Unser Forschungskonzept zur Identifikation von Schlüsselproteinen in der Herzinsuffizienz und der Arteriogenese im Patienten mittels Mikrodialyse
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- Lieselotte Kolbe
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1 Unser Forschungskonzept zur Identifikation von Schlüsselproteinen in der Herzinsuffizienz und der Arteriogenese im Patienten mittels Mikrodialyse Proteomicsgruppe Herzinsuffizienz und Arteriogenese, Bad Rothenfelde, in Zusammenarbeit mit dem Max-Planck Institut für Herz und Lungenforschung in Bad Nauheim
2 Inhalt I. Einführung II. Die Proteom Arbeitsstation III. Projekt: Herzinsuffizienz und Herzmuskelzellwachstum IV. Projekt: Arteriogenese im infarktgefährdeten Herzmuskel V. Monitoring der Arteriogenese mit der Mikrodialyse VI. Über uns: Mitarbeiter und Kooperateure 2
3 II. Die Proteom Arbeitsstation 2.1 Die Proteom Arbeitsstation- Der generelle Aufbau 2.2 Die Proteom Arbeitsstation- das Herzstück-die Western Blot Einheit 3
4 2.1 Die Proteom Arbeitsstation- Der generelle Aufbau Multiplex systems Sample: tissue/cells (confocal) microscopy sample preparation SDS page separation Western Blot IEF separation SDS page separation in-gel protein stain mass spectrometry digital imaging image analysis search databases for protein matches amino acid sequencing search databases for protein matches identification of disease related proteins Diese Abbildung zeigt den generellen Aufbau unserer Proteom Arbeitsstation. Bestehend aus den 4 Kernstationen, Multiplex System, konfokale Mikroskopie, Western Blot und Massenspektrometrie. Während die ersten drei Systeme auf die Nutzung von Antikörpern angewiesen sind, können mit der Massenspektrometrie unbekannte Proteine identifiziert werden. Jede dieser vier Stationen bietet herausragende Untersuchungsmöglichkeiten. 4
5 2.2 Die Proteom Arbeitsstation- das Herzstück-die Western Blot Einheit 1. Beladen des Gels 2. Trennung der 3. Transfer der Proteine Proteine nach Größe aus dem Gel auf die Membran Proben 4. Färbung der Membran kda Inkubation mit spezifischen Antikörpern 6. Sichtbarmachung des Lichts mit dem Film oder der Kamera Diese Abbildung zeigt das Herzstück unserer Arbeitsstation. Während ursprünglich der Western Blot den Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran beschrieb (3), so versteht man heute den Western Blot erweitert. Dieser beinhaltet die Trennung der Proteine im Gel nach der Grösse (1,2), den Transfer der Proteine auf eine Membran (3,4), die Inkubation dieser Membran mit Antikörpern (5) und die Sichtbarmachung des Analysanden durch die Emission von Licht durch den Zweitantikörper mittels Film oder Kamera. Diese Technik ist wie ein Schachspiel, von den Grundprinzipien einfach, aber für den Profi eine sehr komplexe Methode mit unglaublich grossem Analysepotential. 5
6 III. Projekt: Herzinsuffizienz und Herzmuskelzellwachstum 3.1 Was ist Herzinsuffizienz 3.2 Das Herzmuskelzellwachstum während der postnatalen Entwicklung 3.3 Die Prinzipien des Herzmuskelzellwachstums (physiologisch und pathologisch) 3.4 Erwartungen unserer Forschung 6
