DER LABLOEFFLER. NEWS für das LABOR. Heft , Nr. 10

Transkript

1 DER LABLOEFFLER NEWS für das LABOR Heft , Nr. 10

2 Liebe Kolleginnen und Kollegen, es ist endlich geschafft. Nach vielen Forschungsund Validierungsarbeiten und intensiven Diskussionen mit der europäischen Arzneimittelbehörde hat diese nun ein positives Votum zur Zulassung des neuen Marker-Lebendimpfstoffs CP7-E2alf gegen die klassische Schweinepest abgegeben. Dies kann zu einem Meilenstein in der KSP-Bekämpfung werden und, durch das verwendete DIVA-Prinzip in Verbindung mit dem E rns - ELISA, die im Seuchenfall notwendigen Tötungen drastisch reduzieren. Trotz vielem Neuen sollte man aber auch das Alte nicht aus den Augen verlieren! So finden Sie im vorliegenden LABLOEFFLER Nr. 10 mit Rotz und Besnoitiose Themen, die schon lange nicht mehr präsent waren. Wir informieren aber auch über den aktuellen Stand zur porzinen epidemischen Diarrhoe und zur Verbreitung des Typs 2 des Erregers der RHD in Deutschland. Diese Infektionskrankheiten sind in der Öffentlichkeit zwar nicht so bekannt wie Geflügel- oder Schweinepest, für die Veterinäruntersuchungsämter und uns am FLI aber ebenso bedeutsam. Die Berichte von drei Ringversuchen belegen die gute Qualität der Veterinärdiagnostik in den Untersuchungseinrichtungen der Bundesländer und die effiziente Zusammenarbeit mit den nationalen Referenzlaboratorien am FLI, was mich besonders freut. Ich wünsche Ihnen eine interessante Lektüre des vorliegenden LABLOEFFLERS. Mit kollegialen Grüßen Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas C. Mettenleiter Impressum Herausgeber: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Redaktion: Prof. Dr. Martin Beer, Elke Reinking, Wolfram Maginot Anschrift der Redaktion: Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Südufer 10, Greifswald Insel Riems, elke.reinking@fli.bund.de Gestaltung und Layout: Wolfram Maginot Fotos: Friedrich-Loeffler-Institut, soweit nicht anders vermerkt: Seite 18 Abb.1a : Elektronenmikroskopische Aufnahme Trypanosoma (equiperdum) Prof. Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio Deckblatt und Rückseite: Trypanosoma (equiperdum) Prof. Dr. Elisabeth M. Liebler-Tenorio Druck: Wicher Druck, Gera, LABLOEFFLER Nr. 10, Ausgabe 1/2015 ISSN Juni 2015 Inhalt Seite 2 Vorwort, Impressum Seite 3 Inhaltsverzeichnis Seiten 4-6 Zum Auftreten von RHDV-2 in Deutschland aktuelle Herausforderungen in der Diagnostik und Bekämpfung Seite 7 Tritt bovine Besnoitiose in Deutschland häufiger auf als bislang angenommen? Seiten 8-9 Porzine epidemische Diarrhoe aktuelle Situation und Diagnostik Seiten Ergebnisse eines Ringversuchs zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit Seiten Rotz Epidemiologie und Diagnostik Seiten Auswertung des nationalen Ringtests zur Diagnostik von viralen Fischseuchen-Erregern Seite Riemser Diagnostiktage am 26. und 27. November 2015 in Greifswald Seiten Laborvergleichsuntersuchung zur serologischen Diagnostik der Beschälseuche 2015 Seiten Next-Generation Sequencing und Metagenomanalyse - Potential für die Diagnostik Seite 24 KSP-Markerimpfstoff CP7_E2alf nach über 10 Jahren Entwicklungsarbeit zugelassen Seite 25 Workshop Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin erfolgreich durchgeführt Seiten Nationale Referenzlaboratorien Seite 30 Zulassungsstelle Seite 31 Redaktionsteam LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 2 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 3

3 Zum Auftreten von RHDV-2 in Deutschland aktuelle Herausforderungen in der Diagnostik und Bekämpfung Horst Schirrmeier Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) Institut für Virusdiagnostik, Greifswald Insel Riems Die durch ein Calicivirus verursachte Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD) wurde erstmals 1984 in China bei zuvor aus Deutschland importierten Kaninchen festgestellt. In Deutschland seit 1988 bekannt, ist sie heute nahezu weltweit verbreitet. In Australien (1995) und Neuseeland (1997) wurde das Virus nach unbeabsichtigter bzw. illegaler Freisetzung durch Farmer zur Eindämmung der Wildkaninchenplage eingesetzt. Während bis Ende der 90er Jahre die RHDV relativ einheitlich waren, fanden wir danach eine als RHDVa bezeichnete Virusvariante, die erstmals 1996 zeitgleich in Italien und Deutschland nachgewiesen wurde (Capucci et al.,1998, Schirrmeier et al., 1999) und in Europa in den Folgejahren die klassischen Stämme weitgehend verdrängte. Ein apathogenes Calicivirus (RCV) wurde 1996 in Italien nachgewiesen (Capucci et al., 1996), weitere apathogene, als RHDV-like, RCV-like oder auch non-pathogenic lagovirus (NP-LV) bezeichneten Stämme sind beschrieben, so das Ashington Virus in UK (Moss et al., 2002) das Lamby Virus in Irland (Forrester et al., 2007), RRCV-A1 in Australien (Strive et al., 2009) und MRCV in den USA (Bergin et al., 2009). Durch sie induzierte Antikörper waren protektiv gegenüber RHDV. Bei einem vor zwei Jahren in Frankreich festgestellten weiteren apathogenen Virus ( France ) gab es diesen Kreuzschutz nicht mehr (LeGall-Recule, et al., 2011a). Auftreten von RHDV-2 Im Oktober 2010 wurden im Nordwesten Frankreichs vermehrt RHD-Fälle diagnostiziert, die sowohl Wildkaninchen als auch ungeimpfte und geimpfte Hauskaninchen betrafen (LeGall-Recule, et al., 2011b, 2013). Als Erreger wurde eine neue, sowohl von den RHDV als auch von den RHDVa und apathogenen Lagoviren abgrenzbare, als RHDV-2 bezeichnete Calicivirusvariante festgestellt. Die Homologie des RHDV-2 zu anderen RHDV beträgt zwischen 80 und 85 % auf Nukleotidebene. Als charakteristisch wurden ein protrahierter Krankheitsverlauf, eine vergleichsweise niedrige Mortalität, die Empfänglichkeit auch sehr junger Tiere (~4 Wochen) und der fehlende oder stark eingeschränkte Schutz nach Impfung herausgestellt. Ein Jahr später wurde ein nahezu identisches Virus in der Provinz Navarra in Spanien nachgewiesen, das bis Januar 2013 in insgesamt 78 Kaninchenhaltungen von 23 spanischen Provinzen sowie in Portugal zu Ausbrüchen führte (Dalton et al., 2012, Lopez et al., 2015). Das Virus wurde als RHDVb bezeichnet, RHDV-2 und RHDVb werden derzeit synonym verwendet. In Italien gibt es seit 2012 RHDV-2-Feststellungen, allerdings ist, im Gegensatz zu Fankreich, keine landesweite Verbreitung und Verdrängung des bisherigen RHDV zu verzeichnen (Capucci, pers. Mitteilung). Nachweise der neuen Virusvariante gibt es auch von den britischen Inseln (Westcott; 2014) und von den Azoren (Duarte 2015). Bestimmte Feldhasenspezies, die normalerweise gegenüber RHDV refraktär sind, erwiesen sich als empfänglich für RHDV-2 (Puggioni, et al., 2013; Carmada et al., 2014). In Deutschland wurde RHDV-2 erstmals im Juni 2013 in einem Kaninchenbestand im Kreis Unna, Nordrhein-Westfalen, nachgewiesen. Der Bestand war 6 Wochen zuvor gegen RHD geimpft worden. Etwa 50 % der Tiere mit Erstimpfung verendeten an der Erkrankung, während Alttiere, die teilweise bereits mehrfach vakziniert worden waren nicht erkrankten bzw. Rekonvaleszenz zeigten. Außerdem verendeten 25 zwischen 4 und 11 Wochen alte ungeimpfte Jungtiere. Ab März 2014 wurden weitere Ausbrüche diagnostiziert, inzwischen sind mehr als 40 Fälle bei Haus- und Wildkaninchen registriert und es gibt zwei Fälle bei Feldhasen (Totfunde) aus Rheinland-Pfalz. Insgesamt sind 10 Bundesländer betroffen (Abb. 1). Da die diagnostische Dichte bei auftretenden Kaninchenverlusten in Deutschland relativ gering ist und die Differenzierung der Virusvarianten bisher ausschließlich am FLI durchgeführt wurde, ist jedoch von einer beträchtlich höheren Zahl von Ausbrüchen auszugehen. Aus an uns eingesandten Proben aus Dänemark konnten wir ebenfalls RHDV-2 nachweisen. Abb. 1 : Diagnostizierte RHDV-2 Fälle in Deutschland bei Hausund Wildkaninchen sowie Feldhasen Diagnostik Prinzipiell gestaltet sich die Diagnostik des RHDV-2 wie bei den klassischen RHDV, d.h. Hämagglutinationstest, Elektronenmikroskopie und Antigen- ELISA sind einsetzbar, erlauben jedoch keine Differenzierung zwischen RHDV und RHDV-2. Die Immunfluoreszenz mit einem marktverfügbaren FITC-Konjugat zeigt dagegen lediglich eine geringe Reaktivität (Tab. 1). Die als Referenzmethode nach OIE-Manual geltende Real-Time PCR nach Gall et al. (2007) detektiert das RHDV-2 überhaupt nicht, ebenso nicht die gelbasierte RT-PCR aus der AVID-Methodensammlung. Daher wurde ein neues RHDV-2 spezifisches Protokoll entwickelt. Durch die Empfänglichkeit von Feldhasen war eine Erweiterung der Differentialdiagnostik bei Calicivirusinfektionen bei Leporiden generell angezeigt. Daher wurde eine Real-Time RT-PCR für den spezifischen Nachweis von EBHSV-Genom etabliert. Primer und Sondendesign sind der nachstehenden Tab. 2 zu entnehmen, das komplette Protokoll ist in der AVID-Methodensammlung nachlesbar: PDF_AVID_Alt/website/Methodenkandidaten/AVID-MK-VIR01_ RHD-EBHS_V_2014_11.pdf Molekulare Epidemiologie Von allen festgestellten RDDV-2 wurde ein 592 bp langer Genomabschnitt aus dem Bereich der hypervariablen Region E des Kapsidproteins VP60 sequenziert und mittels MEGA 5 Programm analysiert. Von einigen Stämmen liegen auch Gesamtgenome vor. Das in Deutschland vorkommende Virus ist nicht einheitlich, die Variabilität auf Nukleotid-, wie Aminosäureebene liegt bei ca 3 %. Allerdings konnten wir in der Umgebung des ersten Ausbruches über einen Zeitraum von fast zwei Jahren Viren feststellen, die eine 100 %ige Identität aufwiesen, was eher gegen eine schnelle Veränderung spricht und einen mehrfachen Eintrag unterschiedlicher RHDV-2 nach Deutschland vermuten lässt. In einigen Fällen ließen sich aufgrund der Sequenzdaten Übertragungswege zwischen Wild- und Hauskaninchen sowie zwischen Kaninchenbeständen nachvollziehen. Tab. 1 : Verfügbarkeit und Effizienz von Methoden für den RHDV-Nachweis Tab. 2 : Primer und Sonden für den Nachweis von RHDV, RHDV-2 und EBHSV RHDV (Gall et al. 2007) RHDV-2 (unpublished) EBHSV (unpublished) Forward Primer Reverse Primer Sonde 5`-ACY TGA CTG AAC TYA TTG ACG-3` 5 ACT TGT CAG AAC TTG TTG ACA-3 5 -ACA GAY CTC ATT GAC GTK CG-3 5`- TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT GG-3` 5 -TCA GAC ATA AGA AAA GCC ATT AG-3 5 CAG ACA TAG GAR TAY CCR GTG -3 5`- FAM-CCA ARA GCA CRC TCG TGT TCA ACC T-TAMRA 5 -FAM-CCA CAA GCA CGC TTG TGT ACA ACT TG-BHQ FAM ACA CTC GTG TTC AAC CTT RCC GGA GT-BHQ1-3 Tab. 3 : Klinische Daten nach Challenge von immunisierten (OV und RV) Tieren sowie Kontrolltieren LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 4 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 5

