ZUR BESTIMMUNG DER CHOLSAURE. II. Mitteilung:* Eine Verbesserung zur Methode von Gregory und

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1 The Journal of Biochemistry, Vol. 28, No. 1. ZUR BESTIMMUNG DER CHOLSAURE. II. Mitteilung:* Eine Verbesserung zur Methode von Gregory und Pascoe, VON TOSHIO SHIMADA. (Aus dem physiologisch-chemischen Laboratorium der "Nippon"-Medizin - Hochschule, Tokio. Vorstand: Prof. Dr. K. Kaziro.) (Eingegangen am 25. April 1938) Eine Methode, die die einzelnen Gallensauren gesondert zu bestimmen befahigt, ist unter den zahlreichen Angaben uber die Gallensaurebestimmung noch nicht anzutreffen. Die Pettenkofer' sche Farbreaktion der Gallensaure mit H2SO4 und Rohrzucker ist als empfindlichste Nachweis und Bestimmungsreaktion zur Bestimmung derselben auf kolorimetrischem Wege in ausgedehntem Masse herangezogen worden. Diese Reaktion verlauft aber, wie bekannt, je nach den Gallensaurearten verschieden stark und mit verschiedenen Farbnuancen. Hierin liegt eine Beschrankung der Brauchbarkeit dieser Reaktion, sie bietet jedoch gleichzeitig eine Moglichkeit zur gesonderten Bestimmung einzelner Gallensauren. So z. B. mit der Anderung der Art und Konzentration der Saure, der Reaktionstemperatur, sowie der beigefugten Aldehydarten (wie Furfurol, Vanillin oder Benzaldehyd) wurde die Empfindlichkeit und die Spezifitat der Reaktion verandert. TTnter zahlreichen Modifikationen der Reaktion haben sich aber nur wenige als wirklich spezifisch fur bestimmte Gallensauren erwiesen. Heute sieht man die Reaktionen von Gregory und Pascoe (1929), von Abe (1937) Bowie von Ohyama (1938) als fur Cholsaure spezifisch und die Reaktion von Kaziro und Shimada (H2S04-Benzaldehyd Eisessig, 1938) als fur Desoxycholsaure spezifisch an. (Siehe Tabelle I. vgl. auch die spektrographischen Studien von Shimada, 1938). * I. Mitteilnng: Ohyama, Jl. of Biochem., 27, 351 (1938). 149

2 150 T. Shimada: Soinit konnen nur die auf der genannteit Reaktion beruhenden Best imm nzgsmethoden als zuverlassig betrachtet werden. TABELLE I. In der vorangegangenen Mitteilung hat Ohyama eine Bestim mungsmethode der Cholsaure ausgearbeitet, die auf der spezifischen HCl-Lavulose-Reaktion beruht. Wie damals von ihm erwahnt wurde, kann die Reaktion schwer zur gewohnlichen Kolorimetrie oder Spektrophotometrie Anwendung finden, da die konz. HCl wegen des starken Rauches die Handhabung stort. In dieser Hinsicht ist die Reaktion von Gregory and Pascoe viel branch barer als diese. Die Gregory-Pascoe-Reaktion wurde ausser von ihnen auch