7 3.1 Was ist Herzinsuffizienz Als Herzinsuffizienz bezeichnet man die Unfähigkeit des Herzens, die vom Körper benötigte Pumpleistung zu erbringen (eingeschränkte Herzfunktion). Der Begriff Herzinsuffizienz bezeichnet ein Syndrom, das als Folge unterschiedlicher Grunderkrankungen auftritt. Die durchschnittliche Erkrankungshäufigkeit liegt bei 0,5-1% in der Bevölkerung, wobei es im Alter zu einem überproportionalen Anstieg bei beiden Geschlechtern kommt (25-30 Fälle pro 1000 Einwohner bei über 80 Jahre). Bedingt durch den demographischen Wandel der Gesellschaft von Industrienationen ergeben sich hieraus erheblich ökonomische Konsequenzen. Trotz erheblicher therapeutischer Fortschritte während der letzten 15 Jahre liegt die 5-Jahres-Sterblichkeitkeit von Patienten mit symptomatischer Herzinsuffizient bei ca %. Bei fortgeschrittener Herzinsuffizienz liegt die 1-Jahressterblichkeit heutzutage bei ca. 20%. Damit stellt die Herzinsuffizienz eines der bedeutendsten Probleme der kardiovaskulären Medizin sowie der Gesundheitsökonomie dar. Die Prognose der Herzinsuffizienz ist somit mit der von malignen Erkrankungen vergleichbar. In den letzten Jahren hat sich das Verständnis der Herzinsuffizienz verändert, nämlich von einem vereinfachten Modell des kardialen Pumpversagens hin zu einer Multisystemerkrankung. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Immunsystem für das Fortschreiten der Herzinsuffizienz von wesentlicher Bedeutung sein könnte. Dieses System setzt sich aus verschiedenen Komponenten zusammen, die komplex interagieren. Hierbei spielen entzündungsvermittelnde Substanzen wie Zytokine (z.b. TNF-α, Il-1, L-6, Il-10), deren Rezeptoren, und andere Moleküle (z.b. Endotoxin, Adhäsionsmoleküle, Stickstoffmonoxid) eine wichtige Rolle. 7
8 3.2a Das Herzmuskelzellwachstum während der postnatalen Entwicklung A B Diese Abbildung zeigt frisch isolierte Herzmuskelzellen aus einem Tag (A) und drei Monate alten Rattenherzen (B) in der Zellkultur. Man sieht die Grössenzunahme und die deutliche Querstreifung bei den ausgewachsenen Herzmuskelzellen (A vs B). Da diese Zellen frisch isoliert sind, dürfte keine wesentliche morphologische Änderung durch die Isolation stattgefunden haben. 8
9 3.2b Das Herzmuskelzellwachstum während der postnatalen Entwicklung ph3 ph10 ph3 ph10 A B Diese Abbildung zeigt silbergefärbte 2D-Gele von einem Tag (A) und drei Monate alten Rattenherzen (B). Aufgetragen wurden 60µg Proteine aus dem Zytoplasma. Jeder Spot entspricht mindestens einem Protein. Man sieht deutlich mehr Spots in A, dafür erscheinen aber viele Spots in B intensiver. Das bedeutet nicht, dass im Herzen einer frisch geborenen Ratte mehr Proteinsorten als im erwachsenen Herzen vorliegen, sondern dass einige Proteine, die die Funktion des ausgewachsenen Herzens ausmachen, an Masse zugenommen haben und dadurch im Gel die in geringerer Konzentration vorhandene Proteine zu verdrängen scheinen. 9
10 3.3a Die Prinzipien des Herzmuskelzellwachstums (pathologisch und physiologisch) hypertrophe Herzmuskelzelle Stress: Verstärkte Arbeitslast, Infektionen, Drogen, Medikamente etc Wachstumsfaktor normale Herzmuskelzelle Herzinsuffizienz chronische Exposition von Wachstumsfaktoren und/oder Zytokinen funktionelle Adaptation Zytokin fötale Reprogramierung der Herzmuskelzelle Diese Abbildung fasst unsere Erfahrung mit kultivierten erwachsenen Herzmuskelzellen zusammen. Sie zeigt zwei prinzipiell verschiedene Anpassungsreaktionen der Herzmuskelzelle auf Stress. Generell findet unter Wachstumsfaktorstimulation eher Hypertrophie (wie z.b. Insulin-like Growth Factor) statt, während Zytokine eher zur fötalen Reprogrammierung beitragen. Im Tier bzw Menschen sind während pathologischer Prozesse wahrscheinlich beide Signalketten beteiligt, die aber je nach Tiermodell oder Herzkrankheit unterschiedlich stark beteiligt sein dürften. 10