4 Übertragungsversuch Nach der Erstfeststellung wurden zur Ermittlung biologischer Parameter zwei Kaninchen mit dem Stamm «WE 2013 «oronasal infiziert. Die Tiere verendeten nach 36 bzw 40 Stunden perakut, eine Fieberphase war wegen des rasanten Verlaufes nicht feststellbar, das Sektionsbild entsprach dem für RHD bekannten (Abb. 2). Die Untersuchung von Lebermaterial mit den differenzierenden RT-PCR-Protokollen verlief Abb. 2 : Leber eines nach experimenteller RHDV-2 Infektion verendeten Kaninchens. Die Leber ist aufgehellt, die Läppchenzeichnung prominent und die Konsistenz brüchig («wie gekocht») mit der RT-PCR nach Gall negativ, mit dem neu etablierten spezifischen RHDV-2 Protokoll wurden hohe Genomlasten (ct 10) festgestellt. Die aus Frankreich mitgeteilten Informationen über einen milderen und protrahierten Verlauf mit geringerer Mortalität konnten wir in diesem wie auch in weiteren Versuchen nicht bestätigen. Vermutlich handelte es sich dabei teilweise um geimpfte Tiere, die zu einer Reduzierung der Bestandsmortalität führen, wobei aber ungeimpfte Einzeltiere akut und perakut verenden. Diese Beobachtungen gibt es auch bei Ausbruchsbeständen in Deutschland. Untersuchungen zum Kreuzschutz Da die Mehrzahl der uns erreichten Einsendungen von geimpften Tieren stammen, teilweise im Rahmen des Verfolgs von Pharmakovigilanzmeldungen, wurde ein erster orientierender Versuch zum protektiven Wert von zwei unterschiedlichen Impfstoffen durchgeführt. Dazu wurden jeweils vier Kaninchen mit einem auf Leberhomogenaten basierenden konventionellen (OV) und einem rekombinanten (RV) Impfstoff nach Herstellerangeben immunisiert und nach 5 Wochen mit dem Stamm «WE2013» testinfiziert. Alle geimpften Tiere zeigten eine Serokonversion, gemessen in einem indirekten ELISA gegen den RHDV Stamm «Eisenhüttenstadt». Ein ELISA unter Verwendung eines gereinigten RHDV-2 Antigens zeigte erwartungsgemäß deutlich niedrigere Werte an. Nach Challenge verendeten sowohl die vier ungeimpften Kontrolltiere als auch die mit RV geimpften Kaninchen am 2. Tag nach der Infektion an RHD. Drei der vier OV geimpften Tiere zeigten Fieber über einen Zeitraum von bis zu drei Tagen und Anorrhexie, eines verendete am 4. Tag p.i. nach scheinbarer Genesung (Tab. 3). Wegen der geringen Tierzahlen sind die Ergebnisse allerdings nicht repräsentativ, deuten aber unterschiedliche Wirksamkeiten der sich auf dem Markt befindlichen Impfstoffe an. Inzwischen wurde für zumindestens einen der zugelassenen Impfstoffe gezeigt, dass eine zweimalige Impfung eine deutlich bessere Protektion vermittelt, was mit den Beobachtungen aus dem Feld über den Schutz älterer, bereits mehrfach geimpfter Tiere übereinstimmt. Zusammenfassung Seit dem Erstnachweis der RHD in Deutschland im Jahre 1988 in einem Bestand bei Potsdam wurden am FLI mit wechselnder Intensität Arbeiten zum Erreger und zur Erkrankung durchgeführt. Das umfasste das Anpassen des diagnostischen know hows an die jeweiligen epidemiologischen Gegebenheiten, die morphologische, phänotypische und molekulare Charakterisierung des Erregers, die Impfstoffentwicklung, die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern für Diagnostik und Erregercharakterisierung sowie Forschungsarbeiten zur Etablierung von rekombinanten Systemen für die Expression des Hauptstrukturproteins VP60 des RHDV. Mit den ersten Informationen über das Auftreten einer neuen RHDV-Variante wurden Arbeiten zur Anpassung der Diagnostik vorgenommen, wobei wir uns in der frühen Phase auf die Hilfe und Unterstützung der französischen Arbeitsgruppe um Gislaine LeGall-Recule, später auch spanischer und italienischer Kollegen stützen konnten. Im Ergebnis konnten zeitnah eine funktionelle Diagnostik etabliert und preliminäre Daten zur Wirksamkeit von Impfstoffen erhalten werden. Dadurch waren wir in der Lage, unterstützend und aufklärend bei Kaninchenhaltern, Tierärzten und diagnostischen Einrichtungen zu wirken. Gleichzeitig zeigt die Geschichte der RHD beispielhaft, wie Viren, die auf Grund ihres enorm hohen Virulenzpotenzials der Gefahr der «Selbstausrottung» ausgesetzt sind, es verstehen, sich dieser immer wieder durch Veränderung und Anpassung zu entziehen. Literatur beim Verfasser Tritt bovine Besnoitiose in Deutschland häufiger auf als bislang angenommen? Gereon Schares, Jens Peter Teifke, Franz J. Conraths Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Epidemiologie, Abteilung für experimentelle Tierhaltung und Biosicherheit, Greifswald Insel Riems Im Jahr 2008 wurde ein erster Ausbruch boviner Besnoitiose in Deutschland diagnostiziert. Nachdem es längere Zeit keine Hinweise auf neue Infektionen mit Besnoitia besnoiti gab, wurden im laufenden Jahr weitere Fälle akuter und chronischer boviner Besnoitiose in wertvollen Fleischrinderherden beobachtet und vom FLI bestätigt. Derzeit wird untersucht, auf welchem Wege der Erreger in die neu betroffenen Herden gelangt sein könnte, ob Verbindungen zur Ausbruchsherde aus dem Jahre 2008 bestanden oder ob Zukäufe aus Ländern mit endemischer Besnoitiose die neuen Fälle verursacht haben. Da sich die bovine Besnoitiose in Europa weiter ausbreitet ( ist zu befürchten, dass sich die Infektion in Deutschland bereits etabliert hat und häufiger vorkommt als bislang angenommen. Die bovine Besnoitiose ist eine protozoäre Erkrankung, die durch Besnoitia besnoiti hervorgerufen wird. Akut infizierte Tiere zeigen Fieber und oft schmerzhafte, entzündlich-ödematöse Schwellungen, auch im Unterbauchbereich und an den Beinen. Ursache hierfür ist die Vermehrung der Protozoen in Gefäßendothelien. Weiterhin können bei den Tieren geschwollene Lymphknoten, reduzierte Fresslust, Lichtscheuheit, Nasenausfluss, Durchfall, Lahmheit und Symptome einer Hodenentzündung beobachtet werden. Die akute Phase kann mehrere Tage andauern und geht in eine subklinische Phase über. In der chronischen Phase kommt es nach Befall von Bindegewebszellen zur Bildung zahlreicher Gewebezysten, beispielsweise in der Haut, aber auch in der Unterhaut, in Blutgefäßwänden, in Faszien und Sehnenscheiden. Die ca. 0,1 mm großen Zysten sind von einer sekundären Zystenwand aus Bindegewebe umgeben und daher häufig makroskopisch als kleine weißliche Erhebungen sichtbar, wie zum Beispiel in den Schleimhäuten der Nase (Abb. 1), in Sehnenscheiden (Abb. 1B), in den skleralen Konjunktiven oder in der Schleimhaut des Vestibulum vaginae ( kammer.de/downloads/dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_ _besno.pdf ). Zu den verschiedenen Phasen der Infektion sowie labordiagnostischen und pathologisch-histologischen Veränderungen liegen aktuelle Berichte aus Deutschland vor ( ). Ist die Haut chronisch infizierter Tiere stark von Gewebezysten befallen, kann dies zu Sklerodermie, Hyperkeratose und Alopezie führen. Histologisch findet sich eine unterschiedlich stark ausgeprägte eosinophile und lymphoplasmazelluläre Dermatitis (Abb. 1C). In betroffenen Herden kann die Besnoitiose erhebliche wirtschaftliche Schäden verursachen. Die Mortalität ist zwar gering, jedoch lassen sich stark befallene Tiere aufgrund ihres schlechten Gesundheitszustands nur schlecht vermarkten. Die Haut befallener Tiere weist nur noch einen geringen Wert auf. Bullen, die mit dem Erreger infiziert sind, können zeitweilig oder auch dauerhaft infertil werden. Besnoitia besnoiti kann durch blutsaugende Insekten, wie zum Beispiel Bremsen und Stechfliegen, übertragen werden. Dies ist der einzige bislang gesicherte Übertragungsweg. Der Endwirt des Parasiten ist nicht bekannt. Endwirte sind Tierarten, welche die umweltresistenten Dauerstadien des Parasiten im Kot ausscheiden. Feliden werden als mögliche Endwirte von Besnoitia besnoiti diskutiert; experimentelle Untersuchungen konnten ihre Rolle als Endwirte aber bisher nicht bestätigen. Der klinische Verdacht einer Besnoitiose kann durch die histologische Untersuchung von Hautbiopsien und den Einsatz spezifischer DNA-Nachweisverfahren bestätigt werden. Nach dem Ende der akuten Phase ist ein sicherer Nachweis spezifischer Antikörper in einer Reihe serologischer Tests möglich. Serologische Tests können auch genutzt werden, um die Freiheit von Rindern von Besnoitiose vor dem Erwerb bzw. der Eingliederung in eine Herde zu prüfen ( dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_ _besno.pdf). Falls weitere Fälle boviner Besnoitiosen bekannt werden, wäre die Einbeziehung des Friedrich-Loeffler-Instituts wünschenswert, um diese Fälle epidemiologisch aufzuarbeiten und wirksame Maßnahmen zur Sanierung der Herden zu entwickeln. Literatur beim Verfasser Abb. 1: Zwei Gewebezysten von Besnoitia besnoiti im Quetschpräparat der Nasenschleimhaut eines infizierten Rindes (A). Makroskopisch sichtbare Gewebezysten von Besnoitia besnoiti in der Sehnenscheide eines Rindes (B). Massiver Befall der Haut mit Gewebezysten von Besnoitia besnoiti (C). Weitere Bilder finden sich bei Gollnick et al. (Besnoitia besnoiti auf der Spur Ein Diagnostikleitfaden. Deutsches Tierärzteblatt 4/2010, dtbl/2010/artikel/dtb_04_s_ _besno.pdf ). LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 6 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 7

