Antibiotische Peptide Lantibiotika

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1 Übersicht Antibiotische eptide Lantibiotika abriele Bierbaum, Bonn Antibiotische eptide sind im Reich der Lebewesen weit verbreitet. Unter den bakteriellen antibiotischen eptiden gibt es eine ruppe, die sich durch die Anwesenheit der Thioetheraminosäure Lanthionin und anderer nicht-proteinogener Aminosäuren auszeichnet, die so genannten Lantibiotika. an unterscheidet hier zwei größere Unterklassen: Typ-A-Lantibiotika sind längliche stäbchenförmige eptide, die ihre antibakterielle Wirkung durch Depolarisierung der Zytoplasmamembran ausüben. Zu den eher globulären Typ-B-Lantibiotika gehören unter anderem ersacidin und Actagardine, die über einen neuartigen echanismus den Transglykosylierungsschritt innerhalb der eptidoglykan-biosynthese hemmen und sich damit als Leitsubstanzen für die Entwicklung einer neuen Antibiotikaklasse anbieten. Lantibiotika besitzen trukturgene und werden auf ribosomalem Wege synthetisiert. Die seltenen Aminosäuren werden durch posttranslationale odifikationsreaktionen in die eptide eingefügt. Die hierfür benötigten Enzyme und weitere akzessorische roteine sind zusammen mit den trukturgenen in Biosynthesegenclustern organisiert. Diese ribosomale ynthese der Lantibiotika ermöglicht die Veränderung der eptidstruktur durch gezielte utagenese. chlüsselwörter: Lantibiotika, ersacidin, ep5, Nisin, Actagardine Antibiotic peptides are very common in nature. One group of bacterial antibiotic peptides is characterized by the presence of the thioether amino acid lanthionine and other non-proteinogenic amino acids and was therefore called lantibiotics. Two major subclasses of lantibiotics may be distinguished: Type-A-lantibiotics are elongated peptides, which act by depolarizing the cytoplasmic membrane. Among the globular type-b-lantibiotics, mersacidin and actagardine inhibit the transglycosylation step of peptidoglycan biosynthesis via a novel mechanism and therefore represent a lead structure for the development of a new class of antibiotics. Lantibiotics possess structural genes and are synthesized via the ribosomal pathway. The rare amino acids are introduced into the peptides by posttranslational modification reactions. The enzymes that are involved in these modification reactions, the structural gene and further accessory proteins are organized in biosynthetic gene clusters. This ribosomal biosynthesis mechanism enables genetic engineering of lantibiotics. Keywords: Lantibiotics, mersacidin, ep5, nisin, actagardine Antibiotisch wirksame eptide mit relativen olekÿlmassen von bis Da werden in vielen Lebewesen gefunden (Tab. 1) [12]. Die meisten antibiotischen eptide tragen eine positive Nettoladung, bilden amphiphile trukturen aus und sind in der Lage, bakterielle Zellmembranen zu schšdigen. Es gibt aber auch eptide mit anderen Wirkungsmechanismen wie Bacitracin, das die Zellwandbiosynthese hemmt. Die klassischen eptidantibiotika, wie ramicidin und A, Bacitracin oder Valinomycin werden von ikroorganismen (insbesondere Bacillus, treptomyceten) Ÿber ultienzymkomplexe synthetisiert. Diese Antibiotika enthalten oft nicht-proteinogene AminosŠuren. Ribosomal synthetisiert werden dagegen die eukaryontischen Abwehrpeptide wie die Cecropine der Insekten, die againine der Amphibien und die Defensine und rotegrine, die zur unspezifischen Infektabwehr der Šuger beitragen. Die Defensine zum Beispiel bilden ungefšhr 10 % des totalen Zellproteins in polymorphonuklearen