3 Zur Bestimmung der Cholsaure. -II. 151 von Josephson(1935) und von Doubilet(1936) zu einer brauch baren Methode ausgearbeitet. Die Reaktion hat jedoch den grossen Nachteil, dass sie sehr oft eine Trubung hervorruft, die die An wendung der Methode erschwert. Ausserden wird die Reinheit der Farbe bei der genannten Ausfuhrung von den gleiehzeitig vorhandenen anderen Gallensauren enter Umstanden stark beein trachtigt, wenn z. B. der Desoxycholsauregehalt den Cholsaure gehalt weit uberschreitet, wie dies bei der Kaninchengalle der Fall ist. Um diese Nachteile zu uberwinden empf ahlen Gregory und Pascoe sowie Reinhold und Wilson (1932) ein bestimmtes Filter auszusuchen, und wollte Doubilet (1936) die Trubung durch Zusatz von Alkohol beseitigen. Die mit Alkohol vermischte Farblosung gibt tatsaehlich eine reinere Farbe, vor allem ist die Losung vollkommen kiar, wie Doubilet bemerkt hat. Leider bleibt aber die Farblosung dann nicht mehr stabil, worauf auch vom Verfasser besonders aufmerksam gemacht wurde. Bei der ganannten Ausfuhrungsweise ist eine genaue Auswertung des Chol saurewertes praktisch kaum moglich. Ausserdem wird die Farb starke durch Alkoholvermischung stark abgeschwacht. Ich habe nun bei der Ausfuhrung der Reaktion anstelle des Alkohols Eisessig genommen. Durch diese kleine Modifikation werden alle die obenerwahnten Nachteile der ursprunglichen Aus fuhrung vollstandig beseitigt. Die Farbreinheit wird nicht mehr durch andere Gallensauren beeintrachtigt, die Empfindlichkeit bleibt erhalten, vollkommene Klarheit wird erreicht, und die Farbung bleibt ausserst stabil. Diese neu gewonnene Farblosung kann photometrisch sowie kolorimetrisch zur quantitativen Bestim mung vollig befriedigend angewandt werden. So gestattet mein Verfahren, schon sehr kleine Cholsauremengen von 0,15mg an quantitativ zu erfassen. METHODISCHER TEIL. A. Uber die Farbentwicklung und die Reaktionsbedingungen. 1) Die Trubung der Farblosung, die beim ursprunglichen

4 152 T. Shimada: Verfahren zur Durchfuhrung dieser Reaktion unvermeidlich er folgt, bereitet der Ausgestaltung einer auf dieser Reaktion beru henden Bestimmungsmeth ode die grosste Schwierigkeit. Die Triibung soil nach Doubilet durch die beigemengte Desoxychol saure verursacht werden. Um diese Schwierigkeit zu uberwinden wurde ehnmal von Doubilet vorgeschlagen, die Trubuung der Farb losung durch Alkoholbeimisehung zu beseitigen, was aber gleich zeitig den grossen Nachteil bereitet, dass dadurch die Farbe nicht mehr stabil bleiben kann. Wenn man aber, wie hier berichtet wird, zur Auflosung der Trubung Eisessig statt Alkohol verwendet, so wird dieser Nachteil sofort beseitigt. Durch diese Behandlung andert sick weder die Farbintensitat noel die Farbeigenschaft der Reaktionslosung, was auch durch die spektroskopische Beobachtung bestatigt werden kanu. 2) Wie aus der Figur 1 ersichtlich ist, errreicht die Farbstarke der Reaktion nach 30 Minuten bei 65 Ž ihr Maximum und bleibt dann wahrend 2er Stunden unverandert. Durch die Verkurzung der Reaktionsdauer erhalt man gewohnlich eine weniger getrubte Losung; in diesem Falle bleibt aber die Farbentwicklung unvoll kommen wie aus Figur 1 ersichtlich ist. So sind die Reaktions Figur 1.

5 Zur Bestimmung der Cholsaure. -II. 153 bedingungen von Josephson, d. h. 20 Minuten bei 65 Ž un geeignet, weil die Reaktion wahrend dieser Zeit noch nicht zu einer Farbstarke fortschreitet, welche eine konstante und stabile Farb losung gewahrleistet. 3) Auf die Farbentwicklung ist die zugesetzte Furfurolmenge auch von gewissem Einfluss, wie aus der gleichen Figur ersichtlich ist (Fig. 1). Bei quantitativen Bestimmungen muss also auch die Furfurollosung moglichst genau abpipettiert werden. 4) Als die geeignetsten Reaktionsbedingungen sind zu empfehlen: 40 Minuten bei 65 Ž mit 0,5 ccm 1% iger Furfurol losung und 5ccm H2SO4 vom spez. Gew. 1,400 fur 1ccm Na-Cholat losung (0,35-1,4mg Cholsaure). 5) Die genannte Farbreaktion ist ausserst spezifisch fur Chol saure, und wird deshalb bei der Bestimmung von Cholsaure keines wegs von Desoxycholsaure beeinflusst werden, was durch die Zusatz versuche bestatigt wurde und aus Tabelle II zu ersehen ist. TABELLE II. Versuch mit Desoxycholsaure. 6) Fur die praktische Anwendung ist bier die Bestimmung mittels des Pulfrich-Photometers zu wahlen, da die Berechnung des Cholsauregehaltes durch die Verwendung von Eichkurven sehr erleichtert wird. In Laboratorien, die nicht uber ein Pulfrich - Photometer verfugen, kann auch ein Kolorimeter benutzt werden, wenn eine Standardlosung von ahnlicher Konzentration zum Ver gleich herangezogen wird. Ein besonderer Vorteil der hier mitgeteilten Methode liegt darin, dass der Farbstoff und die anderen Gallenbestandteile (ausser den Muzinen) nicht entfernt zu werden brauchen, da man wegen der grossen Empfindlichkeit dieser Reaktion meistens mit einer stark verdunnten Gallensaurelosung arbeiten kann.