5 Porzine epidemische Diarrhoe aktuelle Situation und Diagnostik Sandra Blome und Anne Pohlmann Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Greifswald Insel Riems Der Vergleich von PEDV-Stämmen, die aus Beständen mit geringer bzw. hoher Mortalität stammten, zeigte keine sequenzseitigen Virulenzmerkmale. Der mögliche Einfluss von viralen und bakteriellen Sekundärinfektionen bzw. Managementfaktoren wird derzeit untersucht. Kürzlich wurde von sehr verlustreichen Ausbrüchen in ukrainischen Schweinebetrieben berichtet. Das dort gefundene PEDV ist sehr eng mit den hoch-virulenten US-amerikanischen Stämmen verwandt und unterscheidet sich somit von den Stämmen, die in Deutschland gefunden wurden. Die epizootische Virusdiarrhoe des Schweins (engl. porcine epidemic diarrhea; PED) ist eine hochansteckende Coronavirusinfektion. Sie geht mit einer schweren Darmentzündung, wässrigem Durchfall, Erbrechen und Dehydrierung einher. Während alle Altersklassen von Schweinen erkranken können, sinkt die Sterblichkeit mit zunehmendem Alter. Bei Saugferkeln kann die Infektion mit dem Virus der PED (PEDV) zu sehr hohen Verlusten (bis zu 100 % in den ersten Lebenswochen) führen. Die Erkrankung ähnelt damit der transmissiblen Gastroenteritis des Schweins (TGE), die eine wichtige Differentialdiagnose darstellt und ebenfalls durch ein Coronavirus hervorgerufen wird (TGEV). Während die TGE der Meldepflicht unterliegt, gibt es für die PED keine Auflagen. Zur Situation Die PED trat erstmals 1971 in Europa auf, verbreitete sich rasch und verursachte in den darauffolgenden Jahren große Verluste, insbesondere in Asien. Während nur wenige europäische Länder dauerhaft Erkrankungsfälle verzeichneten, war die PED ein konstantes Problem in asiatischen Ländern. Seit 2010 wurde dort von hoch-virulenten Stämmen berichtet, die mit besonders hohen Verlustraten einhergingen. Seit Mai 2013 sorgt die PED auch in den USA für Aufsehen. Immense Ferkelverluste führten zu deutlichen Einbußen im Schweinesektor und beunruhigten Schweinehalter und Tierärzte weltweit. Vor dem Hintergrund dieser Sensibilisierung wurden auch in Deutschland vermehrt Proben von durchfallerkrankten Schweinen zur diagnostischen Abklärung eingesandt. Es stellte sich heraus, dass in Deutschland seit Mai 2014 PED-Fälle auftreten, wobei es zu steigenden Fallzahlen im Winter 2014/15 kam. Insgesamt wurden zwischen Mai 2014 und März 2015 ca. 120 Fälle diagnostiziert. Betroffen sind bisher v.a. die Bundesländer Baden-Württemberg, Bayern, Rheinland-Pfalz, Nordrhein-Westfalen, Niedersachsen und Schleswig-Holstein (siehe Abbildung 1), wobei die Dunkelziffer unter Umständen sehr hoch ist. In den meisten Fällen standen sehr hohen Erkrankungsraten (i. d. R. 100 %) geringen Verlustraten gegenüber. In diesem Zusammenhang ist allerdings anzumerken, dass vorwiegend Abb.1: Von PED betroffene Gemeinden in Deutschland (Mai März 2015) Mastschweine betroffen waren, die, wie oben aufgeführt, generell mildere Verläufe zeigen. Einige Zucht- und Kombibetriebe berichten über eine hohe Sterblichkeit bei jungen Saugferkeln (> 80 %). Es wird berichtet, dass einzelne Betriebe nach einer ersten Erkrankungswelle auch ein zweites Mal betroffen waren und Tiere, die als Saugferkel erkrankt waren, erneut Symptome zeigten. Generell ist wenig über die Herdenimmunität bekannt. Sequenzanalysen Die Volllängensequenzierung (Next-Generation Sequencing, NGS) repräsentativer PEDV-Stämme aus dem aktuellen PED-Geschehen in Deutschland zeigte, dass alle Virusstämme eng miteinander verwandt sind und eine Gruppe bilden, die sich von den historischen PEDV-Stämmen (Prototyp wäre der Stamm CV777) deutlich unterscheidet (siehe Abbildung 2). Sie lassen sich zudem von den hochvirulenten US-amerikanischen und asiatischen Stämmen abgrenzen. Eine sehr hohe Ähnlichkeit besteht mit einem Stamm, der ebenfalls in den USA in Fällen mit milderer Klinik beschrieben wurde (OH851). Die Abgrenzung zu den hochvirulenten Stämmen erfolgt anhand einiger Sequenzmuster im Spike-Gen des PEDV-Genoms. Hier gruppieren sich die deutschen Stämme zu den sogenannten S INDEL Stämmen, wobei INDEL für Insertion und Deletion steht. In den USA kozirkulieren diese Stammvarianten. Stämme, die den deutschen PEDV-Varianten ähneln, wurden auch in den Niederlanden, Frankreich, Italien und Österreich gefunden. Diagnostik Die PED kann mittels Real-Time RT-PCR problemlos in Kot- und Darmproben erkrankter Schweine diagnostiziert werden. Am FLI werden zu diesem Zweck zwei PCR-Systeme verwendet, die vom Veterinary Diagnostic Lab der Universität von Minnesota entwickelt und intensiv validiert wurden. Die PCRs amplifizieren ein S- bzw. N-Gensegment des PEDV. Die entsprechenden Methoden wurden am FLI geprüft und an den Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft übergeben. Sie können dort als Methodenkandidat heruntergeladen werden ( index.php?id=1767). Ein PCR-System, das zwischen TGEV und PEDV unterscheidet, wird von der Firma Qiagen vertrieben und befindet sich derzeit in der Zulassung. Referenzmaterial für die molekulare Diagnostik kann vom FLI in begrenztem Maß bereitgestellt werden. Eine Anzucht des Virus gelingt nur selten, ist jedoch unter Trypsinzugabe auf Verozellen und PK15-Zellen möglich. Mittels Elektronenmikroskopie können Coronaviruspartikel detektiert werden, die jedoch keine weitere Differenzierung erlauben. Für serologische Untersuchungen stehen mehrere ELISA-Systeme und Präparate für die indirekte Immunfluoreszenz zur Verfügung. Bekämpfung Derzeit steht in Europa kein PED-Impfstoff zur Verfügung, so dass insbesondere der Biosicherheit der Betriebe eine große Bedeutung zukommt. Aktuelle Fälle, in denen das Virus binnen eines Tages mehrere Produktionseinheiten eines Betriebes durchseuchen konnte, haben gezeigt, dass es anscheinend noch deutlichen Spielraum für Verbesserungen hinsichtlich der Betriebshygiene und Biosicherheit gibt. Abb. 2: Die Sequenzanalyse zeigt die enge Verwandtschaft der in Deutschland auftretenden PEDV-Stämme (in rot) sowie deren Abgrenzung zu den in den USA festgestellten hochvirulenten Stämmen (in grün). In blauer Schrift sind die so genannten S INDEL-Stämme aus den USA dargestellt, zu denen der erwähnte Stamm OH851 gehört. LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 8 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 9

6 Ergebnisse eines Ringversuchs zur Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit Conrad Freuling, Bernd Hoffmann, Kerstin Wernike und Thomas Müller Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie, Institut für Virusdiagnostik Greifswald Insel Riems Die Aujeszkysche Krankheit (AK) ist eine anzeigepflichtige Tierseuche, die zu großen wirtschaftlichen Verlusten bei Hausschweinen führt. Sie wird durch das Suid Herpesvirus 1 (SHV-1), auch als Pseudorabies Virus (PrV) oder Virus der Aujeszkyschen Krankheit (AKV) bezeichnet, hervorgerufen. Deutschland ist seit dem Jahr 2003 nach OIE-Kriterien offiziell anerkannt frei von AK in Hausschweinebeständen. Trotz der Freiheit im Hausschweinebereich zirkulieren, wie in vielen anderen europäischen Ländern auch, hoch-adaptierte SHV-1 Varianten in Schwarzwildpopulationen Deutschlands. Bis auf einige wenige Fälle von AK bei Hunden und einzelnen Virusnachweisen bei Schwarzwild wurden SHV-1-positive Tiere seit Jahren nicht mehr diagnostiziert. Aufgrund der mehr als 10-jährigen AK-Freiheit geriet auch die AK-Diagnostik auf Bundesebene ein wenig in Vergessenheit. Deshalb diente der in 2014 durchgeführte Ringversuch, neben der Überprüfung der serologischen Routinediagnostik, gleichzeitig der Einführung hoch sensitiver molekularer Methoden zum Nachweis virusspezifischer DNA. Dabei handelte es sich um zwei von Dr. Kerstin Wernike und Dr. Bernd Hoffmann (FLI, IVD) neuentwickelte Triplex-Real-Time PCR-Systeme zur Unterscheidung von Feld- und Impfvirusstämmen. Im Rahmen des Ringversuches wurden jeweils ein Panel von 8 kodierten, lyophylisierten Serumproben sowie DNA Proben (8 Referenzproben für die PCR Validierung, 24 Ringtestproben, 1 Probe IC2-DNA) für die Real-Time PCR an die Untersuchungseinrichtungen der Länder übersandt. Den teilnehmenden Laboratorien wurden vorab die entsprechende SOP für die Triplex-Real-Time PCR sowie Informationen zu Primer- und Sondensequenzen, die im FLI erzielten Ct-Werte der 8 DNA-Referenzproben mit zwei verschiedenen PCR Kits als auch die jeweiligen Protokollvorlagen zugesandt. Die Ringversuchsseren sollten mit den in den jeweiligen Laboratorien etablierten ELISA Kits getestet werden, die routinemäßig für die jährlichen serologischen Stichprobenuntersuchungen zur Aufrechterhaltung des AK-freien Status benutzt werden. Zudem wurde darum gebeten, die Testseren, ausgehend von der vom Testhersteller angegebenen Testverdünnung, weiter in einer seriellen log2 Verdünnungsreihe zu untersuchen, um zusätzlich Informationen über die analytische Sensitivität der Testkits zu bekommen. Darüber hinaus sollte der Titer virusneutralisierender Antikörper durch Endpunkttitration im Serumneutralisationstest (SNT) entsprechend der in den jeweiligen Labors gültigen Standard Operating Procedures (SOP) bestimmt werden. Am Ringversuch nahmen insgesamt 26 Untersuchungseinrichtungen der Bundesländer sowie die AGES Mödling (Österreich) teil. Ergebnisse Serologie Von den 27 teilnehmenden Laboratorien übermittelten 24 Ergebnisse für den ELISA sowie 18 für den SNT. Von den insgesamt sieben der nach 32 TierImpfStV zugelassenen ELISA Tests kamen fünf im Rahmen des Ringversuches zum Einsatz, wobei die Mehrheit der Labore gb bzw. Vollvirusantigen ELISAs verwendeten. Vier bzw. drei Labore untersuchten die Testseren in zwei bzw. drei verschiedenen ELISA Tests. Sämtliche Referenzseren wurden durch die teilnehmenden Labore richtig erkannt. Die Verdünnungsreihe lieferte vergleichbare Ergebnisse für die beiden am häufigsten eingesetzten ELISAs, den ID Screen Aujeszky gb Competition (ID VET) und den IDEXX PRV/ADV gb (IDEXX). Hier konnten bis auf jeweils eine Probe in einem Labor die positiven Seren bis zu einer Verdünnungsstufe von mindestens 1:256 als positiv erkannt werden. Die darüber hinaus von einigen Teilnehmern gelieferten Daten zur analytischen Sensitivität zeigten dann aber eine größere Schwankungsbreite (Tab. 1). Bei den serologischen Untersuchungen im SNT variierten neben der Inkubationszeit (N=5) die einzelnen Testprotokolle unter anderem auch in den verwendeten Zelllinien (N=10) sowie in der Anzahl verwendeter AK-Testvirusstämme (N=11). Am häufigsten wurden Feldvirusstämme auf Verozellen benutzt (Tab. 2). Zwar wurden alle Referenzseren von den 18 Teilnehmern richtig erkannt, allerdings wiesen die ermittelten Titer virusneutralisierender Antikörper (VNA) zum Teil erhebliche Unterschiede auf (Abb. 1). Dabei scheint die Inkubationsdauer einen wesentlichen Einfluss auf den gemessenen VNA-Titer zu haben. Die VNA-Titer waren bei einer Langzeitinkubation (>18h) deutlich höher als bei einer 2-stündigen Inkubationszeit. In vielen Fällen war die im SNT eingesetzte Testvirusmenge (TCID50) in Bezug auf die Volumenmenge nicht klar definiert (Tabelle 2). Tab.1: Ergebnisse für ELISAs von Adiagene (ADIAVET PRV REALTIME) sowie ein nicht-kommerziell erhältliches Testsystem zum Einsatz. Alle 24 Ringtestproben sind von allen Versuchsteilnehmern mit allen verwendeten Testsystemen richtig als positiv oder negativ erkannt worden. Die während der Validierung festgestellte Übereinstimmung der Ergebnisse der einzelnen Zielregionen der zwei unabhängigen Triplex-PCR (gb+ge1+ic bzw. Tab. 2: Ergebnisse der Serumneutralisationstests UL19+gE2+IC) konnte durch die Ergebnisse des Ringversuches bestätigt werden. Die Schwankungsbreite der ct/ cq-werte war dabei sehr gering (Abb. 2). Interessanterweise konnte zwischen der Qiagen-Chemie und der von Quanta innerhalb des Ringversuchs kein Unterschied festgestellt werden. Abb.1: Die Titer virusneutralisierender Antikörper (VNA) wiesen zum Teil erhebliche Unterschiede auf Real-Time PCR Von den 16 am PCR Ringversuch teilnehmenden Laboratorien etablierte die große Mehrzahl die vom FLI vorgeschlagenen Triplex Real-Time PCR-Systeme unter Nutzung der Qiagen- Chemie. Darüber hinaus kam auch ein kommerzielles Testkit LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 10 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 11