Leukozyten und akrophagen. Die Konformation der Defensine wird durch DisulfidbrŸcken, die zwischen hochkonservierten Cystein-Resten ausgebildet werden, vermittelt und ist fÿr die bakterizide Wirkung essentiell. Es gibt auch ribosomal synthetisierte antibakterielle eptide prokaryotischen Ursprungs, die allgemein als Bacteriocine bezeichnet werden. Hier kšnnen unmodifizierte eptide (z. B. die Lactococcine) von modifizierten eptiden unterschieden werden. Zu der letzteren ruppe gehšren neben einem Vertreter der icrocine, die von gramnegativen Bakterien gebildet werden, die von den grampositiven Bakterien ausgeschiedenen Lantibiotika. Die Bezeichnung Lantibiotika leitet sich von Lanthionin-haltige eptidantibiotika ab. Neben den Thioether-AminosŠuren Lanthionin (Lan) und ethyllanthionin (elan), die intramolekulare Ringstrukturen ausbilden, wurde in Lantibiotika eine Reihe anderer seltener AminosŠuren, wie Didehydroalanin (Dha), Didehydrobutyrin (Dhb), -Aminovinylcystein, Erythro-3-hydroxyaspartat, D-Alanin, Dimethylalanin und Lysinoalanin beschrieben. Zum Thema Lantibiotika existieren zahlreiche bersichten [z. B. 8, 12Ð14, 22, 23]. Tabelle 2 gibt einen berblick Ÿber die bis heute identifizierten Lantibiotika; die trukturformeln dreier repršsentativer Vertreter sind in Abbildung 1 dargestellt. Die ruppe der Lantibiotika ist nicht homogen, sondern umfasst eptide mit ganz unterschiedlicher trukturen und Wirkungsmechanismen. Die molekularen assen der beschriebenen Lantibiotika reichen von Da fÿr ersacidin [6] bis Da fÿr Carnocin UI 49 [25]. Der Nomenklatur von Jung [13, 14] folgend, werden die Lantibiotika in zwei ruppen, die Typ-A- und Typ-B-Lanti- Anschrift des Verfassers: riv.-doz. Dr. abriele Bierbaum, Institut für edizinische ikrobiologie und Immunologie der Universität Bonn, igmund-freud-tr. 25, Bonn Jahrgang Heft 6/1999

2 Tab. 1. Überblick über antibiotische eptide [12] Biosynthese roduzent Antibiotische eptide Enzymatisch Bacillus Bacitracin, urfactin, ramicidin, Tyrocidin, olymyxin B treptomyces Trichoderma viride biotika, eingeteilt: Die Typ-A-Lantibiotika besitzen eine lšngliche Konformation, schšdigen die bakterielle embran und kšnnen wiederum in charakteristische Untergruppen unterteilt werden [22]. Die Leitsubstanz der am besten charakterisierten Untergruppe ist Nisin, das am lšngsten bekannte Lantibiotikum, das von Lactococcus lactis produziert und in vielen LŠndern zur Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt wird [11]. Alle Valinomycin, Bialaphos Alamethicin Ribosomal Unmodifizierte eptide Bakterien Unmodifizierte Bacteriocine: z. B. Lactococcine, ediocine Einkeimblättrige flanzen Thionine Insekten Cecropine, Hymenoptaecin, Apidaecin Krebse Tachyplesine Amphibien againine, Brevenine äuger Defensine, rotegrine osttranslational Escherichia coli icrocin B17 modifizierte eptide rampositive Bakterien Lantibiotika Lantibiotika vom Nisin-Typ besitzen eine positive Nettoladung. Die Typ-B-Lantibiotika, wie zum Beispiel Cinnamycin, Duramycin A, B und C oder Ancovenin, besitzen durch eine Kopf-chwanz-VerknŸpfung eine kugelige estalt und tragen keine oder eine negative Nettoladung [13, 14]. Die Vertreter des Cinnamycin-Typs bestehen aus 19 AminosŠuren und sind strukturell eng miteinander verwandt. ersacidin und Actagardine besitzen eine deutlich andere truktur und bilden einen zweiten ubtyp [6, 27]. Die Typ-B-Lantibiotika vom Cinnamycin-Typ zeigen eine membranaktive Wirkung und komplexieren hosphatidylethanolamin, was zum Beispiel zu einer Hemmung