxation durch zyklische Nukleotide Der vasodilatative Effekt der zyklischen Nukleotide camp und cgmp, welche ihre Wirkung über Aktivierung der Proteinkinasen A bzw. G entfalten, ist seit langem bekannt wurde camp als Mediator der durch diverse Pharmaka hervorgerufenen Vasodilatation postuliert [ANDERSSON 1973]. Zeitweilig wurde dem camp eine vasodilatative und dem cgmp eine vasokonstriktive Wirkung zugeschrieben [DUNHAM et al. 1974]. Später jedoch wurde auch die vasodilatative Eigenschaft des cgmp und dessen Verbindung zum endothelium derived relaxing factor, dem Stickstoffmonoxid (NO), und dem Wirkungsmechanismus des klinisch bedeutsamen Vasodilatators Glyceroltrinitrat belegt [DIAMOND & CHU 1983, FURCHGOTT et al. 1984, AXELSSON et al. 1985, IGNARRO et al. 1987]. Auch dem camp wurde eine Beteiligung an der Wirkung von Natriumnitroprussid unterstellt [MAURICE et al. 1990]. Der camp-pka Signalweg wird seit 1981 als Effektor der betaadrenergen Vasodilatation beschrieben, die allerdings damals neben der Reduzierung des intrazellulären Calciums noch einer inhibitorischen Phosphorylierung der MLCK zugeschrieben wurde [KERRICK & HOAR 1981, SILVER et al. 1982]. Spätere Erkenntnisse sprachen gegen diese Hypothese der inhibitorischen MLCK-Phosphorylierung [VANRIPER et al. 1995, 1997]. Die Arbeitsgruppen um RÜEGG und MORGAN beschrieben eine Entkopplung zwischen intrazellulärem Calcium und glattmuskulärer Kraft durch camp im Sinne einer Calciumdesensitivierung [RÜEGG & PAUL 1982, RÜEGG & PFITZER 1985, MORGAN & MORGAN 1984]. Die Inhibition der MLCP-Phosphorylierung wurde später als Grundlage der cgmp-vermittelten Ca 2+ -Desensitivierung postuliert [LEE et al. 1997]. Als 16

25 Hauptwirkung wurde dabei die Inhibition der RhoA-Aktivität angenommen [SOMLYO & SOMLYO 2003]. Die physiologische Relevanz der Rho-Inhibition durch cgmp mittels Phosphorylierung von Rho an Ser188 [SAUZEAU 2000] ist jedoch umstritten [SAWADA et al. 2001]. Zumindest für PKA werden weitere Mechanismen stromaufwärts von RhoA angenommen [ESSLER et al. 2000]. Auch dem Telokin wird eine Rolle in der cgmpabhängigen Muskelrelaxation zugeschrieben [WU et al. 1998]. Neuere Untersuchungen legen nahe, dass die Wirkung auch der cgmp-vermittelten Calciumdesensitivierung zumindest partiell PKA-abhängig ist [WOERNER et al. 2006]. Im Gegenzug wird angenommen, dass die camp-vermittelte Verminderung des intrazellulären Calciumspiegels auch über cgmp vermittelt werde [LINCOLN et al. 1990]. Eine durch cyclische Nukleotide vermittelte Relaxation ohne Myosindephosphorylierung wird als force suppression bezeichnet [MCDANIEL et al. 1992]. Auch der Agonist des corticotropin releasing factor Rezeptors, Urocortin, vermittelt seine relaxierende Wirkung zumindest teilweise über eine Erhöhung des intrazellulären camp-spiegels [MIKI et al. 2004, LUBOMIROV et al. 2006]. 1.5 Urocortin Die Polypeptide der Urocortingruppe (in den drei Unterformen Urocortin 1-3) sind Agonisten des Corticotropin-releasing-factor-Rezeptors (CRF-R). Aktivierung des CRF-Rezeptors bewirkt eine Aktivivitätssteigerung der Adenylatcyclase und folglich eine Erhöhung des intrazellulären camp-spiegels. Urocortine sind unter anderem an der Gewichts- und Temperaturregulation und an der Entstehung von Depression, Furcht und Abhängigkeitsverhalten [RYABININ et al. 2012] beteiligt. Der Einsatz von insbesondere Urocortin 2 zur Behandlung der Duchenneschen Muskeldystrophie ist Gegenstand experimenteller Forschung [REUTENAUER-PATTE et al. 2012]. In Nagermodellen zeigten Urocortine zudem protektive Wirkung gegen die diabetische Nephropathie [LI et al. 2008]. Im Gefäßsystem wirkt Urocortin als Vasodilatator. Einige Untersuchungen postulieren eine endothelunabhängige, durch Calciumdesensitivierung [LUBOMIROV et al. 2001, 2006] sowie Inhibition des Calciumeinstroms [SMANI et al. 2007] vermittelte Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur, wohingegen in anderen Arbeiten zusätzlich eine endothelabhängige Komponente der Relaxation in Aortenprapäraten beobachtet wurde, die im Rattenmodell mit zunehmendem Alter einen größeren Anteil einnimmt [MIKI et al. 2004, CHEN et al. 2005]. 17

26 1.6 EPAC: Exchange Protein directly activated by camp Exchange Protein directly activated by camp wurde erstmalig 1998 beschrieben [DE ROOIJ et al. 1998]. Es ist ein Guanosinnukleotidaustauschfaktor (GEF), der den GTP- Austausch der Ras-ähnlichen GTPase Rap1 sowie, wie später gezeigt wurde, auch anderer kleiner GTPasen wie R-Ras, Rit und Rims katalysiert. Via Rap1 soll es die Aktivität des Proteins Rac1 steigern und RhoA inhibieren [ROSCIONI et al. 2008]. Außerdem erhöht es die Offenwahrscheinlichkeit bestimmter Ionenkanäle [HOLZ et al. 2006]. Induziert wird die Aktivität von EPAC durch camp. Die Aktivierung von EPAC soll dabei direkt durch camp, unabhängig von der bis zur Entdeckung von EPAC als einzigen Effektor des camp angenommenen Proteinkinase A, geschehen. Die intrazelluläre Lokalisation von EPAC ist zellzyklusabhängig. Während der Interphase befindet es sich perinukleär, wohingegen es in der Metaphase an den Zentrosomen lokalisiert ist, was eine Beteiligung an der Mitose nahelegt [QUIAO et al. 2002]. EPAC existiert in den beiden Varianten EPAC1 (synonym CAMPGEFI) und EPAC2 (syn. CAMPGEFII), die unterschiedlich exprimiert sind. Gemeinsam sind den beiden die carboxyterminale katalytische Einheit und die aminoterminale regulatorische Einheit, wobei EPAC2 N-terminal zusätzlich eine cyclische Nukleotide bindende Untereinheit besitzt. Im Zuge der Aktivierung durch camp unterläuft EPAC eine Konformationsänderung. Das im inaktiven Zustand gefaltete Protein wird durch camp gestreckt, wodurch der mit Rap interagierende Anteil der katalytischen Einheit, CDC25HD, freigelegt wird [BOS 2006]. EPAC ist in mannigfaltigen biologischen Prozessen in verschiedensten Organsystemen, wie Herz, Blutgefäße, Lunge, Nervensystem, Immunsystem Niere, Pankreas involviert [Übersicht bei GLOERICH et al. 2010, GRANDOCH et al. 2010]. Es induziert unter anderem Integrin-vermittelte Zelladhäsion und reduziert die Permeabilität des Endothels. In Kardiomyozyten wurde ein prohypertrophischer Effekt von EPAC über den Calcineurin/NFAT-Signalweg gezeigt [MOREL et al 2005], dem durch Inhibierung von EPAC in der Zukunft therapeutisch entgegengewirkt werden soll [MÉTRICH et al. 2008, LEZOUALC H et al. 2009]. EPAC inhibiert den Natrium-Protonen- Austauscher NHE3 im Bürstensaum des proximalen Nierentubulus [HONEGGER et al. 2006] und den ATP-abhängigen Kaliumkanal in pankreatischen ß-Zellen [KANG et al. 2006]. Sulfonylharnstoffe aktivieren EPAC2; ob dies zu ihrer therapeutischen Wirkung zur Behandlung des Diabetes mellitus Typ2 beiträgt, ist bisher nicht geklärt [HERBST et al. 2011]. EPAC ist außerdem an der Entwicklung einer Hyperalgesie in entzündetem Gewebe beteiligt [HUCHO et al. 2005]. 18