7 Zusammenfassung Die Ergebnisse dieses Ringversuchs zeigen, dass die Untersuchungseinrichtungen der Länder auch in Zeiten der AK-Freiheit in den Hausschweinebeständen die Diagnostik der Aujeszkyschen Krankheit hervorragend abdecken können. Unter der Berücksichtigung der Tatsache, dass das neuentwickelte Triplex-Real-Time PCR-System im Zuge des Ringversuches zum ersten Mal an den Untersuchungseinrichtungen etabliert wurde, ist die extrem geringe Schwankungsbreite der ct/cq-werte zwischen den Untersuchungseinrichtungen ein äußerst bemerkenswertes Ergebnis, welches für die Robustheit des Testsystems spricht. Im Hinblick auf die Varianz der im SNT erzielten VNA-Titer ist gemeinsam zu diskutieren, ob ein einheitliches Protokoll Abb. 2: Vergleich ct/cq-werte aus der Real-Time PCR Rotz Epidemiologie und Diagnostik Mandy C. Elschner Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Bakterielle Infektionen und Zoonosen, Nationales Referenzlabor für Rotz, Jena Die Zoonose Rotz, verursacht durch Burkholderia mallei, gehört zu den ältesten, bereits durch Hippokrates erwähnten, anzeigepflichtigen Tierseuchen. Friedrich Loeffler entdeckte 1886 das auslösende Agens. Infizierte Tiere dürfen nicht therapiert werden, sondern sind zu töten und unschädlich zu beseitigen. Von einer natürlichen Infektion sind vor allem Pferd, Esel, Maultier und Kamel betroffen. Infizierte, insbesondere latent und subklinisch erkrankte Tiere sind die einzige Quelle für Neuinfektionen. Die Übertragung erfolgt durch direkten Kontakt, gemeinsame Futtereinrichtungen und Personen oder Gegenstände, die mit infizierten Pferden in Kontakt kommen. Die Erreger-Eintrittspforten sind Schleimhäute, Hautläsionen sowie der Respirations- und Magendarmtrakt. Je nach Bakterienstamm, Infektionsdosis, Infektionsort, Wirtstierart und Immunstatus des Individuums kann es durch die Methodensammlung vorgegeben werden sollte oder modifizierte SNTs akzeptiert werden, sofern diese schwach-positive Seren noch richtig erkennen. Dazu müssen zukünftige Ringversuche beitragen. Danksagung Allen teilnehmenden Laboratorien sei an dieser Stelle für ihre Unterstützung und die schnelle Übermittlung der Ergebnisse gedankt. Ein besonderer Dank geht an Jeannette Kliemt (Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie), Christian Korthase (Institut für Virusdiagnostik) sowie Anette Beidler (Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie), welche maßgeblich an der Probenvorbereitung, dem Versand sowie der Übermittlung der Zertifikate beteiligt waren. zum akuten, chronischen oder latenten Verlauf kommen. Körperliche Überlastung, Mangelernährung, vorangegangene Infektionen und Immunsuppression begünstigen den Ausbruch der Krankheit bzw. den Übergang von latenter oder chronischer zur akuten Form. Die Inkubationsdauer beträgt wenige Tage bis mehrere Wochen, bei chronischen Erkrankungen bis zu mehreren Monaten und Jahren. Rotz wird als wiederaufflammende Tierseuche betrachtet. In Westeuropa wurde die Erkrankung durch konsequente Eradikationsprogramme getilgt, in Ländern Afrikas, Asiens und Südamerikas gibt es jedoch noch endemische Gebiete bzw. immer neue Ausbruchsmeldungen (Tab. 1). Die EU schützt ihren Handelsraum vor der Einschleppung durch Importverbote oder die Forderung von Export-Gesundheitszertifikaten, die eine serologische Untersuchung auf Rotz mittels Komplementbindungsreaktion mindestens 30 Tage vor dem Verbringen der Tiere zwingend vorsieht. Zudem sind bei importierten Tieren gründliche klinische Untersuchungen durchzuführen sowie Quarantänemaßnahmen empfehlenswert. Dass mit dem Einschleppen der Krankheit nach Europa gerechnet werden muss, wird durch einen Fall 2014 in Niedersachsen deutlich. Auch wenn in diesem Fall die Infektionsquelle nicht gefunden werden konnte, müssen sich Behörden und Tierärzte beim Handel mit Tieren oder bei Kontakt mit Tieren aus endemischen Gebieten des Risikos bewusst sein. Je nach primärer Lokalisation der Symptome wird von Lungen-, Haut- und Nasenrotz als klinische Formen der Erkrankung gesprochen. Die Symptome gehen jedoch meist ineinander über oder treten parallel auf. Die Vielfalt der möglichen klinischen und pathologischen Veränderungen wurde seitens des FLI ausführlich in einem Artikel beschrieben, der über die Internetseite des Nationalen Referenzlabors für Rotz ( verlinkt ist. Für die Identifikation infizierter Tiere, Handels- und Überwachungsuntersuchungen werden komplementbindende Antikörper im Blutserum nachgewiesen (KBR). Die Spezifität und Sensitivität der KBR wird in hohem Maße durch das verwendete Antigen bestimmt. Mit dem für Deutschland zugelassenen Diagnostikum werden ca. 3,5-5,5 % falsch positive Ergebnisse erzielt. Für KBR-positive Befunde wird deshalb im Referenzlabor am FLI ein Westernblot als serologischer Bestätigungstest durchgeführt (Abb. 1). Andere serologische Methoden, wie Agglutinationstests und ELISA sind beschrieben, teilweise auch kommerziell erhältlich, jedoch aufgrund mangelnder Daten zu Spezifität und Sensitivität in Deutschland nicht zugelassen. Abb.1: Westernblot zur Detektion von Rotz-Antikörpern: 1: positives Kontrollserum 2: negatives Kontrollserum; 3+4 Seren infizierter Pferde aus Pakistan Tab. 1: Rotz-Status OIE, gemeldete Rotz-Fälle von (OIE World Animal Health Information System Online im Internet: Diseasetimelines; Stand: ) Für den Erregernachweis bei bestätigten positiven serologischen Befunden am lebenden Tier gibt es bisher keine verlässlichen Verfahren. Im Falle des Vorliegens klinischer Symptome kann der Nachweis aus dem Nasentupfer oder Hautläsionen durch Anzucht oder PCR gelingen. Eine weiterführende Diagnostik kann nur post mortem durch die Anzucht aus veränderten Bereichen insbesondere der Leber, Lunge, Milz sowie den Lymphknoten mit anschließendem PCR-Nachweis erfolgen. Da der Erreger oft nur in geringer Anzahl im Gewebe vorkommt, langsam wächst und keine Selektivmedien zur Verfügung stehen, ist die mikrobiologische Diagnostik schwierig. An Isolaten von B. mallei sind durch molekularbiologische Typisierungsmethoden forensische Ausbruchsanalysen zur Aufdeckung epidemiologischer Zusammenhänge möglich. Sind alle Untersuchungen ohne Ergebnis geblieben, stellt der diagnostische Tierversuch mit männlichen Meerschweinchen die letzte Möglichkeit dar. Die Tiere werden intraperitoneal mit Aufarbeitungen von verdächtigem Probenmaterial infiziert, um eine Orchitis (Strauß-Reaktion) zu induzieren. Die Nachweisrate des Erregers konnte mit dieser Methode beispielsweise bei einem Rotzausbruch in Dubai 2004 erhöht werden. Für eine finale Diagnosestellung sollten so viele verschiedene Untersuchungsmethoden wie möglich miteinander kombiniert werden. Bei Verdacht auf oder Ausbruch von Rotz werden die Verfahren in der nach 27 Absatz 4 Nummer 1 des Tiergesundheitsgesetzes veröffentlichten Amtlichen Methodensammlung sowie die Falldefinition im Tierseuchennachrichtensystem angewendet. Demzufolge bedürfen positive serologische Befunde in der KBR immer einer sofortigen Abklärungsuntersuchung und ziehen 3 Nachuntersuchungen des Tieres im Abstand von 2 bis 3 Wochen nach sich. Voraussetzungen für den Verdacht sind das Vorliegen klinischer Symptome oder positiver serologischer Befunde, insbesondere nach Kontakt mit Tieren aus endemischen - oder Ausbruchsgebieten. In betroffenen Beständen werden von allen empfänglichen Tieren Blutproben entnommen und mit der KBR auf Antikörper untersucht. Serologische Abklärungsuntersuchungen in Verdachts- oder Ausbruchsbeständen müssen mindestens 3 mal im Abstand von 2 bis 3 Wochen negativ verlaufen, bevor eine Bestandssperre aufgehoben werden kann. Ein Fall von Rotz liegt bei positivem serologischem Befund in der KBR vor, der mittels Westernblot bestätigt wurde oder bei kulturellem Nachweis und molekularer Identifizierung oder bei ausschließlichem molekularem Nachweis des Erregers. Literatur bei der Verfasserin Brasilien Brasilien Eritrea Brasilien Iran Mongolei Russland Brasilien Iran Mongolei Brasilien Iran Kuwait Mongolei Myanmar Bahrain Brasilien Eritrea Iran Kuwait Mongolei Myanmar Pakistan Afghanistan Bahrain Brasilien Iran Libanon Myanmar Pakistan Afghanistan Brasilien Iran Pakistan Brasilien Iran Pakistan Russland Brasilien Deutschland Iran Irak LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 12 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 13

8 Auswertung des nationalen Ringtests zur Diagnostik von viralen Fischseuchen-Erregern Heike Schütze, Sven M. Bergmann und Uwe Fischer Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Infektionsmedizin, Nationale Referenzlabore für Fischseuchen, Greifswald Insel Riems Der Fischverbrauch in Deutschland wird vorrangig durch Importe abgedeckt. Lediglich ca. 10 % des Gesamtaufkommens werden in Deutschland durch die See- und Binnenfischerei sowie Aquakulturen abgedeckt. Aquakultur bezeichnet die kontrollierte Aufzucht von Karpfen, Forellen und zahlreichen anderen Arten. Zum Erhalt einer gesunden Aquakultur wurden gesetzliche Rahmenbedingungen auf nationaler und internationaler Ebene geschaffen (Tiergesundheitsgesetz, Fischseuchenverordnung, Richtlinie 2006/88EG und deren Verordnungen). Eine Maßnahme betrifft die Anzeigepflicht hochansteckender viraler Erkrankungen wie die Virale Hämorrhagische Septikämie (VHS), die Infektiöse Hämatopoetische Nekrose (IHN), die Infektiöse Anämie der Lachse (ISA), die Koi-Herpesvirus Infektion (KHV-I) und die Epizootische Hämatopoetische Nekrose (EHN) (Anon. 2). Jährlich verursachen Erkrankungen der IHN, VHS und KHV-I Verluste in der deutschen Aquakultur. Der Erreger der exotischen und anzeigepflichtigen Fischseuche EHN (EHNV) wurde in Europa bislang nicht nachgewiesen. Ebenso ist Deutschland frei von ISA. Im Rahmen der Seuchenbekämpfung sind standardisierte diagnostische Verfahren unerlässlich und regelmäßig zu prüfen. Auf Grundlage des Tierseuchengesetzes 27 (Anon. 1) führten die nationalen Referenzlabore (NRL) für anzeigepflichtige Fischseuchen einen Ringversuch zur Diagnostik der viralen Erreger der IHN, VHS, ISA und der KHV-I durch. Der Nachweis der Erreger der exotischen Erkrankung EHN sowie der nicht anzeigepflichtigen, nicht exotischen Erkrankungen der Frühjahresvirämie der Karpfen (SVC) und der Ranavirus-Infektion des Welses (ECV) war optional. EHNV ist genetisch eng verwandt mit den Ranaviren der Welse (ECV und ESV), die in Deutschland, Frankreich und Italien Krankheitsgeschehen verursachen. Deshalb und auf Grund von Interessenbekundungen einzelner Untersuchungsämter enthielt der Ringtest ebenfalls Ranaviren. Aufgabenstellung Der nationale Ringtest umfasste zwei Teile. Negativkontrollen wurden beiden Teilen beigefügt. Alle Proben enthielten jeweils 2 x 2 ml virushaltigen bzw. nicht virushaltigen Zellkulturüberstand. Vor dem Versand wurden alle Proben am FLI mit den empfohlenen Testverfahren untersucht. Teil FLI_RT2014_A enthielt insgesamt 6 Proben. Ziel war die Diagnostik der Erreger IHNV, VHSV und ISAV. Der Nachweis dieser Pathogene sollte auf Grundlage der EU-Entscheidung 2001/183/EC (Anon. 4) und den amtlichen Methoden (Amtliche Methodensammlung) erfolgen. Die Diagnostik der Ranaviren EHNV und ECV war fakultativ. Teil FLI_RT2014_B bestand aus 4 Proben. Aufgabe der Teilnehmer war der Nachweis von KHV und optional des SVCV. Eine detaillierte Beschreibung der standardisierten diagnostischen Verfahren aller Erreger wurde den Teilnehmern im Rahmen des Ringvergleichs übermittelt. Teilnahme Insgesamt beteiligten sich 18 amtlich zugelassene Labore der Bundesländer. Laut Abfrage gaben 17 Labore einen Akkreditierungsstatus an. Alle 18 Labore erklärten eine Teilnahme zur Diagnostik von KHV (Teil FLI_RT2014_B) und 16 Labore beteiligten sich am Nachweis von IHNV und VHSV. Tab. 1 fasst die Beteiligung der Landeslabore zum Nachweis der Fischseuchen-Erreger zusammen. Ergebnisse FLI_RT2014_A Die Erreger der anzeigepflichtigen Erkrankungen der IHN und VHS wurden von allen 16 teilnehmenden Laboren korrekt Tab.1: Teilnahme der Landeslabore an der Diagnostik der Ringtestproben RT_2014 Nachweis Erreger Beteiligung A Pflicht IHNV 16 Pflicht VHSV 16 Pflicht ISAV 12 Optional EHNV 6 Optional ECV/ ESV 6 B Pflicht KHV 18 Optional SVCV 15 nachgewiesen. Entsprechend den gesetzlichen Vorgaben und Empfehlungen (Amtliche Methodensammlung, Anon.1, - 6) wurden diese Erreger in der Zellkultur isoliert und anschließend in der Immunfluoreszenz oder im Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) identifiziert. Zusätzlich erfolgte in 14 Laboren der Genomnachweis in der RT-PCR mit anschließender nested-pcr und/oder der Real-Time RT-PCR (RT-qPCR). In zwei Landeslaboren kam auch die Elektronenmikroskopie zur Diagnostik dieser Erreger zum Einsatz. Die ermittelten Titer (TCID50) lagen zwischen und je ml für IHNV (FLI: 107.5) bzw und je ml für VHSV (FLI: ). An der Diagnostik von ISAV beteiligten sich 12 Landeslabore. Der Erreger wurde von den Teilnehmern korrekt identifiziert. Zur Anwendung kamen die Virusisolierung, der Antigennachweis mittels Immunfluoreszenz oder der Genomnachweis (RT-PCR oder RT-qPCR). Sechs Teilnehmer nutzten die Option zum Nachweis des Erregers der exotischen anzeigepflichtigen Erkrankung EHN und des Ranavirus ECV. Elf von 16 Teilnehmern des Teils A identifizierten nach entsprechender Inokulation von Zellkulturen mit den Proben 5 (EHNV) und 6 (ECV) einen zytopathogenen Effekt (CPE). Der Genomnachweis erfolgte in vier Laboren mit anschließender Restriktionsanalyse und/oder Sequenzierung des PCR-Produktes. Vier Labore bestätigten den Nachweis von Iridoviren nach Analyse in der Elektronenmikroskopie. Die Negativkontrolle wurde von allen beteiligten Laboren korrekt bewertet. Ergebnisse FLI_RT2014_B An der Identifizierung des Erregers der anzeigepflichtigen KHV-I beteiligten sich alle 18 Labore mit Erfolg. Der Erreger wurde in allen Laboren unter Anwendung der qpcr nach Gilad et al., 2004 nachgewiesen. Die Cq-Werte variierten zwischen und der Ampulle B1 bzw und der Ampulle B2. Vier Landeslabore bestätigten den positiven Genomnachweis zusätzlich mit unterschiedlichen (nested-) PCR-Methoden. Die Negativkontrolle (Ampulle B4) wurde in allen Laboren als KHV-negativ identifiziert. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse zur Diagnostik der Ringtestproben durch die Landeslabore ist in (Tab. 2) aufgelistet. Die Ergebnisse des diesjährigen nationalen Ringtestes verdeutlichen, dass die Erreger der anzeigepflichtigen Erkrankung IHN, VHS und KHV-I von den teilnehmenden Laboren korrekt identifiziert wurden. Die Diagnostik zum Nachweis des ISAV ist bereits in 12 Landeslaboren etabliert. Einige Landeslabore nutzten im Rahmen des Ringtestes auch erfolgreich Verfahren zur Identifizierung von Ranaviren einschließlich des Erregers der exotischen und anzeigepflichtigen EHN. Hervorzuheben ist, dass 14 Labore bei einer entsprechenden diagnostischen Fragestellung die Proben gemäß den gesetzlichen Vorgaben unverzüglich ans FLI weiterleiten würden. Virusanzucht Der Virusnachweis von IHNV und VHSV erfolgte in den teilnehmenden Laboren auf den vorgeschriebenen Zelllinien EPC bzw. FHM der Elritze (CCLV Rie 173 und 057) und BF-2 vom Sonnenbarsch (CCLV Rie 057 und 088) bzw. RTG der Regenbogenforelle (CCLV Rie 38). Zum Nachweis des ISAV wurden SHK- (CCLV Rie 489) und/oder ASK- (CCLV Rie 926) Zellen mit dem Probenmaterial inokuliert. Die Angaben zu den verwendeten Zellpassagen variierten zwischen den Teilnehmern z.t. sehr deutlich. Aus der Befragung der teilnehmenden Labore geht hervor, dass die Zellen in der Regel bei der Zellbank des FLI bestellt wurden. Nur in wenigen Laboren war die Herkunft der verwendeten Zellen nicht eindeutig. Im Rahmen der Diagnostik ist es notwendig, sowohl Erreger als auch Zellen regelmäßig auf Tab. 2: Zusammenfassung der Ergebnisse der teilnehmenden Labore am nationalen Ringtest : korrekter Nachweis, *: keine Teilnahme, CPE: zytopathogener Effekt in der Zellkultur Teil nehmer A1: ISAV A2: K- A3: VHSV A4: IHNV A5: EHNV A6: ECV B1: KHV B2: KHV B3: SVCV *CPE *CPE * * *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE *CPE * * * * * *CPE *CPE * *CPE *CPE * * * * * * + + * + 18 * * * * * * + + * + 12/16 16/16 16/16 16/ / /16 18/18 18/18 15/16 18/18 ihre Eignung zu überprüfen. Die Qualität der Zellen, die Anzahl der Zellpassagen, das Medium bzw. dessen Zusätze wie z.b. FKS können den Virusnachweis stark beeinflussen (z.b. Titerreduktion). Genomnachweis Die RNA- bzw. dann-isolierung erfolgte unter Verwendung von unterschiedlichen kommerziellen Kits der Firmen Qiagen, Roche und Macherey-Nagel entsprechend den Herstellerangaben bzw. den Empfehlungen des FLI. Der qualitative Genomnachweis von RNA-Viren wurde einheitlich unter Verwendung des One Step RT-PCR Kits der Firma Qiagen durchgeführt. Das Genom von DNA-Viren wurde unter Verwendung von Produkten der Firmen Qiagen (Hot Star Taq bzw. Hot Star Master Mix), Thermo Scientific (Ready PCR Master Mix), Fermentas (Dream Taq DNA Polymerase) und 5-Prime (Hot Master Taq Mix) nachgewiesen. Produkte der Firmen Qiagen, Applied Biosystems, Invitrogen und Life Technology kamen beim quantitativen Genomnachweis der Erreger (Real-Time (RT-) PCR) zum Einsatz. Die angewandten Methoden zum Genomnachweis der zu untersuchenden Erreger sind in (Tab. 3) aufgeführt. Alle teilnehmenden Labore nutzten zum Nachweis von KHV-Genom die qpcr nach Gilad et al. (2004). Zusätzlich zum quantitativen Nachweisverfahren wurden auch drei qualitative PCR-Methoden zum Nachweis des KHV-Genoms angewendet. Amplifizierungsverfahren zum Nachweis von IHNV und VHSV Genom sollen demnächst von der EU als diagnostische Methoden zugelassen werden. Entsprechende Nachweisverfahren sind in der Mehrzahl der teilnehmenden Labore bereits etabliert. Mit Hilfe der RT-PCR und/oder der RT-qPCR wurde der Virusnachweis dieser Erreger bestätigt. In 10 teilnehmenden Laboren sind Amplifizierungsverfahren zur Diagnostik von ISAV etabliert. Generell ist anzumerken, dass die Reaktionsbedingungen gleicher Amplifizierungsverfahren in den Laboren variieren. B4: K- LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 14 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 15