der hospholipase A 2 fÿhrt. Actagardine und ersacidin greifen in die Biosynthese der bakteriellen Zellwand ein (s. u.). Im Folgenden soll kurz dargestellt werden, wie Lantibiotika gebildet werden, wie sie wirken und welche Eigenschaften die ersacidin-untergruppe zu attraktiven Leitsubstanzen fÿr eine neue Antibiotika-Klasse machen. Biosynthese der Lantibiotika Im egensatz zu klassischen eptidantibiotika werden Lantibiotika nicht durch ultienzymkomplexe synthetisiert. FŸr jedes Lantibiotikum existiert ein trukturgen, das fÿr ein so genanntes ršpeptid kodiert, welches wiederum aus einer N-terminalen Leadersequenz und einem C-terminalen ropeptid besteht. Die trukturgene sind sowohl auf lasmiden als auch im Chromosom oder auf Transposons lokalisiert. Nach der ribosomalen ynthese des ršpeptides werden die Lan- und elan-reste durch posttranslationale odifikation aus den er-, Thrund Cys-Resten des ropeptides gebildet. Danach wird die ignalsequenz an einer a CH3 CH 2 Lys Val ln ly Lys Lys Asn C CO Ala ly ro Ala Ile Arg Ala Ala Ala ln Lys Dhb Leu Lys Ala Dhb Arg Leu he Abu Ala ly O Val Ala Ala Lys COOH b ly ly ly ro ly Leu Val Ala Abu he Abu Ala Abu Ala Ile Lau lu Abu Dha NH CH c er ly Trp Val Ala Ala Ala Abu lu Leu Ile Abu ly Abu O Val Ala Ile Ala Ala CH Abb. 1. Die trukturen des Typ-A-Lantibiotikums ep5 (A), und der Typ-B-Lantibiotika ersacidin (B) und Actagardine (C). Die seltenen Aminosäuren wurden folgendermaßen abgekürzt: Dha: Dehydroalanin; Dhb: Dehydrobutyrin; Ala--Ala: Lanthionin; Abu--Ala: ethyllanthionin. ChemotherapieJournal 8. Jahrgang Heft 6/

3 Tab. 2. Bisher bekannte Lantibiotika [10, 17, 19, 23, K. onomoto, pers. itteilung] ( = molekulare asse in Dalton, Reste = modifizierte Reste in %) Lantibiotikum roduzentenstamm Reste Typ-A Lantibiotika Nisin A Lactococcus lactis Nisin Z Lactococcus lactis ubtilin Bacillus subtilis Epidermin taphylococcus epidermidis allidermin taphylococcus gallinarum [Val1, Leu6]-Epidermin taphylococcus epidermidis utacin B-Ny266 treptococcus mutans utacin 1140 treptococcus mutans ep5 taphylococcus epidermidis Epicidin 280 taphylococcus epidermidis Epilancin K7 taphylococcus epidermidis Lactocin Lactobacillus sake A-FF22 treptococcus pyogenes Lacticin 481 Lactococcus lactis alivaricin A treptococcus salivarius [Lys2, he7]-alivaricin A treptococcus salivarius Variacin icrococcus varians Nukacin IK-1 taphylococcus sp. 2960? Cypemycin treptomyces sp Typ-B Lantibiotika Cinnamycin treptomyces cinnamoneus Duramycin treptomyces cinnamoneus Duramycin B treptoverticillium ssp Duramycin C treptomyces griseoluteus Ancovenin treptomyces sp ersacidin Bacillus sp Actagardine Actinoplanes sp truktur unvollständig Cytolysin L1 Enterococcus faecalis 4164? Cytolysin L2 Enterococcus faecalis 2631? utacin II (T8) treptococcus mutans 3245? Carnocin UI49 Carnobacterium piscicola 4635? taphylococcin C55a taphylococcus aureus C ? taphylococcin C55b taphylococcus aureus C ? Lacticin 3147 A Lactococcocus lactis DC3147?? Lacticin 3147 B Lactococcocus lactis DC3147?? ublancin 168 Bacillus subtilis 3877? konservierten roteaseschnittstelle abgespalten. Die ene des hierfÿr notwendigen Biosyntheseapparats sind mit dem trukturgen in einem encluster kodiert. In Abbildung 2 ist beispielhaft das Biosynthesegencluster des Lantibiotikums ersacidin dargestellt. mrsa, das trukturgen, kodiert fÿr das ršpeptid rsa. Das modifikatorische Enzym rs katalysiert hšchstwahrscheinlich die Biosynthese der DehydroaminosŠuren sowie der Lan- und elan- Reste. rsd oxidiert und