6 154 T. Shimada: B. Bestimmungsmethode mittels Pulfrich-Photometer. Die typische Farbkurve der modifizierten Farblosung von Gregory und Pascoe ist in Fig. 2 wiedergegeben. Das Absorp tionsmaximum liegt beim Filter S61. Die Kurve A zeigt die beo bachtete Liclitabsorption bei der Benutzung einer blauen Glas scheibe am Lampenfenster, und die Kurve B die Absorption ohne Glasscheibe. Aus praktischen Grunden erhalt man mit dem Filter S57 (anstatt S61) in der Regel bessere Resultate, weshalb dieses Filter fur die genannten Bestimmungsverfahren sich vorzugsweise zur Benutzung eignet. Es empfiehlt sich dabei die Benutzung der blauen Scheibe vor dem Fenster der Lampe, was aber nicht unbedingt notwendig ist. Figur 2. Die Eichkurven wurden mit Hilfe reiner Cholsaurelosungen bekannten Gehaltes erhalten, die entsprechend den Untersuchungs bedingungen hergestellt wurden. Bei der angegebenen Ausfuhrung der Reaktion und bei geeigneter Filterwahl trifft das Lambert - Beersehe Gesetz mit genugender Genauigkeit zu; die Konzentra tionen zweier Losungen verhalten sich zueinander wie ihre Extink tionskoeffizienten (Tabelle III).

7 Zur Bestinimung der Cholsaure. -II. 155 TABELLE III. Filter S57, bei 1,010cm Kuvettendiehte. Die aus der Tabelle erhaltene Eichkurve zeigt die nachste hende Figur. Der Verlauf der Kurve ist in dem untersuchten Konzentrationsbereich geradlinig (Fig. 3). Figur 3. Bestimmung in der Galle. Eine Methode zur Bestiimnung der Cholsaure in der Galle, die sich als praktisch sehr brauchbar erwiesen hat, war folgende. Reagentien: 1) H2SO4 vom spez. Gew. 1,400 (50,11%). 2) 1% wasserige Furfurollosung. Furfurol wird 2 mal redestilliert.

8 156 T. Shimada: Die Losung wird in einer verschlossenen Flasche im Eisschrank aufbewahrt, so ist sie wochenlang haltbar. Ausfuhrung: 1ccm Galle wird in einem markierten Reagenz glas genau abpipettiert, mit 10-15ccm 96% igem Alkohol kurz auf dem Wasserbade erwarmt, nach dem Abkuhlen mit bis zu 20ccm Alkohol versetzt und durch ein trockenes Filter filtriert. 1ccm dieses Filtrates wird in ein Reagenzglas abpipettiert, der Alkohol verdampft, der Ruckstand im Wasser zu 10ccm gelost und wieder 1ccm (0,35-1,4mg Cholsaure) davon wird nun zur Bestimmung verwendet. 1ccm dieser Losung wird mit 0,5ccm 1% iger Furfurollosung u nd 5ccm H2SO4 (D 1,40) gut vermischt, leicht gestopselt und 40 Minuten lang bei 65 Ž gehalten. Nach Vollendung der ersten Reaktion wird die Losung nach dem Abkuhlen enterr der Wasser leitung mit 5ccm Eisessig versetzt und gut gemischt. Die nach dem Ablassen der entstandenen feinen Blasen nun vollig klare Farblosung wird zur Ablesung der Lichtabsorption verwendet (gewohnlich nach Minuten). Die Lichtabsorption wird dann mittels Pulfrich-Photometer bei 1cm Kuvettendicke mit Filter S57 und Wasser als Kompensationsflussigkeit beobachtet und daraus kann der gesuchte Cholsaurewert auf einfache Art aus der einmal gewonnenen Eichkurve mit Hilfe einer Errechnungstabelle, (siehe Tabelle V) errechnet werden. Der Galle zugesetzte Cholsaure wurde durch diese Methode quantitativ wiedergefunden, wie aus Tabelle IV zu ersehen ist. TABELLE IV.

9 Zur Bestimmung der Cholsaure. -II. 157 TABELLE V.

10 158 T. Shimada: C. Das Verfahren zur Kolorimetrie. Die neue Farblosung kann auch zur kolorimetrischen. Bestim mung in ziemlich einfacher Weise und mit genugender Genauig keit herangezogen werden. Durch Vergleichen der Farbstarke einer unbekannten Losung mit einer annahernd gleichwertigen Standardlosung lasst sich die gesuchte Konzentration leicht und genau ermitteln. Man braucht dabei kein Farbfilter. Wenn aber die Konzentrationen beider Losungen zu sehr von einander ver schieden sind, werden auch die Farbeigenschaften zweier Losungen manchmal abweichen; dadurch wird in grosserem Konzentrations bereich die Bestimmung mit einer einzigen Standardlosung er schwert. Der Gultigkeitsbereich des Bee rschen Gesetzes ist in diesem Falle ziemlich eng, worauf auch von Doubilet bei seinem Verfahren besonders aufmerksam gemacht wurde (Fig. 4). Figur 4. Eichkurve bei 0.5mg Standard 10mm Hohe Da aber die neue Farblosung ausserst stabil ist, wird die Bereitung einer geeigneten Standardlosung ziemlich erleichtert und so bereitet eine richtige Vergleichung beider Losungen praktisch keine Schwierigkeit. Bei Benutzung von 0,5mg Chol saure als Standard wurde die gesuchte Cholsaure von 0,35-0,75mg mit zufriedenstellenden Resultaten wiedergefunden. (vgl. Fig. 4).

11 Zur Bestimmung der Cholsaure. -II. 159 Ausfuhrnng mit einer Gallenflussigkeit. Als Reagentien dienen: 1) Furfurollosung, wie oben, 2) H2SO4 (50%) und 3) Standardlosung: 0,1% ige alkoholische Chol saurelosung. 1ccm oder mehrere ccm des alkoholischen Filtrates von einer Galle (0,35-0,75mg Cholsaure) werden in einem Reagenzglas genau abpipettiert und nachdem der Alkohol verdampft ist mit 2ccm H2SO4-Reagens und mit 0,2ccm Furfurollosung versetzt, gut geschuttelt, leicht gestopselt und 30 Minuten bei 65 Ž gehalten. Erst danach wird die hier blau gefarbte Losung mit 2-5ccm Eisessig versetzt und gut gemischt. Nach 30 Minuten wind sie mit einer auf gleiche Art hergestellten Standardflussigkeit in einer Hohe von 10mm kolorimetrisch verglichen. Die Errechnung der gesuchten Werte geschieht in ublicher Weise. Desoxycholsaure stort die Bestimmung nicht. Bei einer grossen Beimengung von Desoxycholsaure, wie bei einem Mengenverhaltnisse von Cholsaure : Desoxycholsaure=0,5:3-5mg, tritt eine ziemlich starke Trubung auf, die auch durch mein Verfahren leicht beseitigt werden kann und die gesuchte Cholsaure kann quantitativ wieder erfasst werden. Der Galle zugesetzte Cholsaure wurde durch diese Methode auch quantitativ wiedergefunden, wie aus der Tabelle VI ersicht lieh ist. TABELLE VI. Versuch mit Hundegalle.

12 160 T. Shimada. LITERATUR. Abe, Y. (1937): Jl. of Biochem., 25, 181 u. 26, 232. Doubilet, H. (1936): Jl. of Biol. Chem., 114, 289. Gregory, R. u. T. A. Pascoe (1929): Jl. of Biol. Chem., 83, 35. Josephson, B. (1935): Bioch. Jl., 29, Kaziro, K. u. T. Shimada. (1938): Z. fur Physiol. Chem., noch nicht ersehienen. Ohyama, Y. (1938): J1. of Biochem., 27, 351. Reinhold, J. G. u. D. W. Wilson (1932): Jl. of Biol. Chem., 96, 637. Shimada, T. (1938): Nippon-Ikadaigaku-Zassi, noch nicht ersehienen.