27 Bezüglich der Wirkung von EPAC auf die Kontraktilität der glatten Muskulatur ist bisher wenig bekannt. In nicht permeabilisierten Präparaten der Rattenaorta bewirkten EPAC- Aktivatoren eine partielle Relaxation nach alpha-adrenerger kontraktiler Stimulation [SUKHANOVA et al. 2006]. Eine aktuelle Arbeit an der trachealen Muskulatur des Meerschweinchens zeigt eine Reduktion der durch Metacholin induzierten Kontraktion, MLC 20 -Phosphorylierung und RhoA-Aktivierung nach Behandlung mit dem EPAC-Aktivator 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP, welche einer Verminderung der ROCK-Aktivität bei Erhöhung der Rac1-Aktivität zugeschrieben wird [ROSCIONI et al. 2011]. In einer weiteren nach der Durchführung der dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente publizierten Untersuchung wird eine Relaxation permeabilisierter Pulmonalarterien des Kaninchens nach Behandlung mit dem 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP beschrieben [ZIEBA et al. 2011]. In unserem Labor wurde mittels PCR die Expression von EPAC1 und EPAC2 in der Gefäßmuskulatur der Schwanzarterie der Maus nachgewiesen [PÜTZ, unveröffentlicht]. 1.7 camp-analoga zur selektiven Aktivierung von PKA und EPAC Da traditionell zur camp-erhöhung genutzte Substanzen wie Forskolin, ebenso wie eine Inhibition der camp abbauenden Phosphodiesterasen, eine unselektive Aktivierung aller camp-effektoren bewirken, wurden zur differenzierten Erforschung der spezifischen Funktionen der beiden camp-effektoren PKA und EPAC gezielt veränderte Analoga von camp entwickelt, die durch chemische Modifikation eine spezifische, oder zumindest präferentielle Aktivierung von entweder PKA oder EPAC erlauben. Die Entfernung des OH-Restes am Ribosylring (Position 2) verringert die Affinität des so geschaffenen camp-analogons 2 -deoxy-camp zu PKA deutlich, etwa auf 1/15000 gegenüber dem nativen camp. Jedoch ist auch die EPAC-Affinität von 2 -deoxy-camp gering. Durch den Austausch des 2 -OH durch ein 2 -O-Methyl und die Addition eines Parachlorphenylthio-Restes an Position 8 (8-pCPT) konnte die Affinität für EPAC deutlich gesteigert und somit der EPAC-Aktivator 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (in dieser Arbeit auch als pcpt-camp abgekürzt) konstruiert werden, dessen Affinität zu EPAC mehr als einhundert mal größer ist als zu PKA [ENSERINK et al. 2002] und der in dieser Arbeit zur EPAC- Aktivierung verwendet wird. Über eine Bindung und Inhibition der Phosphodiesterasen PDE 1,2 und 6 und daraus resultierende globale camp- und cgmp-erhöhung durch 8-pCPT-2 -O- Me-cAMP wurde berichtet [LAXMAN et al. 2006, POPPE et al. 2008]. Eine noch weiter 19

28 erhöhte Selektivität für EPAC weist das 8-pMeOPT-2 -O-Me-cAMP auf [HOLZ et al. 2006], die Membranpermeabilität des 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP kann durch Addition eines Acetoxymethylesters zum 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP-AM gesteigert werden [VLIEM et al. 2008]; diese Substanzen kommen in der vorliegenden Arbeit nicht zum Einsatz. Additionen an Position 6 am Adeninring des camp erzeugen eine hohe Affinität zu PKA bei gleichzeitig geringer Affinität zu EPAC [CHRISTENSEN et al. 2003]. Zur selektiven PKA- Aktivierung wird in dieser Arbeit somit das 6-Benzoyl-cAMP (dieser Arbeit auch als BnzcAMP abgekürzt) verwendet Zielsetzung der Arbeit In dieser Arbeit sollen die Wirkung von PKA und EPAC auf die Kontraktions- und Relaxationskinetiken sowie die Calciumsensitivierung durch kontraktile Agonisten in der permeabilisierten Gefäßmuskulatur der Maus beleuchtet werden. Dabei sollen mittels camp- Analoga, die gezielt entweder PKA oder EPAC aktivieren sollen, die jeweiligen Anteile von PKA und EPAC an Phänomenen, die bisher allein der PKA als ehemals einzigem bekannten Effektor des camp zugeschrieben wurden, herausgearbeitet werden. Es wird untersucht, wie PKA und EPAC die agonisteninduzierte und die calciuminduzierte Kontraktion und Myosinphosphorylierung modulieren. Weiterhin wird, als Surrogat ihrer Wirkung auf die MLCP-Aktivität, die Beeinflussung der Relaxationskinetik in calciumfreier Lösung durch PKA und EPAC gemessen. Weitere Experimente widmen sich dem Vergleich von PKA und EPAC mit Urocortin, das den intrazellulären camp-spiegel erhöht, in ihrem Vermögen, die durch zwei auf verschiedenen Wegen wirkende kontraktile Agonisten Phenylephrin und U46619 induzierte Calciumsensitivierung zu beeinflussen. Hierbei wird, neben dem Arterientonus und der Myosinphosphorylierung, die Phosphorylierung dreier regulatorischer Aminosäurereste von MYPT1 - Serin 695, Threonin 696 und Threonin 853 sowie VASP gemessen. MYPT1 Serin 695 und VASP gelten als Phosphorylierungsstellen der PKA, während MYPT1 Threonin 696 und 853 durch die Effektorkinasen kontraktiler Agonisten phosphoryliert werden sollen. Das Netzwerk der Regulation des Muskeltonus und die möglichen Mechanismen der EPAC-Wirkung sind in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Abschließend wird zur Prüfung der Spezifität der verwendeten camp-analoga beobachtet, ob ein Inhibitor der PKA die Wirkung des PKA-Aktivator und des EPAC-Aktivators abzuschwächen vermag. 20

29 Abb. 4: schematische und vereinfachte Darstellung der Regulation des Tonus der Gefäßmuskulatur. Auf der linken Seite sind zur Kontraktion führende, auf der rechten Seite zur Relaxation führende Signalwege abgebildet. Hypothetische Mechanismen sind mit Fragezeichen gekennzeichnet. 21

30 2. Materialen und Methoden 2.1 Versuchstiere Für die Versuche werden männliche Mäuse des Stammes C57BL/6 ( black six ) im Alter von fünf bis acht Wochen verwendet. Die Tiere werden mit Genehmigung der Bezirksregierung Köln im Tierstall des Zentrums für Physiologie gemäß den einschlägigen Bestimmungen gehalten und mit Pressfutter und Wasser ad libitum ernährt 2.2 Präparation der Mausschwanzarterie Das Tier wird mit Isofluran (500 µl in einem Glasgefäß von ca. 500 ml Volumen) anästhesiert und nach Eintritt der Bewusstlosigkeit rasch mit einer Schere dekapitiert. Der Schwanz wird mit einem Scherenschnitt abgesetzt und nach dem Abziehen der Haut unverzüglich in Ca 2+ -arme PSS bei 4 C überführt. In dieser Lösung wird das Präparat für 30 Minuten bei 4 C belassen. Danach wird der Mausschwanz in einer mit Ca 2+ -armer PSS gefüllten Petrischale mit vier Nadeln fixiert und unter dem Stereomikroskop mit Pinzetten und Mikroschere die ventrale Mausschwanzarterie vorsichtig isoliert, wobei umliegendes Fett- und Bindegewebe sowie abgehende Blutgefäße entfernt werden. Dabei sollte mit der Pinzette nur das periadventitielle Gewebe, nicht die Arterie selbst, gepackt werden. Nach der Isolation verbleibt die Arterie für 10 Minuten in Ca 2+ -armer PSS, um sich auf ihre endgültige Länge einzustellen, und wird dann unter Kontrolle einer im Okular eingebrachten Skala in Abschnitte gleicher Länge zerteilt. Daraufhin werden die Präparate für 15 Minuten in einem Eppendorfgefäß mit Relaxationslösung belassen, bevor sich die chemische Permeabilisierung der Zellmembran anschließt Permeabilisierung der Zellmembran Um Phänomene der Kontraktion und Relaxation der glatten Muskulatur, welche vom intrazellulären Calciumgehalt unabhängig sind, zu studieren, hat sich die Untersuchung von permeabilisiertem Muskel etabliert [PFITZER 1996]. Im Zuge der Permeabilisierung wird die Eigenschaft der Zellmembran, intrazellulär einen von dem des die Muskelzelle umgebenden Mediums verschiedenen Calciumspiegel aufrecht erhalten zu können, zunichte 22

31 gemacht. Somit kann mit einer Lösung eines definierten Calciumgehalts im Organbad nun auch das intrazelluläre Calcium auf eben diesem Niveau fest eingestellt, oder durch Änderung der Lösung variiert werden Alpha-Haemolysin Alpha-Haemolysin, auch alpha-toxin genannt, ist ein porenbildendes Exotoxin aus Staphylococcus areus, das Zellmembranen schädigt und somit zur Virulenz des Bakteriums beiträgt. Die erzeugten Poren sind 1-3 nm groß und für Moleküle von <1 kda permeabel, so dass kleinere Moleküle wie beispielsweise ATP, nicht aber größere wie Calmodulin allen Lösungen zugesetzt werden müssen. Die Präparate werden über 40 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung aus alpha-haemolysin in Relaxationslösung (37,50 Einheiten alpha-haemolysin/ml) permeabilisiert. Zum Abschluss der Permeabilisierung werden die Präparate erneut in Relaxationslösung transferiert. [Übersicht bei PFITZER 1996]. Rezeptorgekoppelte Signalkaskaden bleiben von der Wirkung des Toxins verschont, so dass Vorgänge der pharmakomechanischen Kopplung an mit alpha-toxin permeabilisierten Präparaten untersucht werden können [KITAZAWA et al. 1989] Beta-Escin Das aus der Rosskastanie stammende Beta-Escin ist ein Saponinester, der Cholesterin aus Zellmembranen löst. Die Membranen werden dadurch permeabel für Moleküle von bis zu 150 kda. Die Funktion intrazellulärer G-Protein gekoppelter Signalkaskaden bleibt erhalten. Da kleinere Moleküle, wie etwa das zur glattmuskulären Kontraktion benötigte Calmodulin (17 kda), aus mit Saponoiden permeabilisierten Zelle heraus diffundieren, muss Calmodulin der Lösung im Organbad zugesetzt werden. [GARDNER et al. 1989]. Die Präparate werden über 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss in einer Lösung aus ß-Escin (50 µm) und Relaxationslösung permeabilisiert. Zum Abschluss der Permeabilisierung werden die Präparate erneut in Relaxationslösung transferiert. [Übersicht bei PFITZER 1996] 23