9 Tab. 3: Übersicht angewandter diagnostischer Amplifizierungsverfahren zum Nachweis von fischpathogenen viralen Erregern im Rahmen des nationalen Ringtests 2014 n: Gesamtanzahl der Labore mit etablierten Amplifizierungsverfahren, n: Anzahl der Labore entsprechend dem angegebenen Amplifizierungsverfahren, ORF: offener Leserahmen, *: KHV-U (GenBank DQ657948) Erreger n (RT)-(nested)PCR RT-(q)PCR Methode ORF n Methode ORF n IHNV 12 Miller et al., 1998 G 11 Purcel et al., 2013 N 1 Emmenegger et al., 2000; G 1 Lui et al., 2007 N 1 OIE Knüsel et al., 2007 N 1 Overturf et al., 2001 N 1 Williams et al., 1999 N 1 VHSV 13 Miller et al., 1998 G 12 Chico et al., 2006 N 1 Emmenegger et al., 2000 N 1 Jonstrup et al., 2012 N 2 Lui et al., 2007 N 2 KHV 18 Bergmann et al., 2010 (sn) 89/90* 2 Gilad et al., * 18 Gilad et al. 2002; Bergmann et al., /90* 3 Engelsma et al., * 1 ISAV 10 Mjaaland et al., 1997 M (sg8) 4 Snow et al., 2006 M (sg8) 4 EU RL Fish HE (sg6) 1 OIE HE (sg6) 1 EHNV/ 4 Ohlemeyer et al., 2011 MCP 4 ECV SVCV 11 OIE 2009; G 2 Liu et al., 2007 M 4 Stone et al., 2003 Koutná et al., 2003 G 3 Miller et al., 1998 G 2 laborspezifisch N 1 Verwendete in vitro Diagnostika Um eine einheitliche und vergleichbare Diagnostik sicherzustellen, sind sowohl standardisierte Methoden als auch geprüfte Reagenzien (z. B. Antikörper) essentiell. Nicht zugelassene in vitro Diagnostika können zu starken unspezifischen Reaktionen führen, die eine eindeutige Diagnostik erschweren oder gar verhindern. Für in vitro Diagnostika zum Nachweis von Erregern anzeigepflichtiger Tierseuchen besteht die Zulassungspflicht (Anon. 1). Listen der in Deutschland zugelassenen Mittel und freigegebenen Chargen sind auf der Homepage des FLI verfügbar. Eine Übersicht derzeit zugelassener und geprüfter Chargen von mak zum Nachweis von IHNV, VHSV und ISAV sind in der Tab. 4 dargestellt. Tab. 4: In Deutschland zugelassene mak und geprüfte Chargen zur Diagnostik der anzeigepflichtigen Erreger der IHN, VHS und ISA Erreger EU-Empfehlung Deutschland FLI-Zulassung Charge Gültigkeit IHNV BIO 285 (136/3) FLI-B 647 aihn14c VHSV IP5B11 BIO 282 (IP5B11) FLI-B 646 avhs14c ISAV 3H6F8/ BIO 337 FLI-B 422 aisa14b C9F5 Fazit Der nationale Ringtest verlief insgesamt zufriedenstellend. Alle Labore haben entsprechend ihrer Beteiligung zum Nachweis der unterschiedlichen Erreger korrekte Befunde erhoben. Die Nukleinsäure-Isolierung und der anschließende Genomnachweis erfolgten unter Verwendung verschiedener Kits unterschiedlicher Hersteller, was bei gleicher Eignung und entsprechender Validierung möglich ist. Kritisch anzumerken ist, dass nur zugelassene Chargen von in vitro Diagnostika verwendet werden dürfen, damit diagnostische Ergebnisse in der Praxis einer seuchenrechtlichen Überprüfung standhalten. Weiterhin ist eine regelmäßige Validierung der für die Virusanzucht verwendeten Zellkulturen zu empfehlen. Die Ergebnisse des Ringtests bestätigen die Fachkompetenz der Labore. Referenzen Amtliche Methodensammlung / Hrsg.: Friedrich-Loeffler Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit. www. fli.bund.de/de/startseite/veroeffentlichungen. Anon. 1. Gesetz zur Vorbeugung und Bekämpfung von Tierseuchen (Tiergesundheitsgesetz TierGesG) vom 22. Mai 2013 (BGBl. I S (Nr. 25). Tagungsankündigung 7. Riemser Diagnostiktage am 26. und 27. November 2015 in Greifswald Liebe Kolleginnen und Kollegen, wir laden Sie zu den 7. Riemser Diagnostiktagen ein, die Ende November vom Institut für Virusdiagnostik (IVD) in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID) ausgerichtet werden. Mit dieser Tagung wenden wir uns mittlerweile schon traditionsgemäß an Sie als die Praktiker des Laboralltags in staatlichen und privaten Untersuchungseinrichtungen. Die Anmeldung für die 7. Riemser Diagnostiktage ist ab August online über die Homepage des FLI möglich. Wir freuen uns auf spannende Themen und einen regen Erfahrungsaustausch mit Ihnen und verbleiben mit kollegialen Grüßen Prof. Dr. Martin Beer, Dr. Bernd Hoffmann Datum: Ort: Kontakt: Vorläufige Themenschwerpunkte: ab 9:00 bis bis 14:00 Uhr Alfried-Krupp-Kolleg, Martin-Luther-Str. 14, Greifswald Prof. Dr. Martin Beer (martin.beer@fli.bund.de), Ines Jakobi (ines.jakobi@fli.bund.de) Tel Verordnungen und Gesetze relevante Neuerungen und Änderungen Berichte aus den Referenzlaboratorien Berichte aus der Laborpraxis und der Industrie Moderne Diagnostikmethoden Vektorübertragene Tierkrankheiten und Zoonosen Klassische Tierseuchen Eradikationsprogramme Anon. 2. Aquakultur-Richtlinie 2006/88/EG des Rates vom 24. Oktober 2006 mit Gesundheits- und Hygienevorschriften für Tiere in Aquakultur und Aquakulturerzeugnissen und zur Verhütung und Bekämpfung bestimmter Wassertierkrankheiten (ABl. L 328 vom , S. 14). Anon. 3. Durchführungsrichtlinie 2014/22/EU vom Anon. 4. Entscheidung der Kommission 2001/183/EG vom 22. Februar 2001 zur Festlegung der Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter Fischseuchen und zur Aufhebung der Entscheidung 92/532/ EWG. (ABl. EU Nr. L 56 S. 65). Anon. 5. Fischseuchenverordnung und Verordnung zur Änderung der Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 24. November 2008 (FischSeuchV 2008, BGBl. I S. 2315), zuletzt geändert durch Artikel 30 der Verordnung vom 17. April 2014 (BGBl. I S. 388). Anon. 6. "Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases" des Office International des Epizooties (O.I.E.) in der jeweils aktuellen Ausgabe. Weitere Literatur bei den Verfassern LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 16 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 17