11 3.3b Die Prinzipien des Herzmuskelzellwachstums Wachstumsfaktor Zytokin B Hypertrophie Normale frisch isolierte Zellen Remodellierte Zellen A C Wachstumsfaktor Zytokin B` A C Diese Abbildung zeigt das Wachstum von frisch isolierten Herzmuskelzellen aus einem Tag (A,B,C) und drei Monate alten Ratten (A`, B, C ) in der Zellkultur. Man sieht deutlich hypertrophes Wachstum durch Massenzunahme und eine gewebeähnliche Formation (B, B`). Diese Zellen bauen neue Sarkomeren auf. Wenn man diese Zellkulturen mit bestimmten Zytokinen behandelt, zeigen sie ausgeprägtes Längenwachstum und verlieren ihre muskelähnlichen Eigenschaften. Ein Vorgang, der mit dem Term fötale Reprogrammierung beschrieben wird und oft mit einer Kardiomyopathie einhergeht. 11
12 3.3c Die Prinzipien des Herzmuskelzellwachstums Gesund Gesund Krank Krank Kontrolle Zytokin myosin (320 kda) Cardiac myosin (200kDa) A B C Herzmuskelgewebe Zellkultur Western Blot MALDI-TOF Diese Abbildung zeigt ein Beispiel der fötalen Reprogrammierung. Man sieht im gesunden Herzen die Hauptbanden des Myosins bei 200 kda im Western Blot (A). Im kranken Herzen taucht eine zusätzliche (Doppel) Bande bei 320kDa auf, die im gesunden Herzen nicht vorhanden ist (A). In kultivierten Herzmuskelzellen wurde diese Bande durch ein Zytokin induziert (B), welches die fötale Reprogrammierung in Herzmuskelzellen induziert, wie die klassischen Marker der fötalen Reprogrammierung, das atriale natriuretische Peptid und das glatte Muskelaktin, welche auch in diesen Proben nachweissbar waren. Um aber letztendlich zu klären, ob es sich wirklich um eine Isoform des Myosins, welches im gesunden Herzen nicht vorkommt, handelt, wurde noch eine massenspektrometrische Analyse durchgeführt (C). 12
13 3.3d Die Prinzipien des Herzmuskelzellwachstums A B Diese Abbildung zeigt den Unterschied in der Wirkung eines Wachstumsfaktors (A) und eines Zytokins (B) auf Herzmuskelzellen in der Zellkultur. Mit dem konfokalen Mikroskop kann man deutlich die Sarkomeren (A, grün) in wachstumsfaktorstimulierten Zellen erkennen, während nach Zugabe von Zytokinen die fötale Reprogrammierung durch Anhäufung von glattem Muskelaktin stattfindet (rot, B). Man sieht auch an der geringen Grünfärbung den Verlust von Muskelmasse (B). Anmerkung: Herzmuskelzellen der ausgewachsenen Ratte haben zwei Kerne (blau). 13
14 3.4 Erwartungen unserer Forschung Unser Ziel ist es, eine Analyse mit Hilfe der zuvor beschriebenen Arbeitsstation von stimulierten Herzmuskelzellen (Zellkultur/Tierexperiment) durchzuführen, um Schlüsselproteine zu finden, denen bei der Entstehung von Herzmuskelerkrankungen eine bedeutende Rolle zukommt. Gefundene Faktoren sollen weiterhin in klinischen Studien mit denen von Patienten korreliert werden, um Parameter zu finden, die prognostische Aussagen oder den Erfolg einer Therapie geben zu können. Des weiteren sollen die Aktivitäten dieser Schlüsselproteine verstärkt oder gehemmt werden, je nach kausalem Zusammenhang. 14
15 IV. Projekt: Arteriogenese im infarktgefährdeten Herzmuskel 4.1 Die Problematik der koronaren Herzkrankheit 4.2 Kompensation des Koronararterienverschlusses durch Arteriogenese 4.3 Das Prinzip der Arteriogenese: Kollaterale wachsen zu Arterien 4.4 Die glatten Muskelzellen sind die Grundlage der Arteriogenese 15
16 4.1 Die Problematik der koronaren Herzkrankheit Die koronare Herzerkrankung ist in den westlichen Industrieländern beim Menschen weit verbreitet. Sie manifestiert sich in einer Mangeldurchblutung (Ischämie) des Herzmuskels mit den Krankheitsbildern einer Angina pectoris, eines Herzinfarktes oder einer Herzschwäche (Herzinsuffizienz). Der akute Herzinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen. Er ist definiert als eine schlagartig auftretende, länger andauernde Unterbrechung des herzeigenen Gefäßsystems (Koronarien). Hierdurch kann das Herzgewebe nicht mehr in ausreichendem Maße versorgt werden und geht, abhängig von der Dauer des Gefäßverschlusses, zugrunde. Wenn eine reversible Ischämie nicht rechtzeitig behoben wird, folgen Schäden an den Herzmuskelzellen, die im Verlauf der weiteren Ischämie zunehmen und zum Zelltod führen. Der point-of-no-return beschreibt den Punkt, an dem eine Regeneration der Zellen unmöglich wird. Dies bedeutet, daß eine irreversible Schädigung eintritt, die auch nicht durch Aufhebung der Ischämie zu beheben ist. Wenn der point-of-no-return einmal erreicht ist, schreitet die Zerstörung des Gewebes unaufhörlich voran und aktiviert zusätzlich verschiedene, vielschichtige Abläufe von Entzündungsreaktionen. In den meisten Fällen handelt es sich bei einem Herzinfarkt um eine sich langsam entwickelnde Erkrankung. Häufig gehen atherosklerotische Erkrankungen der Herzkranzgefäße einem Infarkt voraus. Daher betrifft der Gefäßverschluss nicht nur einzelne, sondern meistens mehrere Gefäße, deren Verengung langsam fortschreitet. 16
17 4.2 Kompensation des Koronararterienverschlusses durch Arteriogenese Die meisten Patienten sind bei einem Arterienverschluss auf medizinische Hilfe angewiesen. Es gibt aber auch Patienten, die trotz Koronararterienverschluss keinen Herzinfarkt bekommen. Der Grund liegt in der Überbrückung diese Verschlusses, der Stenose, durch die Bildung von natürlichen Bypässen. Dieser Prozess, der neuerdings Arteriogenese genannt wird, ist das Wachstum kleinerer mit glatten Muskelzellen ausgekleideten Gefäßen, den so genannten Kollateralen. Daher sind die Mechanismen, die zur Kompensation des Koronararterienverschlusses durch Arteriogenese führen, unser Forschungsschwerpunkt. 17
18 4.3a. Das Prinzip der Arteriogenese: Kollaterale wachsen zu Arterien A B C Abbildung A zeigt, dass beim Verschluss eines grösseren Gefässess (Stenose) das Blut über Kollateralgefässe fliessen muss, um die unterversorgten Muskelbereiche zu erreichen. Dieses führt zu einer erhöhten Schubspannung im Gefäß, zur Adhäsion und Invasion von Monozyten und letztendlich zur Freisetzung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren wie in Abbildung B dargestellt. Die Zellteilung vaskulärer Zellen (hauptsächlich den glatten Muskelzellen) und die Zunahme an extrazellulärer Matrix (Kollagen, Elastin etc) führt zu vergrösserten korkenzieherähnlichen Gefässen. Ein Prozess, den man Arteriogenese nennt. Sie gewährleistet die für das Überleben notwendige Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen. 18
19 4.3b Das Prinzip der Arteriogenese: Kollaterale wachsen zu Arterien A B Diese Abbildungen zeigen den Verschluss der Arteria Femoralis im Tier im Angiogram. Der weisse Doppelbalken gibt den Ort des Verschlusses an und die weissen Linien den Umgehungskreislauf durch Arteriogenese. Es sind eine ganze Reihe Korkenzieherähnliche Kollateralen zu erkennen. Exemplarische korkenzieherähnliche Strukturen sind mit weissen Pfeilen bzw Linien markiert. Diese Struktur ist typisch für wachsende Kollateralgefäße (A). Das gleiche Angiogram ohne Markierung ist noch einmal in (B) dargestellt. 19
20 4.4 Die glatten Muskelzellen sind die Grundlage der Arteriogenese A B Abbildung A zeigt glatte Muskelzellen im Lichtmikroskop, die zu hoher Dichte gewachsen sind und mehrere Zellschichten bilden. Mit dem konfokalen Mikroskop kann man gut die dreidimensionale Struktur übereinanderliegender Muskelzellen erkennen (Abbildung B; grün = glattes Muskelaktin; Blau = Zellkerne). Da glatte Muskelzellen den Hauptzelltyp der Arterien bilden und ihre Kontraktilität zur Funktion der Arterien beiträgt, bilden sie auch die Grundlage der Arteriogenese. 20
21 V. Projekt: Monitoring der Arteriogenese mit der Mikrodialyse 5.1 Arteriogenese-Monitoring mittels Mikrodialyse 5.2 Prinzip der Mikrodialyse 5.3 Proteinzusammensetzung des myokardialen, interstitiellen Mikrodialysats 5.5 Protein W ist ein potenter Hemmstoff der Arteriogenese 5.6 Unser Ziel ist die therapeutische Arteriogenese 21
22 5.1 Arteriogenese-Monitoring mittels Mikrodialyse Ein Ansatz zur direkten Gewebe-Analytik von aktiven Parametern während der Arteriogenese bietet die gewebespezifische Mikrodialyse. Die Mikrodialyse ist eine Technik zur kontinuierlichen Probenahme aus verschiedenen Zielgeweben mit dem Ziel der Messung von Stoffwechselparametern. Seit mehreren Jahren findet sie bereits in der präklinischen Forschung im Tierversuch Anwendung. Seit 1996 wird sie auch zur Darstellung des zellulären Stoffwechsels von Humangewebe in der Klinik eingesetzt. Beispielsweise wird routinemäßig der Leberstoffwechsel nach Lebertransplantationen überwacht, um Abstoßungsreaktionen unmittelbar darstellen zu können. Weiterhin wird die Mikrodialyse häufig im zerebralen Monitoring eingesetzt, wenn traumatische Gehirnverletzungen oder Hirnblutungen vorliegen und der Hirnstoffwechsel zur Beurteilung der Durchblutung gemessen werden muss. Wir konnten bereits zeigen, dass die Mikrodialyse-Technik für die frühzeitige Detektion von Sauerstoffmangelzuständen nach herzoperativen Eingriffen sehr geeignet ist. 22
23 5.2a Prinzip der Mikrodialyse Das Prinzip der Mikrodialyse ist die Diffusion von Proteinen und anderen Bestandteilen des Interstitiums über eine semipermeable Membran in ein Trägermedium. Es werden ausschließlich gelöste Moleküle aufgenommen, wodurch es nicht zum Verlust von Gewebsflüssigkeit kommt. Der Mikrodialyse-Katheter liegt zunächst umhüllt von einer Kanüle vor, die das Platzieren des Katheters in die äußere Wand des linken Ventrikels ermöglicht und anschließend wieder entfernt werden kann. Von innen wird der doppellumige Katheter mit einer physiologischen Lösung, zumeist Laktat-freie Ringer-Lösung, gespült. Die Lösung tritt am Ende in den äußeren Bereich des Katheters ein. Da die Ringer-Lösung die diffundierten Moleküle nicht entgegen dem Konzentrationsgradienten binden kann, wird der Ringer-Lösung Dextran zugegeben. Dextran ist ein Polysaccharid aus Glukose-Monomeren, welches unter anderem als Plasmaexpander eingesetzt wird, da es in einer 6%igen Lösung einen dem Blut entsprechenden kolloidosmotischen Druck sowie dessen Viskosität aufweist. Eine Mikrodialysepumpe sorgt für einen kontinuierlichen Fluss und ermöglicht so eine stetige Probennahme. Das Dialysat wird in Mikrovials gesammelt. 23
24 5.2b Prinzip der Mikrodialyse Semipermeable Membran Dialysepumpe Mikrodialysat Vial-Halter Microvial 24
25 5.3 Proteinzusammensetzung des myokardialen, interstitiellen Mikrodialysats Mikrodialysat aus dem Herzmuskel eines bypassoperierten Patienten (a) intraoperativ; b) 6h postoperativ; c) 12h postoperativ; d) 18h postoperativ; e) 24h postoperativ. Im Vergleich zum Serum und zur Perikardflüssigkeit konnten ähnliche Muster beobachtet werden. Das klassische Muster, welches durch die Auftrennung von Proteinen aus dem Herzen entsteht, ist auf allen Gelen erkennbar. Außerdem finden sich in allen Proben Immunglobuline. Die Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des Herzmuskels liefern Erkenntnisse über die frühen Regenrationsprozesse der minderdurchbluteten Muskelbereiche unmittelbar nach der koronaren Bypassanlage. 25
26 5.4 Identifikation von Schlüsselproteinen aus dem Mikrodialysat Wir konnten aus dem Mikrodialysat von bypassoperierten Patienten das Protein W identifizieren, welches sich bei Mausexperimenten als ein Hemmstoff in der Arteriogenese zeigte. Die Proteomanalyse basierte im Wesentlichen auf den klassischen Techniken der zweidimensionalen Gelelektrophorese zur Auftrennung der Proteinproben und der anschließenden Identifizierung der einzelnen Proteine mit Hilfe von Massenspektrometrie und Datenbankvergleich. Die Proteine des Mikrodialysats wurden zunächst in der isoelektrischen Fokussierung nach ihrem isoelektrischen Punkt, in der 2. Dimension nach ihrem Molekulargewicht in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Proteinfärbung sichtbar gemacht, sodass ein charakteristisches Proteinmuster einer Probe entsteht. Mit Hilfe des MALDI-TOFs konnte das Protein W detektiert werden, welches sich im anschließenden Mausexperiment als potenter Inhibitor der Arteriogenese zeigte. 26
27 5.5 Protein W ist ein potenter Hemmstoff der Arteriogenese Kontrollbehandlung A B C Maus vor der Ligatur der Arteria Femoralis Maus direkt nach der Ligatur der Arteria Femoralis Maus 14 Tage nach der Ligatur der Arteria Femoralis Behandlung mit Protein W D E F Hier wird die Durchblutung des Mäusehinterbeines mittels Laserdoppler gezeigt. Man sieht deutlich die gut durchbluteten Hinterbeine (weiss/rot; A,D) im unbehandelten Tier. Durch Abklemmen (Ligatur) der Arteria Femoralis wird die Durchblutung gestoppt (dunkelblau; B,E). Die einsetzende Arteriogenese sorgt für die Wiederherstellung der Durchblutung (C) nach 14 Tagen. Das von uns in glatten Muskelzellen identifizierte Protein W verhindert die Arteriogenese (F) und ist damit der erste definierte Inhibitor der Arteriogenese. 27
28 5.6 Unser Ziel ist die therapeutische Arteriogenese Im Kontrast zur Angiogenese, welches das Wachstum von kleinen Kapillaren durch Proliferation und Intussuszeption von Endothelzellen beschreibt, wird die Arteriogenese von den glatten Muskelzellen dominiert. Es ist bekannt, dass kleine Gefässe aufgrund des Poiseuilleschen Gesetzes Arterien nicht ersetzen können. Daher ist das Ziel unserer Forschung die Arteriogenese therapeutisch zu fördern. Das kann geschehen durch die Gabe von stimulierenden Substanzen, aber auch durch die Blockade von hemmenden Proteinen, wie dem Protein W, das in glatten Muskelzellen gebildet wird. Ein wesentlicher Schritt liegt daher in unserer Forschung in der Identifikation dieser Proteine in Mikrodialysefiltraten mittels unserer Proteom Arbeitsstation. 28
29 VI. Über uns: Mitarbeiter und Kooperateure Projektleiter: Prof. Dr. med. H. Warnecke Wissenschaftliche Mitarbeiter: Dr. med. N. Hübner Dr. med. J. Pöling Dr. med. W. Rees Dr. med. Sylvia Schimanski Doktoranden: Sylvia Jeratsch Zaber Khochfar Kontakt: Kooperateure (Max-Planck-Institut): Wissenschaftliche Mitarbeiter: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. T. Braun Dr. rer. nat. T. Kubin Doktoranden: Praveen Gajawada Holger Lörchner Jaeyoung Shin Technische Assistenten: Kerstin Richter Jutta Wetzel 29
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