32 2.4. Isometrische Kraftmessungen der Arterienpräparate Der Tonus der Gefäßmuskulatur wird mit dem Drahtmyographen 610M der Firma Danish Myo Technology (Abb. 5) untersucht. Abb. 5: Drahtmyograph 610M der Firma DMT (Quelle: mit freundlicher Genehmigung) Darin werden 1,8 bis 2,0 mm lange Gefäßabschnitte, deren Innendurchmesser µm beträgt, unter mikroskopischer Sicht mit feinen Pinzetten behutsam auf zwei 40 µm starke Drähte aufgezogen und isometrisch fixiert. Dazu wird zunächst an einem Ende der linken der beiden zangenförmigen Backen ein Draht fixiert, auf welchen dann das Arterienpräparat nach sanfter Öffnung seines Lumens mit Hilfe zweier Pinzetten vorsichtig aufgefädelt und in der Mitte der Backen des Myographen zentriert wird (Abb. 6A). Nach der Befestigung des zweiten Endes des ersten Drahtes wird ein zweiter Draht unter Führung der Pinzette durch das Lumen der nun fixierten Arterie geschoben, wobei peinlichst darauf zu achten ist, das Präparat so wenig als möglich zu traumatisieren. Mit der Befestigung des zweiten Drahtes wird die Montage des Präparates auf dem Myographen vervollständigt (Abb. 6B). Ein Draht ist in dem mit Relaxationslösung gefüllten Organbad mit einem starren Mikropositionierer, der andere mit einem mechanoelektrischen Signalwandler verbunden. Kontraktionen bzw. Relaxationen des Muskelpräparats führen zu kleinen Bewegungen des Kraftüberträgers, aus denen die einwirkende Kraft errechnet und in der PC-Software Myodaq/Myodata dargestellt wird. Um mit kleineren Volumina der Lösungen (1,5 bis 2,0 ml) arbeiten zu können, werden in die Organbadkammer des Gerätes Kunststoffklötzchen, die mit Fett (vacuum grease, Bayer) fixiert werden, eingesetzt. 24

33 Abb. 6: schematische Darstellung des Montierens der Arterie auf den Myographen (Quelle: A: Vorschieben der Arterie über den ersten Draht mit Hilfe einer Pinzette B: auf zwei Drähten fixierte Arterie nach Abschluss des Montagevorgangs Im Organbad werden die Arterien kontinuierlich mit Luft begast, um durch strömende Luftblasen eine bessere Durchmischung der zugesetzten Substanzen im Organbad zu erzielen und insbesondere keine unbewegten Flüssigkeitsschichten ( unstirred layer ) entstehen zu lassen. Der Montage auf den Myographen folgend werden die Präparate mit dem Mikropositionierer schrittweise vorgedehnt, um eine einem Blutdruck von 100 mmhg entsprechende Wandspannung zu erhalten (Abb. 7) [HALPERN & MULVANY 1976, User s Manual DMT]. Danach werden die Präparate zur Depletion intrazellulärer Calciumspeicher mit dem Ionophor A23187 (10µmol/l) behandelt, welches der Relaxationslösung zugegeben wird und 20 Minuten einwirkt. Nach dieser Vorbereitung werden Kontraktionen als Wandspannung registriert und durch den Signalwandler in einen elektrischen Impuls umgewandelt, der im dazugehörigen Computerprogramm Myodaq aufgezeichnet und in mn/mm dargestellt wird. Abb. 7: beispielhafte Darstellung des in Stufen ablaufenden Vordehnungsprozesses. Nach Erreichen der höchsten Stufe (4) wird die optimale Vordehnung errechnet und der Mikropositionierer auf diesen Wert zurückgestellt (N) (Quelle: 25

34 2.5. Phosphorylierungsanalyse der Arterienpräparate Probengewinnung Für die Bestimmung der Proteinphosphorylierung werden Western Blots aus Homogenisaten eingefrorener Arterien angefertigt. Hierzu werden die Präparate von 3,5 bis 4,0 mm Länge - analog zum oben beschriebenen Aufziehen auf den Drahtmyographen auf zwei Drähten isometrisch fixiert, begast und vorgedehnt. Beide Drähte sind jedoch starr montiert und nicht an einen mechanoelektrischen Signalwandler gekoppelt, so dass gleichzeitig keine Kräfte gemessen werden können. Daher kann auch die Vordehnung nur approximativ vorgenommen werden. Nach Ablauf des Versuchsprotokolls werden die fixierten Arterien in einem Gemisch aus Aceton und Trockeneis schockgefroren und für 10 Minuten bei 80 C in 15% Trichloressigsäure/Aceton fixiert. Danach werden sie eine Minute lang in Aceton gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei 80 C gelagert SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Mit der SDS-Polyacrylamidgelektrophorese (Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamid Gel Electrophoresis: SDS-PAGE) werden Proteine unabhängig von ihrer Ladung nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Das negativ geladene SDS in Gel und Puffer lagert sich an die Proteine an, so dass diese homogen negativ geladen sind und im elektrischen Feld zur Anode migrieren [LAEMMLI 1970]. Zunächst werden die Proben mit dem Mikrohomogenisator (Tissue Grind Micro, Typ , Firma Kontes) in SDS-Probenpuffer homogenisiert, 3 Minuten bei 95 C erhitzt, 1:1 (v/v) mit zehnmolarer Harnstofflösung versetzt und auf Eis gesetzt. Nach einer Stunde werden die Probengefäße 10 Minuten lang bei g bei 4 C zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Gel aufgetragen oder zur späteren Verwendung bei 80 C gelagert. Bei den zur SDS-PAGE verwendeten Gelen handelt es sich um sogenannte Gradientengele von 10x8cm Größe, bei denen der Acrylamidgehalt von 4% im oberen bis auf 20% im unteren Bereich ansteigt. Dies dient einer gegenüber einem uniformen Gel besseren Auftrennung der Proteine über einen sehr breiten Molekulargewichtsbereich. Die Gele werden eigenhändig hergestellt. Zunächst werden eine vierprozentige und eine zwanzigprozentige Trenngellösung hergestellt. Durch Zugabe von APS und TEMED wird die Polymerisation initiiert. Unmittelbar darauf wird mittels einer aus zwei miteinander verbundenen Röhren bestehenden Mischapparatur die Trenngellösung mit dem 26

35 entsprechenden Acrylamidgradienten in den SE245 GelCaster der Firma Hoefer zwischen zwei sorgfältig mit Isopropanol gereinigte Glasplatten gegossen. Bis zur vollständigen Polymerisation vergeht etwa eine Stunde, danach können die Gelplatten, mit feuchten Tüchern umwickelt, bis zu drei Tage bei 4 C aufbewahrt werden. Um einen einheitlichen Start der Proteinseparation zu gewährleisten, wird über das eigentliche Trenngel ein Sammelgel, in welchem vor Einlaufen in das Trenngel die Proteinbeladungen gebündelt werden, aus 3,3% Acrylamid gegossen, in das mittels eines Kunststoffkamms Taschen zum Auftragen der Proteinlösung eingebracht werden. Die Aushärtung des Sammelgels nimmt etwa eine halbe Stunde in Anspruch. In der mit Laufpuffer gefüllten Hoefer260-Laufkammer wird der die Beladungstaschen formende Kamm entfernt und die gewünschten Proben sowie Molekulargewichtsmarker in die entstandenen Spuren des Gels pipettiert. Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine geschieht bei einer Stromstärke von 10 ma im Sammel- und 15 ma im Trenngel. Nach Durchführung der SDS-Page wird das Gel geteilt und der obere Bereich des Gels, in dem die > 120 kda schweren Proteine zu liegen kommen, mit Coomassieblau angefärbt. Dazu verbleiben die Gelabschnitte unter ständiger Bewegung für 1 Stunde in CoomassieR- Lösung, dann für 30 Minuten in Entfärber1-Lösung und für 3 Stunden in Entfärber2-Lösung. Die resultierenden angefärbten Proteinbanden werden im Scanner digitalisiert und mit dem Computerprogramm Phoretix densitometrisch ausgewertet Western Blot Per SDS-PAGE aufgetrennte Proteine werden beim Western Blot auf eine Nitrozellulosemembran (Protran) transferiert und können mit spezifischen Antikörpern immunochemisch detektiert werden [TOWBIN et al. 1979]. Die gewünschten Gelabschnitte werden in einem sogenannten Sandwich zwischen zwei Lagen Filterpapier der Blotmembran angelegt. Dieses Sandwich wird in eine Blotpufferlösung im elektrischen Feld eingetaucht, so dass die negativ geladenen Proteine vom Gel auf die Membran transferiert werden. Dies geschieht in der Apparatur BioRad Mini TransBlotCell über 1,5 Stunden bei einer Spannung von 80V. Die Apparatur wird während des gesamten Vorganges von innen und außen mit Eis gekühlt. Nach Abschluss des Blottingvorgangs erfolgt eine vorübergehende Färbung mit Ponceaurot. Die gefärbte Membran wird eingescannt. 27

36 Daraufhin wird die Membran in TBST entfärbt und zur Blockade unspezifischer Proteinbindungsstellen eine Stunde in 5% (w/v) Milchpulver in TBST bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Membran kurz mit TBST gewaschen und mit spezifischen Primärantikörpern inkubiert. - pmypt1 Ser 695 1:5000 in 5% (w/v) Milchpulver in TBST - pmypt1 Thr 696 1:20000 in 5% (w/v) Milchpulver in TBST - pmypt1 Thr 853 1:15000 in 5% (w/v) Milchpulver in TBST - pmlc 20 Ser 19 1:1000 bzw. 1:500 in 5% (w/v) BSA in TBST - MLC 20 1:2000 in 5% (w/v) Milchpulver in TBST - VASP 1:2000 in 5% BSA (w/v) Die Inkubation erfolgt unter konstanter Bewegung bei 4 C über Nacht. Nach viermaligem fünfminütigem Waschen in TBST wird die Membran mit einem Meerrettichperoxidasekonjugierten Zweitantikörper unter konstanter Bewegung eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Einsatz kommen, je nach Ursprung des Primärantikörpers, folgende Zweitantikörper - Esel anti Kaninchen IgG 1:10000 (v/v) in 5% (w/v) Milchpulver in TBST - Ziege anti Maus IgM 1:10000 (v/v) in 5% (w/v) Milchpulver in TBST Nach erneutem Waschen in TBST wird mit einem Substrat der Meerrettichperoxidase Chemilumineszenz (ECL) stimuliert. Verwendet werden dazu - SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Firma Perbio) - SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Firma Perbio) Die Substanzen werden nach Anweisung des Herstellers auf die Membranen aufgebracht, um die Chemilumineszenz zu erzeugen. Abschließend wird das Chemilumineszenzsignal durch Belichtung eines Röntgenfilmes (variable Belichtungszeit, je nach Intensität des Signals) detektiert. Die Membran wird getrocknet und asserviert. 28