10 Laborvergleichsuntersuchung zur serologischen Diagnostik der Beschälseuche 2015 Björn Bassarak und Irmgard Moser Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese, Nationales Referenzlabor für Beschälseuche, Jena Beschälseuche der Pferde und anderer Equiden wird durch Trypanosoma (T.) equiperdum, einen einzelligen Parasiten (Abb. 1a), hervorgerufen, der ausschließlich beim Deckakt übertragen wird. Der Erreger ist in Asien, Afrika, Russland und Teilen des Mittleren Ostens verbreitet, kommt aber auch in südlichen Regionen Europas sporadisch immer wieder vor (Abb. 1b). Deutschland ist seit vielen Jahrzehnten frei von Beschälseuche, die in Europa zu den anzeigepflichtigen Tierseuchen zählt. Abb. 1a : TEM Bild Trypanosoma equiperdum Um beim Import von Pferden aus Risikoregionen die Gefahr der Einschleppung der Seuche zu mindern, sind die Landesuntersuchungsämter gehalten, im Rahmen der amtlichen Diagnostik, serologische Untersuchungen, vorzugsweise die Komplement-Bindungsreaktion (Diagnostikmethode der Wahl auf Empfehlung der OIE), zum Nachweis spezifischer Antikörper im Blutserum bei den Tieren durchzuführen. Das hierfür benötigte Antigen wird vom nationalen Referenzlabor für Beschälseuche für die deutschen Untersuchungsämter bereitgestellt. Bei der Produktion von Antigen nach der von der OIE empfohlenen Methode ist das Setzen einer Infektion bei Labornagern, vorzugsweise Ratten, zur Vermehrung und die Gewinnung der Parasiten im präparativen Maßstab durch maximalen Blutentzug, der zum Exitus der Tiere führt, notwendig. Als Alternative wurde in den vergangenen drei Jahren im Rahmen eines vom BMBF geförderten Projektes ( 3R-Methoden zum Ersatz und zur Verbesserung gesetzlich geforderter Tierversuche bei der Prüfung von immunologischen Arzneimitteln: In vitro-vermehrung von Trypanosoma equiperdum zur Gewinnung von Antigen zu Diagnosezwecken, Förderkennzeichen C) eine Methode zur Kultivierung von T. equiperdum in vitro entwickelt. Die Laborvergleichsstudie, über die hier berichtet wird, verfolgte zwei Ziele. Zum Ersten sollte die Qualität der serologischen Beschälseuche-Diagnostik in den amtlichen Untersuchungseinrichtungen überprüft werden. Zum Zweiten sollte ein auf alternative Weise (in vitro) produziertes Beschälseuche-Antigen im Vergleich zum amtlich zugelassenen Antigen evaluiert werden. Die Landesuntersuchungsämter folgender Bundesländer sowie das Nationale Referenzlabor für Beschälseuche des FLI nahmen an der Studie teil: Baden-Württemberg Bayern-1 Bayern-2 Berlin / Brandenburg Hessen Niedersachsen Nordrhein-Westfalen Rheinland-Pfalz Sachsen Schleswig-Holstein Methoden Die Komplement-Bindungsreaktion sollte nach dem jeweils bei den teilnehmenden Labors etablierten Protokoll durchgeführt werden. Vom FLI wurden jedem Teilnehmer lyophilisiertes Beschälseuche-Antigen (T. equiperdum) aus konventioneller Herstellung (amtlich zugelassen; Antigen A) und lyophilisiertes Antigen, hergestellt aus in vitro vermehrten Trypanosomen (alternativ; Antigen B), mit entsprechenden Anwendungshinweisen zur Verfügung gestellt. Weiterhin wurden 14 Serumproben vom Pferd (A1 - A14) für die KBR mit Antigen A und für die KBR mit Antigen B (B1-14) sowie positives und negatives Kontrollserum vom Pferd an die Teilnehmer versandt. Bei den Seren handelte es sich um sechs positive Feldseren mit geringem, mittlerem und hohem Titer gegen konventionell hergestelltes Beschälseuche-Antigen von immunisierten bzw. erkrankten Pferden, die uns vom Europäischen Referenzlabor für Beschälseuche in Frankreich und von italienischen Kollegen zur Verfügung gestellt worden waren. Sieben negative Feldseren entstammten dem Referenzlabor des FLI. Bei den positiven und negativen Kontrollseren handelte es sich um die für die amtliche Diagnostik vom FLI üblicherweise zur Verfügung gestellten Kontrollseren. Die Titer aller versandten Seren waren vorab am NRL bestimmt bzw. bestätigt worden. Die Serumtiter wurden gemäß OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2013 ab einem Titer von 1:5++ als positiv bewertet. Bei antikomplementärer Aktivität eines Serums sollte, gemäß der Empfehlung der OIE, das Ergebnis als positiv bewertet werden, wenn der spezifische Serumtiter mindestens drei Verdünnungsstufen größer war als der antikomplementäre Titer des fraglichen Serums. Bei der Vorauswahl der Seren war bei keinem Serum antikomplementäre Aktivität festgestellt worden. Zusammenfassende Bewertung und Ausblick Die überwiegende Anzahl der Teilnehmer erzielte die erwarteten positiven bzw. negativen Ergebnisse. Die Variationsbreite der mit den positiven Seren erzielten Werte entspricht der Variationsbreite der Ergebnisse, die auch in anderen Laborvergleichsstudien mit der Beschälseuche-KBR erreicht werden, wenn bei Verwendung des gleichen Antigens Reagenzien unterschiedlicher Hersteller und unterschiedliche Durchführungsbedingungen verwendet werden. Mit vier negativen Seren und Antigen A (zugelassenes Antigen) wurden bei zwei von elf Teilnehmern schwach positive Ergebnisse erzielt. Validierung des alternativ produzierten Antigens sind jedoch noch weitere Untersuchungen erforderlich. Ergebnisse Die mit S gekennzeichneten Serumtiterwerte (siehe Säulendiagramme) stellen die Sollwerte dar, die mit den entsprechenden Seren am FLI in Vorversuchen erzielt oder von den Herkunftslabors in Frankreich oder Italien mitgeteilt worden waren. Bei den Seren 7, 9 und 11 wurde der Solltiter nur mit Antigen A überprüft. Der Serumtiterwert bei einer Serumverdünnung von < 1:5++ wurde auf der Y-Achse der Diagramme mit dem Zahlenwert 2,5 belegt. Feinabstufungen der Serumtiter innerhalb einer Titerstufe ( ) sind in den Abbildungen nicht dargestellt. Negative Seren (Abbildungen 2a 2g) Bei den Seren 1, 3, 4, 6, 8, 12 und 13 waren Serumtiter von < 1:5++ zu erwarten. Quantitative Analyse der Differenzen zwischen Serumtiter-Ergebnissen für die Antigene A und B Der Vergleich der mit den Antigenen A und B erzielten Ergebnisse zeigte, dass in 92,2 % der Fälle die Differenz nicht mehr als eine Titerstufe betrug (Tab. 1). Tab. 1: Qualitativer Vergleich der KBR-Ergebnisse für Antigen A und Antigen B Differenz der Anzahl der Ergebnisse Titerstufen zwischen Antigen A und Antigen B Keine Abb. 2b: Vorkommen von Beschälseuche von Januar bis Juni 2012 Karte: Disease distribution map WAHID OIE Aus dem europäischen Ausland nahmen das EU-Referenzlabor und die Referenzlabors aus Italien, den Niederlanden und Polen an der Laborvergleichsstudie teil. In dem hier vorgelegten Bericht wurden die Ergebnisse der letztgenannten Labors jedoch nicht berücksichtigt. Mit vier positiven Seren und Antigen A wurden bei zwei von elf Teilnehmern negative Ergebnisse erzielt. Die Analyse der Differenzen zwischen den Serumtiter-Werten für die Antigene A (zugelassen) und B (alternativ) zeigt, dass das alternativ produzierte und das zugelassene Antigen im wesentlichen vergleichbare Ergebnisse hervorbringen. Zur LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 18 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 19

11 Negative Seren (Abbildungen 2a 2g) -Bei den Seren 1, 3, 4, 6, 8, 12 und 13 waren Serumtiter von < 1:5++ zu erwarten. Positive Seren (Abbildungen 3a 3c) -Bei den Seren 5, 7 und 11 wurde ein geringer positiver Titer erwartet. Abb.: 2a Abb.: 2b Abb.: 3a Abb.: 3b Abb.: 2c Abb.: 2d Abb.: 3c Bei den Seren 9 und 14 (Abbildungen 4a und 4b) wurde ein mittlerer positiver Titer erwartet. Abb.: 2e Abb.: 2f Abb.: 4a Abb.: 4b Bei den Seren 2 und 10 (Abbildungen 5a und 5b) wurde ein hoher bzw. sehr hoher positiver Titer erwartet. Abb.: 2g Abb.: 5a Abb.: 5b LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 20 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 21

12 Next-Generation Sequencing und Metagenomanalyse - Potential für die Diagnostik Maria Jenckel Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Greifswald-Insel Riems Bereits 2011 zeigte die Identifizierung des Schmallenberg Virus als Erreger in Milchkühen das Potential von Next-Generation Sequencing und Metagenomanalyse. Doch nicht nur in der Metagenomanalyse und der Identifizierung neuer Pathogene hat die Hochdurchsatzsequenzierung an Bedeutung gewonnen. Auch für bereits bekannte Viren bietet diese Methode eine Reihe von Möglichkeiten. Einerseits kann so das gesamte Genom abgedeckt und sequenziert werden, anderseits macht es die Analyse von Varianten möglich, welche durch klassische Sangersequenzierung gar nicht oder nur unzureichend detektiert werden können. Ferner ermöglicht die Sequenzierung ebenfalls Studien wie Transkriptomanalysen. Im Folgenden soll das Verfahren und das Potential für die Diagnostik dargestellt werden. Sequenzierplattformen für das Next-Generation Sequencing Auf dem Markt gibt es mittlerweile eine Handvoll Hochdurchsatzsequenzierer unterschiedlicher Firmen. So bietet Life Technologies neben dem Ion Torrent außerdem den SOLiD als Sequenzierplattform an, von Roche wird noch bis Tab. 1: Übersicht und Vergleich unterschiedlicher Sequenzierplattformen, * Preis in US$ Methode Read Länge Genauigkeit Reads pro Lauf Pacific Bio (Single-molecule realtime sequencing) 5,000 bp bis ~22,000 bp % Consensus 87 % Einzelread 50,000 pro SMRT cell Ion Torrent (Ion semiconductor sequencing) 454 (Pyrosequencing) Illumina (Sequencing by synthesis) Bis zu 400 bp Bis zu 1000 bp 50 bis 300 bp SOLiD (Sequencing by ligation) oder bp 98 % 99.9 % 98 % 99.9 % Bis zu 80 Millionen 2016 der Genome Sequencer FLX verfügbar sein. Ebenso bietet Illumina verschiedene Geräte an. Während die bereits genannten Geräte der zweiten Generation des Sequenzierens angehören, bietet Pacific BioScience mit dem PacBio ein Gerät der dritten Generation an und auch Oxford Nanopore befindet sich mit einem Gerät der dritten Generation bereits in der Testphase. Alle Systeme haben unterschiedliche Vorund Nachteile (siehe Tab.1), sodass die Wahl des Sequenzierers von der entsprechenden Fragestellung abhängig ist. Für Metagenomanalysen sind beispielsweise der Ion Torrent und der GS-FLX nutzbar, da hier eine Kontamination am geringsten ist, wohingegen sich die Illumina-Geräte auf Grund ihres hohen Durchsatzes für Amplikon- und Volllängensequenzierung eignen. Probenvorbereitung und Sequenzierung Für die Geräte der 2. Generation (Ion Torrent, 454, Illumina, SOLiD) ist das Prinzip der Probenvorbereitung ähnlich. Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf eine, von der Sequenzierplattform abhängigen, Länge fragmentiert. Für den Ion Torrent PGM und den Illumina MiSeq werden beispielsweise Fragmentgrößen von Basenpaaren (bp), für den 454 GS-FLX von bp verwendet. Anschließend werden an die Enden dieser Fragmente Adapter ligiert um eine DNA-Bibliothek zu generieren. Mit Hilfe dieser Adapter erfolgt im nächsten Schritt eine klonale Amplifikation der DNA-Bibliothek. Das heißt, jedes DNA-Fragment wird unabhängig voneinander amplifiziert um im folgenden Sequenzierprozess für die nötige Signalverstärkung zu sorgen. Diese Amplifikation kann auf verschiedenen Wegen geschehen. Für den 454, den SOLiD und den Ion Torrent wird eine Emulsions-PCR (empcr) 1 Million Bis zu 3 Milliarden 1.2 bis 1.4 Milliarden genutzt. Dabei wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt, wobei jedes Wassertröpfchen einen Mikroreaktor darstellt, in dem sich jeweils ein DNA-Fragment der Bibliothek, ein DNA-Bead und die benötigten Primer, Nukleotide und die Polymerase befinden. Durch das Verhältnis von DNA-Beads zu DNA-Fragmenten der Bibliothek wird gewährleistet, dass statistisch nur jeweils ein DNA-Fragment an ein DNA-Bead bindet und entsprechend klonal amplifiziert wird. Illumina nutzt für die klonale Amplifizierung das Prinzip der Brücken-Amplifikation. Hier binden DNA-Fragmente an eine mit Adaptern besetzte Oberfläche. Da beide Enden des DNA-Fragments mit Adaptersequenzen versehen sind, bindet das zweite Ende des DNA-Fragments ebenfalls an die Oberflächen-Adapter und es entsteht eine Brücke, wobei die Oberflächenadapter als Primer für die Amplifikation dienen. Es entstehen sogenannte Cluster. Hierbei ist die statistische Verteilung von DNA-Fragment zur Fläche der entscheidende Faktor. Während der Sequenzierung erfolgt die Detektion der eingebauten Nukleotide in der Regel über optische Signale, welche von einer Kamera detektiert, übereinandergelegt und anschließend von einer Software in eine Nukleotidsequenz übersetzt werden. Lediglich der Ion Torrent bedient sich keiner optischen Detektionsmethode. Hier wird die Konzentration der frei werdenden Protonen bzw. die ph-wertänderung während des Einbaus eines Nukleotids gemessen. Was ist eine Metagenomanalyse? Die Metagenomanalyse ist die Untersuchung der Zusammensetzung einer Population auf genomischer Ebene und die Identifizierung der in ihr enthaltenen Organismen und Viren. Abb.1 zeigt schematisch den Ablauf einer Metagenomuntersuchung. Dabei ist gerade der bioinformatische Anspruch dieser Analysen sehr hoch, um möglichst viele Organismen und Viren innerhalb der untersuchten Population in einer angemessenen Zeit zu identifizieren. Hierfür stehen verschiedene Software-Anwendungen zur Verfügung, unter anderem der automatisierte Workflow RIEMS (Reliable Information Extraction for Metagenomic Sequence datasets) 1, welcher jede Read-Sequenz eines Datensatzes in einer kaskaden-artigen Abfolge taxonomisch zuordnet. Damit ist es möglich, ein umfassendes Bild über die Zusammensetzung einer Probe zu erhalten. Der Erfolg der Metagenomanalyse hängt jedoch nicht nur von der Probenvorbereitung, dem jeweiligem Sequenziersystem und der Datenauswertung ab, sondern wird auch entscheidend durch das Probenmaterial bestimmt. Da für Metagenomanalysen fast ausschließlich Organmaterial zur Verfügung steht, bildet hier das Wirtsgenom das größte Problem. Dieses wird ebenfalls sequenziert und macht in der anschließenden Datenanalyse den Großteil der Sequenzen aus. Da im Vorfeld nicht bekannt ist, ob es sich um ein DNA- oder RNA-Virus handelt, bietet es sich im Allgemeinen an, RNA zu extrahieren und diese für die Sequenzierung zu nutzen, da replizierende DNA-Viren auf mrna-ebene detektiert werden können. Hier sind stoffwechselaktive Organe wie z.b. die Leber sehr problematisch, da der Anteil an wirtseigener mrna entsprechend groß ist. Zu beachten ist ebenfalls der Zeitpunkt der Probennahme und die Art der Probe (Organsystem, Serum, Blut, Nasentupfer etc.). Ist das Tier nicht mehr virämisch bzw. kommt das entsprechende Pathogen nicht oder nicht in ausreichender Menge in der gewählten Probenmatrix vor, ist auch hier die Virusdetektion unwahrscheinlich. Manchmal kann jedoch auch schon die Detektion von einer Handvoll oder selbst einer einzigen virusspezifischen Sequenz ausreichend sein, um das entsprechende Pathogen zu identifizieren und anschließend mittels klassischer Diagnostik den Befund zu bestätigen. Dabei stellt die Metagenomanalyse immer nur einen Startpunkt dar, der dann mit anderen Methoden weiter verfolgt werden kann. 1 Scheuch M, Höper D, Beer M RIEMS: a software pipeline for sensitive and comprehensive taxonomic classification of reads from metagenomics datasets. BMC Bioinformatics 16:69 2 Höper D Ein Virus wird entdeckt: Forschung und Diagnostik mit dem Next Generation Sequencing. Forschungsreport 2:20-23 Zeit pro Lauf 30 Minuten bis 2 Stunden 2-5 Stunden 24 Stunden 1-11 Tage 1-2 Wochen Kosten pro 1 Mio. Basen * Vorteile $ $1.50 $1 $10 $ $0.15 $0.13 Längste Readlänge, Schnell, Detektion von Modifikationen Weniger teures Gerät Schnell Lange Readlänge Schnell Hoher Durchsatz, geringer Preis pro Base Geringer Preis pro Base, hohe Genauigkeit Nachteile Moderater Durchsatz Gerät ist sehr teuer Homopolymer Fehler Reagenzien sind teuer, Homopolymer Fehler Geräte relativ teuer, Kontaminationsanfällig Langsam, kurze Readlängen, Probleme mit Palindromen Abb. 1: Schematische Darstellung der Metagenomuntersuchung (A, B) Probenentnahme, Nukleinsäureextraktion und Herstellung einer DNA-Bibliothek (C) Sequenzierung der DNA-Bibliothek (D) Bioinformatische Auswertung der erhaltenen Sequenzdaten (E) Taxonomische Zuordnung der Sequenzdaten 2 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 22 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 23