decarboxyliert den C-terminalen Cys-Rest, der nach Ringschluss mit 15 Dhb den -Aminovinylmethylcysteinrest bildet. rst ist ein TypA-ABC-Transporter, der zusštzlich eine N-terminale roteasedomšne besitzt und rozessierung und Export des ropeptides vermittelt. rsr1, rsr2 und rsk2 zeigen Homologien zu Zweikomponenten-Regulationssystemen und werden fÿr die Regulation der ersacidin-biosynthese verantwortlich gemacht. rse/f/ stellen einen TypB-ABC- Transporter dar, der vermutlich den roduzentenselbstschutz gewšhrleistet [K. Altena, A. uder,. Bierbaum, unveršffentlicht]. WŠhrend Derivate herkšmmlicher Antibiotika durch zeitaufwendige ynthesen im Labor hergestellt werden mÿssen, eršffnet sich damit fÿr Lantibiotika die einzigartige šglichkeit, die AminosŠuresequenz Ÿber eine genetische ethode, nšmlich durch zielgerichtete utagenese im trukturgen, zu veršndern und so die antimikrobielle AktivitŠt zu modulieren, oder andere Eigenschaften wie Lšslichkeit, Haltbarkeit oder roteaseresistenz zu optimieren. Wirkungsweise der Lantibiotika Typ-A-Lantibiotika zeigen eine membranaktive Wirkung, wšhrend die Typ-B- Verbindungen Lipide komplexieren und durch diese Interaktion verschiedene Enzyme hemmen. Im Folgenden soll die Wirkungsweise von charakteristischen Vertretern der zwei ruppen dargestellt werden. ep5 (Abb. 1) ist mit Da das grš te der strukturell gut charakterisierten Typ-A-Lantibiotika und besitzt acht positive Ladungen. Zwei Lan- und ein elan-rest bilden drei intramolekulare Ringstrukturen, die vom N-Terminus zum C-Terminus mit A, B und C bezeichnet werden. Der N-terminale A- Ring und das C-terminale Doppelringsystem sind durch eine zentrale lineare Region aus 10 AminosŠuren getrennt. 2D-NR-tudien haben gezeigt, dass ep5 in wšssriger Lšsung keine definierte truktur ausbildet. Im egensatz dazu nimmt das olekÿl in apolaren Lšsungsmitteln eine schraubenfšrmige Konformation ein, bei der die Lys-Reste in osition 11, 15 und 18 auf derselben eite angeordnet sind, sodass sich ep5 als ein amphiphiles stšbchenfšrmiges olekÿl darstellt. Diese Konformation wird auch bei der Interaktion mit einer bakteriellen embran eingenommen [9]. Neuere Untersuchungen an Nisin und Epilancin K7 haben gezeigt, dass die Typ-A-Lantibiotika vermutlich mit ihrer hydrophoben eite in die embran eintauchen, wšhrend die positiv geladenen Reste mit den negativ geladenen Kopfgruppen der hospholipide interagieren [26]. Wenn nun ein embranpotential Jahrgang Heft 6/1999

4 mrsk2 mrsr2 mrsf mrs mrse mrsa mrsr1 mrsd mrs mrst ensorkinase Response- Regulator ABC-Transporter ImmunitŠt trukturgen Regulator odifikation II odifikation I Export, rozessierung Abb. 2. Biosynthese-encluster des Lantibiotikums ersacidin (s. Text). Die Transkriptionsrichtung der ene ist durch die feile angegeben. von mindestens 80 mv an die embran angelegt wird, reorientieren sich die eptid-helices senkrecht zur embranoberflšche. Dabei bleibt die Interaktion der positiven Ladungen mit den Kopfgruppen der Lipide erhalten, sodass die Šu ere und innere chicht der embran verschmelzen und sich fÿr einen kurzen Zeitraum (illisekunden bis ekunden) eine wassergefÿllte ore šffnet (Abb. 3a). Der Durchmesser dieser ore betršgt etwa 0,1 bis 1 nm, sie dient zum Efflux von kleinen etaboliten (AminosŠuren, AT etc.) aus den Zellen [1]. leichzeitig bricht das embranpotential zusammen, was zur sofortigen Einstellung aller Biosynthesen fÿhrt. FŸr Nisin und Epidermin, aber nicht fÿr ep5, konnte inzwischen gezeigt werden, dass die Anwesenheit der extrazellulšren Zellwandvorstufe Lipid II die orenbildung enorm erleichtert. Beide eptide binden auch in vitro an den ZellwandprŠkursor, der hier als AnkermolekŸl fÿr die orenbildung zu dienen scheint (Abb. 3b) [5]. ekundšr lysieren die Zellen. o haben Untersuchungen an taphylococcus simulans 22 gezeigt, dass bei geringer IonenstŠrke kationische eptide an die negativ geladenen olymere der Zellwand, Lipoteichon- und TeichonsŠuren, binden. Dies fÿhrt zur VerdrŠngung zweier autolytischer Enzyme, einer N-Acetylmuramyl- L-Alaninamidase und einer N-Acetylglucosaminidase, die ebenfalls stark positiv geladene roteine sind, von ihren ubstrat-intrinsischen Inhibitoren. Bei gehemmter Neusynthese der Zellwand fÿhrt diese apparente Aktivierung der Autolysine zur Lyse der Zellen im Bereich der epten [2]. ersacidin ist mit Da und 20 AminosŠuren das kleinste bisher bekannte Lantibiotikum, das aus dem Kultur- Ÿberstand eines Bacillus-tammes (HIL- Y 85,54788) isoliert wurde [6]. ersacidin enthšlt insgesamt vier Ringstrukturen, von denen drei durch ethyllanthionin und eine durch 2-Aminovinylmethylcystein gebildet werden. Der erste ethyllanthionin-ring von ersacidin weist zudem eine Besonderheit auf: Bei Typ-A-Lantibiotika ist der er- (oder Thr-) Rest, der die eine HŠlfte des (e-) Lan bildet, immer zwischen dem N-Terminus des olekÿls und dem beteiligten Cysteinrest lokalisiert. Im ersten Ring von ersacidin liegt der Cysteinrest jedoch vor dem Threoninrest. Das olekÿl tršgt keine Nettoladung. Die Konformation von ersacidin wurde erst kÿrzlich aufgeklšrt. 2D-NR Daten zeigen, dass der N-Terminus von ersacidin mit dem zentralen Teil des olekÿls interagiert. Die intramolekularen BrŸcken verleihen ihm eine relativ a b c Dy Lipid II Lipid II polymeres eptidoglycan Lipid I UD U Abb. 3. chematische Darstellung der Wirkungsweise der Typ-A-Lantibiotika ep5 (a), Epidermin oder Nisin (b), bzw. des Typ-B-Lantibiotikums ersacidin (c). Während Nisin oder Epidermin Lipid II als Ankermolekül für die nachfolgende orenbildung benutzen, komplexiert ersacidin lediglich Lipid II und hemmt danach die folgende Transglykosylierungsreaktion der Zellwandbiosynthese. ymbole: : N-Acetylglucosamin; : N-Acetylmuraminsäure; : hosphat; Zickzacklinie: Undekaprenyl-; dunkelblau schattierte Kreise: Aminosäuren der eptidkette; die Lantibiotika sind hellblau schattiert dargestellt. ChemotherapieJournal 8. Jahrgang Heft 6/

5 Jahrgang Heft 6/1999 rigide, globulšre truktur; die einzige flexible DomŠne befindet sich im Bereich der (ly) 4 -equenz des zweiten neungliedrigen Rings. Die Carboxylgruppe des lu-rests in osition 17 befindet sich in der NŠhe von 3 he auf der OberflŠche. Die a e des olekÿls betragen 13 x 24 [20]. ersacidin wirkt Ÿber eine Hemmung der Zellwandbiosynthese; im mikroskopischen Bild fšllt auf, dass in egenwart von ersacidin wesentlich dÿnnere ZellwŠnde ausgebildet werden, die Dicke der epten ist ebenfalls reduziert. Umfangreiche Untersuchungen haben dann gezeigt, dass ersacidin die Zellwandbiosynthese durch Komplexierung des extrazellulšren ZellwandprŠkursors Lipid II hemmt (Abb. 3c); durch diese Interaktion ist der Einbau der Zellwandvorstufe in den wachsenden eptidoglycansacculus, die Transglycosylierung, blockiert [3, 4]. Das lycopeptidantibiotikum Vancomycin hemmt die Zellwandbiosynthese ebenfalls Ÿber eine Interaktion mit Lipid II, die im Bereich der eptidseitenkette stattfindet und sich durch Zugabe von Bisacetyl-Lys-D-Ala-D-Ala antagonisieren lšsst. Die HK von ersacidin dagegen bleibt in egenwart des Bisacetyltripeptides unveršndert, und das Lantibiotikum hemmt auch das Wachstum von Vancomycin-resistenten Enterokokken; eine Antagonisierung der bakteriziden Wirkung von ersacidin lšsst sich dagegen durch Zugabe von Lipid II erreichen. Diese Experimente lassen den chluss zu, dass ersacidin mit einem anderen Teil von Lipid II als Vancomycin interagiert. Hierbei deutet die hšhere AffinitŠt von ersacidin zu Lipid II im egensatz zu Lipid I auf eine Beteiligung der Disaccharidgruppe hin, und die timulation der Bindung durch zweiwertige Kationen kšnnte durch eine gleichzeitige Interaktion mit der yrophosphatgruppe bedingt sein. Actagardine ist der andere Vertreter dieses ubtyps, der ebenfalls in die Zellwandbiosynthese eingreift [24]. Bei Vergleich der rimšrstrukturen beider ubstanzen fšllt auf, dass der zweite Ring in Actagardine und der dritte Ring in ersacidin bis auf einen Dha-Ile-Austausch weitgehend identisch sind. In den Raumstrukturen beider eptide [20, 27] kann der Bereich der konservierten equenz eine palte ausbilden und in Bindungsstudien scheinen die eptide um ihr Target zu konkurrieren. Dies legt die Annahme nahe, dass es sich bei dieser konservierten equenz um die Bindungstasche fÿr Lipid II handelt [4]. ersacidin wirkt auf taphylokokken, treptokokken, Bacilli, Clostridien, Corynebakterien und ikrokokken bakterizid. Es bestehen keinerlei Unterschiede in der Wirksamkeit von ersacidin gegen ethicillin-resistente oder ethicillin-sensitive.-aureus-tšmme [7, 15]. Der empfindlichste Organismus ist icrococcus luteus mit einer minimalen Hemmkonzentration (HK) von 0,1 mg/ml. Obwohl in vitro die HK-Werte von ersacidin gegen. aureus ungefšhr 8- bis 16-mal hšher liegen als jene von Vancomycin, Teicoplanin oder Daptomycin [18], entspricht seine therapeutische Wirksamkeit gegen ethicillin-resistente taphylococcus-aureus-tšmme in infizierten Šusen mindestens der von Vancomycin [7, 15]. Durch ein Šhnlich ungewšhnliches VerhŠltnis der In-vitro- /In-vivo-Wirksamkeit gegen treptococcus pyogenes zeichnet sich Actagardine aus [16]. Zusammenfassend stellen sich ersacidin und Actagardine als Leitsubstanzen einer neuen Antibiotika-Klasse dar, die an eine bisher nicht genÿtzte Zielstruktur innerhalb von Lipid II binden und eine Entwicklungsmšglichkeit fÿr neue Antibiotika aufzeigen, die als Alternative zu Vancomycin eingesetzt werden kšnnten. Anmerkung Der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Land Nordrhein-Westfalen sei fÿr die Fšrderung der experimentellen Arbeiten der Autorin gedankt. Literatur Da der verfÿgbare latz begrenzt ist, wurden, wann immer mšglich, bersichtsartikel zitiert. FŸr vollstšndige Literaturlisten zum Thema Lantibiotika siehe [12, 23]. 1. Benz R, Jung, ahl H. echanism of channel-formation by lantibiotics in black lipid membranes. In: Jung, ahl H, editors. Nisin and novel lantibiotics. Leiden: ECO, 1991: Bierbaum, ahl H. Induction of autolysis in taphylococcus simulans 22 by ep5 and nisin and influence of the cationic peptides on the activity of the autolytic enzymes. In: Jung, ahl H, editors. Nisin and novel lantibiotics. Leiden: ECO, 1991: Brštz H, Bierbaum, Reynolds E, ahl H. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis at the level of transglycosylation. Eur J Biochem 1997;246: Brštz H, Bierbaum, Leopold K, Reynolds E, et al. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis by targeting lipid II. Antimicrob Agents Chemother 1998;42: Brštz H, Josten, Wiedemann I, chneider U, et al. 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