37 Soll die Intensität eines phosphospezifischen Antikörpers gegen ein Protein mit der Signalintensität eines nicht phosphospezifischen Antikörpers gegen dasselbe Protein verglichen werden, so wird der initial gebundene phosphospezifische Antikörper mittel chemischen strippings von der Membran entfernt. Hierzu wird die Membran zweimal für zwanzig Minuten in Stripping-Puffer inkubiert. Dazwischen verbleibt sie für zwanzig Minuten in TBST. Ein Teil der Western-Blots wird mit dem Infrarotdetektionssystem Odyssee der Firma Li- Cor bearbeitet. Hierzu wird ein fluoreszierender Sekundärantikörper (Firma Li-Cor) eingesetzt, mit dem der Blot eine Stunde bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert wird. Nach Waschen in TBST wird das Fluoreszenzsignal im Odyssee-Scanner detektiert. Die quantitative Auswertung der Signalintensitäten erfolgt mit dem Computerprogramm Phoretix Lösungen Für die Zubereitung der Lösungen wurde sofern nicht anders angegeben total entsalztes Wasser 1 (R=18 MOhm aus den Reinstwasseranlagen MembraPure oder MilliQ) verwendet. Relaxationslösung (ph= 7,0 bei 23 C): als Stammlösung (aliquotiert bei -20 C gelagert und vor Gebrauch aufgetaut): 30 mm Imidazol 7,5 mm Na 2 ATP 10 mm EGTA 10 mm Magnesiumacetat 10 mm Creatinphosphat (21% H 2 0) 5 mm NaN 3 31,25 mm Kaliummethansulfonat Zugabe vor Gebrauch: 0,001 mm Leupeptin 2 mm DTT 20 µm GTP 10 mg/ml Glucose 29

38 Kontraktionslösung Wie Relaxationslösung, zusätzlich 10 mmol/l CaCl 2 Ca-arme PSS (physiological saline solution) (ph=7,4 bei 23 C): 118 mm NaCl 5 mm KCl 1,2 mm Na 2 HPO 4 24 mm HEPES 1,2 mm MgCl 2 0,16 mm CaCl 2 10 mm Glucose Lagerung bei 4 C Probenpuffer Lagerung bei -20 C: 50 mm Tris-HCl (ph=6,8) 1 % SDS (w/v) 20 % Glycerin (wasserfrei) (v/v) 0,005 % Bromphenolblau (w/v) Zugabe vor Gebrauch: 2 mm DTT 10 µm Leupeptin 5 µg/ml Aprotinin Harnstofflösung 10 M Harnstoff (in H 2 O) Trenngel 4 bzw. 20 % (v/v) Acrylamid/Bisacrylamid 375 mm Tris-HCL (ph=8,8) 2,5 % (v/v) Glycerin 0,1 % (w/v) SDS 0,05 % (w/v) APS 0,05 % (v/v) Temed 30

39 Sammelgel 3,3 % (v/v) Acrylamid/Bisacrylamid 125 mm Tris-HCL (ph=6,8) 0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) APS 0,1 % (v/v) Temed Unmittelbarer Gebrauch Laufpuffer (ph=8,3) 25 mm Tris 192 mm Glycin 0,1 % (w/v) SDS Lagerung bei Raumtemperatur Coomassie-Färbelösung 0,05 % Coomassie R-250 (w/v) 25 % Isopropanol (100 %) (v/v) 10 % Essigsäure (98 %) (v/v) Lagerung bei Raumtemperatur Entfärbelösung 1 50 % Ethanol (96 %, vergällt) (v/v) 7 % Essigsäure (98 %) (v/v) Lagerung bei Raumtemperatur Entfärbelösung 2 5 % Ethanol (96 %, vergällt) (v/v) 7 % Essigsäure (98 %) (v/v) Lagerung bei Raumtemperatur 31

40 Blotpuffer 25 mm Tris 192 mm Glycin 0,1 % SDS (w/v) 20 % Methanol (v/v) Lagerung bei Raumtemperatur Ponceau-Färbelösung Ponceau-S 1:100 in H 2 O verdünnt Lagerung bei Raumtemperatur TBS (Tris buffered saline) 10 mm Tris 150 mm NaCl Bei Raumtemperatur mit HCl auf ph 8 eingestellt. Lagerung bei Raumtemparatur. TBST (Tris buffered saline plus Tween) TBS-Lösung (siehe oben) versetzt mit 0,5 % Tween (v/v) Lagerung bei Raumtemperatur Blockierungslösung 5 % Magermilchpulver (w/v) in TBST Unmittelbarer Gebrauch Stripping-Puffer 200 mm Glycin 0,1 % SDS 20% 1,0 % Tween 20 Lagerung bei 4 C 32

41 2.7. Bezugsquellennachweis Substanzen zur Zellmembranpermeabilisierung Alpha-Haemolysin aus Staphylococcus aureus Sigma (USA) ß-Escin Sigma Calmodulin Inst. f. Vegetative Physiologie, Köln Ionophor A23187 Calbiochem (USA) Zyklische Nukleotide 8- (4-Chlorophenylthio)- 2'- O- methyladenosine- 3', 5'- cyclic monophosphate (8-pCPT-2'-O-Me-cAMP / "007" ) Biolog (Bremen) N 6 - Benzoyladenosine- 3', 5'- cyclic monophosphate (6-Benzoyl-cAMP ) Biolog Rezeptoragonisten Phenylephrin U46619 Urocortin 1 Sigma Alexis (Schweiz) Sigma Kinaseinhibitoren KN92 KN93 PKA-inhibitorisches Peptid 5-24 (PKI) Calbiochem Calbiochem Invitrogen (USA) Antikörper MLC 20 pmlc 20 Serin 19 pmypt1 Serin 695 pmypt1 Threonin 696 pmypt1 Threonin 853 Cell Signaling Technology (USA) Rockland (USA) Santa Cruz Biotechnology (USA) Milipore (USA) Milipore 33

42 VASP Esel anti-kaninchen (ECL) Esel anti-kaninchen (Odyssee) Ziege anti-maus (ECL) Ziege anti-maus (Odyssee) Cell Signaling Technology Immuno Research Laboratories (USA) Li-Cor (USA) Thermo Scientific (USA) Thermo Scientific Chemikalien Aceton Acrylamid/Bisacrylamid (30/0,8) Adenosintriphosphtat (NaATP) Ammoniumpersulfat (APS) Aprotinin Ammoniumpersulfat (APS) Bromphenolblau BSA (albumin bovine fraction V) Calciumchlorid (CaCl 2 ) Coomassieblau G250 Creatinphosphat Di-Kaliumhydrogenphosphat (K 2 HPO 4 ) Di-Natriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4) Dithiotritol (DTT) Dimethylsulfon (DMSO) Essigsäure Ethanol (unvergällt) Ethanol (vergällt) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) Glukose Glycerin Glycin Imidazol Kalilauge (KOH 1 M) Kaliumchlorid (KCl) Roth (Karlsruhe) Applichem (Darmstadt) Sigma Roth Applichem (Gatersleben) Applichem Roth Serva (Heidelberg) Applichem Biorad (USA) Roche (Schweiz) Serva Merck (Darmstadt) Applichem Merck Merck Roth Brenntag (Mülheim/Ruhr) Applichem Fluka (USA) Roth Roth Applichem Sigma Merck Roth 34

43 Leupeptin Magermilchpulver Magnesiumacetat Magnesiumchloridhexahydrat Methanol Methansulfonsäure Natriumazid (NaN 3 ) Natrimchlorid (NaCl) Natriumdodecylsulfat (SDS) Natronlauge (NaOH 1 M) Ponceau S Salzsäure (HCl 1 M) Tetramethylendiamin (TEMED) Trichloressigsäure (TCA) Tris-hydroxymethyl-Aminomethan (Tris) Tween-20 Sigma Applichem Fluka Merck Roth Roth Sigma Roth Applichem Merck Sigma Merck Applichem Roth Roth Serva Verbrauchsmaterialen für Western Blot Filterpapier Nitrozellulosemembran (Protran) ECL-Lösung Entwickler Fixierer Film Schleicher&Schuell (Dassel) Schleicher&Schuell Amersham Kodak (USA) Kodak Kodak Geräte Elektrophorese Dual Gel Caster und Zubehör Gelmischkammer (2-kammerig) High Voltage Power Pack P30 Powerpack 200 Protean III Mini Gel System Hoefer (USA) Werkstatt Uniklinik Köln Biometra (Göttingen) Biorad Biorad 35

44 Gellaufkammer 250 Easy Breeze Gel Dryer Hoefer Hoefer Filmkassette Suprema 24x30 cm Pb Dr. Goos-Suprema (Heidelberg) Infrarotsignaldetektion Odyssey Infrared Imaging System LI-COR (Bad Homburg) Kaltlichtquelle KL1500 electronic Schott (Mainz) Magnetrührer KMO 2 IKA-Laborwerke (Staufen) Myograph Wire Myograph 610M Danish Myo Technologies (Dänemark) ph-meter Ikamag RH IKA-Laborwerke Präparierbesteck Mikroschere Typ Vanna Pinzette Dumont 5 Sezierschere Plano (Wetzlar) Dumont&Fils (Schweiz) Plano Schüttler, Rotatoren und Vortexer DUOMAX 1030 Red Rocker Rotamax 120 test-tube rotator Vortex Genie2 Heidolph (Schwabach) Hoefer (USA) Heidolph Snijders Scientific (Niederlande) Scientific Industries (USA) 36

45 Stereomikroskope SZ-PT SZH Olympus (Japan) Olympus Heizblock Blockthermostat BT100 Kleinfeld Labortechnik (Gehrden) Western Blot Kammersystem Power Pack HC Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIORAD BIORAD Zentrifugen Typ 5417 Typ 5403 Eppendorf (Hamburg) Eppendorf 2.8. Datenanalyse und Statistik Die Auswertung sowie statistische und graphische Verarbeitung der experimentell gewonnenen Daten erfolgt mit dem Computerprogramm GraphPad Prism 4.0. Ergebnisse werden als arithmetisches Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Zur Prüfung auf statistische Signifikanz kommen Student s t-test und Varianzanalyse (ANOVA) zum Einsatz. Statistische Signifikanz wird bei p<0,05 angenommen, als Signifikanzniveaus sind p<0,05: *, p<0,01: ** und p<0,001: *** bezeichnet. 37

46 3. Ergebnisse 3.1. Aktivierung von PKA und EPAC nach Calciumsensitivierung Zur Überprüfung der Wirkung der Aktivierung von PKA beziehungsweise EPAC nach durch eine Calciumsensitivierung herbeigeführte Kontraktion in der permeabilisierten Mausschwanzarterie werden folgende, vom Versuchsprotokoll den Experimenten einer nach Durchführung dieser Untersuchungen publizierten Studie [ZIEBA et al. 2011] ähnelnde, Versuche durchgeführt: Nach der in Kapitel 2.4 beschriebenen Vorbereitung wird mit pca=6,1 eine Kontraktion induziert. Bei Erreichen des Plateaus der gemessenen Kraft, das nach ca. 10 Minuten eintritt, wird je eine der folgenden Substanzen mit den angegebenen Konzentrationen im Organbad appliziert, um eine für den jeweiligen kontraktilen Agonisten maximal erreichbare Calciumsensitivierung (vgl. Kapitel 3.3) herbeizuführen: 1) Phenylephrin 10-4 mol/l 2) U mol/l Nach zehnminütiger Inkubationszeit werden kumulativ folgende camp-analoga zugefügt, die in der jeweils höheren Konzentration in Vorexperimenten in unserem Labor bei pca=6,1 eine vergleichbare Tonusreduktion erzeugt hatten: 1) 6-Benzoyl-cAMP: 3*10-7, 10-6 mol/l 2) 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP: 10-5, 3*10-5 mol/l Die nächsthöhere Konzentration wird nach zehnminütiger Einwirkung appliziert. Abschließend werden die Präparate kurz bei pca=4,3 maximal aktiviert, bevor sie bei pca>8 für 15 Minuten relaxiert werden (Abbildung 8, 9). 38

47 A B Abb. 8: A: Schema des Versuchsprotokoll zur Wirkung von 6-Benzoyl-cAMP nach Calciumsensitivierung mit Phenylephrin bzw. U46619 B: Schema des Versuchsprotokolls zur Wirkung von 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP nach Calciumsensitivierung mit Phenylephrin bzw. U46619 A B C D Abb. 9: beispielhafte Originalaufzeichnungen der Myographie A: Calciumsensitivierung mit Phenylephrin, Behandlung mit Bnz-cAMP B: Calciumsensitivierung mit Phenylephrin, Behandlung mit pcpt-camp C: Calciumsensitivierung mit U46619, Behandlung mit Bnz-cAMP D: Calciumsensitivierung mit U46619, Behandlung mit pcpt-camp Die Zugabe von 100µM Phenylephrin bewirkt eine Tonuserhöhung um 60%, die Zugabe von 100nM U eine Tonuserhöhung von 100% gegenüber dem Ausgangstonus bei pca=6,1. Nach Calciumsensitivierung mit Phenylephrin führen bereits die jeweils niedrigeren Dosen der camp-analoga zu einer statistisch signifikanten (pcpt-camp 10µM) oder hochsignifikanten (Bnz-cAMP 0,3µM) Tonusreduktion. Nach Calciumsensitivierung mit 39

48 U46619 kann erst mit der jeweils höheren Konzentrationsstufe (pcpt-camp 30µM, BnzcAMP 1µM) eine statistische Signifikanz der Tonusreduktion erreicht werden. Die Dosissteigerung von 10 µm auf 30µM bewirkt nach Calciumsensitivierung mit Phenylephrin eine deutliche, statistisch signifikante weitere Tonusreduktion, während nach Calciumsensitivierung mit U46619 der Gefäßtonus beinahe unverändert bleibt. Im Falle des Bnz-cAMP bewirkt die Dosissteigerung von 0,3µM auf 1µM bei beiden kontraktilen Agonisten eine numerisch deutliche, statistisch allerdings nicht signifikante weitere Tonusreduktion. In den mit Phenylephrin behandelten Präparaten fällt der Tonus nach Applikation der camp-analoga jeweils unter den Ausgangswert bei pca=6,1 zurück, in den mit U46619 behandelten Präparaten wird mit Bnz-cAMP (1µM) ein annähernd identischer Tonus wie bei pca=6,1 erreicht, mit pcpt-camp (30µM) liegt der Tonus noch immer 45% über dem Augangswert bei pca=6,1 (Abbildung 9). A B Kraft in % * *** *** * *** ns ** Kraft in % ns ** ns ns ns * ns pca=6.1 PE e-4 Bnz-cAMP 3e-7 Bnz-cAMP e-6 pcpt-camp e-5 pcpt-camp 3e-5 pca=6,1 U46619 e-6 Bnz-cAMP 3e-7 Bnz-cAMP e-6 pcpt-camp e-5 pcpt-camp 3e-5 Abb. 9: A: Relative Kraft nach Calciumsensitivierung mit Phenylephrin und anschließender Aktivierung von PKA (Bnz-cAMP) bzw. EPAC (pcpt-camp). Mittelwert und Standardfehler aus 4 Experimenten. B: Relative Kraft nach Calciumsensitivierung mit U46619 und anschließender Aktivierung von PKA (Bnz-cAMP) bzw. EPAC (pcpt-camp). Mittelwert und Standardfehler aus 4 Experimenten. 40

49 3.2. Wirkung von PKA und EPAC auf die maximale Kraftentwicklung, die Kontraktions- und Relaxationskinetiken und die MLC 20 -Phosphorylierung Zur Untersuchung des Einflusses von PKA respektive EPAC auf die maximale Kraftentwicklung sowie die Kontraktions- und Relaxationskinetiken der permeabilisierten Gefäßmuskulatur nach calciuminduzierter Kontraktion werden die folgenden Versuche durchgeführt. Auf die wie in Kap 2.4 vorbereiteten Präparate in Relaxationslösung werden nun folgende Substanzen aufgebracht: 1. Präparat: 6-Benzoyl-cAMP 10-6 mol/l 2. Präparat: 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP 3*10-5 mol/l 3. Präparat: 6µl H 2 0 als Kontrolle Nach zehnminütiger Inkubation wird mit Aktivierungslösung (pca 4,3), die ebenfalls die entsprechenden Substanzen enthält, eine maximale Kontraktion induziert. Sobald ein Plateau der Kraft erreicht ist, werden die Arterien in Relaxationslösung (pca>8) mit der entsprechenden Substanz über 15 Minuten relaxiert (Abb. 10, 11). Von Interesse sind hierbei die Bestimmung der maximal erreichten Kraft sowie die Charakteristik der Kontraktions- und Relaxationskinetiken und deren Veränderung durch die Vorbehandlung mit den genannten zyklischen Nukleotiden. Die Relaxationskinetik wird in einer calciumfreien Lösung, in der die MLCK inaktiv ist, gemessen, so dass Veränderungen der Relaxationskinetik durch eine Modulation der Aktivität der MLCP zu erklären sind. Abb. 10: Schema des Versuchsprotokolls zur Untersuchung der Kontraktions- und Relaxationskinetiken 41

50 Zur Bestimmung der Proteinphosphorylierung in entsprechend behandelten Arterien werden Präparate zu folgenden Zeitpunkten in TCA fixiert und eingefroren: T1: im approximativen Kraftplateau (ca. 3-5 Minuten nach Applikation von pca=4,3) T2: T Sekunden nach Reapplikation von pca>8 Abb. 11: Originalregistrierung eines Kontraktions-Relaxationszyklus. Calciumreiche Aktivierungslösung (pca=4,3) löst eine Kontraktion des mit α-toxin permeabilisierten Arteriensegments aus. Bei Erreichen eines Kraftmaximums wird calciumfreie Lösung (pca>8) ins Organbad eingebracht, die zur Relaxation des Arterienpräparates führt Die Behandlung der Arterien mit 6-Benzoyl-cAMP führt zu einer Reduktion der maximalen Kontraktion bei pca=4,3 um 22%, die Behandlung mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP zu einer Reduktion um 12%. Die Senkung des Arterientonus gegenüber den Kontrollpräparaten ist bei beiden camp-analoga statistisch signifikant. Das numerisch unterschiedliche Ausmaß der Tonusreduktion zwischen 6-Benzoyl-cAMP und 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP weist gegeneinander jedoch keine Signifikanz auf (Abbildung 12, Tabelle 1). Kraft bei pca=4.3 (mn/mm) * * Kontrolle Bnz-cAMP pcpt-camp Abb. 12: Maximalkraft der Arterienpräparate bei pca=4,3. Gemessen wird der Tonus, der zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion erreicht wird. Aufgetragen sind arithmetisches Mittel und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus 5 Experimenten. 42

51 Maximale Kraft ± SEM [mn/mm] Kontrolle 6-Benzoyl-cAMP (1µM) 8-pCPT-2 -O-MecAMP (30µM) 1,46 ± 0,07 1,14 ± 0,14 1,28 ± 0,16 Tab. 1: Maximalkraft der Arterienpräparate bei pca=4,3. Gemessen wird der Tonus, der zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion erreicht wird. Angegeben sind arithmetisches Mittel und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus n=5 Experimenten. Die Geschwindigkeit der Kontraktionsentwicklung, gemessen vom Moment des Einbringens der Kontraktionslösung in das Organbad bis zum Erreichen der maximalen Kraft, wird durch 6-Benzoyl-cAMP signifikant, durch 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP jedoch nicht signifikant verringert (Abbildung 13). Der Zeitpunkt der fünfzigprozentigen Kontraktion wird nach Behandlung mit 6-Benzoyl-cAMP signifikant später erreicht als ohne Behandlung oder nach Behandlung mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP. (Abbildung 14, Tabelle 2) 100 relative Kraft (%) Bnz-cAMP pcpt-camp Kontrolle Zeit (Sekunden) Abb. 13: Zeitverlauf der Kontraktion nach Applikation von Kontraktionslösung (pca=4,3) bei Raumtemperatur. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). 43

52 75 * ns t 1/2 (Sekunden) Kontrolle Bnz-cAMP pcpt-camp Abb. 14: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Kontraktion erreicht wird. Abgebildet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 5 Experimenten. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). Kontrolle 6-BenzoylcAMP (1µM) 8-pCPT-2 -O-MecAMP (30µM) t ½ (sec) ± SEM 39,6 ± 2,7 64,3 ± 7,2 45,6 ± 4,1 Tab. 2: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Kontraktion erreicht wird. Aufgelistet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 5 Experimenten. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). Nach Erreichen des Plateaus der Maximalkraft wird nun der Zeitverlauf der Relaxation, beginnend mit dem Moment des Austauschs der calciumreichen Kontraktionslösung (pca=4,3) durch die calciumfreie Relaxationslösung (pca<8), gemessen. Nach Zugabe der calciumfreien Lösung folgt eine einige Sekunden anhaltende Plateauphase, in der noch keine Kraftminderung messbar ist. Diese hält in den Kontrollpräparaten etwa sieben Sekunden, in den mit camp-analoga behandelten Präparaten etwa vier Sekunden an. Dieser Plateauphase schließt sich eine Phase eines zunächst steilen, sich dann asymptotisch der völligen Relaxation nähernden Kraftabfalls an. Die Behandlung der Präparate mit 6-BenzoylcAMP und 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP beschleunigt die Relaxation gegenüber den nicht vorbehandelten Präparaten (Abbildung 15). Die Zeiten, zu denen eine fünfzigprozentige Relaxation erreicht (t 1/2 ) wird, werden gegenüber der Kontrolle signifikant verkürzt (Abbildung 16, Tabelle 3). 44

53 relative Kraft (%) Bnz-cAM P pcpt-camp Kontrolle Zeit (Sekunden) Abb. 15: Zeitverlauf der Relaxation nach Applikation von Relaxationslösung (pca>8) bei Raumtemperatur. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-MecAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). Mittelwertskurve aus 5 Experimenten. t 1/2 [Sekunden] * n.s. * * 0 Kontrolle Bnz-cAMP pcpt-camp Abb. 16: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Relaxation erreicht wird (Raumtemperatur). Abgebildet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 5 Experimenten. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). Kontrolle 6-BenzoylcAMP (1µM) 8-pCPT-2 -O-MecAMP (30µM) t ½ (sec) ± SEM 25,2 ± 1,7 18,9 ± 1,3 17,5 ± 1,0 Tab. 3: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Relaxation erreicht wird (Raumtemperatur). Aufgelistet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 5 Experimenten. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). 45

54 Die Relaxationsmessungen werden bei erniedrigter Temperatur (11 C) erneut durchgeführt, um einen verlangsamten Relaxationsablauf beobachten zu können. Zu diesem Zweck werden die Messapparaturen in einen Kunststoffblock, der von Wasser einer definierten, regelbaren Temperatur durchströmt wird, eingesetzt. Durch Verringerung der Temperatur der Lösungen auf 11 Celsius, also einer Temperaturminderung um ca. 10 C (äquivalent zu 10 Kelvin), verlangsamt sich der Ablauf der Relaxation erheblich (Abbildung 17). Die Dauer bis zum Erreichen einer 50-prozentigen Relaxation (t 1/2 ) wird in etwa verfünffacht (Abbildung 18, Tabelle 4), was einen Temperaturkoeffizient Q 10 von ca. 5 bedeutet (Ausnahme 8-pCPT-2 - O-Me-cAMP: 106/17,49=6,06). relative Kraft (%) Bnz-cAMP pcpt-camp Kontrolle Zeit (Sekunden) Abb. 17: Zeitverlauf der Relaxation nach Applikation von Relaxationslösung (pca<8) bei 11 C. Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O- Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µlH 2 O). Mittelwertskurve aus 3 Experimenten (Bnz-cAMP: 2). 150 t 1/2 (Sekunden) Kontrolle Bnz-cAMP pcpt-camp Abb. 18: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Relaxation erreicht wird (11 Celsius). Abgebildet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 3 Experimenten (2 bei Bnz-cAMP, daher dort kein SEM). Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). 46

55 Kontrolle 6-BenzoylcAMP (1µM) 8-pCPT-2 -O-MecAMP (30µM) t ½ (sec) ± SEM 130,7 ± 6,1 94,5 ± n.a. 106,0 ± 11,0 Tab. 4: Zeitpunkt, zu dem eine 50-prozentige Relaxation erreicht wird (11 Celsius). Aufgelistet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 3 Experimenten (2 bei Bnz-cAMP, daher dort kein SEM). Den entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist 6-Benzoyl-cAMP (1µM) bzw. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, den Kontrollpräparaten das gleiche Volumen Lösungsmittel (2µl H 2 O). Um zu untersuchen, ob die Calcium/Calmodulin-Kinase II (CamKII) an der Beschleunigung der Relaxationskinetik durch EPAC beteiligt ist [PEREIRA et al. 2007], wird die Relaxationskinetik von 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP wie oben beschrieben sowie nach zusätzlicher Behandlung mit dem CamKII-Inhibitor KN93 (5µM) und, als Negativkontrolle, dessen nicht als CamKII-Inhibitor aktiver Trägersubstanz KN92 (5µMl) gemessen. Eine Inhibition der Calcium/Calmodulin-Kinase II bewirkt dabei keine relevante Veränderung der Relaxationskinetik (Abbildung 19). relative Kraft (%) 100 pcpt-camp pcpt-camp + KN92 75 pcpt-camp + KN Zeit (Sekunden) Abb. 19: Zeitverlauf der Relaxation nach Applikation von Relaxationslösung (pca>8) bei Raumtemperatur. Allen Präparaten ist 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) beigefügt, en entsprechend gekennzeichneten Präparaten ist zusätzlich der CamKII-Inhibitor KN93 (5µM) bzw. dessen inaktive Trägersubstanz KN 92 (5µM). Mittelwertskurve aus 3 Experimenten. Es wird nun die Beziehung zwischen dem Gefäßtonus und der Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette des Myosins, MLC 20, untersucht. Zur Messung der MLC 20 - Phosphorylierung werden die Präparate zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion und nach 15 Sekunden in der calciumfreien Relaxationslösung in einem Aceton-Trockeneis-Gemisch 47

56 eingefroren. Nachdem die Proben die im Kapitel beschriebene Behandlung durchlaufen haben, wird mittels SDS-PAGE und Western Blot die Phosphorylierung am Serinrest 19 der MLC 20 bestimmt. Dies geschieht in diesem Fall mit einem phosphospezifischen Antikörper (pmlc 20 ), dessen Signalintensität zu dem Signal des nach chemischem Stripping der Blotmembran aufgebrachten nicht phosphospezifischen MLC 20 -Antikörpers (MLC 20 -total) in Relation gesetzt wird. In den mit camp-analoga behandelten Präparaten ist die Myosinphosphorylierung zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion niedriger als in den unbehandelten Kontrollpräparaten. Behandlung mit 6-Benzoyl-cAMP senkt den Phosphorylierungsgrad um 22%, Behandlung mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP um 11%. 15 Sekunden nach Initiierung der Relaxation kann in den mit dem PKA- bzw. EPAC-Aktivator versetzten Präparaten eine stärkere Dephosphorylierung festgestellt werden, als in den Kontrollproben (Abbildung 20, Tabelle 5). In den mit 6-Benzoyl-cAMP behandelten Präparaten liegt der Phosphorylierungsgrad bei 52% der korrespondierenden Kontrollpräparate, in den mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP behandelten Präparaten bei 62%. A pca=4,3 pca=4,3 Bnz pca=4,3 pcpt pca>8 pca>8 Bnz pca>8 pcpt pmlc 20 Ser 19 MLC 20 -total B pmlc 20 / MLC pca=4,3 pca=4,3 Bnz pca=4,3 pcpt 15sec pca>8 15sec pca>8 Bnz 15sec pca>8 pcpt Abb. 20: Phosphorylierung von MLC 20 Ser19 (Verhältnis pmlc 20 / MLC 20, pca=4,3 definiert als 1) zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion (pca=4,3) und 15 Sekunden nach Auslösen der Relaxation (pca>8) A: Originalabbildung eines Western Blots mit pmlc 20 und MLC 20 -total Antikörper B: statistische Auswertung der gemessenen Phosphorylierung aus 4 Experimenten 48

57 pmlc 20 / MLC 20 pca=4,3 pca=4,3 Bnz-cAMP 1,0 0,78 ± 0,25 pca=4,3 pcpt-camp 0,89 ± 0,07 15 Sek pca>8 0,31 ± 0,02 15 Sek pca>8 Bnz-cAMP 0,16 ± 0,05 Tab. 5: Phosphorylierung von MLC 20 Ser19 (Verhältnis pmlc 20 / MLC 20, pca=4,3 definiert als 1) zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion (pca=4,3) und 15 Sekunden nach Auslösen der Relaxation (pca>8).angabe des arithmetischen Mittels und des Standardfehlers des Mittelwerts (SEM)aus 4 Experimenten. Zur Annäherung an die Frage, ob die relaxierende Wirkung der camp-analoga auf phosphorylierungsabhängigen oder phosphorylierungsunabhängigen Mechanismen beruht, werden nun Kraftniveau und MLC 20 -Phosphorylierung in Relation gesetzt, d.h. es wird der Quotient zwischen im Western Blot gemessener MLC 20 -Phosphorylierung und der in der gleichen Situation myographisch gemessenen Kraft gebildet. Dabei findet sich in allen Präparaten ein praktisch identisches Verhältnis zwischen Kraft und Phosphorylierung, sowohl bei den mit camp-analoga behandelten Arterien als auch den Kontrollpräparaten (Abbildung 21). Nach 15 Sekunden ist der Quotient aus Kraft und Phosphorylierung in allen Präparaten deutlich kleiner als zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion, d. h. innerhalb der 15sekündigen Relaxation geht die Dephosphorylierung dem Kraftverlust deutlich voraus (vgl. auch Abbildung 22). 15 Sek pca>8 pcpt-camp 0,19 ±0,06 MLC 20 -Phosphorylierung / Kraft pca 4.3 Bnz-cAMP pcpt-camp Ctrl 15sec pca>8 Abb. 21: Verhältnis von MLC 20 -Phosphorylierung und Kraft zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktion (pca=4,3) und 15 Sekunden danach (15sec pca>8). Mittelwert und Standardfehler (SEM) aus 4 Experimenten. 49

58 In dem durch Verringerung der Temperatur auf 11 C verlangsamten Reaktionsablauf können zu zwei Zeitpunkten im Verlauf der Relaxation Proben gewonnen werden. Messungen der MLC 20 -Phosphorylierung bei Einleitung der Relaxation sowie 30 und 80 Sekunden danach zeigen eine schnelle initiale Dephosphorylierung. Im weiteren Verlauf hingegen fällt die MLC 20 -Phosphorylierung bei starker weiterer Relaxation nicht mehr ab (Abb. 22). pmlc 20 (max. Kraft = 1) Kontrolle Bnz pcpt Relaxation in % Abb. 22: Verhältnis von Relaxation (x-achse) zu MLC 20 -Phosphorylierung (y-achse) zu Beginn der Relaxation sowie 30 und 80 Sekunden danach, bei 11 C. Mittelwert und Standardfehler (SEM) aus 3 Experimenten. 50

59 3.3. Modulation der agonisteninduzierten Calciumsensitivierung durch PKA und EPAC Um den Einfluss von PKA und EPAC auf die Wirkung kontraktiler Agonisten, die die Calciumsensitivität der Gefäßmuskulatur erhöhen, zu untersuchen, werden mit 6-BenzoylcAMP beziehungsweise 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP relaxierte Arterienpräparate mit kumulativ steigenden Konzentrationen der kontraktilen Agonisten Phenylephrin (PE), einem alpha 1 - Adrenorezeptor-Agonisten, respektive U46619, einem Thromboxan A2 -Rezeptor-Agonisten, inkubiert. Nach der Vorbereitung (siehe Kap. 2.4) wird bei pca=6,1 eine Kontraktion induziert. Bei Erreichen des Plateaus der gemessenen Kraft, das nach ca. 10 Minuten eintritt, wird je eine der folgenden Substanzen mit den angegebenen Konzentrationen, die in Vorexperimenten vergleichbare Relaxationen erzielt hatten, im Organbad appliziert: 1) 6-Benzoyl-cAMP 10-6 mol/l (PKA-Aktivator) 2) 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP 3*10-5 mol/l (EPAC-Aktivator) 3) Urocortin 10-7 mol/l (CRF Rezeptor-Agonist) 4) H 2 O 2 µl (Kontrolle) Nach zehnminütiger Inkubationszeit beginnt die Calciumsensitivierung mit ansteigenden Konzentrationen der kontraktilen Agonisten Phenylephrin (PE) beziehungsweise U46619 in folgenden Stufen: Phenylephrin: 3*10-6, 10-5, 3*10-5, 10-4 mol/l U46619: 3*10-9, 10-8, 3*10-8, 10-7, 3*10-7, 10-6, 3*10-6 mol/l Die nächsthöhere Konzentration wird jeweils bei Erreichen eines Kraftplateaus der vorangegangenen Konzentration appliziert; dies ist nach etwa 5 Minuten der Fall. Nach Ablauf der Calciumsensitivierungsreihe werden die Präparate kurz bei pca=4,3 auf Maximalkraft gebracht, bevor sie bei pca>8 für 15 Minuten relaxiert werden (Abb. 23). 51

60 A B Abb. 23: A: Schema des Versuchablaufes zur Calciumsensitivierung mit Phenylephrin B: Schema des Versuchsablaufes zur Calciumsensitivierung mit U46619 Zur Untersuchung der Proteinphosphorylierung in entsprechend behandelten Präparaten werden Arteriensegmente isometrisch fixiert und einem vereinfachten Versuchsprotokoll mit je zwei Konzentrationsstufen des kontraktilen Agonisten unterzogen. Dies sind bei Phenylephrin 10-5 M und 10-4 M und bei U M und 10-6 M. Zur späteren Verwendung im Western Blot werden die Präparate wie beschrieben in TCA fixiert und eingefroren. Die Kraft wird relativ zur maximalen Kraft bei pca=4,3 angegeben. Nach Erhöhung des pca auf 6,1 erfolgt eine überschießende Kontraktion, die sich innerhalb von ca. 10 Minuten auf einem Plateau einstellt. Die dann folgende Zugabe von 6-Benzoyl-cAMP, 8-pCPT-2 -O-MecAMP oder Urocortin führt zur submaximalen Relaxation des Gefäßes. Diese Relaxation ist bei 6-Benzoyl-cAMP mit 81,25 ± 5,77 % stärker ausgeprägt als bei 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP mit 61,84 ± 8,24 % und Urocortin mit 66,67 ± 11,18 %. Das daraufhin nach zehnminütiger Inkubation resultierende Kraftniveau wird zur weiteren Berechnung als Basalwert (relative Kraft f rel =0=0%) definiert. Der in der abschließenden Maximalkontraktion bei pca=4,3 erzielte Wert wird als Maximalwert (f rel =1=100%) definiert. In Bezug dazu werden die nach Applikation ansteigender Konzentrationen der kontraktilen Agonisten erreichten Kräfte in Prozent ausgedrückt. 52

61 Calciumsensitivierung mit dem α 1 -Sympathomimetikum Phenylephrin. A B C D Abb. 24: beispielhafte Originalaufzeichnungen der Myographie, Calciumsensitivierung mit Phenylephrin A: Kontrolle B: Vorbehandlung mit 30µmol/l 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP C: Vorbehandlung mit 1µmol/l 6-Benzoyl-cAMP D: Vorbehandlung mit 100nM/l Urocortin Phenylephrin bewirkt eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Kraft, die bei der Höchstkonzentration von 10-4 mol/l ohne Behandlung mit zyklischen Nukleotiden 20,5% der bei pca=4,3 erreichten Maximalkraft beträgt. Diese wird durch Vorbehandlung mit 6- Benzoyl-cAMP und 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP reduziert, so dass nur noch 2,75% (6-BenzoylcAMP) beziehungsweise 7,8% der Maximalkraft bei pca=4,3 erreicht werden. Die Behandlung mit Urocortin mindert die Calciumsensitivierung durch Phenylephrin hingegen nicht (Abbildung 25, Tabelle 6). 53

62 30 relative Kraft in % log [Phenylephrin] mol/l * ** Urocortin Kontrolle pcpt-camp Bnz-cAMP Abb. 25: Calciumsensitivierung mit Phenylephrin und ihre Beeinflussung durch 6-Benzoyl-cAMP (1µM), 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) und Urocortin (100nM). Relative Kraft angegeben in Prozent der Maximalkraft bei pca=4,3 abzüglich des Grundtonus bei pca=6,1. Dargestellt sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 4 Experimenten. [Phenylephrin] mol/l Kontrolle 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP 6-Benzoyl-cAMP Urocortin 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 3*10-6 3,0 ± 0,6 0,8 ± 0,3 1,0 ± 0,0 2,5 ± 1,5 1*10-5 6,7 ± 1,2 1,5 ± 0,3 1,0 ± 0,0 7,0 ± 2,0 3* ,3 ± 3,3 4,0 ± 1,8 1,5 ± 0,3 13,5 ± 2,5 1* ,5 ± 3,9 7,8 ± 2,5 2,8 ± 0,3 22,5 ± 0,5 Tab. 6: Calciumsensitivierung mit Phenylephrin und ihre Beeinflussung durch 6-Benzoyl-cAMP (1µM), 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) und Urocortin (100nM). Relative Kraft angegeben in Prozent der Maximalkraft bei pca=4,3 abzüglich des Grundtonus bei pca=6,1. Aufgelistet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 4 Experimenten. Beide camp-analoga sowie Urocortin bewirken bei pca=6,1 einen Abfall der MLC 20 - Phosphorylierung; 6-Benzoyl-cAMP um 49%, 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP um 29% und Urocortin um 12%. Phenylephrin (10-4 M) bewirkt in den Kontrollpräparaten einen Anstieg der Phosphorylierung um 30%. In mit 6-Benzoyl-cAMP vorbehandelten Präparaten führt Phenylephrin zu einer Zunahme der Phosphorylierung um 15%, in den mit 8-pCPT-2 -O-MecAMP vorbehandelten Präparaten um 40% gegenüber dem Ausgangswert. In mit Urocortin behandelten Präparaten liegt die MLC 20 -Phosphorylierung nach Zugabe von Phenylephrin um 47% höher als zuvor (Abbildung 26). 54

63 Es zeigt sich also ein in der Tendenz ähnliches Verhalten der MLC 20 -Phosphorylierung und der myographisch gemessenen Kraft. Auffällig ist, dass in mit den camp-analoga oder Urocortin behandelten Präparaten der Anstieg der Phosphorylierung nach Phenylephrin-Gabe den Anstieg der myographisch gemessenen Kraft deutlich übersteigt. Dabei gilt es freilich zu beachten, dass Versuchsaufbau und -Protokoll nicht identisch sind (siehe Kapitel 2.5.1) und zudem beide Methoden mit einer gewissen Fehlerbreite behaftet sind. relative MLC 20 -Phosphorylierung Ctrl pca=6.1 Bnz pca=6.1 pcpt pca=6.1 UCN pca=6.1 Ctrl PE Bnz PE pcpt PE UCN PE Abb. 26: Phosphorylierung von MLC 20 an der Position Serin 19 nach Behandlung mit Phenylephrin, 6-Benzoyl-cAMP, 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP und Urocortin, gemessen im Western Blot aus dem Verhältnis der Signalintensität des phosphospezifischen MLC 20 - Antikörpers und des alpha-aktin-antikörpers. Dargestellt sind der Mittelwert und der Standardfehler (SEM) aus 6 Experimenten in arbiträren Einheiten. 55

64 Calciumsensitivierung mit dem Thromboxananalogon U46619 A B C D Abb. 27: beispielhafte Originalaufzeichnungen der Myographie, Calciumsensitivierung mit U46619 A: Kontrolle B: Vorbehandlung mit 30µmol/l 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP C: Vorbehandlung mit 1µmol/l 6-Benzoyl-cAMP D: Vorbehandlung mit 100nmol/l Urocortin U46619 bewirkt eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Kontraktion, die stärker ist, als die durch Phenylephrin induzierte Kontraktion. In den Kontrollpräparaten wird bei der höchsten Konzentration von U46619, 3*10-6 mol/l ein Kraftanstieg auf 46,8% der bei pca=4,3 gemessenen Kraft erreicht. Die Calciumsensitivierung wird durch Urocortin und 6- Benzoyl-cAMP im gleichen Ausmaß auf 23,7% (Urocortin) respektive 25,3% (6-BenzoylcAMP) der Maximalkraft abgeschwächt. Die von 6-Benzoyl-cAMP vermittelte Reduktion der Calciumsensitivierung ist geringer als bei Sensitivierung mit Phenylephrin. Urocortin jedoch zeigt hier einen mit 6-Benzoyl-cAMP vergleichbaren hemmenden Effekt auf die Calciumsensitivierung, der bei der Verwendung von Phenylephrin nicht zu beobachten war. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP hat keinen inhibierenden Effekt auf die Calciumsensitivierung mit U46619, mit 47,3% der Kraft bei pca=4,3 ist die Calciumsensitivierung hier praktisch gleich stark wie in den Kontrollpräparaten (Abbildung 28, Tabelle 7). 56

65 relative Kraft in % p=0,07 * Kontrolle pcpt-camp Bnz-cAMP Urocortin log [U46619] mol/l Abb. 28: Calciumsensitivierung mit U46619 und ihre Beeinflussung durch 6-Benzoyl-cAMP (1µM), 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) und Urocortin (100nM). Relative Kraft angegeben in Prozent der Maximalkraft bei pca=4,3 abzüglich des Grundtonus bei pca=6,1. Dargestellt sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 3 Experimenten. [U46619]mmol/l Kontrolle 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP 6-Benzoyl-cAMP Urocortin 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ±0 3*10-9 1,8 ± 0,5 0 ± 0 0,3 ± 0,3 0,7 ± 0,3 1*10-8 7,5 ± 2,5 5,0 ± 2,1 1,0 ± 0,6 0,7 ± 0,3 3* ,0 ± 6,3 15,0 ± 7,2 2,7 ± 0,9 1,3 ± 0,9 1* ,5 ± 9,8 28,3 ± 10,3 6,0 ± 2,5 6,0 ± 1,2 3* ,8 ± 9,4 41,3 ± 10,8 14,7 ± 3,8 17,0 ± 0,6 1* ,3 ± 7,9 46,7 ± 8,4 22,3 ± 4,7 24,0 ± 0,6 3* ,8 ± 6,5 47,3 ± 5,2 25,3 ± 6,4 23,7 ± 2,9 Tab. 7: Calciumsensitivierung mit U46619 und ihre Beeinflussung durch 6-Benzoyl-cAMP (1µM), 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP (30µM) und Urocortin (100nM). Relative Kraft angegeben in Prozent der Maximalkraft bei pca=4,3 abzüglich des Grundtonus bei pca=6,1. Aufgelistet sind das arithmetische Mittel und der Standardfehler (SEM) aus 3 Experimenten. U46619 (10-6 M) bewirkt in den Kontrollpräparaten einen Anstieg der MLC 20 - Phosphorylierung um 75%. In mit 6-Benzoyl-cAMP vorbehandelten Präparaten führt U46619 zu einer Zunahme der Phosphorylierung um 111%, in den mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP vorbehandelten Präparaten um 136% gegenüber dem Ausgangswert. In mit Urocortin behandelten Präparaten liegt die MLC 20 -Phosphorylierung nach Zugabe von Phenylephrin um 90% höher als zuvor. (Abbildung 29) 57

66 relative MLC 20 -Phosphorylierung Ctrl pca=6.1 Bnz pca=6.1 pcpt pca=6.1 UCN pca=6.1 Ctrl U46619 Bnz U46619 pcpt U46619 UCN U46619 Abb. 29: Phosphorylierung von MLC 20 an der Position Serin 19 nach Behandlung mit U46619, 6-Benzoyl-cAMP, 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP und Urocortin, gemessen im Western Blot aus dem Verhältnis der Signalintensität des phosphospezifischen MLC 20 -Antikörpers und des alpha-aktin-antikörpers. Dargestellt sind der Mittelwert und der Standardfehler (SEM) aus 6 Experimenten in arbiträren Einheiten Wirkung der camp-analoga auf die Phosphorylierung von MYPT1 und VASP Zur Untersuchung der Phosphorylierung von MYPT1 an den Phosphorylierungsstellen Serin 695, Threonin 696 und Threonin 853 werden homogenisierte Arterienpräparate im Western Blot Verfahren mit entsprechenden phosphospezifischen Antikörper inkubiert. Zusätzlich wird die Phosphorylierung des vasodilatator-stimulated phosphoprotein (VASP) registriert. Dies geschieht hier nicht mittels eines phosphospezifischen Antikörpers gegen an Serin 157 phosphoryliertes VASP, sondern, da mit dem phosphospezifischen Antikörper nur eine unbefriedigende Signalintensität erreicht werden konnte, mit einem Antikörper gegen das Gesamtprotein. Aufgrund der Tatsache, dass phosphoryliertes VASP ein höheres apparentes Molekulargewicht aufweist als nicht phosphoryliertes VASP, bilden sich in der Gelelektrophorese und im Western Blot zwei diskrete Banden, aus deren relativer Signalintensität das Verhältnis zwischen phosphoryliertem (schwere Bande) und nicht phosphoryliertem VASP (leichte Bande) bestimmt werden kann. MYPT1 Serin695 und VASP gelten als Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase A, MYPT1 Threonin 696 und Threonin 853 als Phosphorylierungsstellen von ZIP-Kinase und Rho-Kinase. 58

67 Coomassie Ponceau Abb. 30: beispielhafte Originalabbildung eines SDS-PAGE/Western Blot Experiments. oben: Coomassiefärbung des oberen Abschnitts des Elektrophoresegels unten: Ponceaufärbung der Blotmembran zum Nachweis des Proteintransfers Insgesamt sind die erzielten Ergebnisse mit einer großen Streuungsbreite behaftet, die dazu führt, dass die beobachteten Phosphorylierungsänderungen keine statistische Signifikanz erlangen. Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase A: MYPT1 Serin 695 und VASP Die Serin695-Phosphorylierung in mit Phenylephrin behandelten Präparaten ist nahezu identisch (94%) zu den Kontrollpräparaten, in mit U46619 behandelten Präparaten sinkt die Phosphorylierung auf 72% des Ausgangswertes. Die Phosphorylierung von MYPT1 an Serin 695 wird durch Behandlung mit 6-Benzoyl-cAMP um 140% erhöht. In den mit 6-BenzoylcAMP und Phenylephrin bzw. U46619 behandelten Präparaten liegt die Phosphorylierung um 130% bzw. 260% höher als in den nur mit dem jeweiligen kontraktilen Agonisten behandelten Präparaten. 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP bewirkt an sich keine Änderung der Serin695-Phosphorylierung. In den mit 8-pCPT-2 -O-Me-cAMP und den kontraktilen Agonisten Phenylephrin bzw. U46619 behandelten Präparaten nimmt die Serin695- Phosphorylierung um 47% bzw. 187% gegenüber alleiniger Behandlung mit dem jeweiligen kontraktilen Agonisten zu. Die Behandlung mit Urocortin führt zu einem Anstieg der Serin695-Phosphorylierung um 55%. Bei zusätzlicher Behandlung mit Phenylephrin steigt die Phosphorylierung um 123%, bei zusätzlicher Behandlung mit U46619 um ca. 48% gegenüber alleiniger Behandlung mit dem jeweiligen kontraktilen Agonisten. 59