13 Suvaxyn CSF Marker der KSP-Markerimpfstoff CP7_E2alf wurde nach über 10 Jahren Entwicklungsarbeit durch die Europäische Arzneimittelagentur zugelassen Sandra Blome und Martin Beer Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Greifswald Insel Riems Die Klassische Schweinepest (KSP) gehört zu den wichtigsten Infektionskrankheiten der Schweine und ist aufgrund ihrer Konsequenzen für die Schweineindustrie weltweit gefürchtet. In der Europäischen Union wird seit 1990 eine strikte, auf die Tilgung der Seuche ausgerichtete Bekämpfungsstrategie ohne prophylaktische Impfung umgesetzt. Daher trafen Einträge des KSP Virus (KSPV) seither auf eine voll empfängliche Schweinepopulation. Insbesondere in schweinedichten Gebieten bedeutet dies hohe ökonomische Verluste und eine immense Anzahl zu tötender, häufig gesunder Tiere. Dies ist sowohl aus ethischen sowie ökonomischen Gesichtspunkten fragwürdig und dem Verbraucher, vor allem vor dem Hintergrund der Existenz leistungsfähiger Impfstoffe, nur schwer zu vermitteln. Die entsprechenden Rechtsvorschriften sehen allerdings durchaus die Möglichkeit einer Notimpfung im Krisenfall vor und beschränken dies nicht auf eine Impfstoffart. Aufgrund von Handelsrestriktionen, denen konventionell geimpfte Tiere und ihre Produkte unterliegen, ist jedoch nur der Einsatz von Impfstoffen diskutabel, die eine Differenzierung von geimpften und infizierten Tieren ermöglichen (Markerkonzept; DIVA). Leider waren die bislang verfügbaren DIVA KSP-Impfstoffe mit deutlichen Schwächen behaftet (mehrfache Impfung, keine orale Vakzinierung), so dass von der Notimpfmöglichkeit im Hausschweinebereich nicht bzw. kaum Gebrauch gemacht wurde. Auch bei der Notimpfung von Schwarzwildpopulationen würde der Einsatz eines DIVA-Impfstoffes deutliche Vorteile bringen, da die Seuchensituation durch die Testmöglichkeiten besser nachvollzogen werden kann. CP7_E2alf beruht auf dem infektiösen Klon des zytopathogenen Bovinen Virusdiarrhöevirus (BVDV) CP7. Die für das Hauptimmunogen der Pestiviren, das Hüllglykoprotein E2, kodierende Region wurde durch das entsprechende Teilstück des KSPV-Stammes Alfort 187 ersetzt. So ließen sich die Vorzüge eines Lebendimpfstoffes mit einem tragfähigen Markerkonzept vereinen. Die serologische Differenzierung erfolgt anhand der Detektion von KSPV-spezifischen E rns -Antikörpern, die nur nach Feldvirusinfektion nachweisbar sind. Darüber hinaus wurde eine impfvirusspezifische Real-Time RT-PCR entwickelt, die auch ein genetisches DIVA-Konzept möglich gemacht hat. Im Rahmen der Impfstofftestungen, die durch Arbeitsgruppen des FLI und internationale Partner durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass der chimäre Impfstoff genetisch stabil und unschädlich für die Zieltierart (Haus- und Wildschwein) ist. Des Weiteren überschreitet der Impfstoff nicht die Plazenta und kann keine persistierenden Infektionen induzieren. Es konnte zudem gezeigt werden, dass in anderen relevanten Spezies (kleine Wiederkäuer, Rinder, Kaninchen) nach Inokulation keine produktive Infektion entsteht. In Wirksamkeitsprüfungen wurde belegt, dass ein sehr früher, langanhaltender und belastbarer Schutz gegen hoch-virulente KSPV-Stämme und relevante, moderat-virulente Feldstämme der letzten Jahre (inklusive KSPV Rösrath ) nach einmaliger Impfung mit CP7_E2alf besteht. Maternale Antikörper können, wie bei anderen Lebendimpfstoffen, die Schutzwirkung beeinflussen und der vertikale Schutz kann bei sehr früher Belastungsinfektion mit sehr hoch virulenten KSPV-Stämmen variieren. Diese Punkte sind bei der Planung einer Impfstrategie zu bedenken und in die Risikoabwägung einzubeziehen. Für die serologische Markerdiagnostik steht derzeit ein zugelassenes kommerzielles System zur Verfügung (ehemals Fa. Prionics) und weitere Tests befinden sich in der finalen Phase der Entwicklung. Basierend auf den vorgelegten Daten wurde der Impfstoffkandidat CP7_E2alf unter dem Handelsnamen Suvaxyn CSF Marker (Fa. Zoetis) im Februar 2015 durch die Europäische Arzneimittelagentur (EMA) zugelassen und steht nun für den Einsatz als Lebendmarkerimpfstoff für Hausschweine zur Verfügung. Workshop Molekulare Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin erfolgreich durchgeführt Dr. Bernd Hoffmann Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Virusdiagnostik, Nationales Referenzlabor für Blauzungenkrankheit Institut für Virusdiagnostik, Greifswald Insel Riems Die Fachgruppe AVID der DVG hat, in Zusammenarbeit mit dem Institut für Virusdiagnostik am Friedrich-Loeffler-Institut, sehr erfolgreich einen Workshop zur molekularen Diagnostik von Infektionserregern durchgeführt. In zwei Durchgängen von jeweils 10 Personen trafen sich vom März und März 2015 insgesamt 20 interessierte Kolleginnen und Kollegen, um in den Laboren des FLI-Standorts Insel Riems verschiedenste Aspekte der modernen molekularen Infektionsdiagnostik in der Veterinärmedizin zu diskutieren und entsprechende Erfahrungen durch theoretische Unterweisungen sowie praktisches Arbeiten zu gewinnen und auszubauen. Der Workshop wurde von Dr. Bernd Hoffmann, Leiter des Nationalen Referenzlabors für Blauzungenkrankheit und AVID-Vorsitzender, organisiert und richtete sich besonders an technische Kräfte und Jungwissenschaftler/ Neueinsteiger im Bereich der veterinärmedizinischen Molekulardiagnostik. Somit war es nicht verwunderlich, dass mit 13 technischen Kräften diese Gruppe von Teilnehmern besonders stark vertreten war. Die Schwerpunkte des praktischen Teils des Workshops waren die manuelle und automatisierte Nukleinsäure-Extraktion mittels Silikamembran- und magnetic bead-basierten Verfahren sowie die Durchführung und Auswertung von Real-Time PCR-Analysen an den verschiedensten PCR-Cyclern. Dazu konnten die Teilnehmer auf insgesamt 9 unterschiedliche Real-Time PCR-Cycler von 7 Firmen zurückgreifen. Neben der Möglichkeit der praktischen Testung dieser Cycler sowie der entsprechenden Software wurden Stärken und Schwächen der einzelnen Geräte besprochen und diskutiert. Die praktische Arbeit wurde in Teams von 2 Teilnehmern sowie einer betreuenden Technischen Assistentin durchgeführt und ermöglichte so einen intensiven Erfahrungsaustausch. Neben der praktischen Arbeit wurden theoretische Grundlagen zur Nukleinsäure-Extraktion und Real-Time PCR vermittelt. Hierbei wurden besonders eigene Erfahrungen aus dem Referenzlabor mitgeteilt sowie Kit-Validierungen und neue Entwicklungen auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik vorgestellt. Insbesondere die Schnell-Extraktion und highspeed Real-Time PCR, aber auch die Vorstellung der digitalen PCR als besondere Anwendung der Real-Time PCR wurden besprochen. Den Abschluss des theoretischen Teils des Workshops bildete ein Vortrag zur Funktionsweise und Anwendungsmöglichkeiten von klassischer Sanger-Sequenzierung und des Next-Generation Sequencing. Die FG AVID dankt allen Kolleginnen und Kollegen des FLI, ohne deren Zuspruch und Einsatz diese Veranstaltung nicht möglich gewesen wäre. Hierbei seien insbesondere die technischen Kräfte der Nationalen Referenzlabore für Blauzungenkrankheit, klassische Schweinepest und Maul- und Klauenseuche genannt, die den praktischen Teil des Workshops intensiv geplant und begleitet haben. Die sehr positive Resonanz der Teilnehmer auf den Inhalt und die Durchführung des Workshops soll Grundlage für die Planung weiterer entsprechender Angebote sein. Die FG AVID und das Friedrich-Loeffler-Institut streben damit eine Optimierung der veterinärmedizinischen Infektionsdiagnostik an und bauen die vorhandenen engen Kontakte mit den staatlichen und privaten Untersuchungseinrichtungen durch Workshop-Angebote weiter aus. In den letzten 10 Jahren wurde, im Rahmen von zwei aufeinanderfolgenden EU-geförderten Forschungsprojekten, einer der erfolgversprechendsten Lebendimpfstoffkandidaten für die Impfung von Haus- und Wildschweinen, CP7_E2alf, unter maßgeblicher Beteiligung des FLI, konstruiert, getestet und zur Marktreife geführt. Bei der Entwicklung machte man sich die Möglichkeit zunutze, chimäre Pestiviren auf der Basis sogenannter infektiöser Klone herzustellen. Das Virus LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 24 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 25

14 Nationale Referenzlaboratorien am Friedrich-Loeffler-Institut Für die aufgeführten anzeigepflichtigen Tierseuchen wurden folgende Nationale Referenzlaboratorien benannt: Tierseuche Leiter Institut Telefon Affenpocken Dr. D. Hoffmann IVD, Insel Riems Afrikanische Pferdepest Dr. B. Hoffmann IVD, Insel Riems Afrikanische Schweinepest Dr. S. Blome IVD, Insel Riems Amerikanische Faulbrut Dr. M. Schäfer IMED, Insel Riems Ansteckende Blutarmut der Einhufer (Infektiöse Anämie der Einhufer) Dr. P. König IVD, Insel Riems Ansteckende Blutarmut der Lachse (Infektiöse Anämie der Lachse) Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems Aujeszkysche Krankheit Dr. T. Müller IMVZ, Insel Riems Befall mit Kleinem Bienenbeutenkäfer (Aethina tumida) Dr. M. Schäfer IMED, Insel Riems Befall mit Tropilaelaps-Milbe Dr. M. Schäfer IMED, Insel Riems Beschälseuche der Pferde Dr. I. Moser IMP, Jena Blauzungenkrankheit Dr. B. Hoffmann IVD, Insel Riems Bovine Herpes Virus Typ 1-Infektion (alle Formen) Prof. Dr. M. Beer IVD, Insel Riems Bovine Virus Diarrhoe Dr. H. Schirrmeier IVD, Insel Riems Brucellose der Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen Dr. F. Melzer IBIZ, Jena Ebola-Virus Infektionen Dr. M. Groschup INNT, Insel Riems Enzootische Leukose der Rinder Dipl.-Vet.-Med. G. Kotterba IMED, Insel Riems Epizootische Hämatopoetische Nekrose Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems Epizootische Hämorrhagie der Hirsche Dr. B. Hoffmann IVD, Insel Riems Geflügelpest (Aviäre Influenza) Prof. Dr. T. Harder IVD, Insel Riems Infektiöse Epididymitis Dr. F. Melzer IBIZ, Jena Infektiöse Hämatopoetische Nekrose der Salmoniden Dr. H. Schütze IMED, Insel Riems Infektion mit West-Nile-Virus bei einem Vogel oder Pferd Dr. U. Ziegler INNT, Insel Riems Koi Herpesvirus-Infektion der Karpfen Dr. S. Bergmann IMED, Insel Riems Lumpy-skin-Krankheit (Dermatitis nodularis) Dr. D. Hoffmann IVD, Insel Riems Lungenseuche der Rinder Dr. M. Heller IMP, Jena Maul- und Klauenseuche Dr. B. Haas IVD, Insel Riems Milzbrand Dr. M. Elschner IBIZ, Jena Muschelkrankheiten Dr. S. Bergmann IMED, Insel Riems Infektion mit Bonamia extiosa, Bonamia ostreae, Marteilia refringens, Microcytos mackini, Perkinsus marinus Newcastle-Krankheit PD Dr. C. Grund IVD, Insel Riems Niedrigpathogene aviäre Influenza bei einem Prof. Dr. T. Harder IVD, Insel Riems gehaltenen Vogel Pest der kleinen Wiederkäuer Dr. B. Hoffmann IVD, Insel Riems Pferdeenzephalomyelitis (alle Formen) Dr. M. Keller INNT, Insel Riems Pockenseuche der Schafe und Ziegen Dr. D. Hoffmann IVD, Insel Riems Rauschbrand Dr. C. Seyboldt IBIZ, Jena Rifttal-Fieber Dr. M. Eiden INNT, Insel Riems Rinderpest Dr. B. Hoffmann IVD, Insel Riems Rotz Dr. M. Elschner IBIZ, Jena Salmonellose der Rinder Dr. U. Methner IBIZ, Jena Schweinepest (klassische Schweinepest) Dr. S. Blome IVD, Insel Riems Stomatitis vesicularis Dr. B. Haas IVD, Insel Riems Taura-Syndrom (exotisch) Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems Tollwut Dr. T. Müller IMVZ, Insel Riems Transmissible Spongiforme Enzephalopathien PD Dr. A. Balkema- INNT, Insel Riems (alle Formen) Buschmann Trichomonadenseuche der Rinder Dr. K. Henning IBIZ, Jena Tuberkulose der Rinder (M. bovis, M. caprae) Dr. I. Moser IMP, Jena Vesikuläre Schweinekrankheit Dr. B. Haas IVD, Insel Riems Vibrionenseuche der Rinder Dr. H. Hotzel IBIZ, Jena (bovine genitale Campylobacteriose) Virale Hämorrhagische Septikämie der Salmoniden Dr. H. Schütze IMED, Insel Riems Weißpünktchenkrankheit der Krebstiere Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems Yellowhead Disease (exotisch) Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 26 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 27

15 Für die aufgeführten meldepflichtigen Tierkrankheiten wurden folgende Nationale Referenzlaboratorien benannt: Tierkrankheiten Leiter Institut Telefon Ansteckende Equine Metritis (Contagiöse Equine Metritis) Dr. F. Melzer IBIZ, Jena Campylobacteriose (thermophile Campylobacter) Dr. H. Hotzel IBIZ, Jena Chlamydiose Dr. C. Schnee IMP, Jena Echinokokkose Prof. Dr. F. Conraths IfE, Insel Riems Equine Virus-Arteritis-Infektion Dr. P. König IVD, Insel Riems Infektiöse Laryngotracheitis des Geflügels (ILT) Dr. W. Fuchs IMVZ, Insel Riems Maedi / Visna Dipl.-Vet.-Med. G. Kotterba IMED, Insel Riems guenter.kotterba@fli.bund.de Niedrigpathogene aviäre Influenza der Wildvögel Prof. Dr. T. Harder IVD, Insel Riems timm.harder@fli.bund.de Paratuberkulose Dr. H. Köhler IMP, Jena heike.koehler@fli.bund.de Q-Fieber Dr. K. Henning IBIZ, Jena klaus.henning@fli.bund.de Toxoplasmose Dr. G. Schares IfE, Insel Riems gereon.schares@fli.bund.de Tularämie PD Dr. H. Tomaso IBIZ, Jena herbert.tomaso@fli.bund.de Verotoxin bildende Escherichia coli Dr. L. Geue IMP, Jena lutz.geue@fli.bund.de Weitere Nationale Referenzlaboratorien am FLI: Tierkrankheit Leiter Institut Telefon Bunyavirale Erkrankungen (Hanta-Virus) PD Dr. R. Ulrich INNT, Insel Riems rainer.ulrich@fli.bund.de Caprine Arthritis und Enzephalitis Dipl.-Vet.-Med. G. Kotterba IMED, Insel Riems guenter.kotterba@fli.bund.de Japanische Enzephalitis Prof. Dr. M. Groschup INNT, Insel Riems martin.groschup@fli.bund.de Krebstierkrankheiten (Crustaceen): (weitere gelistete) Dr. U. Fischer IMED, Insel Riems uwe.fischer@fli.bund.de Krim-Kongo-Fieber Prof. Dr. M. Groschup INNT, Insel Riems martin.groschup@fli.bund.de Muschelkrankheiten (Bilvalvia): Perkinsus olseni, Xenohalitiotis californiensis, Abalone Virussterblichkeit Dr. S. Bergmann IMED, Insel Riems sven.bergmann@fli.bund.de NIPAH/Hendra Virusinfektion PD Dr. A. Balkema- Buschmann INNT, Insel Riems anne.buschmann@fli.bund.de Durch Zecken übertragene Krankheiten (ZÜK) Dr. C. Klaus IBIZ, Jena christine.klaus@fli.bund.de Änderungen sind gelb hinterlegt. Stand: Mai 2015, bearbeitet von Jens Schell LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 28 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 29

16 Erteilung einer Zulassung gemäß 23 der Tierimpfstoff-Verordnung ( bis ) Bezeichnung des Mittels Anti-Borrelia-ELISA Hund in den Handelsformen: 1. Anti-Borrelia-ELISA Hund (IgG) Kurzform: Anti-Borrelia Hund/ Dog IgG 2. Anti-Borrelia-ELISA Hund (IgM) Kurzform: Anti-Borrelia Hund/ Dog IgM Art der Anwendung Zul.-Nr. Datum der Zulassung Pharmazeutischer Unternehmer ELISA FLI-B EUROIMMUN D Lübeck cattletype BHV1 ge Ab ELISA FLI-B QIAGEN Leipzig GmbH D Leipzig Kylt MGS Triplex DNA Extraktionsund Real-Time PCR Detektionskit für Mycoplasma gallisepticum und Mycoplasma synoviae Kurzform: Kylt MGS Triplex Kylt Influenza A Real-Time RT-PCR Detektionskit zum Nachweis von Influenzavirus Typ A Kurzform: Kylt Influenza A Anaplasma-ELISA DOG Kurzform: Anaplasma-ELISA RealPCR BVDV RNA Test DNA-Extraktion und Real-Time PCR FLI-B AniCon Labor GmbH D Höltinghausen Real-Time RT- PCR FLI-B AniCon Labor GmbH D Höltinghausen ELISA FLI-B AFOSA GmbH D Blankenfelde-Mahlow Real-Time PCR System FLI-B IDEXX Europe B.V. NL-2132 LR Hoofddorp ADIAVET PARATB REAL TIME Real-Time PCR FLI-B biomérieux Deutschland GmbH D Nürtingen virotype ASFV PCR Kit Kurzform: virotype ASFV ID Screen IBR gb Competition Kurzform: IBRGBC LSI VetMAX Coxiella burnetii- Absolute Quantification Kurzform: LSI VetMAX Q Fever Real-Time PCR FLI-B QIAGEN Leipzig GmbH D Leipzig ELISA FLI-B ID VET SARL F Grabels Real-Time PCR FLI-C Life Technologies Lyon F Lissieu INgene q PPA q PCR FLI-B INGENASA ES Madrid bactotype MAP PCR Kit Kurzform: bactotype MAP Real-Time PCR FLI-B QIAGEN Leipzig GmbH D Leipzig Eradikit EIAV ELISA ELISA FLI-B In3diagnostic s.r.l. I Grugliasco (TO) Liebe Kolleginnen und Kollegen, wir können Ihnen im ersten LABLOEFFLER für 2015 wieder ein breites Themenspektrum aus der Arbeit des FLI vorstellen. Mit drei Beiträgen sind die Ringversuche diesmal stark vertreten. Außerdem informieren wir Sie über den aktuellen Stand zu alten und schon fast vergessenen Infektionskrankheiten wie Rotz und Besnoitiose. Ebenfalls beleuchtet werden die porcine epidemische Diarrhö, die im letzten Jahr besonders in den USA zu sehr hohen Verlusten in den Schweinebeständen führte, und RHDV-2, zu dem in der letzten Zeit vermehrt Anfragen hinsichtlich der Impfung von Kaninchen am FLI eingingen. Vorstellen möchten wir aber auch die Möglichkeiten des Next-Generation Sequencing für die Diagnostik. Diese Methode hat sich in den letzten Jahren enorm weiterentwickelt und wird in absehbarer Zeit zu weiteren Veränderungen in der Tierseuchendiagnostik führen. Wie gewohnt, finden Sie zudem die aktuellen Übersichten der Nationalen Referenzlaboratorien und der seit der letzten Ausgabe zugelassenen Diagnostika. Besonders hinweisen möchten wir auf die Ankündigung der 7. Riemser Diagnostiktage, und ich hoffe sehr, viele von Ihnen im November in Greifswald begrüßen zu dürfen. Wie immer bitten wir an dieser Stelle um Rückmeldungen zum LABLOEFFLER was fehlt, was können wir noch optimieren? Oder was gefällt Ihnen besonders? Zuerst einmal wünschen wir Ihnen aber viel Freude beim Lesen! Mit kollegialen Grüßen, Martin Beer und das Redaktionsteam Alle Informationen der Zulassungsstelle finden Sie auch auf der Internetseite des FLI unter in der Rubrik Service, Zulassungsstelle. Bei Fragen wenden Sie sich bitte an Dr. Jana Heidrich (jana.heidrich@fli.bund.de). LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 30 LABLOEFFLER , Heft 1 Seite 31

17 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie Institut für Infektionsmedizin Institut für Virusdiagnostik Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger Institut für Immunologie Institut für Epidemiologie Südufer 10 D Greifswald - Insel Riems Tel.: Institut für molekulare Pathogenese Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen Naumburger Straße 96 a D Jena Tel.: Institut für Tierernährung Bundesallee 50 D Braunschweig Tel.: Institut für Nutztiergenetik Höltystraße 10 D Neustadt Tel.: Institut für Tierschutz und Tierhaltung Dörnbergstraße D Celle Tel.: