Konformationseditoren

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1 Gliederung 1) Konformationseditoren a. Protein-Faltung in vivo und in vitro b. Klasse 1 Chaperone: Hasp60/Hsp10 c. Klasse 2 Chaperone: Hsp70/Hsp40 d. Klasse 3 Chaperone: Hsp90 e. Klasse 4 Chaperone: Hsp20 f. Hsp100 Familie (Clp Chaperone) g. Weitere Faltungssysteme (TF, Präfoldin, ) h. Faltungsenzyme (PDI, PPI) i. Zusammenarbeit der Chaperone 2) Degradationsmaschinerien a. Das Ubiquitin-System b. Das ssra-tagging System c. Der N-end rule Pathway d. Das Proteasom e. ClpAP, ClpXP, HsIUV Proteasen und Adaptoren f. FtsH, m-aaa und i-aaa g. Degradation von Peptiden h. Protein-Kinesis und globale Protein-Stabilität 3) Lysosomale Degradation und Autophagie a. Bedeutung und Arten der Autophagie b. CMA und Mikroautophagie c. Die Makroautophagie d. Regulation der Autophagie e. Atg8 und homologe Proteine (LC3, GABARAP) f. Autophagosomales Targeting: Proteinaggregate und Organellen g. Atg19 und der Cvt-Pathway h. Atg4 und die Atg8-Konjugation 4) ERQC und ERAD a. ER-abhängige Degradation b. UPR c. Calnexin-Zyklus

2 Konformationseditoren Protein-Faltung in vivo und Molekulare Chaperone Faltung in vitro und in vivo In vitro: Anfinsen Experiment Faltung von Ribonuklease S (124 AS). Im Experiment wurde mittels Mercaptoethanol die vier nativen Disulfidbrücken reduziert und anschließend Harnstoff (8 M) hinzugegeben, um das Protein weiter zu denaturieren. Anschließend wurde Harnstoff entfernt (Reorientierung des Peptids in Richtung nativ) und die Disulfidbrücken wieder oxidiert, wonach 90% aktives Protein erhalten wird. Zur Kontrolle wurde die Oxidation vor der Renaturierung durchgeführt, wodurch sich zufällige Disulfidpaare und ein inaktives Protein ergaben. - Faltungsexperimente in vitro finden in unendlicher Verdünnung statt, außerdem hat man unendlich viel Zeit für die Faltung. Es existieren ca. 10 kleine Modellproteine, die in der Biochemie studiert werden. Sie sind meist klein, weshalb ein Testen der Faltung in vitro möglich ist. In vitro ist das System im Gleichgewicht. Faltung In vivo - In vivo erfolgt die Proteinsynthese innerhalb von 10 bis 60 Sekunden, wonach ein sofort gefaltetes, funktionsfähiges Protein resultiert. Die Faltung ist hier sehr viel komplexer, da makromolekulare Assemblierungen auftreten, verschiedene Organellen und ph-werte benötigt werden. In der Zelle herrscht keine unendliche Verdünnung (Protein-Konzentration: mg/ml, hoch viskos). GFP/Luciferase als Reporterprotein für Faltung (bei korrekter Faltung, Fluoreszenz) - In einer Zelle herrscht immer ein schwer zu beschreibendes thermodynamisches NICHT- Gleichgewicht, da Proteine gebildet, modifiziert und zerstört werden. Biologische Systeme sind metastabil.

3 - Je schneller ein Prozess stattfindet, desto fehlerhafter (unspezifischer, unakurater) ist er! Dennoch wird in vivo eine schnelle und akurate Expression genetischer Information benötigt, die sofort funktionsfähig, also gefaltet, vorliegen soll. Zwei wesentliche Unterschiede bei der in vivo Faltung: (1) N-terminale Seite wird vor C-terimale Seite synthetisiert. Während der Translation ist damit die zur Faltung verfügbare Sequenz unvollständig. Transiente und unreife Faltungen müssen daher verhindert werden, bis mindestens eine vollständige Domäne am Ende des Tunnels angekommen ist. (2) Wegen hoher Konzentration an Proteinen (300 mg/ml in E.coli) und anderer Moleküle ist das Zytosol ein ungünstiger Ort zur Faltung. Unspezifische Wechselwirkungen mit naszierender Polypeptidkette wahrscheinlich, wodurch Aggregation und frühzeitige Degradation gefördert werden. Die kleinsten Faltungsdomänen haben mehrere Motive (z.b. faltblatt-helix-faltblatt). Eine Domäne hat statistisch ca. 100 bis 150 AS. Der Rekord der kleinsten Faltungsdomäne liegt bei 13 AS. Was sind Chaperone? - Molekulare Chaperone sind nach heutiger Definition Proteine, die an instabilen Konformationen anderer Proteine binden und diese stabilisieren, ohne selbst dabei Bestandteil der letztendlich biologisch funktionellen Struktur zu sein. Chaperone erkennen exponierte, hydrophobe Abschnitte in entstehenden oder fehlgefalteten Polypeptiden, die im nativen Zustand verborgen sind. Chaperone verhindern indirekt Aggregatbildung, indem sie hydrophobe Oberflächen binden. - Bindung und Freisetzung von Polypeptidsubstraten durch Chaperone wird oft durch eine ATP-vermittelte Konformationsänderung erreicht, wobei auch mehrere Interaktions-Runden zwischen Substrat und Chaperon stattfinden können. - Chaperone sind keine Katalysatoren (Chaperone steigern typischerweise den Ertrag aber nicht die Geschwindigkeit einer Faltungsreaktion). Dies ist ein Unterschied zu Faltungs- Katalysatoren wie Peptidylprolyl-Isomerasen oder Proteindisulfid-Isomerasen, welche die für eine Faltung notwendigen Isomerisierungsreaktionen katalysieren. Faltungshelfer werden demnach in Faltungskatalysatoren und molekulare Chaperone klassifiziert. - Molekulare Chaperone ermöglichen, dass das Protein schneller wieder aus Zwischenfaltungen heraus kommt (sowohl aus falschen, als auch aus richtigen). Dadurch werden Faltungs-Einbahnstraßen verhindert, die oft zur Proteolyse führen, und damit die Ausbeute an nativem Protein erhöht. - Chaperone sind ubiquitär verbreitet. Viele von ihnen wurden zunächst als Stressproteine klassifiziert, obwohl sie auch unter normalen Bedingungen essentielle Funktionen besitzen. Neben ihrer Funktion bei der de novo Proteinfaltung sind Chaperone auch in verschiedene andere zelluläre Prozesse, wie Protein-Targeting, Degradation und Signaltransduktion involviert (können Proteine auch im ungefalteten Zustand halten und stabilisieren, um später eine Komplexbildung, Sezernierung oder Transport zu ermöglichen). - Trotz der hochentwickelten Chaperon-Mechanismen der Zelle gibt es spezielle Fälle, in denen mutierte Proteine mit abweichender Stabilität oder Faltung, fehlgefaltet in der Zelle

4 verbleiben. Dies ist Ursache für einige Krankheiten (z.b. Creutzfeld-Jakob, Alzheimer- oder Huntington-Krankheit). Klassifikation der Chaperone Definition von Hitzeschockprotein: Expression unter Hitzestress, Erkennung hydrophober Oberflächen (diese sind nativ im Proteininneren gelegen). Man unterscheidet hauptsächlich 4 Familien: (1) Hsp60/Hsp10 (z.b. GroEL/GroES) und TF55/CCT: erkennen globuläre, hydrophobe Regionen; Chaperonin mit Untereinheiten in Ringformanordnung; Einschließung von Proteinen in Kavität (verhindert Aggregatbildung). Erkennen eine Vielzahl nicht-nativer globulärer Konformationen. (2) Hsp70 (z.b. DnaK in Eukaryonten): erkennen extendierte, hydrophobe Regionen in extendierten Polypeptid-Ketten (z.b. von solchen, welche Membranen passieren). Sie halten diesen Zustand aufrecht, um das Protein für die weitere Biogenese vorzubereiten. (3) Hsp90 (nur höhere Eukaryonten): große, multimere Komplexe, an hormonelle Signaltransduktion beteiligt (Überbleibsel der Evolution). Nukleäre und cytosolische Hormon-Rezeptoren haben Faltungsprobleme, wenn sie keine Liganden gebunden haben. Daher mit Hsp90 dekoriert, das den ungefalteten Zustand stabilisiert. Wenn der Ligand bindet (z.b. Steroidhormon), dissoziiert Hsp90 ab. Es erfolgt die Translokation in den Kern und die Aktivierung der Expression von u.a. Hormon-Rezeptoren. (4) Hsp20: es handelt sich um kleine, globuläre Kollektiv-Schwämme. Eine Vielfalt an Proteinen bindet an ihre Oberfläche, häufig durch Hitzeschock induzierte Expression und kein ATP- Verbrauch. Freigabe der Proteine, wenn Hitzeschock vorbei (Temperatur wieder gesunken). Die Faltung kann dann mithilfe anderer Chaperone erfolgen. Nur die Hsp70- und die Chaperonin-Systeme sind in der Lage die Faltung von Proteinen zu unterstützen und nicht nur eine Aggregation zu verhindern, wobei sie in manchen Fällen auch zusammenarbeiten. Alle anderen Chaperonfamilien binden an teilweise ungefaltete Proteine und verhindern ihre Aggregation, aber benötigen die Unterstützung von Hsp70-Chaperonen oder Chaperoninen, um die Faltung zu vermitteln. Andere Chaperone, wie Hsp90, sind dem Hsp70-System nachgeschaltet und erfüllen spezialisierte Funktionen. Klasse 1: Hsp60/Hsp10 (Chaperonine) Einteilung in zwei Klassen

5 Es handelt sich um ATP-abhängige Foldasen, die sich nochmals in zwei Klassen einteilen lassen: Zur Klasse 1 gehört das bakterielle System aus GroEL und GroES (System aus Hsp60 und Hsp10). Es ist in Bakterien und Organellen endosymbiotischen Ursprungs (Chloroplasten, Mitochondrien) zu finden. Die Klasse 2 Chaperonine bestehen nur aus einer einzelnen Polypeptidkette (Die GroES-Funktion ist in dieser als helikaler Überstand eingebaut: Built-in lid ) und bilden octa- oder nonamere Ringe. Sie kommen im eukaryotischen Zytosol und in Archeen vor und sind weniger gut charakterisiert. Ein wichtiges Co-Chaperon für Klasse2-Chaperonine sind die Präfoldine (GimC, siehe unten). Die allgemeine Chaperonin-Struktur besteht aus zwei übereinanderliegeneden Ringen, die ein Fass bilden und jeweils aus 7, 8 oder 9 ca. 60-kDa schweren Untereinheiten (Gesamtmasse: kda), abhängig vom Organismus, bestehen. Die Endung in in Chaperonin deutet einen Komplex aus mehreren Proteinen an. Es handelt sich um ein nano-kompartiment (eigenes subzelluläres Kompartiment). Struktur des GroEL-GroES-Systems Bei GroEL (Hsp60, 547 AS) handelt es sich um zwei sieben-gliedrige Ringsysteme mit 56kDa- Untereinheiten (homotetradecamer), die eine zylindrische Struktur mit zwei zentralen Höhlungen formen. Die Faltungskavität kann Proteine einer Größe von bis zu kda aufnehmen (Eingangspore: 4,5 nm breit). GroEL (547AS) misst ohne das Co-Chaperon GroES eine Höhe von 142Å und eine Breite von 140Å. Es erfolgt eine Ausdehnung der oberen GroEL Hälfte (cis-ring genannt), wenn GroES andockt, sodass der GroEL Komplex nun 151Å hoch ist. Der GroEL Ring, an dem GroES nicht angedockt ist, wird als trans-ring bezeichnet. GroES (Hsp10) ist ein Kern-β-barrel mit zwei β-hairpin-loops, das sich ebenfalls über ihre 10kDa- Einheiten zu einem heptameren Ring zusammenlagert. GroES bindet über einen der Loops an das Ende des GroEL Zylinders in der Anwesenheit von Nukleotid, was die Größe der GroEL-Kavität fast verdoppelt (Loops in Lösung dynamisch, in Bindung strukturiert). GroES misst 7-8 nm im Durchmesser und ist ca. 3 nm hoch.

6 Die zwei Kavitäten sind durch eine Wand (äquatoriale Domäne) getrennt und kommunizieren über allosterische Konformationsänderungen. Jede der beiden GroEL-Ringsysteme hat 3 Domänen. Die apikale Domäne (oben bzw. unten, richtet sich auf, wenn GroES andockt) besteht aus einer orthogonalen β-faltblatt- Struktur, welche von beiden Seiten durch α-helices flankiert wird. Diese Domäne ist die flexibelste Domäne, die auch für Peptid- und GroES-Bindung erforderlich ist. Die äquatoriale Domäne bildet die Grenzfläche zwischen den zwei GroEL-Ringen und enthält die Hauptkontakte zwischen den Untereinheiten, innerhalb eines Rings und zwischen den Ringen. Die Domäne besteht aus langen, fast parallelen α-helices. Die zentrale Kavität wird durch 24 COOH- Resten am Äquator geschlossen. Diese Domäne enthält die ATP-Bindestelle, sowie die ATPase- Aktivität, welche die Bewegungen steuert. Die Nukleotidbindestelle besteht aus in Chaperoninen hochkonservierten Loops. Die GDGTT Sequenz befindet sich in einem Phosphat-bindenden Loop, der direkt und indirekt über gebundenes Magnesium mit den Sauerstoffatomen aller drei Phosphate interagiert. Es gibt zwei Interaktionsstellen in diesen Domänen, eine auf der rechten, die andere auf der linken Seite. Der Phosphat-Binde-Loop befindet sich direkt innerhalb einer dieser Kontakte, was die Induktion von Konformationsänderungen und allosterische Effekte vereinfacht. Die intermediäre Domäne ist eine kleine Domäne und fungiert als Scharnier. Sie enthält an der Grenzfläche zur apikalen Domäne 2 Glycinreste; wenn ein Glycin durch Alanin ausgetauscht wird,

7 kann das Chaperon nicht mehr seine Funktion erfüllen. Diese Domäne hat einen Kontakt zur apikalen Domäne der benachbarten Untereinheit (rechts liegend, blickend von außen auf den oberen Ring), was essentiell für negative und positve allosterische Effekte ist (siehe unten). Konformationsänderungen im Zuge der GroES-Bindung Dockt GroES an, dreht sich die apikale Domäne um 90 und bewegt sich um 60 nach oben (dadurch werden hydrophobe Reste innerhalb der Kavität verdeckt), während sich die intermediäre Domäne um 25 in Richtung äquatoriale Domäne ausrichtet (dadurch wird ATP in die Nähe eines für die Hydrolyse essentiellen Restes gebracht). Mechanismus der Faltung durch GroEL/ES Im Gegensatz zu Hsp70 Proteinen, die lineare Sequenzen binden (naszierende Polypeptidketten, cotranslational), erkennen die Chaperonine kollabierte Faltungs-Intermediate (molten globules; posttranslationale Faltungshelfer). GroES (Hsp10 in Mitochondrien) ist das für den Mechanismus erforderliche Co-Chaperon, das die Höhlung von GroEL verschließt. In Anwesenheit eines Nukleotids bildet sich ein symmetrischer GroES 7 -GroEL 14 -GroES 7 Komplex. Durch ATP-Bindung wird dieser Komplex gebildet Durch Spaltung wird er wieder zerstört. ATP-Bindung ist für die erste Konformationsänderung erforderlich, um das Andocken von GroES zu ermöglichen; ATP-Spaltung ist wegen der zweiten, destabilisierenden Konformationsänderung im cis-groel Ring erforderlich, die den Faltungsprozess beendet. Befindet sich das Chaperon im offenen Zustand (kein fehlgefaltetes Protein in Kavität, GroES ist nicht an GroEL gebunden), so erfolgt die Bindung eines ungefalteten Proteins mit seinen hydrophoben exponierten Resten an GroEL, da GroEL innen hydrophob ist. Ist das fehlgefaltete Protein nun im Inneren von GroEL (geschlossener Zustand, GroES hat angedockt), so erfolgt die Konformationsänderung und das Innere der Kavität wird hydrophil (Nettoladung: 42fach negativ), wodurch die korrekte Faltung des Proteins gefördert wird. Die Bindung zwischen hydrophoben GroEL Resten und dem fehlgefalteten Protein wird gebrochen, indem die hydrophoben GroEL Reste neue Kontakte zwischen den einzelnen GroEL-Untereinheiten knüpfen. Protein-Bindung und GroES-Bindung verlaufen nacheinander: Proteine binden über Helix-Motiv der apikalen Domäne (in der Nähe der Kanal-Öffnung). Domäne zieht das Protein und dreht sich schließlich ganz weg (streift Protein ab). Domäne richtet sich anschließend auf. GroES bindet über mobile Loops an selbe Stelle. Die umschlossene Kavität ist der Ort für Proteinfaltung. Fehlgefaltete Proteine haben 10 Sekunden zur Faltung innerhalb des Käfigs, wonach sie aus der Kavität geschleust werden. Die Zeit wird bestimmt durch die Dauer der ATP-Hydrolyse nach Aufnahme des Polypeptids in den Käfig von 6-8 Sekunden. Entweder das Protein ist nun korrekt gefaltet oder es hat Gelegenheit (meist im selben Chaperon, da schnell wieder eingefangen, oder in einem anderen Chaperon-Komplex) erneut die korrekte Faltung zu suchen. Oft treten mehrere Reaktionszyklen in Folge auf. GroEL/GroES ist nicht in der Lage Protein-Aggregate zu lösen. Das System kompetiert kinetisch den Weg der Fehlfaltung und Aggregation.

8 Der GroEL-GroES Reaktionszyklus Das ungefaltete Protein bindet an das geöffnete Chaperon (apikale Domäne des trans-rings) über hydrophobe Wechselwirkung. GroEL interagiert mit sehr früh kollabierten Faltungsintermediaten ( M -1 s -1 ), wodurch das Gleichgewicht in Richtung natives Protein verschoben wird. Es folgt die Bindung von insgesamt 7 ATP. Nun wird der trans- Ring zum cis-ring, da GroES andockt und GroEL schließt. ATP- Bindung, Konformationsänderung, GroES Bindung erfolgen sehr schnell hintereinander. GroES drückt quasi das ungefaltete Protein in die Kavität, sodass dieses (wegen der plötzlichen Hydrophilie der Kavität) nicht abdissoziieren kann, sondern gefangen ist. Analyse der ATP-Bindung mit ATP-γ-S, AMP-PCP oder PMP möglich (keine Hydrolyse). Durch die Konformationsveränderung erhöht sich das Volumen der Kavität um mehr als das 2fache (siehe Abbildung rechts), da sich die apikalen Domänen aufrichten, wodurch auch größere Zwischenfaltungen existieren können. Durch die Hydrophilie der Kavität wird eine korrekte Faltung ebeneso gefördert. Es erfolgt letztlich die Hydrolyse des ATP im cis-ring (alle werden synchron gespalten), wodurch die Struktur destabilisiert wird. Die Bindung von ATP im trans-ring (ebenso synchron zur Spaltung im cis- Ring) bewirkt die Disassemblierung der cis-seite: GroES und Substrat werden entlassen. Nach dem Reaktionszyklus können Substrate im (a) nativen Zustand (b) einem Zustand, aus dem das Protein in Lösung spontan in den nativen Zustand gelangen kann oder (c) einem nicht-nativen Zustand entlassen werden. Letztere können neu von GroEL gebunden werden. Energie-Bedarf: Es werden 7 oder 14 ATP Moleküle für diesen Prozess benötigt. Entfaltung und Degradation wäre wesentlich kostengünstiger. Allerdings ist der Zelltod oder auch die Neusynthese des Proteins wesentlich teurer. Positive und negative Kooperativität

9 Negative Kooperativität zwischen den Ringen: Beide Untereinheiten arbeiten sehr synchron: Hillkoeffizient >1. Die zweite Untereinheit kann erst ATP binden, wenn andere Untereinheit ATP hydrolysiert hat. Wahrscheinlich wird Maschinerie langsamer, wenn keine Proteine mehr da sind, die gefaltet werden müssen (kommt in Zelle aber nicht vor). Die negative Kooperativität wird durch das Kippen der cis E-Domäne um 4 bei Anwesenheit von Nukleotid und GroES bewirkt. Positive Kooperativität innerhalb der Ringe: Wegdrehen der einzelnen Untereinheiten. Dadurch bewegen sich die hydrophoben Kontaktstellen nach außen und bilden Kontakte zwischen den Untereinheiten. Der Radius der Kavität wird dadurch erhöht, da die hydrophobe Wand nach außen verschoben ist. Mechanismen der Refaltung

10 Spontan: Es erfolgt die Faltung über andere lokale Minima. Es ist jedoch genug Energie vorhanden, dass die Energiebarrieren überwunden werden können und das absolute Minimum gefunden wird. Iterative Annealing durch Wiedereinfangen: Durch Verwendung von 7 ATP wird das ungefaltete Protein energetisch wieder auf neue Startbedingungen angehoben (hydrophile Kavität Hydrophobe Proteinoberfläche energetisch ungünstig => Entfaltung => neue Faltung). Das Wiedereinfangen desselben ungefalteten Proteins nach einem nicht erfolgreichen Reaktionszyklus, wonach das Protein in irgendeinem nicht nativen Zustand kinetisch gefangen ist, ermöglicht die Rückführung zum Ursprungszustand und die neue Faltung. Confinement Theory durch Anfinsen-Käfig: Das Protein wird in seinem nicht nativen Zustand gefangen und direkt zum absoluten Energieminimum geführt. Andere lokale Minima werden im Käfig ausgeschlossen; Anfinsen-Käfig: Der Käfig ist essentieller Bestandteil für eine effiziente Protein-Refaltung in vivo. Vergrößerung der Proteine resultiert in schnellerer Faltung durch das Chaperonin. Ursache ist die verminderte Beweglichkeit. Die Protein-Enden sind immer in der Nähe. Es wird ausgeschlossen, dass andere Faltungszwischenprodukte entstehen, da kein Platz. Eine Reduktion in der Käfig-Größe (Mutationen) führt zu einem Verlust der E.Coli Lebensfähigkeit, ohne dass die Substrat-Bindung behindert ist. Lediglich die Substrat- Beweglichkeit innerhalb der Kavität ist eingeschränkt. Zu große Proteine können nicht mehr gefaltet werden. Sind diese essentiell kann dies zum Zelltod von E.Coli führen. Klasse 2 Chaperonine cytosolic chaperonin containing T complex polypeptide-1 (kurz TCP-1 Ring Complex [TRiC] oder auch CCT) ist ein eukaryotisches Chaperonin. Es besteht aus 2 mal 8 verschiedenen Untereinheiten. Der Faltungs-Mechanismus von CCT hat Gemeinsamkeiten mit dem von GroEL/ES, ist aber nicht identisch. Die Aktivität von CCT wird nicht durch die Bindung, sondern durch die Hydrolyse von ATP induziert, im Gegensatz zu den anderen Chaperoninen, welche durch ATP-Bindung in die geschlossene Konformation wechseln. CCT entlässt die Substrate nicht in die Kavität, sie bleiben vielmehr am Chaperon gebunden. CCT ist u.a. für die Faltung von Cytoskelet-Proteinen (Aktin, Tubulin) verantwortlich, wobei es nicht alleine agiert, sondern in Zusammenarbeit mit dem Co- Chaperon Präfoldin. Das Thermosom besteht aus 2 mal 4 α- und 4 β-untereinheiten zu je 58 kda, die alternierend in den zwei Ringen auftreten, und kommt in Archeen vor. In Sulfolobus existiert noch eine dritte Untereinheit. Das Thermosom ist 40% identisch zu CCT (CCT-Homolog). Im Gegensatz zum bakteriellen barrel GroEL/ES (ein offenes und ein geschlossenenes Ende) hat das Thermosom eine kurze, zylindrische Form mit zwei abgerundeten Enden, sodass es mehr als Kugel erscheint. Klasse 2: Hsp70/Hsp40 Ubiquitär vorkommend, große Hsp70 Protein-Familie (viele Gene), am stärksten konservierte Proteinfamilie unter den Hitzeschockproteinen (min. 45% Sequenzübereinstimmung); 1-2% des Gesamtzellproteins; Gruppe umfasst konstitutiv exprimierte (basale Expression essentiell) und induzierbare (Überexpression nach Hitzeschock) Mitglieder.

11 Die meisten Genome codieren eine Vielzahl von Hsp70 Proteinen (im Mensch existieren 13, in E.Coli drei), die meist spezifisch in bestimmten Organellen Funktionen erfüllen. Sie liegen in Zytosol, Zellkern, Mitochondrien, Chloroplasten und im ER vor. - In Säugern: BiP/Grp78 im ER und mthsp70 im Mitochondrium. Hsp72 (Hsp70) ist die stressinduzierte Form im eukaryotischen Cytosol, Hsp73 (Hsc70) die konstitutiv exprimierte Form. - In Hefe: Ssc1/Tim44 ist ein spezielles Hsp70/Hsp40 System in Hefe, Ssa1-4 im Hefe-Cytosol. - In Bakterien: DnaK/DnaJ ist ein spezielles Hsp70/Hsp40 System. Es ist das am besten charakterisierteste System. Die Hsc70 Chaperon-Maschinerie hat eine Vielfalt von Funktionen. - Funktionen als reiner Faltungshelfer o Faltung und Assemblierung neu synthetisierter Proteine (10-20% der E.Coli Proteine) o Refaltung fehlgefalteter Proteine o Inhibition der Faltung toxischer Proteine o Deassemblierung aggregierter Proteine (in Verbindung mit Hsp100) - Targeting für Degradation, dirigiert zum Proteasom und zum lysosomalen Weg - Translokation organeller Proteine - Aktivitätskontrolle regulatorischer Proteine (Steroidhormon-Rezeptor, Transkriptionsfaktoren) - Deassemblierung von Clathrin-coated Vesikel vor Vesikelfusion (steuert somit Endozytose) - Regulation der Exozytose (Co-Chaperon: Cystein-String-Protein, CSP) - interagiert auch mit GPCRs und moduliert Signaltransduktion Vielfältige Funktionen werden erreicht durch o o o Amplifikation und Diversifikation von hsp70 Genen. Wechselwirkung mit verschiedenen Co-Chaperonen (hsp40). Kooperationen zwischen hsp70-hsp40 Komplexen und anderen Chaperon-Systemen. Nur einzelne Domänen bisher kristallisiert, Interaktionen unbekannt. Struktur von Hsp70 Chaperonen Zwei funktionelle Domänen: hochkonservierte N-terminale ATPase-Domäne (45 kda) und weniger konservierte Peptidbindungsdomäne nahe dem C-Terminus. Der C-Terminus selbst ist unstrukturiert. Der C-Terminus enthält das Peptidmotiv EEVD, das ein Bindungsmotiv für Cofaktoren aus der TPR (tetratricopeptid-repeat) Protein-Familie darstellt. Hsp70-Proteine besitzen schwache intrinsische ATPase-Aktivität. Die ATPase Domäne ist hochkonserviert (nahezu identisch mit Aktin und Hexokinase I). 4 Unterdomänen (IA, IB, IIA, IIB) umgeben eine zentrale Nukleotidbindungsfurche. Zur Stabilisierung des ATP wird ein Magnesium koordiniert. Zwei Kalium Ionen sind für eine effiziente Hydrolyse ebenso wichtig. Die ATP Bindetasche ist stark hydrophob, wodurch ATP vor spontaner Hydrolyse geschützt ist. Struktur von DnaK (607AS)

12 N-terimnal liegt eine β-sandwich Unterdomäne, aufgebaut aus acht antiparallelen β-faltblättern, welche die Peptidbindungsfurche enthalten. Der C-Terminus der Peptidbindungsdomäne wird aus fünf α-helices gebildet. Eine lange Helix (B), die über eine kurze Helix (A) mit dem β-sandwich verbunden ist, bildet eine Art Deckel, der die Substratbindestelle offen legen oder bedecken kann. ATPase-Domäne von Hsc70 mit gebundenem ADP Substratbindungsdomäne von DnaK aus E.Coli im Komplex mit einem Heptapeptid (grün) Gesamtstruktur: ATPase-Domäne in blau, SB-Domäne in gelb, Linker in rot, Substratbindestelle in grün) Der molekulare Mechanismus der Hsp70-Funktion - Chaperone der Hsp70-Familie binden kurze, hydrophobe Abschnitte ungefalteter Proteine. Während einer Faltungsreaktion können Substrate mehrmals mit Hsp70 interagieren, bevor sie ihre native Struktur besitzen. - Die Modulation dieser Reaktion wird durch ATP-Bindung und Hydrolyse, sowie durch verschieden Co-Chaperone erreicht, die mit Hsp70 zusammenarbeiten. Hsp70 wechselt zwischen ATP und ADP-gebundenen Zustand. o In ATP-gebundener Form besitzt es schwache Affinität für Substrate mit hoher Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeit. o Die ADP-gebundene Form ist durch hohe Affinität und langsamen Austausch charakterisiert. - Zwischen ATPase-Domäne und SB-Domäne existiert hoher Grad an Kommunikation. ATP- Hydrolyse führt zur Konformationsänderung innerhalb der C-terminalen SB-Domäne. Die Peptidbindetasche weschselt dabei von der offenen Konformation im ATP-gebundenen Zustand in eine geschlossene Konformation im ADP-gebundenen Zustand. Das gebundene ungefaltete Protein wird damit eingefangen und stabilisiert. - Hsc70 bindet naszierende Polypeptidketten, sobald sie das Ribosom verlassen, um hydrophobe Reste von unspezifischen Interaktionen zu schützen. Es findet keine aktive Faltung während der Bindung an Hsc70 statt. Nicht-native Proteine werden lediglich stabilisiert und vor Abbau geschützt. So haben sie mehr Zeit von z.b. GroEL gefaltet zu werden. - Eukaryotischer Mechanismus: Hsc70 hat einen flexiblen Linker, der die Substrat- Bindedomäne (SBD) und die Nukleotidbindedomäne (NBD) verknüpft. SBD und NBD interagieren im ADP-gebundenen Zustand. Die J-Domäne von Hsp40 dirigiert den Linker von der NBD-Oberfläche weg, wodurch die SBD wieder neues Substrat binden kann

13 (Aktivierung/Stabilisierung der Client-Bindung); in Prokaryonten interagieren SBD und NBD allerdings nicht! Regulation des Hsp70-Reaktionszyklus durch Co-Chaperone Der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Reaktionszyklus ist die ATP-Hydrolyse, nachdem ein Peptid in die SB-Domäne eingedrungen ist. Die intrinsische ATPase-Aktivität (0,02-0,2 pro Minute) ist zu gering, um eine effiziente Chaperon-Funktion und Proteinfaltung zu ermöglichen. Bindung des Substrats erhöht die ATP-Hydrolyserate um das 10fache. Dennoch wird die Hydrolyserate maßgeblich durch Co-Chaperone reguliert. Hsc70 wird u.a. durch DnaJ/Hsp40, Bag-Family Proteine, Hip, Hop und CHIP reguliert. Die Familie der Hsp40-Co-Chaperone Hsp40- Proteine (im Bakterium: DnaJ) stellen die größte Klasse von Hsp70-Co-Chaperonen dar. Es handelt sich um eine heterogene Gruppe von Multidomänen-Proteinen mit 44 Mitgliedern im Menschen und 6 in E.Coli. Sie enthalten alle eine konservierte 70-AS große J-Domäne aus 4 α-helices, welche die ATPase Aktivität der Hsp70 Proteine stimuliert. Die antiparallelen Helices 2 und 3 bilden dabei einen exponierten Finger, der durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert wird. Das hochkonservierte HPD-Motiv in Schleife zwischen Helix 2 und 3 ist für die Interaktion mit ATPase- Domäne eines Hsp70-Partners essentiell. Außerdem interagiert das QKRAA-Motiv der J-Domäne von Hsp40 wahrscheinlich mit der Peptidbindungsdomäne des Hsp70-Partners. Domänenarchitektur von DnaJ 3D-Struktur der J-Domäne Zusätzlich zur Steigerung der ATPase Aktivität von Hsp70 besitzt Hsp40 selbst auch eine Chaperon- Funktion, indem es ungefaltete Peptide bindet und sie an Hsp70 weitergibt. Es existieren neben der J-Domäne zwei weitere Domänen: Die Glycin/Phenylalanin-reiche Region (GF-Region) und eine Cystein-reiche Region mit zwei Zinkzentren (Zn 2+ -Ionen durch jeweils vier Cysteinreste koordiniert), die Substrat-Bindung ermöglicht. Hsp40 Proteine können nach dem Vorhandensein dieser drei Domänen in drei Klassen eingeteilt werden: Typ I Hsp40-Proteine enthalten alle 3 Domänen (Beispiel: DnaJ). Typ II besitzt J-Domäne und G/F-Region. Typ III besitzt ausschließlich die J-Domäne. Durch das Vorhandensein von J-Domänen in verschiedenen Proteinen wird das Hsp40/Hsp70 System zur Ausübung spezialisierter zellulärer Funktionen befähigt. Hsp40 Proteine können ein spezifisches

14 oder auch mehrere Hsp70 Moleküle binden. Neben der J-Domäne existieren Motive, welche das Protein zu spezifischen Client-Proteinen und Lokalisationen dirigieren. Nukleotidaustauschfaktoren Die Freisetzung des ADP, nach der durch Hsp40 stimulierten ATP-Hydrolyse, und damit auch des Substrates von Hsp70 wird durch Nukleotidaustauschfaktoren reguliert. In E.Coli ist dies GrpE. Das Öffnen der Nukleotidbindetasche entspricht einer Rotation der Unterdomäne IIB der ATPase-Domäne. Diese Rotation wird durch die DnaK(ADP)-GrpE Wechelwirkung stimuliert, was den Nukleotidautausch um einen Faktor von ca beschleunigt. In den eukaryotischen Organellen endosymbiotischen Ursprungs existieren GrpE-Homologe Proteine. In Zytosol und ER sind keine solchen Homologe bekannt, es existieren aber Proteine mit derselben Funktion. Säuger-ER: BAP als Nukleotidaustauschfaktor für BiP Säuger-Zytosol: HspBP1 und Bag-1 als Nukleotidaustauschfaktoren für Hsp70 bzw. Hsc70. Bag-1 (Bcl2-associated athanogen) wurde ursprünglich als Bindungspartner von Bcl2 (Apoptose- Inhibitor) gefunden. Bag-1 interagiert über N-terminale Ubiqutin-ähnliche Domäne mit dem 26S- Proteasom (Verbindung zwischen Proteinfaltungs-Maschinerie und Degradations-Maschinerie). Der Mechanismus des Nukleotidaustauschs ist mit dem von GrpE identisch, auch wenn die Proteine nicht verwandt sind. HspBP1 (Hsp70 binding protein 1) ist weder mit GrpE noch mit Bag-1 verwandt. Hier ist der Mechanismus des Nukleotidaustauschs auch anders. Zusätzliche Cofaktoren für Hsp70 in Säugerzellen Ein 48 kda schweres Hsp70-interagierendes Protein (Hip/p48) bindet an die ATPase-Domäne von Hsp70 in ADP-gebundener Form. Hip verhindert so die Freisetzung von ADP und stabilisiert den Hsp70-Substrat Komplex. Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein) bindet im Gegensatz zu Hip an den C-Terminus von Hsp70. Hip und Hop interagieren mit Hsp70 über TPR-Domänen. Hop besitzt noch eine zweite TPR-Domäne, über die Hop mit Hsp90 interagieren kann. Die entstehenden Hsp70-Hsp90 Heterokomplexe spielen bei Faltung und Reifung regulatorischer Proteine eine Rolle (genaueres über Hop und Hsp90 siehe: Klasse 3 Chaperone ). Das mit dem C-Terminus von Hsp70 interagierende Protein CHIP (carboxyl terminus of Hsc70- interacting protein) ist ein negativer Regulator von Hsp70, da es die Stimulation der Hsp70-ATPase durch Hsp40 und die Luciferasebindung und -Faltung inhibiert. CHIP ist zusammen mit Hsc70 an Ubiquitinierung und dem anschließenden Abbau des bei Mukoviszidose mutierten Chloridkanals CFTR beteiligt. CHIP kann auch an Hsp90 binden und fördert den Ubiquitin-abhängigen Abbau von Hsp90-gebundenem GR. Die Ubiquitinierung erfolgt durch CHIP selbst, weshalb CHIP zu den E3- Ubiquitin-Ligasen gehört. CHIP enthält eine TPR-Domäne sowie eine U-box-Domäne (U-box = spezielle RING-Domäne ohne den Zink-Finger) Hsp70/Hsp40 Systeme im Säuger-Zytosol

15 - 3 humane cytosolische Hsp70-Vertreter: Hsc70 (73 kda Protein) wird ständig basal exprimiert, Hsp70 (72 kda Protein) lediglich unter Hitzeschock, Hsp70L1-7 humane cytosolische Hsp40-Vertreter: Hsp40 (Hdj1), HSDJ (Hdj2), Auxilin, Mrj (mammalian relative of DnaJ), CSP (cysteine string protein), p58ipk und MIDA1 (mouse Id associated 1). Verschiedene Hsp70-Co-Chaperone sind innerhalb des Cytosols an unterschiedlichen Membransystemen oder Cytoskelett-Elementen lokalisiert, wo sie Hsp70 rekrutieren, um an diesem Ort spezifische Aufgaben wahrzunehmen. Auxilin ist an Hsc70 vermitteltes uncoating von Clathrin-umhüllten Vesikeln beteiligt, die sich von Plasmamembran abknospen. Hierzu besitzt Auxilin neben der C-terminalen J-Domäne noch eine zentrale Clathrin-bindende Domäne. Auxilin bindet zunächst an Clathrin-Käfige, woraufhin die J-Domäne die ATPase-Aktivität von freiem Hsc70 stimuliert. Die ADP-Form von Hsc70 bindet anschließend an Clathrin, was dessen Konformation verändert und den Zerfall des Clathrin-Käfigs herbeiführt. Freies Clathrin wird dann von Hsc70 stetig gebunden und wieder freigesetzt, wodurch Clathrin stabilisiert wird und für die Reassemblierung an der Plasmamembran zur Verfügung steht. CSP (Cysteine String Protein) ist an der Calcium-aktivierten Exozytose von synaptischen Vesikeln beteiligt. Es enthält neben der N-terimalen J-Domäne eine zentrale Cystein-reiche Domäne, mit der es sich über mehrfache Palmitoylierung an Vesikelmembranen heften kann. CSP interagiert mit einigen neuronalen SNARE Proteinen, die für die Zielsteuerung und Fusion von Vesikeln verantwortlich sind. Das durch die J-Domäne von CSP rekrutierte Hsc70 stabilisiert die unstrukturierten monomeren SNAREs. CSP reguliert des Weiteren auch direkt die Calcium-Kanäle, welche die Freisetzung von Neurotransmitter auslösen. Mrj spielt eine Rolle bei Zusammensetzung des Keratin-Filament-Zytoskeletts. Es erkennt mit seiner C-terminalen Domäne spezifisch die Keratin18-Komponenente und rekrutiert mit seiner J-Domäne Hsc70, das die Zusammensetzung der Filamente bewerkstelligt. Hsp70/Hsp40 Systeme im Endoplasmatischen Retikulum Das ER ist nach dem Zytosol das Hauptfaltungskompartiment der eukaryotischen Zelle. Hier werden sekretorische Proteine, Proteine der Plasmamembran und ER- oder Golgi-lokalisierte Proteine gefaltet. Der Hauptvertreter der Hsp70-Familie im Säuger-ER ist Grp78 (glucose regulated protein 78 kda) bzw. Bip (Ig heavy chain binding protein). Grp170 ist ein Hsp70- verwandtes Glykoprotein im ER. Es besitzt eine N-terminale ATPase-Domäne, ähnlich der in Hsp70-Proteinen, sowie eine N-terminale Peptidbindende-Domäne, ähnlich der in Hsp110 Proteinen. Das Protein wurde daher keiner der beiden Familien zugeordnet.

16 Bip und Grp170 sind am Proteintransport ins ER beteiligt. Der Transport kann entweder cotranslational oder posttranslational erfolgen und wird durch eine N-terminale Signalsequenz eingeleitet. In beiden Fällen erfolgt der Transport durch die Translokationspore Sec61p-Komplex (Mechanismen siehe Translokations- Zusammenfassung). ATPase Zyklus von Hsc70 [1] Hsp40-Dimer bindet naszierende oder fehlgefaltete Client-Proteine und präsentiert sie Hsc70 im ATP-gebundenen Zustand. [2] J-Domäne von Hsp40 stimuliert die ATPase Aktivität von Hsc70 => ATP-Hydrolyse => Konformationsänderung im ADP-gebundenen Zustand => Client Protein wird in Substratbindestelle festgeklemmt, wonach Hsp40 abdissoziiert (Peptid bindet an β-faltblatt; α-helikaler Deckel klemmt Peptid fest; Hsp40 bindet an beide Regionen). [3] Hip (Hsp70 interacting Protein) stabilisiert das Client-Protein im ADP-gebundenen Hsc70 Zustand, um die Faltung zu unterstützen. Bindung über TPR Domäne. [4] Die Bindung des Bag1 Proteins (im Menschen: HspBP1 oder Hsp110, bakterielles Protein ist GrpE; strukturell sehr unterschiedlich aber selbe Funktion) stimuliert den Nukleotid-Austausch => ADP dissoziiert, ATP bindet. Dadurch resultiert erneute Konformationsänderung, die Helixklemme geht auf, das Client- Peptid kann abdissoziieren. [5] Client-Proteine können multiple Zyklen von Hsc70-Bindung und Freisetzung durchmachen, bevor sie nativ gefaltet vorliegen (Faltung erfolgt durch z.b. GroEL nach Freigabe oder spontan). [6] ATP-gebundenes Hsc70 liegt in der offenen Konformation vor.

17 Vermittler der Client-Protein Ubiquitinierung und Proteasomalen Degradation CHIP (C-terminus of Hsp70 interacting Protein) interagiert mit Hsc70 über die TPR-Domäne und agiert als Ubiquitin-Ligase für Hsc70-Clients, indem es Ubiquitinkonjugierende Enzyme (E2, Ubc) über seine U-box Domäne rekrutiert. HSJ1 bindet Ubiquitin-Ketten an Hsc70-Clients über seine Ubiquitin- Interaktionsmotive (verhindert auch die Spaltung der Ketten durch Ubiquitin-Hydrolasen). HSJ1 präsentiert außerdem die Clients an Hsc70 und stimuliert über seine J-Domäne die ATPase-Aktivität. Bag-1 (Bag-Proteine sind Nukleotidaustauschfaktoren) bindet Hsc70 über seine Bag- Domäne und interagiert direkt mit dem Proteasom über eine Ubiquitin-like Domäne. Entscheidung: Faltung oder Degradation? CHIP (Ubiquitin-Ligase) katalysiert die Ubiquinierung. Mono-Ubiquitinierung hat regulatorische Adapter-Funktion, während Poly-Ubiquitinierung (mindestens 8Ub-Reste infolge) zum Abbau des Proteins führt. Die Bindung von Hop oder anderen produktiven Cofaktoren bewirkt die Faltung der Proteine. Verhältnis von CHIP/Hop bestimmt Targeting.

18 Hip-Hop Zyklus Hsp40 bringt Client zu Hsc70-ATP und stimuliert ATPase Aktivität, wodurch der Komplex Hsc70-ADP-Client entsteht. Hip bindet und stabilisiert die Client-Bindung weiter, wodurch ADP-Freisetzung inhibiert und Faltungszeit erhöht wird (Gegenspieler zu Nukleotidaustauschfaktor). Hop wirkt als Nukleotidsaustauschfaktor, wodurch das Client-Peptid frei wird und Hsc70-ATP regeneriert wurde. Es können mehrere Faltungszyklen durchlaufen werden. Durch Transkriptionsregulation von Hip und Hop wird reguliert, wie lange Proteine von Hsc70 im ungefalteten Zustand stabilisiert werden. Verhältnis Hip/Hop bestimmt Dauer der Client-Protein-Stabilisierung. Regulierter Zyklus von mhsp70 am Protein-Import-Kanal Hsp70 der mitochondrialen Matrix (mthsp70) liefert die treibende Kraft für den mitochondrialen Protein-Import. Es bindet kurze hydrophobe Polypeptid-Bereiche im ATP-gebundenen Zustand. [1] Tim44 (peripheres Membranprotein in der inneren Membran) dirigiert mthsp70 in die Nähe des Importers über eine direkte Interaktion. mthsp70(atp)-tim44 ist die dominierende Interaktion wegen (a) einer erhöhten Affinität im ATP-gebunden Zustand zu Tim44 und (b) der durch Mge1 stimulierten Dissoziation des ADP-gebundenen mthsp70 von Tim44. [2] Wenn die Präsequenz des transportierten Polypeptids auftaucht (getrieben durch das Membranpotential) interagiert sie mit mthsp70. Diese Interaktion stimuliert die Freisetzung von mthsp70 aus der Tim44-Interaktion. [3] Polypeptid-Bindung stimuliert gleichzeitig ATP-Hydrolyse, was die mthsp70-interaktion mit dem Polypeptid stabilisiert und somit die Rückbewegung des Polypeptids zum Zytosol verhindert. Die Freisetzung von mthsp70 aus der Tim44 Interaktion erlaubt nicht nur die Diffusion der Polypeptidkette, sondern auch eine Bindung eines weiteren mthsp70 Moleküls an Tim44, wodurch ein weiterer Zyklus einer mthsp70-bindung an die Polypeptidkette eingeleitet wird. Dadurch wird der Import der Polypeptidkette gefördert (keine Rückdiffusion möglich).

19 [4] Der mthsp70-polypeptid-komplex kann nicht erneut an Tim44 binden. Es kompetiert nicht mit mthsp70-atp um die freie Tim44-Bindestelle Mge1 agiert auch als Nukleotidaustauschfaktor, indem es mthsp70-adp bindet und die ADP- Freisetzung stimuliert. Anschließende ATP-Bindung bewirkt die Freisetzung von mthsp70 von der Polypeptidkette, wodurch die aktive ATP-gebundene Form regeneriert wurde und die Faltung der Polypeptidkette beginnen kann. Für die Translokation existieren prinzipiell zwei mögliche Mechanismen: (1) Brownian ratchet model: Die Polypeptidkette unterliegt lediglich der Brownschen Molekularbewegung. Aufgrund der ständigen Bindung von mthsp70, kann diese Bewegung nur in eine Richtung erfolgen. (2) power-stroke/pulling model: mthsp70 übt eine Kraft auf die Polypeptidkette aus und zieht sie so in die Matrix. Klasse 3: Hsp90 Die 90 kda Hitzeschockprotein-Familie (Hsp90) ist ein dem Hsp70-System nachgeschaltetes Chaperonsystem. Hsp90 wird in allen eukaryotischen Zellen exprimiert und macht 1-2% des zytosolischen Proteingehalts in ungestressten Zellen aus (häufigstes Chaperon). Das cytosolische Hsp90 hat als Client-Proteine hauptsächlich Proteine der Signaltransduktion, wie Steroid Hormon- Rezeptoren, Kinasen, Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressorproteine. Es kontrolliert damit Aktivität, Umsatz und Transport von einer Vielzahl von Proteinen. Hsp90-Chaperone bestehen aus einer N-terminalen ATPase-Domäne, einer zentralen Substratbindungsdomäne und einer C-terminalen Dimerisierungsdomäne. Über die ATPase- Aktivität wird die Bindung und Freisetzung der Substrate reguliert (ATP-Hydrolyse induziert Konformationsänderung in Hsp90, wodurch Konformationsänderungen im Substrat-Protein induziert

20 werden; In Steroid-Rezeptoren wird durch diese Konfänderung die Steroid-Bindestelle für die Substrate zugänglich). Um seine Funktion auszuüben, kooperiert Hsp90 mit dem Chaperon Hsp70 in definierten Komplexen, die durch das Adapter-Protein Hop aufgebaut werden. Genau wie bei Hsp70 enthält der äußerste C-Terminus von Hsp90 ein EEVD-Motiv, an das Hop mit seinen TPR-Domänen binden kann. Client- Proteine werden innerhalb des Hsp70-Hsp90-Hop-Komplexes von Hsp70 zu Hsp90 übertragen, wobei Hsp70 die Rolle einer Fangvorrichtung für die Client-Proteine übernimmt. Hsp90 ist in diesem Komplex dagegen vielmehr an der Reifung von Signalmolekülen beteiligt, als dass es die normale Funktion eines Chaperons übernimmt. Bezüglich seiner Funktion und Rolle bei der Proteinfaltung, ist Grp94, der Hsp90-Vertreter im Endoplasmatischen Retikulum von Säugerzellen, bisher weniger gut charakterisiert. Seine Expression wird, wie die verschiedener anderer Chaperone auch, durch die Anhäufung ungefalteter Proteine im ER hochreguliert. Grp94 interagiert nur mit wenigen Proteinsubstraten, z.b. mit Immunglobulinketten, wobei es bevorzugt mit einem späten Faltungsintermediat der leichten Kette assoziiert. Rezeptor-Hsp90-Heterokomplex Assemblierung und Hsp90-Co-Chaperone Von ungefähr 100 Proteinen, von denen die meisten in Signaltransduktion involviert sind, ist bekannt, dass sie von Hsp90 reguliert werden. Diese Client-Proteine werden in einen Komplex mit Hsp90 durch eine Hsp70/Hsp90 Multi-Chaperon-Maschinerie gebracht. Neben den Substraten bindet Hsp90 zahlreiche weitere Cofaktoren, die Teil der Heterokomplex-Assemblierungs- Maschinerie sind, sowie Immunophiline, welche Substrat-Hsp90 Komplexe mit Protein-Traffick- Systemen verbinden.

21 Das Minimale System für stabile Rezeptor-Hsp90 Heterokomplexe besteht aus 5 Proteinen (Hsp90, Hsp70, Hop, Hsp40 und p23). Diese Hsp90/Hsp70 basierende Chaperon-Maschinerie (Foldosom) konvertiert die Ligand-Bindestelle des Glucocorticoid-Rezeptors von der gefalteten Konformation, in der die Steroid-Bindetasche geschlossen vorliegt und kein Hormon binden kann, in die open cleft Konformation, die Affinität für das Hormon aufweist. Dieses 5-Protein-System funktioniert auch mit anderen Substraten wie Protein-Kinasen, Transkriptionsfaktoren oder anderen Rezeptoren und scheint generelles Prinzip für die Regulation solcher Proteine zu sein. Steroidhormone diffundieren durch die Membran in das Zytosol. Steroid-Rezeptoren sind lösliche Dimere, die erst im Rezeptor-Hsp90 Heterokomplex aktiv sind und die Steroide binden können. Beispiele für Steroid-Rezeptoren: Glucocorticoid-Rezeptor (GR) und Progesterone Rezeptor (PR). Liegt ein reifer Heterokomplex vor und Hormone binden, so wird die endgültige Faltung des Steroid-Rezeptors induziert. Wenn das Hormon nicht vorhanden ist, wird der ungefaltete Rezeptor freigesetzt und ein erneuter Zyklus der Heterokomplex-Bildung beginnt. Die Prozesse der Heterokomplex-Assemblierung und Deassemblierung sind hochdynamisch und treten simultan auf. Zu Beginn liegt der Komplex Hsp70-Hsp40 vor. Hsp40 ist ein Hsp70-gebundenes Co-Chaperon, das die ATPase Aktivität von Hsp70 fördert. Hsp70-Hsp40 wird über Hop mit Hsp90 zum Foldosom verknüpft. Die Bindung des Steroid-Rezeptors im inaktiven Zustand erfolgt schon durch Hsp70, sobald Hsp90 in den Komplex eintritt, wird das Substrat an Hsp90 übertragen. Die Bindung von Hop geschieht transient in einem intermediären Komplex. Das 60 kda Protein Hop verbindet Hsp70 und Hsp90, moduliert aber auch ihre Aktivitäten: Die N-terminale TPR Domäne bindet Hsp70, die zentrale TPR Domäne bindet die C-terminale TPR-Akzeptor-Domäne von Hsp90. Hop und Hsp70: Hop beschleunigt die Chaperon-Aktivität von Hsp70 in Abwesenheit von Hsp90 und stimuliert den Nukleotidaustausch von Hsp70. Hop bindet selektiv Hsp70- ADP und moduliert Hsp70 damit im Substrat-gebundenen Zustand.

22 Hop und Hsp90: Hop blockiert die ATP-Bindung, sowie ATPase Aktivität von Hsp90, was die Bindung des Co-Chaperons p23 inhibiert (diese benötigt Hsp90 im ATP gebundenen Zustand). Hsp90 liegt als funktionaler Homodimer vor, wobei die Dimerisierungs-Domäne auch innerhalb der TPR-Akzeptor-Stelle liegt. Wahrscheinlich existiert eine TPR-Akzeptor-Stelle pro Hsp90 Dimer. Im ATP-gebundenen Komplex Hsp90-Hop-Hsp70-Hsp40 findet die ATP/Mg 2+ und K + abhängige Öffnung der Steroid-Bindetasche des Steroid-Rezeptors statt (Hydrophobe Oberfläche wird freigelegt). Hsp90 und Hsp70 binden dabei direkt an die hydrophobe Oberfläche der Ligand- Bindestelle des Steroid-Rezeptors und induzieren damit die Öffnung nach ATP-Hydrolyse. Dabei spielt auch eine direkte Interaktion zwischen Hsp70 und Hsp90, ermöglicht durch die Annäherung über Hop, eine entscheidende Rolle. Das Produkt nach Schritt 2 ist kein statischer Zustand! Hier geschieht sehr viel in kurzer Folge: Zunächst erfolgt die Bindung von Hsp70-Hsp40 an den Rezeptor. Wenn sich die Steroid-Bindetasche infolge Hsp90-Bindung öffnet, erreicht Hsp90 den ATP-gebundenen Zustand und Hop dissoziiert vom Rezeptor-gebundenen Hsp90. Anschließend bindet direkt p23 an den ATP-gebundenen Hsp90-Zustand. Hop ist immer noch am Rezeptor-gebundenen Hsp70 assoziiert und muss irgendwie den Komplex verlassen. Die Freisetzung von Hop aus dem intermediären Komplex in Schritt 2 macht den TPR Akzeptor auf Hsp90 frei. Er kann nun Immunophilline mit TPR Domäne (FKBP52, FKBP51, PP5, CyP-40) binden. Der Release-Mechanismus von Hop ist nicht bekannt. Die Affinität von Hsp90 und Hsp70 im ATP gebundenen Zustand zu Hop ist reduziert, was eine Kompetition durch Immunophiline erleichtert. Außerdem ist es möglich, dass Bag-1 (bindet an ATPase Domäne von Hsp70; unterstützt die Freisetzung von ADP), die Freisetzung von Hop induziert, da die Affinität von Hop zu Hsp70-ADP am größten ist. Funktion von p23 p23 interagiert direkt mit Hsp90 im ATP-gebunden Zustand, um den Rezeptor-Hsp90-Heterokomplex zu stabilisieren. Da nur im ATP-gebundenen Zustand die Steroid-Bindestelle im offenen Zustand gehalten werden kann und p23 nur im ATP-Zustand bindet, wird durch p23 die Bindetasche offen gehalten. Die Bindung von p23 geschieht spät im Hsp90-Chaperon-Pathway, wenn Hop von Hsp90 abdissoziiert und die ATP-gebundene Konformation einnimmt. Die Bindung benötigt Molybdat, da es die ATP-gebundene Konformation stabilisiert. Die Bindung von p23 benötigt die ATP-Bindestelle und eine Downstream liegende Domäne im Dimer-Arrangement. Die Funktion von p23 ist unklar. Es kann die Aggregation denaturierter Proteine inhibieren, was im Hsp90 Heterokomplex verwendet werden könnte. p23 scheint SR-Hsp90 Heterokomplexe zu stabilisieren und den Anteil der reifen Komplexe, in denen der SR eine Hormon-Bindungsaktivität aufweist, zu erhöhen. Funktionen der Immunophiline Hop konkurriert mit Immunophilinen um die TPR- Bindestelle in Hsp90. Die Immunophiline, die eine TPR-Domäne aufweisen und Immunophilin-verwandte Proteine könnten für die Funktionsvielfalt von Hsp90 Heterokomplexen verantwortlich sein; ihre genaue Funktion ist unklar.

23 Immunophiline interagieren im letzten Schritt der Rezeptor-Hsp90 Heterokomplex Assemblierung mit Hsp90 (Hop schon längst abdissoziiert). Immunophiline mit TPR-Domäne sind weit verbreitet zwischen tierischen und pflanzlichen Zellen, ihre Bindung an Hsp90 ist konserviert. Immunophiline spielen keine Rolle bei der Assemblierung oder Stabilisierung des Heterokomplexes. Die Bindung von Immunophilinen an Hsp90 beeinflusst Protein-Interaktionen, die in Targeting und Trafficking eine Rolle spielen. Die gemeinsame Eigenschaft der Immunophiline ist die Peptidyprolyl-Isomerase (PPIase) Domäne. Die PPIase Aktivität kann durch Immunosuppressiva der Klasse FK506 oder Cyclosporin A inhibiert werden. Die PPIase Domäne von Hsp90-bindenden Immunophilinen könnnte als Protein-Protein Interaktionsdomäne dienen, welche Steroid-Rezeptoren an das cytoplasmatisch-nukleäre Trafficking System bindet. Die Steroid-Rezeptoren sind ständig zwischen Kern und Zytosol in Bewegung. Wenn GR von einem Steroid gebunden wird, wandert er vom Zytosol in den Kern. Diese Bewegung ist Hsp90-abhängig und geschieht über das Zytosokelett. Es wird angenommen, dass die Bewegung im Rezeptor-Hsp90 Heterokomplex stattfindet und dass Immunophiline für das Targeting der Steroid-Rezeptoren zuständig sind. FKBP52 kolokalisiert im Kern mit SR und im Zytosol mit Mikrotubuli. FKBP52 bindet direkt an GR über ein 35AS langes Segement des Rezeptors. Die PPIase Domäne bindet direkt an die intermediäre Kette zytoplasmatischen Dyneins (retrograder Transpport von Vesikeln entlang von Mikrotubuli), unabhängig von der PPIase Aktivität. Die ebenso Rezeptor-assoziierten Immunophiline Cyclophilin CyP-40 und Proteinphosphatase PP5 binden ebenso über die PPIase Domäne an Dynein. Immunophiline, die nicht an Hsp90 binden, binden auch nicht an Dynein, weshalb es sich um eine spezielle Subklasse von Immunophilinen handeln muss. Funktion von Hip bei der Heterokomplex-Assemblierung Hip wird für die Assemblierung NICHT benötigt (rechte Abbildung aus Tampes Folie ist veraltet!). In PR-Hsp90 Heterokomplexen wurde das 48 kda schwere Protein Hip gefunden. Hip bindet an die ATPase Domäne von Hsp70 und stabilisiert den ADP-Zustand, der eine hohe Affinität zu nichtnativen Substrat-Proteinen hat. Hip und Bag-1 kompetieren um diese Bindestelle. Es wurde angenommen, das Hip für die Wandlung des Rezeptor- Komplexes mit Hsp70 zum Zustand mit Hsp90 notwendig ist. Im 5-Protein-System wurde dieses Postulat überprüft. Hier war die GR-Hsp90 Heterokomplex Assemblierung unbeeinflusst von der Zugabe von Hip. Die Zugabe von Bag-1 jedoch resultierte in einer Inhibition der Assemblierung. Da Hip- mit der Bag-1-Bindung kompetiert, wirkt es der Bag-1 Inhibition entgegen. Hip ist demnach nicht essentiell für die Assemblierung der Rezeptor-Heterokomplexe, könnte aber im Zusammenspiel mit Bag-1 eine regulatorische Rolle spielen.

24 Die Funktion von CHIP Insgesamt wird die Aktivierung von GR inhibiert, sodass Steroid-Rezeptoren nicht für die Bindung an ihr Substrat zur Verfügung stehen. Dies wird über drei Wege erreicht: (1) Das 35 kda Protein CHIP interagiert als TPR-Protein mit Hsp90 und hält Hsp90 in einem ADPgebundenen Zustand, wodurch p23 nicht mehr binden kann. (2) CHIP inhibiert auch die Hsp70-Interaktion mit GR, bevor Hsp90 überhaupt im Heterokomplex-Assemblierungs-Pathway agieren kann. (3) CHIP hat eine C-terimale U-box, die mit Ubiquitin-konjugierenden Enzymen interagiert und damit den Rezeptor mittels Ubiquitinierung zur proteasomalen Degradation markiert (ob nur im Komplex mit Hsp70 oder auch im Hsp90 Komplex ist unklar). Die Funktion von p50 p50, ein 50 kda Phosphoprotein, das homolog zu cdc37 in Hefe ist, bindet direkt an Hsp90, unabhängig von der TPR-Akzeptor-Stelle. Das Protein kann in Protein-Kinase-Hsp90 Heterokomplexen gefunden werden. Ist p50 nicht vorhanden, so wird das Signaling durch diese Kinasen erheblich reduziert. Die genaue Funktion ist unbekannt (erste Vermutung, dass p50 Hsp90 zu Kinasen dirigiert scheinbar falsch). GR-Hsp90 Heterokomplexe beinhalten TPR-Proteine, aber kein p50. Immuno-isolierte cdk4-hsp90-heterokomplexe beinhalten p50, aber keine TPR Proteine. Wahrscheinlich liegt die p50-akzeptorstelle in der Nähe der TRP-Akzeptorstelle, sodass gleichzeitige Bindung nicht möglich ist. Das 5-Protein-System: essentielle und nicht-essentielle Chaperone Das 5-Protein System macht es möglich zwischen essentiellen und nicht essentiellen Chaperonen für die Öffnung der Steroid-Bindetasche und der Assemblierung eines stabilen Rezeptor-Hsp90 Heterokomplexes zu unterscheiden. Die Öffnung der Steroid-Bindetasche kann auch ohne p23 erfolgen, wenn Steroide während der Assemblierung vorhanden sind. p23 ist damit nicht essentiell, da der Rezeptor eine funktionale Konformation in Abwesenheit von p23 erreichen kann. Das Assemblierungssystem arbeitet schneller, wenn essentielle Chaperone durch Hop zusammengebracht werden, aber Hop selbst ist nicht essentiell für die Assemblierung. Hop-Abwesenheit resultiert in Reduktion aber nicht Eliminierung der SR-Aktivität. Hsp40 ist ebenso wie Hop nicht essentiell, erhöht aber die Kapazität der Steroid-Bindung (also die Stabilität und damit die Menge der Heterokomplexe). Ausschließlich Hsp70 und Hsp90 sind essentiell. Die anderen drei Proteine erhöhen lediglich die Steroid-Bindungsaktivität und p23 stabilisiert den Heterokomplex! Struktur-Funktions-Beziehung in Hsp90 Nukleotid-Interaktion N-terminale Nukleotidbindetasche (Aminosäuren 1-220). Strukturell einzigartig. Kleine Proteinfamilie (GHKL-Familie mit Bergerat fold für ATP-Bindung) mit verwandten Bindetaschen für ATP. ATP Bindung und Hydrolyse wird genutzt um die Konformationszustände des Proteins zu regulieren. In Hsp90 induziert die ATP-Bindung die Dimer-Interaktion nahe der N-Termainalen

25 Domänen des Homodimers. Diese Interaktion kommt zu der konstitutiven C-terminalen Dimer- Interaktion hinzu. Es wird angenommen, dass die N-terminale Domäne als molecular clamp während der Chaperon-Funktion agiert. Die ATPase Aktivität von Hsp90 wird auch von Resten außerhalb der Nukleotidbindetasche beeinflusst. Außerdem sind die Dimer-Interaktionen für die ATPase Funktion essentiell. Die Bindung von Client-Proteinen und Co-Chaperonen moduliert die ATPase Aktivität von Hsp90 (ATPase Aktivität wird erst dann induziert, wenn sie notwendig ist). Mechanismus der Spalt-Öffnung Der Prozess der Spalt-Öffnung lässt sich in einer Reihe ATP-abhängiger Schritte erklären. In der Abbildung sind Hop und Hsp40 wegen Übersichtlichkeit weggelassen worden. (1) Unter ATP-Verbrauch entsteht der Rezeptor-Hsp70-Hsp40 Komplex. Durch diese Reaktion wird der Rezeptor für seine Aktivierung durch Hsp90 vorbereitet. (2) Anschließende Bindung von Hsp90, Hop und p23 ist ebenso ATP-abhängig und aktiviert die Öffnung der Steroid-Bindungstasche. (3) Nach Hsp90 Bindung liegt ein weiterer ATP-abhängiger Schritt vor, der es den Steroiden erlaubt in die Steroid-Bindetasche einzudringen. (4) Hsp90 ist nun im ATP-gebundenen Zustand, wodurch p23 binden kann. Bindestellen in Hsp90 - Co-Chaperon-Interaktion: Es sind zwei verschiedene Co-Chaperon Interaktionen für Hsp90 beschrieben. TPR-Proteine wie Immunophiline binden in der Nähe des C-Terminus. Nicht- TPR-Proteine wie p50 binden an eine andere Stelle in Hsp90. - Chaperon-Interaktion: Hsp90 hat zwei unabhängige Chaperon-Bindestellen unterschiedlicher Spezifität. Die eine ist eine Hsp70-Bindestelle. - Hsp90-Substrat Interaktion: Hsp90 kann alleine keine biologischen Substrate binden und benötigt daher die Hilfe zahlreicher anderer Proteine. Die genauen Bindestellen sind nicht bekannt.

26 Klasse 4: Hsp20 Chaperone oder Hsps werden nach ihrem Molekulargewicht in verschiedene Klassen aufgeteilt (100, 90, 70, 60, 40). Alle Hsps, die weniger als 40 kda wiegen, werden in der Klasse der small heat shock Proteine zusammengefasst (shsp oder Hsp20 Klasse; Mitglieder wiegen von 12 bis 43 kda). Es handelt sich um ATP-unabhängige Chaperone (wie auch die Hsp40 Familie), die in allen Organismen vorkommen und hochkonserviert sind. Sie sind essentiell für die Zell-Lebensfähigkeit nach zellulärem Stress und werden häufig (aber nicht immer) infolge von Stressoren vermehrt exprimiert, wodurch der Organismus die neuen physikalischen oder chemischen Stimuli tolerieren kann. Sie binden an ungefaltete Proteine und verhindern dadurch ihre Aggregation. Die anschließende Faltung erfolgt durch das Hsp70/Hsp40 System. Mitglieder dieser Proteinklasse sind: Im eukaryotischen Zytosol: Hsp12, Hsp42 und α-kristallin (A und B Form). Hsp20, Hsp22, Hsp27 erfüllen spezielle Aufgaben. Die bakteriellen kleinen Hitzeschockproteine lbpa und lbpb verhindern ebenfalls die Aggregation und wurden in Assoziation mit inclusion bodies gefunden. Schnelle Anpassung an die lokale Umgebung ist eine wichtige Aufgabe von glatten Muskelzellen. Kraft wird durch glatte Muskelzellen generiert, indem sie sich dynamisch versteifen, wodurch der Fluss von Blut, Luft und Nahrung, sowie Abfallprodukten reguliert wird. shsps sind in Kontraktion, Proliferation, Zellmigration und Sekretion von Signalproteinen in glatten Muskelzellen involviert und spielen daher dort eine besondere Rolle. Sie werden hier konstitutiv in großen Mengen exprimiert (bis zu 1% des Gesamtproteingehalts). Funktion von Hsp27 und Hsp20 in nicht-muskelzellen Die Expression von Hsp27 in Nicht-Muskelzellen kann durch Hitze, chemische Stressoren oder Cytokinen induziert werden. Insgesamt hat Hsp27 mehrere Aufgaben, die auf eine Erhöhung der Tolleranz gegenüber zellulärem Stress hindeuten. Hsp27 agiert als Chaperon, indem es denaturierte Proteine bindet und ihre Faltung in Zusammenarbeit mit Hsp70/Hsp40 beschleunigt. Humanes Hsp27 sorgt ebenso für Erhaltung hoher intrazellulärer Konzentrationen von reduziertem Gluthation. Zusätzlich ist Hsp27 in Zelldifferenzierung und Apoptose involviert, da es mit AKT, MK2 und p38 MAP-Kinase assoziiert. Phosphoryliertes Hsp27 erhöht die Stresstoleranz u.a. durch Stabilisierung des Aktin- Zytoskeletts. Im Dephosphorylierten Zustand inhibiert Hsp27 die Aktin-Polymerisation, was durch Phosphorylierung aufgehoben wird (vermutlich durch Begünstigung der Bildung von F- Aktin). Hsp20 unterscheidet sich von den anderen Mitgliedern dieser Protein-Familie durch eine weniger effiziente Chaperon-Aktivität. Es spielt ebenso bei der Regulierung der Aktin-Dynamik eine Rolle (Funktion unverstanden). Hsp20 agiert auch extrazellulär, indem es die Thrombozyten-Aktivierung durch Verminderung des Calcium-Einstroms inhibiert. Im Gehirn sind Hsp20 und Hsp22 mit nichtfibrillären β-amyloid Proteinen assoziiert. Es wird angenommen, dass sie dort vor Denaturierung schützen und der Alzheimer-Erkrankung entgegenwirken.

27 αb-crystallin ist eine Hauptproteinkomponente der Säuger-Linsen. Es hält durch seine Chaperon- Aktivitäten die Transparenz der Linse aufrecht und verhindert Linsentrübungen. αb-crystallin wird in vielen Zellen exprimiert und bildet multimere Komplexe mit anderen Hsp20-Mitgliedern. Struktur von Hsp27 und Hsp20 Domänen-Architektur und Motive Humanes Hsp27 (205 AS) hat, wie alle shsps, eine konservierte C-terminale α-crystallin Domäne ( AS groß), welche die Dimerisierung von Hsp20 Proteinen über je 9 interagierende β-faltblätter vermittelt. Die C-terminalen Aminosäuren variieren zwischen den Spezies und bilden eine flexible Struktur, die scheinbar für die Chaperon-Funktion verantwortlich ist. Zusätzlich existiert eine N-terminale hydrophobe Domäne, welche das Motiv WDPF enthält und eine Phosphorylierungsstelle für die MAPKAP-Kinase (MK2) darstellt. Dieses Motiv ist essentiell für die Chaperon-Aktivität, sowie die Toleranz gegenüber Hitze. Das WDPF Motiv ist über einen Linker mit der Dimerisierungs-Domäne verbunden. Dieser enthält zwei weitere MK2 Phosphorylierungsstellen in der humanen Sequenz. Die Phosphorylierung an diesen Serinen reguliert Polymer-Assemblierung und Aktin-Bindung. Humanes Hsp20 (160 AS) besitzt ebenso die Dimerisierungsdomäne und zwei Phosphorylierungsstellen. Diese werden durch die camp-abhängige Protein-Kinase (PKA) phosphoryliert. Die Unterschiede in den Molekulargewichten der einzelnen shsps werden durch die unterschiedlichen Längen des Linkers und des C-Terminus begründet. Multimere Strukturen Im glatten Muskel liegen shsps als Makromolekulare Komplexe vor (von Dimeren bis zu Multimeren von kda, Beispiel einer Kristallstruktur siehe Abbildung). Multimere können unterschiedliche Hsps, sowie andere Bindungspartner enthalten. Sie werden dynamisch durch Protein-Kinase Kaskaden reguliert, welche eine oder mehrere Stellen von Hsp27 oder Hsp20 phosphorylieren. Hsp27 assembliert in Multimere zwischen 50 und 700 kda, wobei große Multimere dominieren. Multimere bilden sich durch Interaktionen nicht-phosphorylierter Dimere (Dimerisierung erfolgt über α-crystallin Domäne). Phsophorylierung an Ser82 bewirkt Dissoziation der Multimere und zusätzliche Phosphorylierung an Ser15 reguliert die Interaktion der entstandenen Dimere mit Aktin-Filamenten (F-Aktin wird im Ser15-P Zustand stabilisiert; d.h. Aktin-Polymerisation wird unterstützt, was in glatten Muskelzellen u.a. für Kontraktion verwendet wird). Im Dephosphorylierten Zustand von Hsp27 wird F-Aktin destabilisiert. Die Phosphorylierung wird durch diverse Stimuli wie Neurotransmitter, Cytokine oder Wachstumsfaktoren über GPCRs oder RTKs und anschließende Signalkaskaden bis hin zu MK2 induziert.

28 Hsp100 Familie (Clp Chaperone) Phylogenetische Einteilung der AAA+ATPasen Die bedeutendste Gruppe der NTPasen ist die Gruppe der P-Loop-NTPasen. Die Struktur der P-Loop Domäne besteht aus einem dreischichtigen αβα-sandwich (Faltblätter bilden Zentrum und werden von Helices flankiert). Auf Sequenzebene werden diese P-Loop-NTPasen durch zwei konservative Motive (Walker A und Walker B) charakterisiert, die für Nukleotidbindung via β- und γ-phosphat und die Koordination des für die Hydrolyse benötigten Mg zuständig sind. Zu den P-Loop-NTPasen gehören Proteine, die eine RecA-Faltung aufweisen. Hier befindet sich ein zusätzlicher β-strang zwischen P-Loop-β-Strang und Walker-B-β-Strang, der einen konservativen Rest enthält (Sensor- 1; koordiniert das γ-phosphat des ATP über ein Wassermolekül).

29 Zu den RecA-Faltungsproteinen gehören die Entfalter, die in Rückfaltung und Entfaltung verschiedener Biomoleküle involviert ist. Die Mitglieder dieser Klasse besitzen meist die Fähigkeit hexamere Ringe zu bilden. Eine weitere Gemeinsamkeit ist ein konservativer Arginin-Rest in der N-terminalen Region des β5-stranges, der als Arginin-Finger bezeichnet wird und in Richtung des Nukleotids der Nachbaruntereinheit im Ring zeigt (Kommunikation zwischen Untereinheiten) AAA + -ATPasen haben zusätzlich ein Bündel aus vier helikalen Segmenten, das C-terminal zum β5-strang der ATPase-Domäne lokalisiert ist. Hier ist ebenso ein konservierter Arginin-Rest enthalten (Sensor-2; Hilfsfunktion bei ATP-Hydrolyse, Funktion als Sensor nach Konformationsveränderung). Dieser Bereich fungiert als Substratbindestelle. Die meisten Mitglieder dieser Gruppe fungieren als Chaperone. Die Vielfalt der Funktion von Proteinen in der AAA + -ATPase Familie umfassen Membranfusion, Vesikel-Trafficking, Cytoskelett-Regulation, Intrazellulärer Transport, Biogenese von Organellen, DNA-Replikation und -Reparatur sowie Transkriptionsregulation. Alle AAA + -ATPasen bilden einen Ring- oder Zylinder-förmigen Oligomeren Komplex (meist Hexamer) mit einem engen Kanal in der Mitte und den Nukleotidbindestellen an der Oberfläche zwischen den Untereinheiten. Neben den genannten konservierten Modulen besitzen die AAA + -ATPasen spezifische andere Domänen, welche Spezifität und Lokalisation bestimmen. Viele AAA + -ATPasen interagieren mit Partner-Molekülen, welche ihre Funktionen modulieren. AAA-ATPasen (ATPases Associated with various cellular Activities), kurz: Triple-ATPasen, besitzen einen hoch-konservierten Bereich, der als SRH (Second region of homology) bezeichnet wird. Er enthält ca AS und wird durch Sensor-1 und Arginin-Finger sequenziell begrenzt. AAA-ATPasen besitzen anstelle des Sensor-2 Arginins meist ein Alanin, wobei dafür zwei andere Arginin-Reste hoch konserviert und essentiell für die ATPase Aktivität sind. Man unterscheidet 6 Gruppen von AAA- ATPasen und einige Nebengruppen (siehe unten). Typ 1 und Typ 2 AAA-ATPasen Typ-II-AAA-ATPasen haben eine ATPase-Domäne, Typ-I-AAA- ATPasen haben zwei ATPase Domänen (D1 und D2). Zwischen den Domänen D1 und D2 sind große Sequenzunterschiede, weshalb Einteilung in 2 Klassen erfolgt. Die ATPase- Domänen sind jeweils stark konserviert und für Nukleotidbindung und Hydrolyse verantwortlich. Bei manchen Typ-II-ATPasen mit zwei ATPase-Domänen kann eine der Domänen ihre ATP- Hydrolyseaktivität verloren haben (z.b. inaktive D2 Domäne bei NSF). Diese Domänen haben wahrscheinlich andere Funktionen im Molekül, wie z.b. die der Oligomerisierung. Daneben beinhalten alle Typ-II-AAA-ATPasen eine N-terminale Domäne (N-Domäne), die sich durch eine charakteristische Doppel-ψ-β- Fass- und β-klammer-faltung auszeichnet.

30 Funktionen der Hsp100 Familie (Clp Chaperone) Clp-ATPasen sind Protein-Maschinerien, welche in Protein-Degradation und Disaggregation involviert sind. Sie wurden ursprünglich in der Hsp100-Familie zusammengefasst und gehören phylogenetisch zu den AAA + -ATPasen. Sie sind in Prokaroyten und in Mitochondiren sowie Chloroplasten eukaryotischer Zellen zu finden. Während u.a. ClpA und ClpX aus E.coli Protein-Entfaltungs- Komponenten von Proteasen darstellen (daher siehe Degradationsmaschinerien) ist ClpB eine Protein-Disaggregations-Maschinerie. Ein weiteres gut studiertes Mitglied dieser Familie ist Hsp104 aus S.cerevisiae, das homolog zu ClpB ist und auch keine Partner-Peptidase aufweist. Insgesamt sind Proteine dieser Familie daher für zwei verschiedene Reaktionen zuständig: Degradation oder Remodeling. Remodeling-Reaktionen sind definiert über die Änderung der biologischen Aktivität der Substrat-Proteine durch Veränderung ihrer Struktur. Beispiele für Remodeling-Reaktionen: (1) Vorarbeit der Degradation durch ClpXP und ClpAP. (2) Resolubilisierung Hitze-induzierter Aggregate durch ClpB und Hsp104. (3) Konvertierung von RepA-Dimeren in Monomere.

31 (4) Destabilisierung der Mu Transposase/DNA-Komplexe durch ClpX. Proteindisaggregation mittels ClpB/Hsp104 ClpB (im Menschen Hsp104) unterscheidet sich von ClpA, ClpX und HslU, da es nicht mit Peptidase- Untereinheiten assoziiert, sowie auch im Zytosol von Hefen und Pflanzen zu finden ist. Die Funktion unterscheidet sich ebenso von den anderen genannten Clp-ATPasen. ClpB ist nicht in Protein- Degradation involviert, sondern disaggregiert und reaktiviert stark aggregierte Proteine. Die Disaggregations-Aktivität von ClpB benötigt die Kooperation mit der Hsp70/Hsp40 Maschinerie. Die disaggregierten Proteine können anschließend durch Hsp70/Hsp40 wieder gefaltet oder durch das Proteasom abgebaut werden. In Zusammenarbeit mit der Hsp70 Familie werden thermisch aggregierte Proteine durch ClpB vollständig reaktiviert. Hsp104 resolubilisiert Hitzeschock-induzierte Aggreagate und katalysiert die Konversion zwischen Prion und Nicht-Prion Formen. Strukturelle Unterschiede zwischen ClpA und ClpB In ClpB ist ein 120AS-langes Segment in D1 insertiert, das in den anderen Mitgliedern der Clp Familie nicht vorkommt. Diese Mittel-Domäne bildet ein Propeller-förmiges Coiled-Coil an der äußeren Oberfläche des oligomeren Rings und hat keine Verbindung mit dem zentralen Kanal. Die Disaggregations-Aktivität könnte durch die Bewegung der Coiled-Coil Struktur bewerkstelligt werden. Die Coiled-Coils könnten mit Proteinaggregaten interagieren und als Brecheisen fungieren (dies ist ein nicht verifiziertes Modell; die Funktion dieser Mittel-Domäne ist unklar). Eine andere Hypothese ist, dass diese Domäne zur Immobilisierung von ClpB an den aggregierten Substraten dient und andere Bereiche für die Disaggregation verantwortlich sind (siehe folgenden Abschnitt). Mechanismus der Disaggregation Die Disaggregation erfolgt wahrscheinlich nach dem gleichen Mechanismus wie die Entfaltung bei ClpA (ATP-getriebene Translokation durch Kanal), mit dem Unterschied, dass ClpA lösliche Substrate hat und ClpB einzelne Polypeptide aus aggregierten Partikeln extrahiert. Der Ausgang von ClpB führt auch nicht wie bei ClpA zu einer Peptidase, sondern ist frei und entlässt die Substrate in das Cytosol, wo ihre Refaltung durch andere Chaperone unterstützt werden kann. Die Sequenz von ClpB und ClpA ist sehr ähnlich (vor allem die Kanal-Loops), was ebenso auf einen konservierten Mechanismus schließen lässt. Erkennung der Substrate

32 ClpB erkennt, wie zu erwarten war, keine ssra-tags (diese werden als Degradations-tags nur von degradierenden Clp-Proteinen erkannt, siehe unten). Es existieren keine zellulären tag-mechanismen für aggregierte Proteine. Daher muss ClpB eine einzigartige Fähigkeit haben Aggregate zu erkennen und von ungefalteten Proteinen zu unterscheiden (nur exponierte hydrophobe Oberflächen von Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase reichen nicht aus; Aggregate desselben Proteins schon). Kooperation mit Hsp70 Das Durchziehen aggregierter Substrate ist abhängig von der DnaK-Anwesenheit. ClpB interagiert auch in Abwesenheit von DnaK mit Substraten und kompetiert mit DnaK um die Substrat- Bindestellen. Es liegt also irgendeine Funktion von DnaK vor, die vor der Entfaltung stattfindet. Beweise für eine direkte Interaktion zwischen DnaK und ClpB existieren jedoch nicht. Nicht-proteolytische Reaktionen von ClpA und ClpX Es wurde gezeigt, dass die Entfaltungsenzyme ClpA und ClpX nicht nur Degradation, sondern auch Recycling von Proteinen katalysieren. So konvertiert ClpA verschiedene Proteine in vitro von inaktiven Dimeren zu aktiven Monomeren. ClpX ist am Remodeling des Mu-Transposoms aus der Phage Mu beteiligt. Dieses Remodeling- Ereignis ist sehr gut charakterisiert und konvertiert das Transposom von einem Komplex, der die Phagen-spezifische DNA-Replikation inhibiert zu einem Komplex, welcher aktiv die Replikationsinitiation fördert. Damit wird die Funktion eines stabilen Komplexes durch ClpXabhängiges Remodeling verändert. Mu ist ein Virus, der die replikative Transposition nutzt, um sein Genom zu verteilen und sich zu vermehren. Durch diese Spezialisierung hat sich ein Transpositons- System entwickelt, das die Endsequenzen des Mu-Genoms auf einer supercoiled DNA (Transposase = MuA Protein), das Host-codierte DNA-Bindeprotein (HU Protein) und divalente Metallionen benötigt. Mu nutzt einen Chaperon-regulierten Übergang, um die Stufen der Rekombination zu bestimmen. Andere Threading-Machines innerhalb der AAA + -ATPase-Familie Innerhalb der AAA + -ATPase-Familie exisiteren weitere Proteine, die nach demselben Threading - Mechanismus wie die Clp-Proteine funktionieren (z.b. Helikasen, die zentralen Kanal nutzen, um ssdna oder dsdna zu translokieren). Die Loops zwischen Walker A und Walker B sind für die Substrat-Bindung essentiell. Es gibt zwei verschiedene Loop-Varianten in unterschiedlichen Proteinen. Diese sind in Katanin, p60 und in NSF zu finden (siehe AAA-ATPasen).

33 Beispiele für Typ 1 AAA ATPasen Metalloproteasen (z.b. FtsH-Protease aus E.Coli) in innerer Membran von Bakterien für Abbau von löslichen Proteinen und Membranproteinen zuständig. Außerdem in Mitochondrien zufinden. Bestehen aus transmemebraner N-Domäne, zentraler AAA-Domäne und C-terminaler Metalloprotease Domäne. AAA-ATPasen der Meiotischen Gruppe (z.b. Katanin) sind wenig charakterisiert. Sie sind teilweise in der Mikrotubuli-Deassemblierung während Meiose und Mitose verantwortlich BCS1-Gruppe: BCS1 ist Protein in der inneren mitochondrialen Membran, das an Faltung von Membranproteinen beteiligt ist. Zu den Proteasomalen ATPasen gehören die ATPasen in den 19S-Kappen des eukaryotischen 26S- Proteasoms (zentraler 20S-Proteinkomplex + zwei flankierende 19S-Kappenkomplexe). Die katalytischen Reste liegen abgeschirmt im Inneren der heptameren Tonne. Durch den schmalen Eingangskanal kommen nur entfaltete Proteine. Die Entfaltung erfolgt durch die 19S-Kappen, welche sechs verwandte AAA-ATPasen (Rpt1-Rpt6 => Heterokomplex) beinhalten, die eine hexamere Struktur ausbilden. Dieser Komplex besteht aus acht Nicht-ATPase-Untereinheiten (Rpns), die Ubiquitin-markierte Proteine erkennen und binden. Die ATPase-Untereinheiten entfalten das Protein und translozieren es in das 20S-Proteason (Induktion der Öffnung des 20S-Kanals) nach einem sehr ähnlichen Mechanismus wie Clp Proteine. Die einzelnen AAA ATPasen im Proteasom sind für Erkennung verschiedener Protein-Arten verantwortlich. Außerdem sorgen sie für die Deubiquitinierung vor dem proteolytischen Abbau. In Archeen liegt kein Heterokomplex, sondern ein homooligomerer Komplex (PAN, Proteasom-activating Nucleotidase) vor, der analog zu den 19S Kappen das 20S Proteasom aktiviert. Beispiele für Typ II AAA ATPasen Funktion von p97: ubiquitinäres Vorkommen in allen Reichen. Beteiligt u.a. an Membranfusion und Proteolyse. Während mitotischer Zellteilung in Eukaryonten werden Organellen fragmentiert und auf Tochterzellen aufgeteilt und wieder zusammengesetzt. P97 ist an Fusion von ER-Membranen beteiligt und für post-mitotisches Wachstums des Golgi-Apparats und dem Wideraufbau der Kernhülle verantwortlich. Bei Fusion von ER-Membranen bildet p97 ein Komplex mit Cofaktor p47, der mit Syntaxin 5 (Mitglied der t-snare-familie) wechselwirkt. Spekulation: p97 wirkt als Chaperon und bereitet Syntaxin5 Moleküle auf Komplexbildung vor. Die Art des Cofaktors ist für genaue p97-funktion verantwortlich. In allen Funktionen (Zellzyklus- Regulation, Stressantwort, programmierter Zelltod, B-/T-Zellaktivierung, transkriptionale Regulation, Proteinabbau) wirkt p97 als molekulares Chaperon, wobei die einzelnen Prozesse direkt mit der Proteasom-Ubiquitin-abhängigen Proteolyse verknüpft sind. Vermutung: p97 wirkt als Transportmolekül, das Proteine zum 26S Proteasom transportiert. Die Proteine Katanin p60 und NSF beinhalten die Loop-Motive der Clp Proteinfamilie (siehe unten). Katanin p60 ist die AAA-ATPase Untereinheit des Mikrotubuli-Deassemblierungs-Komplexes und könnte mit demselben Mechanismus agieren wie auch die Clp Proteine. NSF (N-Ethylmaleimide-sensitive factor) dissasembliert SNARE Komplexe nach Membran-Fusion mit α-snap Adaptor Proteinen. NSF beinhaltet zwei AAA Module, wobei nur das obere Modul auch das

34 Loop-Motiv beinhaltet. Dies lässt annehmen, dass NSF ein Substrat in den Kanal ziehen kann und es ohne eine vollständige Translokation zu erreichen, wieder frei lässt. Dies würde einer Destabilisierung des Target-Proteins durch kurzes, mechanisches ziehen an einer seiner Komponenten entsprechen. Im nächsten Schritt könnten die SNAREs dann wieder assemblieren. Kinetische Kompetition zwischen Translokation und Refaltung Weitere, Speziellere Faltungssysteme Cotranslationale Faltung am bakteriellen Ribisom: Trigger Factor

35 Die große Ribosomen-Untereinheit (in Bakterien: 50S; kleine: 30S; Gesamt: 70S) katalysiert die Verknüpfung der Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren. Die um 5-20 AS-Reste pro Sekunde wachsende naszierende Peptidkette wird entlang eines 10nm langen Ausgangtunnels innerhalb der großen Untereinheit geführt. Dieser kann bis zu 35 AS in gestreckter Konformation enthalten. Durch den Kanal-Durchmesser von 1,5nm wird die Ausbildung einer Tertiärstruktur verhindert. Die naszierende Polypeptidkette verlässt den Tunnel daher weitestgehend ungefaltet. Die Faltung eines β-faltblatts ist erst in der Nähe des Ausgangs möglich (Trichterförmiger Ausgang, mehr Platz). Helices können sich schon im Gang ausbilden. In Bakterien bindet der Trigger Factor (TF) als erstes Chaperon an alle naszierenden Polypeptidketten und auch direkt an das Ribosom (1:1 Stöchiometrie). Er kommt lediglich in Bakterien und Chloroplasten vor und ist 2-3fach so hoch konzentriert wie die Ribosomen selbst. TF ist in 3 Domänen aufgebaut. Eine 102 AS große Domäne zeigt PPIase-Aktivität, die sehr oft der zeitlich limitierende Faktor für die Proteinfaltung ist. Für die Faltung neu synthetisierter Proteine spielt diese Aktivität überraschenderweise keine Rolle. Das N-Terimale 14 kda schwere Ende des Proteins ist die Ribosom-Binde-Domäne (RBD). Die Funktion der C-terimalen Region ist unbekannt. Im Zytosol ist TF im Monomer-Dimer Gleichgewicht (2/3 Dimer), wobei nur die monomere Form an das Ribosom bindet (1µM Affinität, 2-3facher molarer Überschuss => 90% der Ribosomen mit TF besetzt). Die Affinität zu Peptiden in Lösung ist gering, weshalb sie nur am Ribosom wechselwirken. Die Bindung zwischen Ribosom und TF erfolgt über einen flexiblen Loop des TF signature motifs (17 AS) in der N-terminalen RBD und dem ribosomalen Protein L23. Die naszierende Polypeptidkette wird in eine Kavität des TF eingeschleust, in der 15kDa schwere Proteine Platz finden und in der die Faltung Domänenweise stattfindet. Die TF-Interkation mit ungefalteten Substraten ist hochdynamisch. Es existieren keine Cofaktoren und keine Nukleotidbindung. Simultane Deletion von DnaK und TF ist letal. Dadurch wurde gezeigt, dass diese Chaperone bei der Faltung neu synthetisierter Proteine zusammenarbeiten. DnaK bildet ein Backup System für TF- Mangel, obwohl beide Systeme sehr unterschiedlich sind. Es existiert eine hohe Überlappung gebundener Peptide (77%) zwischen beiden Chaperonen. TF ist eine PPIase (katalysiert die cis/trans Isomerisierung von Peptidylprolyl Peptidbindungen), dennoch bindet TF Peptide mit aromatischen und basischen AS. Das DnaK Bindemotiv umfasst 5 hydrophobe Reste, die durch positiv geladene flankiert werden, weshalb DnaK aliphatische AS bevorzugt. In beiden Fällen werden negativ-geladene AS nicht gebunden. Cotranslationale Faltung in Eukaryoten und Archeen: Präfoldine

36 Präfoldine (PFDs) bilden eine spzielle Chaperon-Familie, die in Archeen und Eukaryonten zu finden ist. PFDs werden im Allgemeinen nicht durch Hitzeschock hochreguliert. In Eukaryonten haben PFDs eine spzifische Rolle: sie sind für die korrekte Aktin- und Tubulin-Assemblierung verantwortlich, indem sie die Mitglieder dieser Proteinfamilien binden und im ungefalteten Zustand auf CCT übertragen. In Archeen sind PFDs mit Chaperoninen der Klasse 2 konjugiert, um naszierende Proteine transient zu stabilisieren (Schutz vor Aggregation; wie bei TF in Bakterien), bevor sie durch die Chaperonine gefaltet werden (ternärer Komplex); sie sind also Co- Chaperone der Klasse 2-Chaperonine. In Archeen gibt es kein Aktin und kein Tubulin, weshalb die Funktion des PFD-CCT Systems unverstanden ist. Auch die Wechselwirkung zwischen PFD und CCT ist in Archeen weniger gut charakterisiert. Dennoch wurde in vitro eine Affinität von PFD zu zahlreichen ungefalteten Proteinen gezeigt (Aktin, Lysozym, GFP ), was auf eine allgemeine Funktion in Proteinfaltung schließen lässt. PFD scheint als ATP-unabhängige Holdase zu fungieren, bevor es das nicht-native Protein an ein ATPabhängiges Chaperonin weitergibt. Sie können in zwei evolutionäre verwandte Klassen eingeteilt werden: - Die Mitglieder der α-pfd-klasse besitzen 140 Aminosäuren und weisen zwei β-stränge auf, die das Protein-Zentrum ausmachen. - Die Mitglieder der β-pfd-klasse haben 120 AS. Die archeale PFD-Quartiärstruktur besteht aus einem Heterohexamer, das aus zwei identischen α- PFD und vier identischen β-pfd Untereinheiten aufgebaut ist; das eukaryotische PFD- Quartiärstruktur besteht aus zwei verschiedenen, aber verwandten α-ähnlichen PFDs (PFD3 und PFD5) und vier verwandten β-ähnlichen PFDs (PFD 1,2,4,6). Jede Untereinheit wiegt kda. Archeale Struktur Die Assemblierung erfolgt zunächst durch den α-pfd-dimer-kern, der über hydrophobe Kontakte zu zwei β-barrels assembliert. Die zentralen Regionen der beiden α-pfds sind dann für die Hexamer- Bildung verantwortlich (Oligomerisierungsdomäne). Letztendlich entstehen zwei acht-strängige β-barrels, wobei die β-untereinheit je ein und die α-untereinheit je zwei β-hairpin turns zu der Grundstruktur beiträgt. Sechs antiparallele Coiled-Coil α-helices ragen aus diesem double-β-barrel Kern heraus, was eine jellyfish -artige Erscheinung mit 6 Tentakeln ergibt. Die Coiled-Coils werden durch die N- und C-Termini einer jeden Untereinheit gebildet. Das distale Ende dieser Coiled-Coil- Strukturen ist für die Chaperon-Aktivität essentiell, da sie hydrophobe Reste exponieren, welche

37 die multivalente Bindung von nicht-nativen Proteinen ermöglichen. In Lösung sind die Tentakeln vollständig solvatiert und unabhängig voneinander mobil. Eukaryotische Struktur Eukaryotisches PFD hat eine ähnliche Struktur wie archeales. Es wurde beobachtet, dass nichtnatives Aktin in einer Kavität, bestehend aus den sechs Tentakel -Coiled-Coils (aus α- und β-untereinheiten), in der Nähe der Öffnung eingefangen und stabilisiert wird. Diese Stabilisierung basiert auf die hydrophoben Reste der Coiled-Coils, die teilweise im Protein-Inneren gelegen sind. Die Bindung von Aktin und Tubulin erfolgt cotranslational. N- und C-terminale Regionen der β-untereinheit sind bedeutend für die Substrat-Interaktion und die Chaperonin-Interaktion zugleich (duale Funktion der Tentakeln). Die Abbildung zeigt den Komplex aus CCT und PFD, wobei PFD in grün und die mit PFD wechselwirkenden Untereinheiten von CCT in gelb dargestellt sind. Model für Wechselwirkung zwischen Aktin, PFD und CCT

38 PFD-Aktin-Komplex interagiert mit spezifischen CCT-Untereineiten und präsentiert die CCT- Bindestellen des nicht-nativen Aktins den apikalen Domänen der CCT-Untereinheiten. Durch die Bindung von Aktin durch CCT dissoziiert PFD wieder ab. CCT stabilisiert Aktin und die Faltung kann nach ATP-Bindung und Hydrolyse beginnen. Aktin ist in blau dargestellt (rot: Reste, die mit CCT interagieren; gelb: Reste die mit PFD interagieren; grün: Reste die mit CCT und PFD interagieren). Faltungsenzyme Faltungsenzyme sind strikt von den Chaperonen zu unterscheiden. In allen Zellen kommen zwei Typen von Faltungsenzymen vor: Proteindisulfidisomerasen (PDIs) und Peptid-Prolyl-cis/trans- Isomerasen (PPIs). Proteindisulfidisomerasen (PDIs) Neben den verschiedenen Chaperonen spielen auch Faltungsenzyme bei der Faltung von Proteinen eine wichtige Rolle. Eine dominierende Klasse stellen die Protein-Thiol-Oxidoreduktasen dar, die Thiol-Redox-Reaktionen katalysieren, welche zur Oxidation, Reduktion und Isomerisierung von Disulfidbrücken führen. Die Funktion der verschiedenen Mitglieder ist von der Lokalisiation abhängig: Im ER (oxidierende Bedingungen) wird die Oxidation und Isomerisierung von Disulfidbrücken an naszierenden Polypeptiden katalysiert. Im Zytosol (reduzierende Bedingungen), in Endosomen und an der Zelloberfläche wird die Reduktion von Disulfidbrücken vermittelt. PDIs zeichnen sich durch den Besitz von vier hintereinander-geschalteten Thioredoxin-Domänen aus, die mit dem cytosolischen Protein Thioredoxin verwandt sind. Diese Proteinklasse kommt bei Eukaryonten auch im ER vor, obwohl aufgrund des hohen oxidativen Potentials im ER Disulfidbrücken spontan gebildet werden können. Der abundanteste Vertreter im Säuger-ER ist PDI, die mit ca. 2 %

39 des Gesamtprotein-Anteils das abundanteste ER-Protein überhaut darstellt. Neben diesem Hauptvertreter existieren im ER noch weitere Oxidoreduktasen, die homolog zu PDI sind. Das schon erwähnte Erp57 interagiert mit Glykoproteinen über seine Bindung zu Calnexin und Calreticulin. Erp72 ist ein durch Stress induzierbares Calcium-bindendes Protein, das drei aktive Thioredoxin- Domänen besitzt. Es interagiert in vitro mit denaturierten Proteinen in einem Komplex mit PDI, BiP und Grp94. Neben diesen gut bekannten, abundanten Oxidoreduktasen, wurden in den letzten Jahren viele neue Oxidoreduktasen identifiziert, deren Funktion und Substrate unbekannt sind. Auch ein interessanter Vertreter ist PDIp, das nur in Pankreasacinuszellen gebildet wird. Es bindet an missgefaltete Proteine und an Peptide und wurde in transientem Kontakt zu sekretorischen Proteinen, die in das ER tranloziert werden, gefunden. Peptid-Proplyl-cis/trans-Isomerasen (PPIs) Die Gruppe der PPIs enthält zahlreiche ubiquitäre Enzyme, welche die cis-trans-isomerisierung von Prolinen katalysieren, ohne dabei das Gleichgewicht zwischen nativem und denaturiertem Protein zu beeinflussen. Dieser Schritt ist oft Geschwindigkeits-bestimmend bei der Proteinfaltung und stellt aufgrund der hohen Aktivierungsenergie eine langsame Reaktion dar. Zusammenarbeit der Chaperone in Eukaroyten, Prokaryoten und Archeen Funktionelle Kooperation zwischen verschiedenen Chaperon-Maschinerien WD40 β-propeller-proteine werden in Hefe durch eine Kooperation von Hsc70 und CCT gefaltet. Beide Chaperon-Komplexe bilden einen stabilen Komplex, über den die einzelnen ungefalteten Client-Peptide übergeben werden können. Solche Interaktionen werden ebenso über Co-Chaperone reguliert. Das Co-Chaperon Hop bindet Hsc70 und Hsp90 über seine TPR-Domäne. Hop moduliert weiterhin die ATPase Aktivität beider Chaperone, wodurch der Transfer von Client-Proteinen beschleunigt wird. Wichtige Chaperone in Prokaryoten

40 DnaK (Hsp70) und DnaJ (Hsp40) erkennen extendierte ungefaltete Polypeptidketten. Es handelt sich um ein Chaperonen-Paar, dass sich die naszierende Polypeptidkette schnappt, nachdem TF gebunden hat. TF = Trigger Faktor und das Hsp70/Hsp40-System ermöglichen eine korrekte Faltung von 65-80% aller Proteine. Nimmt man zusätzlich noch den exchange Faktor GrpE (ATP<->ADP) hinzu, werden zusätzliche 10-20% der Proteine gefaltet. Wenn das Protein immer noch nicht gefaltet ist, agieren GroEL und GroES unter ATP-Verbrauch, sodass weitere 10-20% der Proteine gefaltet werden können. In Bakterien werden solche Maschinerien nicht sehr benötigt, da die durchschnittliche Größe bakterieller Proteine bei nur 30 kda liegt (automatische Faltung wahrscheinlicher). In Bakterien gibt es zwei Ribosomen-gebundene Faktoren, die neu-synthetisierte Polypeptidketten erkennen, nämlich Trigger-Faktor und DnaK. In Hefe binden Ssb Proteine, spezialisierte Hsp70 Vertreter, an naszierende Ketten am Ribosom. Mit wachsender Länge der Polypeptidkette binden in Bakterien wie höheren Eukaryonten Chaperone der Hsp70 und Hsp40 Familie an exponierte hydrophobe Oberflächen. Langsam faltende Proteine mit einer Tendenz zur Aggregation (10-30% aller bakterieller Proteine) können zusätzlich zu ihrer Assoziation mit naszierende Kette-bindenden Chaperonen auch mit einem anderen Chaperonsystem, den Chaperoninen, interagieren. Eukaryontische Vertreter sind das cytosolische TriC/CCT und das mitochondriale Hsp60. Das am besten charakterisierte Chaperonin ist jedoch das bakterielle GroEL. Proteinfaltung in E.Coli Functional Proteomics Chaperone katalysieren die Faltung von 1/3 aller E.Coli Proteine Größenverteilung der Polypeptide, die an GroEL oder DnaK in E.Coli binden.

41 Degradationsmaschinerien In allen drei Reichen des Lebens gibt es verschiedene Degradationsmaschinerien, die aus zwei funktionalen Elementen, einem oligomeren Protease-Ring und einem oligomeren Chaperon-Ring,

42 aufgebaut sind. Dabei hat das Chaperon die Funktion Substrate zu entfalten und über die Ring-Pore in die proteolytische Kammer des Protease-Oligomers zu translokieren. Lediglich die Entfaltung durch die Chaperone benötigt dabei ATP. Die Degradation erfolgt in allen Fällen innerhalb eines selbstassemblierenden nano-kompartiments. Die Tatsache, dass die aktiven Zentren im Zentrum der Kavität vergraben sind, reduziert den Grad unspezifischer Degradation erheblich. In Eukaryonten ist das 26S Proteasom, welches aus einem 20S schweren Protease-Komplex und einem 19S schweren Chaperon-Komplex besteht, eine solche Degradationsmaschinerie. In Bakterien übernehmen unterschiedliche Maschinerien wie die ClpXP Protease, welche aus der ClpP Protease und dem ClpX Chaperon besteht, dieselbe Funktion. Andere bakterielle Degradationsmaschinerien sind FtsH, Lon und HslUV. Die Substrate aller dieser Degradationsmaschinerien haben bestimmte tags, im Falle vom 26S Proteasom Polyubiquitin und im Falle von ClpXP ssra, welche von Adaptor- Proteinen erkannt werden. Diese Adaptorproteine (z.b. Rad23 fürs Proteasom und SSpB für ClpXP) dirigeren die Substrate zur Degradationsmaschinerie. Es existieren auch Fälle, in denen die Degradationsmaschinerie ohne Adaptoren auskommt, indem sie direkt die Substrate erkennt und bindet. Im Gegensatz zu Proteasen, die in Lysosomen oder Vakuolen residieren und Proteine auf eine nichtspezifische Art und Weise degradieren, hat die Degradation innerhalb des Cytosols einen hohen Grad an Spezifität. Dieser wird benötigt, um zelluläre Proteine vor ungewollter Degradation zu schützen sowie um spezifische Proteine mit Signalfunktionen der regulierten Proteolyse zugänglich zu machen. Die Selektive Entfernung regulatorischer Proteine wie Transkriptionsfaktoren oder Signaltransduktionsproteine ermöglicht eine effiziente und schnelle Strategie um Check-Points für viele zelluläre Prozesse zu kontrollieren (Zellwachstum, Teilung, Differentiation, PCD). Das Ubiquitin-System

43 Ub-Modifikationen und resultierende Ereignisse Es gibt zahlreiche Protein-Modifikationen. Die Konsequenzen der Protein-Phosphorylierung sind am besten verstanden: allosterische Aktivierung oder Inaktivierung, Veränderung der subzellulären Lokalisation, Änderung der Proteinstabilität, Einfluss auf Protein-Protein-Interaktionen. Acetylierung, Methylierung und Ubiquitininierung scheinen eingeschränktere, spezifischere Rollen einzunehmen. Naiv: Ubiquitinierung induziert regulierte Proteindegradation im 26S Proteasom. Die Ub-Signale scheinen jedoch so weitreichend zu sein wie die der Phosphorylierung. Aufgrund der chemischen Komplexität von Ubiquitin hat die Ubiquitinierung ein großes Potential verschiedene Signale zu induzieren. Ub (76 AS) hat 7 Lys-Reste, von denen mindestens 5 zwecks Crosslink zu anderen Proteinen verwendet werden können. Di-Ub Ketten an Lys63 haben extendiertere Konformation als Lys48- verknüpftes Di-Ub. Daher können verschieden verknüpfte Ub-Ketten verschiedene strukturelle Eigenschaften aufweisen und unterschiedliche Ereignisse induzieren. Ubiquitinierung im Allgemeinen verändert die Binde-Eigenschaften des Target-Proteins. Die Modifikation dient daher zahlreichen Funktionen. Mono-Ubiquitinierung Mono-Ubiquitinierung induziert die Rekrutietung spezifischer UBPs, welche über Signalweiterleitung downstream liegende Ereignisse induzieren (Transkription, Histon-Funktion, Endocytose, Membran- Trafficking). Beispiele sind: - Mono-Ubiquitinierung von Membranproteinen (z.b. RTKs) bewirkt Rekrutierung endocytotischer Proteine, was Internalisierung induziert. Es folgt das Targeting zum Lysosom. - Das sequentielle Anhängen und Entfernen eines Ub-Restes auf die Histone H2B und H2A ist für die Transkriptionsaktivierung erforderlich. Dies könnte mit der Auflockerung des Chromatins oder mit der Bindung von Transkriptionsfaktoren zutun haben. Sicher ist, dass weitere Histon-Modifikationen wie Acetylierung und Methylierung gefördert werden (evtl. durch Rekrutierung eines Acetyltransferase Komplexes). Die Ubiquitinierung von H2B ist z.b. das Signal für die Methylierung von H3. Poly-Ubiquitinierung Lys48- (oder weniger häufig Lys11- oder Lys29-) Poly-Ubiquitinierung werden vom 26S Proteasom erkannt, das die Degradation des Zielproteins einleitet. Die Ubiquitinierungs- und Degradations- Maschinerie (E3 und 26S) wird über UBPs verknüpft. Es ist eine schnelle, irreversible Methode die Proteinmenge zu kontrollieren (Bsp. Zellzyklus-regulatorische Proteine werden von diesem System

44 kontrolliert, indem die E3 Enzyme APC und SCF das Protein-Targeting zum Proteasom übernehmen und damit den Zellzyklus kontrollieren). Zur Erkennung durch das Proteasom muss die Poly-Ub Kette mindestens 4 Ub-Reste lang sein. Einige poly-ubiquitinierte Proteine werden jedoch nicht degradiert. Oft findet man mehr als eine Poly-Ub Kette pro Substrat, wobei die Funktion multipler Poly-Ub Markierungen unklar ist (eine Poly- Ub Markierung ist für alle getesteten Substrate als tag zur Degradation ausreichend). Mono- und Poly-Ubiqutitinierung an Lys63 und Lys6 Lys63- und Lys6- Mono- und Poly-Ub Markierungen induzieren keine Degradation, sondern modifizieren die Proteinfunktion (Proteinaktivität, Subzelluläre Lokalisation, Protein-Protein- Interaktionen). Diese Modifikationen sind reversibel. - Poly-Ub Ketten an Lys63 ist an DNA-Reparatur, Transkriptionsfaktoren, Stress-Antwort, Endocytose und Signal-Transduktion involviert, indem die Proteinfunktion direkt moduliert wird. - Poly-Ub Ketten an Lys6 bewirken Ub-Deassemblierung über 26S (Bedeutung unklar). Lys63-verknüpftes Ubiquitin ist auch in das Targeting zum Autophagie-Pathway involviert. In diesem Fall agieren die Proteine p62 und NBR1 als UBD-haltige Proteine, indem sie das Target- Protein erkennen und zur Autophagie-Maschinerie über die Bindung von Atg8/LC3 dirigieren. Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-ähnliche Proteine (ULPs) Ubiquitin ist ein in allen Eukaryonten vorkommendes und hochkonserviertes (96% Identität) Protein, das nicht in Bakterien oder Archeen vorkommt. Es ist mit 8,5 kda ein kleines Protein, das aus 76 Aminosäuren besteht. Alle Proteine mit einer Ubiquitin-ähnlichen (UBL-)Faltung werden als Ubiquitin-ähnliche Proteine (ULPs) bezeichnet. Die UBL Faltung hat insgesamt eine globuläre Form, wobei lediglich die letzten vier C-terminalen Aminosäuren hervorragen.

45 Die Ubiquitin- und UBL-Faltungen sind charakterisiert durch ein gemischtes 5-strängiges β-faltblatt und zwei α-helices in einer ββαββαβ Sekundärstruktur-Topologie (β-grasp Faltung). Dabei sind β1 und β4 im Kern der Faltung parallel zueinander orientiert. Diese sind von der konkaven Seite aus durch die Helices α1 und α2, sowie an beiden Seiten durch die antiparallel orientierten β2 und β3 Faltblätter umgeben. Im Falle der Atg8- Homologen Proteine, die ebenso zur UBL-Familie gehören, existieren zwei weitere N-terminale α-helices, die dann als α1/α2 bezeichnet werden, während die Helices der UBL-Faltung α3/α4 heißen. Vergleich: Ubiquitin-Struktur vs. GABARAP- Struktur (Atg8-homolges Protein). Die Strukturen von ULPs sind sehr ähnlich, wobei größere Strukturunterschiede meist auf die Bereiche N-Terminus (AS 1-14), β1-β2 Loop (AS 37 46), α3-β3 Loop (AS 66-75) und C-Terminus (AS ) zurückzuführen sind. Es wird angenommen, dass das Ubiquitinsystem, wie es in Eukaryoten vorliegt, aus einer Vielzahl verschiedener Teile und Pathways, die bereits ihre Diversifikation in Prokaryonten unterlaufen haben, zusammengebastelt wurde. Ub kann in Hefe transient an tausende verschiedene Proteine verknüpft werden. Einige ULPs haben eine ähnliche Anzahl an Substraten, wie SUMO, andere haben eine eingeschränktere Substratspezifität im Vergleich zu Ub (Atg12 hat nur ein einzelnes Ziel: Atg5). Die molekularen Mechanismen der Ub- und ULP-Modifikationen sind sehr ähnlich. Jedes UBL-Protein hat ein spezifisches ULP-Konjugationssystem, das evolutionär verwandt zum Ub- Konjugationssystem (E1/E2/E3 Kaskade) ist und die Anheftung des UBL-Proteins an das Target- Protein ermöglicht. Der Unterschied zum Ub-Konjugationssystem ist jedoch, dass ULPs keine Polymere am Target-Protein ausbilden. Während Ub die Degradation des Zielproteins einleiten kann, hat die Modifikation mit ULPs verschiedene, nicht-proteolytische Folgen. Gebundene ULPs regulieren hauptsächlich Interaktionen von Proteinen mit anderen Makromolekülen wie die Bindung an das Proteasom oder die Rekrutierung zum Chromatin. Die meisten UBL-Modifikationen sind transient. ULP- und Ub-

46 Konjugation können kompetieren und sich damit gegenseitig regulieren, wenn sie denselben Lys-Rest modifizieren. Bisher wurden neun verschiedene UBL-Proteine entdeckt, die Proteine modifizieren können. Beispiele für UBLs sind NEDD8, SUMO (small ubiquitin related modifier), Atg8 und Atg12 (siehe Autophagie). Es existieren auch ULPs, in denen die UBL-Domäne nur ein kleiner Teil eines größeren Makromoleküls ist. Einige Ubiquitin-ähnliche Domänen (ULDs) können unter spezifischen Bedingungen geschnitten werden. Beispiel: Autocleavage erfolgt im deubiquitierenden Enzym Usp1 nach UV-Schädigung der Zelle, wodurch Usp1 inaktiviert wird. Dadurch akkumuliert Mono-Ub markiertes PCNA, das für Transläsions-DNA-Synthese benötigt wird. UBL-Konjugation verschiedener Proteine ermöglicht die Austattung dieser Proteine mit einer ULD. Das Target-Protein wird also mit einer zusätzlichen, spezifischen Bindestelle ausgestattet, welche eine Affinität zu Ubiquitin-assoziierten Domänen (UBAs) aufweist. Small Ubiquitin-like modifier (SUMO-1) SUMO-1 ist ein UBL mit 97 AS und kann über ähnliche enzymatische Reaktionen an Zielproteine gebunden werden. Zielproteine sind meist im Zellkern, darunter Reparaturenzyme, Transkriptionsfaktoren, Coaktivatoren, Transportproteine und Kernporen-Proeine. SUMO kann verschiedene Funktionen beeinflussen: SUMO kann Ubiquitinierungen unterdrücken. Z.B. kann IκB an derselben Stelle ubiquitiniert und sumoyliert werden, weshalb SUMOylierung die Ub-abhängige Degradation verhindert. SUMO kann Funktionen modifizieren. Der Prozessivitätsfaktor PCNA funktioniert bei der Reparatursynthese, wenn es einen Monoubiquitin-Rest trägt und bei der Replikation, wenn er sumoyliert ist. SUMO beeinflusst die Beweglichkeit von Kernproteinen, den Transport durch die Kernporen und die Mobilität innerhalb des Zellkerns. SUMOylierung von RanGAP1 bewirkt Targeting zum NPC (nuclear pore complex). SUMOylierung von Histon H4 resultiert in Transkriptions-Repression (evtl. durch Rekrutierung von Histon-Deacetylasen). Erkennung ubiquitinierter Proteine durch Ubiquitin-Binde-Proteine (UBPs) Konjugierte Ub/UBL-Reste werden im Allgemeinen durch verschiedene Ubiquitin-Binde-Proteine (UBPs) erkannt, die alle eine Ubiquitin-bindende Domäne (UBD) gemeinsam haben. Solche vermitteln zwischen der spezifischen Ub-Markierung des Target-Proteins und dem dazugehörigen Effektor. Es existieren verschiedene UBDs, welche an Mono- oder Poly-Ub Ketten, sowie UBL- Proteine binden können. Proteine, welche folgende Domänen enthalten sind meist für das Signalling, ausgehend von Ub- oder UBL-markierten Proteinen verantwortlich. Sie könnten auch die Bildung von Poly-Ub Ketten inhibieren, indem sie Lys48 von Ub binden und damit die weitere Polymerisation blockieren. - UBA (Ub-associated domain) - UIM (Ub-interacting motif) - CUE (coupling of Ub conjugation to ER degradation domain) - UEV (Ub E2 variant domain)

47 UBPs wie Rpn10, Rad23, Dsk2 und Ddi1 schützen Poly-Ub Ketten vor Deubiquitinierung und transportieren sie zum Proteasom. Einige UBPs binden E3s und/oder das 26S Proteasom, sodass sie die Brücke zwischen Ubiqutin-System und Degradations-System bilden. Deubiquitinierung durch Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) wirken der Aktivität der E1/E2/E3 Kaskade entgegen, indem sie Poly-Ub Deassemblieren. Ubiquitinierung ist daher eine reversible Reaktion, da viele Cystein- Proteasen und Metalloproteasen (Deubiqutinierungsenzyyme, DUBs) in der Zelle vorliegen (humanes Genom codiert für 95 DUBs). Spezifische DUBs sind für die Reifung von Ub aus seinen Vorläuferproteinen (Gene codieren Polyubiquitin oder Ubiqutin fusioniert an Ribosomalen Proteinen) verantwortlich. Andere DUBs fungieren in dem initialen Schritt des Abbaus Ub-markierter Proteine, um das Recycling von Ub zu gewährleisten. Deassemblierung von ubiquitinierten Protein-Komplexen Werden Proteine mittels Ubiquitinierung zur Degradation ausgewählt, die in einem größeren Proteinkomplex lokalisiert sind, muss das entsprechende Protein vor dem Proteasom-Targeting aus dem Komplex entfernt werden. Dies geschieht über den Cdc48-Komplex. Für die Ubiquitinierung, die der Deassemblierung vorangeht, werden exponierte Lysin-Reste (gelegentilich auch Cys, Ser, Thr) innerhalb einer flexiblen Region benötigt. Die E1/E2/E3 Kaskade: Ein Überblick

48 Ub-Konjugation benötigt zunächst ein Ub-aktivierendes Enzym (E1). Das C-terminale Gly von Ub wird durch E1 adenyliert und anschließend entfernt. Es folgt ein nukleophiler Angriff eines konservierten Cys-Restes in E1, wodurch eine Thioester-Bindung zwischen E1 und Ub entsteht. E1 transferiert nun Ub auf ein Ub-konjugierendes Enzym (E2) über die Bildung einer weiteren Thioester- Bindung. Die kovalente Bindung von Ub an Substraten wird durch Ub-Ligasen (E3) katalysiert; solche Proteine enthalten z.b. die Domänen RING, U-box oder HECT. Die RING- und U-box- Domänen E3s beschleunigen den Ub- Transfer von E2 auf das ausgewählte Substrat (Abschnitt 1 der Abbildung). Die HECT-Domänen E3s sind über eine Thioester-Bindung in der HECT Domäne kovalent an Ub gekoppelt, wobei die nachfolgende Interaktion mit dem Substrat für die Ub-Modifikation notwendig ist (Abschnitt 2 der Abbildung). Es sind 12 Ub E2s in S.cerevisae und über 30 E2s im Menschen bekannt. 6 HECT E3s in S.cerevisase, 27 im Menschen. Die Mehrheit an E3s haben eine RING-Finger Domäne ( E3s in S.cerevisae, über 500 E3s im Menschen). Die E3 Enzyme zeigen eine hohe Diversität, da jedes Enzym ein bestimmtes Substrat erkennt und ligiert. Funktion und Mechanismus von E1 Für die Ubiquitinierung der Zielproteine werden drei Enzyme benötigt. Zunächst wird Ub durch E1 (Ub-activating Enzyme) aktiviert. E1 adenyliert den C-Terminus (enthält konserviertes Di-Glycin) von Ub und bildet anschließend eine Thioester-Bindung zwischen dem Ub C-Terminus und dem katalytischen E1 Cystein-Rest. Um vollständig aktiv zu sein, muss E1 nicht-kovalent an ein zweites Ub-Molekül binden und es adenylieren. Hiernach wird das Thioester-verknüpfte Ub von E1 auf den aktiven Cystein-Rest von E2 (Ubconjugating entyme) transferiert, wo es erneut über Thioester-Bindung verknüpft wird.

49 Die drei Funktionen von E1 (Adenylierung, Bildung des Thioesters, Bindung an E2) erfolgen in einer koordinierten Reihenfolge innerhalb einer einzigen Bindetasche, wo ATP und Ub in zwei angrenzenden Spalten binden. Der C-Terminus von Ub befindet sich im aktiven Zentrum der Adenylierung, 3,5 nm vom katalytischen Cystein entfernt. Die Flexibilität des C-Terminus von Ub, sowie Umorientierungen innerhalb E1 ermöglichen die Bewegung von Ub zwischen den aktiven Zentren. Ein konservierter Thr-Rest, nicht weit entfernt vom katalytischen Cystein, könnte die Deprotonierung der Cysteine aus E1 und E2 erleichtern. Funktion und Mechanismus von E2 E2 Proteine weisen eine konservierte Kerndomäne (150 AS) auf, welche aus einem zentralen β-faltblatt mit flankierenden Helices besteht. Das katalytische Cystein liegt in einer flachen Tasche. Insgesamt ist die E2 Struktur relativ unflexibel (kaum strukturelle Änderungen in E2s, E2-E3 Komplexe und E2-Substrat Komplexe). Der C-terminale Schwanz des Thioester-verknüpften Ubiquitins befindet sich innerhalb der flachen Tasche und zeigt zum aktiven Cystein. In der Nähe des katalytischen Cysteins von E2 befinden sich keine weiteren katalytischen Gruppen. Es wurde keine Base gefunden, welche die Deprotonierung des Lysins und somit den nukleophilen Angriff zur Bildung der Isopeptidbindung erleichtert. Es wurden auch keine Reste gefunden, welche das negativ geladene tetraedrische Intermediat stabilisieren könnten. Solche Gruppen müssten sich demnach in den aktiven Zentren der weniger gut charakterisierten E3 Enzyme befinden (strukturelle Analysen haben jedoch gezeigt, dass auch hier keine katalytischen Reste in der Nähe des E2 Cysteins liegen). Oder der Ub-Transfer geschieht spontan, wenn Substrat und E2-Ub-Thioester korrekt positioniert sind, aufgrund der hochlabilen Thioester-Bindung. Ein konservierter Asp-Rest in E2 ist Teil eines Wasserstoffbrücken-Netzwerks in den E2 Strukturen, weshalb angenommen wird, dass dieser Rest eine essentielle strukturelle Rolle hat. Der Rest soll eine Rolle in der Isopeptid-Bildung spielen, indem er das Oxyanion-Intemediat stabilisiert. Asp ist essentiell für den Ub-Transfer von E2 zum Substrat (nicht aber von E1 zu E2 oder von E2 zu HECT-E3). Dies könnte an einer Asp-Seitenketten-Umorientierung liegen, welche durch die Thioester-Bindung zwischen E2 und Ub induziert wird. Die Spezifität der E2-E3 Interaktion wird nur durch wenige AS bestimmt. Mechanistisch und strukturell verschiedene E3s interagieren mit E2s auf gleicher Art und Weise, indem sie mit einer hydrophoben Tasche zwei loops am Ende der E2 β-faltblätter binden. Funktion und Mechanismus von E3 Mit der Hilfe von E3 (Ub-Ligase) wird Ub von E2 auf den Lysin-Rest eines Substrat-Proteins übertragen. Dieser finale Ub-Transfer resultiert in einer Isopeptidbindung zwischen der ε- Aminogruppe eines Substrat-Lys-Restes und dem C-terminalen Carboxylat von Ub. Seltener kann Ubiquitinierung am N-Terminus des Substrat-Proteins geschehen. Die Mechanismen verschiedener E3s unterscheiden sich voneinander. Positionierung der Akzeptor-Lysine spezifisch gebundener Substrate in direkter Nähe zum aktivierten Ubiqutin ist die Hauptaufgabe der E3s. E3s bilden damit ein Gerüst, um Ub-beladene E2s und Substrate in direkte Nähe zu bringen. Substrate können nach dieser Ansicht an allen Lysin-Resten

50 innerhalb einer akzeptablen Distanz zum aktiven Zentrum Ub-markiert werden. Eine präzise Positionierung spezifischer Akzeptor-Lysine ist nach dieser Auffassung nicht notwendig! In Eukaryonten existiert nur ein einziges E1 Enzym (Uba1). Im Vergleich dazu existieren E2s, wobei jedes E2 Molekül mit mehreren E3 Molekülen interagiert, deren Anzahl die der E2s stark übertrifft. Dies erklärt: E3s sind für die Substrat-Spezifität des Ub-Pathways verantwortlich, wodurch Ub-Modifikationen zu verschiedenen Proteinen übertragen werden können. Das E3 Enzym ist auch die einzige regulierte Komponente des Ub- Pathways. Abbildung: E3s binden E2s und Substrate und positionieren die Reaktanden optimal für die nachfolgende Reaktion. Außerdem könnte E3 eine Base für die Deprotonierung des Elektronenakzeptors Lysin zur Verfügung stellen. Nach Deprotonierung des Lysins erfolgt der nukleophile Angriff auf die Thioesterbindung zwischen E2 und Ub, wodurch ein Oxyanion-Intermediat entsteht, dessen negative Ladung durch ein Oxyanion-Loch stabilisiert wird. Nach der Übertragung des Ub auf das Substrat-Lysin muss das Substrat Repositioniert werden, sodass Lys48 von Ub im aktiven Zentrum liegt. Dieses kann nun mit einem neuen, geladenen E2 Molekül reagieren, um ein weiteres Ub-Molekül aufzunehmen. Klassen von E3 Enzymen E3 Ligasen können in zwei mechanistisch unterschiedliche Kategorien eingeteilt werden. Die größte E3 Klasse ist die RING-E3-Klasse (really intersting new gene), deren Mitglieder eine RING-Domäne oder andere strukturell verwandte Domänen (wie U-box-Domäne) aufweisen. Die zweitgrößte Klasse von E3 Ub-Ligasen ist die HECT-E3-Klasse mit HECT-Domäne (Homologous to E6AP terminus domain). Während HECT-E3-Ligasen auch einen katalytischen Beitrag zur Reaktion leisten, bilden RING-E3- Ligasen primär ein molekulares Gerüst für die Reaktion. HECT-E3s agieren damit wie E1 und E2 Enzyme als katalytische Intermediate während des Transfers von Ub auf das Target-Protein. HECT E3 Ub-Ligasen Die konservierte HECT Domäne (350 AS) bildet über einen konservierten Cystein-Rest ein Thioester-verknüpftes Ub-E3 Intermediat während des Ub-Transfers von E2 auf das Substrat.

51 Der Mechanismus wurde anhand des Komplexes zwischen E6-AP (E3) und UbcH7 (E2) für dieses spezielle E3-E2-System aufgeklärt (siehe Abbildung). Die HECT-Domäne besteht aus zwei Flügeln, die N- und C-Flügel genannt werden und zusammen eine L-förmige Struktur bilden. E2 bindet an den N-Flügel, sodass der E2-E3 Komplex U-förmig ist und die katalytischen Cystein-Reste 4,1 nm voneinander entfernt auf gegenüberliegenden Seiten liegen. Die Struktur eines anderen HECT E3 Enzyms (WWP1) hat statt der L-Form die Form eines inversen T mit dem C-Flügel am Zentrum des N-Flügels. Die Struktur innerhalb der Flügel ist identisch zu der von E6-AP. Die katalytischen Cysteine sind hier 1,6 nm voneinander entfernt, weshalb auch hier Konformationsänderungen erforderlich sind. Die Flexibilität eines Hinge-Loops, welcher N und C Flügel verbindet ist für die katalytische Aktivität erforderlich. Die fünf C-terminalen Reste könnten die Base enthalten, welche für die Deprotonierung des katalytischen HECT-Cysteins oder des Akzeptor-Lysins während des Ub-Transfers erforderlich ist. Es existieren zwei Modelle für den Ubiquitinierungs-Mechanismus. Beide Modelle benötigen Bewegungen im Hinge-Loop. Diese eine generelle Eigenschaft von E3 Ligasen erklärt die Anpassung an verschiedene Substrate. (1) Im Sequentiellen Modell nimmt der C-Flügel einen Ub-Rest von E2 auf, rotiert um den Hinge- Loop, transferiert Ub auf das Substrat und fügt weitere Ub-Rest sequentiell hinzu. (2) Im Querverbindungsmodell wird angenommen, dass die Flexibilität des Hinge-Loops die Bildung einer tetra-ub Kette auf WWP1 erlaubt, wonach diese auf das Substrat transferiert wird. Monomere RING E3 Ub-Ligasen Alle nicht-hect-e3-ligasen fördern den Ub-Transfer ohne die Bildung kovalenter Intermediate. Alle enthalten eine RING finger Domäne oder eine strukturell verwandte Domäne. Viele RING (und Ring-verwandte) Domänen haben die E2-abhängige Aktivität Poly-Ub Ketten zu bilden, entweder auf Substrat-Proteinen oder sich selbst. Die RING-finger Domäne enthält acht hoch-konservierte Zink-Koordinierende Reste, welche zwei Zn 2+ Ionen in einem Querverbund binden. Es handelt sich um eine Cystein-reiche Tandem Zink-Finger Domäne, die AS groß ist. U-box Domänen haben dieselbe Faltung wie RING Domänen, wobei die koordinierten Zink-Ionen durch H-Brücken ersetzt sind.

52 RING Domänen interagieren direkt mit E2 Enzymen. Die RING-finger sind jedoch nicht neben dem katalytischen Cystein von E2 positioniert, sodass er nicht in die Katalyse involviert ist (vorher Annahme: positiv geladene Zink-Ionen bilden Oxyanionen-Tasche). RING-finger könnten E2 Enzyme allosterisch aktivieren, wobei auch dies aufgrund nur geringer struktureller Unterschiede zwischen gebundenem und freiem E2 unwahrscheinlich ist. Außerdem können einige E2s Poly-Ub Ketten in Abwesenheit von E3 assemblieren, sodass E3 nicht unbedingt notwendig für die katalytische Aktivität von E2 ist. Multimere RING E3 Ub-Ligasen Neben den monomeren E3s gibt es auch E3s, die Teil multimerer Protein-Komplexe sind. Solche enthalten einen RING-finger, eine Cullin-Domäne und andere Untereinheiten, von denen einige für die Substratbindung verantwortlich sind. Ein Beispiel für einen solchen Komplex ist der SCF-Komplex (SKP1-cullin-Fbox), der auch für ERAD-Substrate verwendet wird sowie im NF-κB- und Wnt-Signaling eine Rolle spielt. Zudeme existieren verwandte SCF-ähnliche Komplexe. Sie bestehen aus vier Untereinheiten: Cul1, Skp1, Rbx1 und F-box. Im Zentrum steht das Cullin-Protein Cul1. Es bindet auf der einen Protein-Seite an das Adaptor- Protein Skp1 (S-phase-kinase-associated protein-1) sowie auf der anderen Protein-Seite das RING- Finger Protein Rbx1. Rbx1 bindet an die Ubiquitin-beladenen E2-Enzyme, während Skp1 ein spezifisches Substrat-Bindeprotein (F-box Protein) rekrutiert. Im Menschen existieren etwa 40 verschiedene F-Box Proteine, die den Kontakt zu den Zielproteinen herstellen. BTB-Proteine kombinieren die Funktion von Skp1 und F-box Proteinen. Die Cullin-Komponente des SCF-Komplexes bildet ein Grundgerüst. Es organisiert den Substrat-Rezeptor (Skp1 gebundene F-box Proteine) an den elongierten α-helikalen N-Terminus und die E2-Rekrutierungsmodule (RING-Proteine wie Rbx1) an den globulären C-Terminus, welcher auch die Cullin-Homologie Domäne enthält. Substrate werden mithilfe von SKP1 und verschiedener F-box Proteine, welche die Substrat-Spezifität regulieren, zu Cullin rekrutiert. Cul1 und Rbx1 assoziieren über zwei Mechanismen. Zunächst bilden sie ein intermolekulares β-faltblatt, wonach die Cullin-Homologie Domäne eine V-förmige Spalte ausbildet, in der die RING Domäne binden kann. Rbx1 hat eine dritte Zink-Koordinationsstelle, deren Funktion unbekannt, aber essentiell sein sollte, da sie auch im APC vorhanden ist. Die verschiedenen Strukturen von SCF Subkomplexen bestätigen, dass die Rolle von RING E3 die Erhöhung der effektiven Konzentration von Lysin-Resten in der Umgebung des aktiven Zentrums

53 von E2 darstellt. Da auch keine E3-Reste in der Nähe des aktiven Zentrums liegen liegt eine nicht-katalytische Funktion der E3s sehr nahe. Die einzelnen SCF-E3-Ub-Ligasen werden durch Nennung des betreffenden F-box Proteins gekennzeichnet: Das SCF-Protein, das für den Abbau des phosphorylierten IκB (NF-κB-Signaling) und des phosphorylierten β-catenins (Wnt-Signaling) verantwortlich ist, verwendet das F-box Protein β-trcp, sodass man für den SCF-Komplex SCF β-tcrp schreibt. SCF SKP-2 ist für die Ubiquitinierung des CDK-Inhibitors p27 verantwortlich. SCF hcdc4 ubiquitiniert Cyclin E. Ein weiterer Multiproteinen E3-Komplex ist APC (Anaphase Promiting Complex). Er besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten, von denen acht essentiell für die Lebensfähigkeit der Hefe ist. Der Komplex besteht aus einer äußeren Proteinwand, welche eine Käfig-ähnliche Struktur aufweist. Die innere Kammer könnte das katalytische Zentrum enthalten. Spezialfall: Sumoylierung ohne E3 RanGAP1 wird durch das SUMO-konjugierte E2 Enzym Ubc9 ohne E3 Einfluss sumoyliert. Das aktive Zentrum von Ubc9 hat viele Gemeinsamkeiten mit dem anderer E2s, welche Ubiquitinierung vermitteln. Das Lysin-Substrat von RanGAP wird in einer flachen Tasche von Ubc9 gebunden, sodass die ε-aminogruppe des RanGAP-Lysins sehr nahe an der Thiolgruppe des Ubc9-Cysteins lokalisiert ist. Diese ideale Position alleine bewirkt den Angriff des elektrophilen C-Atoms der SUMO-E2 Thioesterbindung durch Lysin. Bildung und Topologie von Poly-Ub-Ketten Das Schicksal eines Proteins ist von der Länge der Ub-Kette und seiner Topologie abhängig, weshalb nicht nur Substratspezifität der E3s, sondern auch die Erkennung der Ub-Länge und Topologie relevant ist. Die Art der Ub-Modifikation (Mono-Ub oder Topologie der Poly-Ub-Kette) wird durch die Zusammenarbeit spezifischer E2s und E3s bestimmt, wobei nicht bekannt ist wie die Erkennung von Ub-Lysin und des Substrats zugleich erfolgt. Die Ub-Kette kann bis zu 10 Ub-Reste enthalten. - Die E3-Ligase Mdm2 ist in der Lage Mono-Ub an p53 zu verknüpfen. Dieseser Mono-Ub Rest kann durch die E3 Ligase p300 verlängert werden, sodass eine Poly-Ub Kette entsteht. - Die E2/E3 Ligase Aktivität von Rad6-Rad18 ist in der Lage Mono-Ub an PCNA zu verknüpfen. Der E2 Komplex aus Ubc13 und Mms2 assoziiert mit der E3 Ligase Rad5 und katalysiert dann die Bildung von Lys63-Poly-Ub aus dem PCNA-Mono-Ub. - Der Ubc13-Mms2 Komplex katalysiert auch die Lys63-Poly-Ubiquitinierung von TRAF2, wodurch er am NFκB Pathway partizipiert. Ebenso können E2s und E3s multimerisieren, was die Bildung von Poly-Ub Ketten beschleunigt. Das E3 Enzym NEDD4 hat zwei unabhängige E2-Bindestellen, von denen beide für die Aktivität notwendig sind. Das SCF E2 Enzym Cdc34p bildet Multimere, die abhängig von der Bildung einer E2-Ub Thioesterbindung sind, wobei diese Cdc34 Selbst-Assoziation für de Poly-UB Kettenbildung essentiell ist.

54 Außerdem spielen E4 Enzyme eine Rolle. Das E4 (poly-ubiquitin chain conjugation factor) Enzym reguliert die Kettenverlängerung. E4 (Ufd2) bindet Substrat-konjugiertes Ub und unterstützt die E1-, E2- und E3-abhängige Polymerisierung von langen Poly-Ub Ketten. E4 wird nicht zur Konjugation des ersten Ub-Restes benötigt, dirigiert aber bestimmte Verknüpfungen in Poly-Ub-Ketten. Ubiquitinspezifische E3 Ligasen, die Ub-Ub Bindungen, aber nicht Ub-Substrat Bindungen katalysieren, spielen eine ähnliche Rolle. Hit&Run-Mechanismus der Polyubiquitinierung über den SCF Komplex: Beobachtung: [1] Bildung des E2-Ub Thioesters erhöht E2-SCF Dissoziationsrate [2] Freisetzung von Ub-beladenem E2 ist essentiell für Ub-Markierung eines SCF Substrats. Postulierter Mechanismus: E3 rekrutiert E2-Ub und setzt es sofort wieder in der Nähe des SCF Substrates frei, wo die Ubiquitinierung stattfinden kann. Dieses dynamische Modell erklärt die Bildung von Poly-Ub Ketten, aber nicht die Spezifität für Lys48. Das ssra-tagging System Die effiziente Verwendung der Translationsmaschinerie wird durch blockierte Ribosomen verhindert. Diese Blockierung wird durch die Anwenseheit seltener Codons, verkürzter mrna oder trna-mangel induziert. Um blockierte Ribosomen wieder zu befreien und den Stress aufgrund derer und der unvollständig synthetisierten Proteine abzubauen, wird, zusammen mit dem RNA-Chaperon SmpB, eine transfer message RNA (tmrna, auch: ssra-rna oder 10S RNA) zum blockierten Ribosom rekrutiert. Diese hat zwei verschiedene Rollen: Sie agiert einerseits als trna und andererseits als mrna. (1) Die Polypeptid-Kette des blockierten Ribosoms wird mithilfe der Alanyl-tRNA Domäne der tmrna mit Alanin verknüpft (trna Funktion), indem sie die A-site des Ribosoms besetzt. (2) Hiernach wird die mrna durch tmrna freigesetzt, wodurch die Ribosomen die Proteinsynthese wieder aufnehmen. (3) Die Translation wird mithilfe der mrna-domäne aus der tmrna, die einen kleinen offenen Leserahmen (ORF) von 10 AS gefolgt von einem Stopp-Codon aufweist, fortgesetzt (mrna Funktion). (4) Dadurch wird die hydrophobe Sequenz AANDENYALAA (E.coli) am C-Terminus des Proteins angeheftet, die auch als SsrA Peptid-tag bezeichnet wird. Außerdem wird das neu synthetisierte, defekte Polypeptid eventuell freigesetzt. Durch Ssra-Markierung werden damit auch die blockierten Ribosomen wieder freigesetzt, wodurch die Translationsmaschinerie wieder aktiviert wird. Für Gewöhnlich ist die Freisetzung der Ribosomen nach der vollständigen Translation ein durch die spezifische Interaktion von Release- Faktoren mit Stopp-Codons regulierter Prozess. Der SsrA Peptid-tag dient als Erkennungssignal zur Proteolyse. Dieser Mechanismus wird trans-translation genannt und ist Teil der Protein- Qualitätskontrolle, indem defekte Proteine zum Abbau markiert werden. SsrA-Gene sind zwischen Bakterien hoch konserviert. Die meisten codieren für eine 10 AS lange SsrA-Sequenz. Es sind bisher über 630 SsrA-Sequenzen aus über 510 Spezies bekannt.

55 Degradation der ssra-markierten Proteine In E.Coli werden SsrA-markierte Proteine zum Ziel für Tsp, Lon, FtsH, ClpXP und ClpAP Proteasen, wobei ClpXP unter normalen Bedingungen die Hauptprotease darstellt. Das E.coli Adaptorprotein SspB unterstützt die Degradation von SsrA-markierten Proteinen durch ClpXP ist aber nicht für die ClpXP-abhängige Degradation erforderlich (Paper 2009). Da ClpX nicht in allen Bakterien konserviert ist, FtsH aber wohl, wird vermutet, dass FtsH die Hauptrolle in der Degradation SsrA-markierter Proteine in solchen Bakterien übernimmt, die kein ClpX aufweisen. Ein Adaptorprotein, das zusammen mit FtsH agiert ist nicht bekannt. ClpA und ClpX erkennen beide den ssra-tag, aber an unterschiedlichen Positionen, sodass sie nicht um dieselbe Bindestelle kompetieren. Der N-end rule Pathway Die N-end rule besagt, dass die Anwesenheit spezieller AS am N-Terminus eines Proteins zu einer kurzen HWZ innerhalb der Zelle führt. Die einzelnen AS werden dabei als stabilisierend oder destabilisierend klassifiziert, wobei letztere als Erkennungs-Determinanten für die Protein- Degradation dienen. Der Eintritt in den N-end rule Pathway kann damit durch das Entfernen stabilisierender und/oder die Generierung destabilisierender N-Termini geschehen. Der N-end rule Pathway ist zwischen Prokaryoten und Eukaryoten hochkonserviert. Beide Reiche nutzen unterschiedliche proteolytische Maschinerien für die Degradation der N-end rule Substrate, haben aber einige Mechanismen der Substrat-Erkennung gemeinsam. Dieser Prozess wurde zunächst in Eukaryoten entdeckt. Hier werden N-end rule Substrate durch spezifische E3 Ligasen (N-Rekognine) prozessiert, welche den N-terminalen destabilisierenden Rest des Substrats (N-Degron) erkennen und das Substrat ubiquitinieren, wodurch das Targeting zum Proteasom eingeleitet wird. In Bakterien zeigt das Adaptorprotein ClpS Homologien zur Substratbindestelle von N-Rekognin und stellt somit ein Medaitor der N-Degron Erkennung dar. Es transferiert die N-end rule Substrate direkt zur ClpAP Protease. Auswahl instabiler Proteine

56 In Eukaryonten dient Ubiquitin als sekundäres Signal zur Protein-Degradation Die Substratspezifität wird durch eine große Anzahl an E3-Ligasen vermittelt, welche N-Degrons erkennen und diese ubiquitinieren, wodurch sie zum Abbau durch das 26S Proteasom markiert werden. In Prokaryonten vermitteln Hsp100-Komponenten der proteolytischen Maschinerie (Shuttle-Faktor ClpS) die Erkennung der N-Degrons. Durch das Vorhandensein spezieller Domänen (N-Domäne in ClpA), die in anderen Mitgliedern der Hsp100 Familie fehlen, wird die Bindung von ClpS ermöglicht, wodurch das N-Degron haltige Substrat durch ClpAP degradiert werden kann. N-Degrons in Säugern, Pflanzen und Bakterien In Säugern und Hefen besteht das N-Degron aus einem N-terminalen destabilisierenden Rest des Typs 1 (basische; Arg, Lys, His) oder des Typs 2 (große hydrophobe; Phe, Leu, Trp, Ile, Tyr) sowie einem zugänglichen Lys-Rest zwecks Ubiquitinierung. In Pflanzen beinhaltet die N-end rule basische und aromatische AS, in E.coli ausschließlich aromatische sowie Leucin (entspricht eukaryotischem Typ 2 Degron außer Ile). N-Degrons beinhalten ausschließlich diese in den entsprechenden Organismen primär destabilisierenden Reste. Arg und Lys sind in Eukaryoten primär destabilisierend, während sie in E.coli sekundär destabilisierend sind und gleichzeitig dennoch Teil des N-Degrons darstellen (Ausnahme; siehe unten). Zusätzlich zum N-Degron muss ein flexibler Linker existieren, der notwendig für den Transfer zur ClpAP Protease ist. Abspaltung des N-terminalen Met-Restes Neu synthetisierte Proteine enthalten immer einen N-terminalen Met-Rest (fmet in Prokaryonten), der in allen Organismen in Bezug auf die N-end rule ein stabilisierender Rest ist. Ein N-Degron eines N-end rule Substrats kann damit ausschließlich durch ein pre-n-degron gebildet werden. Das N-terminale Methionin wird cotranslational von der Mehrheit der neu synthetisierten Proteine durch Methionin-Aminopeptidasen (MetAPs) entfernt. Diese Prozessierung erfolgt nur, wenn der Rest an Position 2 (= N- Terminus nach Prozessierung) eine kleine Seitenkette (Gly, Cys, Ala, Ser, Val, Pro, Thr) aufweist und damit in Säugern ebenso stabilisierend oder tertiär destabilisierend in Bezug auf die N-end rule wirkt (Ausnahme: oxidierter Cystein-Rest wirkt sekundär destabilisierend in Säugern). Es existieren möglicherweise Typ3 destabilisierende Reste (Ala, Ser, Thr), die als Ziel bestimmter Ub Ligasen fungieren, deren molekulare Identität jedoch noch ungeklärt ist (Widersprüchliche Aussagen; neuerdings wieder als stabilisierend klassifiziert). Die Spezifität der MetAPs ist zwischen Prokaryoten und Eukaryoten konserviert. Spaltung durch Endopeptidasen können N-Degrons erzeugen

57 N-Degrons können im Inneren einer Protein-Sequenz vergraben sein und nur durch einen endoproteolytischen Schnitt zugänglich gemacht werden. Prozessierende Proteasen (z.b. Caspasen, Separasen, Calpaine) können pre-n-degrons entweder direkt durch die Generierung gewöhnlicher N-termini mit primären destabilisierenden Resten oder durch die Bildung sekondärer/tertiärer destabilisierender AS erzeugen. Eine spezielle Art und Weise in den N-end rule Pathway einzutreten wurde für instabile virale Proteine beschrieben, welche als Teil eines stabilen Polyproteins synthetisiert werden. Das große Vorläufer-Protein wird in seine individuellen Komponenten prozessiert, welche gewöhnliche N- terminale Reste aufweisen, die N-Degrons repräsentieren könnten. Primäre, Sekundäre und Tertiäre destabilisierende Reste und ihre Konvertierung Eine weitere Strategie destabilisierende N-Termini zu erzeugen beruht auf der enzymatischen Modifikation verschiedener N-Termini, die als Eingangssignal zum N-end rule Pathway fungieren. Der N-end rule Pathway ist hierarchisch aufgebaut, indem zusätzlich zu den N-terminalen primären Resten auch sekundär und tertiär destabilisierende Reste existieren, die ebenso N-terminal lokalisiert sind. Letztere beiden vermitteln nicht wie primär destabilisierende Reste die Protein- Degradation, können aber durch eine enzymatische Kaskade zu primär destabilisierenden Resten konvertiert werden. Ein tertiär destabilisierender Rest wird zunächst zu einem sekundär destabilisierenden Rest konvertiert, wonach ein primär destabilisierender Rest an die Peptid-Kette angehängt wird. Dadurch wird das Protein für die Degradation markiert. In Hefe und Säugerzellen repräsentieren Asn und Gln tertiär destabilisierende Reste, die durch N-terminale Amidohydrolasen (Nt-Amidasen) in die sekundär destabilisierenden Reste Asp und Glu durch Deamidierung konvertiert werden können. In Hefe übernimmt diese Funktion ein einzelnes Enzym (NTA1 = Nt-Amidase), während in Säugern das Enzym NTAN1 (Nt N -Amidase) ausschließlich N-terminales Asn deamidiert. Das hypothetische zweite Enzym NTAQ1 (Nt Q -Amidase), das für die Deamidierung von N-terminalem Gln verantwortloch sein muss, wurde bisher noch nicht identifiziert. Sekundär destabilisierende Reste werden an Arg, einem primär destabilisierenden Rest, mithilfe der Arginyl-tRNA Protein-Transferase (R-Transferase, ATE1) konjugiert. Dabei wird Arg-tRNA aus der Protein-Synthese Maschinerie benötigt. Die Arginylierung beschreibt damit eine einzigartige trna-abhängige Proteinmodifikation, welche die Erkennung durch das Ub-Proteasom System vermittelt und damit die proteasomale Degradation induziert. In Säugern werden durch alternatives Spleißen mindestens sechs ATE1-Isoformen mit verschiedener zellulärer Lokalisation, Gewebe-

58 Verteilung und enzymatischen Aktivitäten für N-terminales Asp, Glu und Cys generiert. ATE1 ist das einzige Enzym, das zur N-terminalen Arginylierung fähig ist. Obwohl die hierarchische Organisation der N-end rule evolutionär konserviert ist, unterscheiden sich die enzymatischen Reaktionen voneinander. In E.coli fungieren Arg und Lys als sekundär destabilisierende Reste und rekrutieren primär destabilisierende Reste (Phe, Leu) durch Konjugation durch eine Leucyl/Phenylalanyl-tRNA Protein-Transferase (L/F Transferase, Aat). Das humane Pathogen Vibrio vulnificus codiert für eine zweite L-Transferase (Bpt), welche homolog zur eukaryotischen R-Transferase (ATE1) ist und eine Hydride Spezifität aufweist: Wie ATE1 erkennt es Asp oder Glu als sekundär destabilisierende Reste, hängt jedoch Leu statt Arg an die Kette an. Das eukaryotische Pathogen Plasmodium falciparum codiert für die Transferase ATEL1, welche Homolog zur L/F Transferase ist, aber dieselbe Aktivität wie eukaryotische R- Transferasen aufweist. Die Änderung dieser enzymatischen Aktivitäten lassen sich auf Unterschiede innerhalb der Aminoacyl-tRNA Bindetaschen zwischen der L/F-Transferase aus E.coli und ATEL1 aus P.falciparum zurückführen. Dies bedeutet, dass die bereits etablierten primär destabilisierenden Reste der N-end rule die Evolution der enzymatischen Kaskade, die auf sekundär destabilisierende Reste wirkt, diktiert hat. N-Rekognin (UBR1-7) bestimmt die N-Degron Spezifität in Säugern Es existieren mehrere E3 Ub-Ligasen welche direkt primär destabilisierende Reste erkennen. Diese werden zusammenfassend als N-Rekognine bezeichnet. In S.cerivisiae existiert nur ein einzelnes N-Rekognin (UBR1), das für die Ubiquitinierung aller Substrate mit destabilisierenden N-Termini verantwortlich ist. Säuger-Genome codieren dahingegen für mindestens sieben verschiedene N-Rekognine (UBR1-7), die alle eine Zink-Finger-ähnliche Domäne (Ubr-box) gemeinsam haben. UBR-box-Proteine sind generell heterogen in Größe und Sequenz aber besitzen alle (mit Ausnahme von UBR4) spezifische Domänen, die für E3-Ub-Ligasen einzigartig sind.

59 UBR1/2/3 besitzen die RING-Domäne, UBR5 besitzt eine HECT Domäne, UBR6 besitzt eine F-box Domäne und UBR7 besitzt einen PHD-Finger (plant homeodomain). UBR1/2/4/5 haben die Fähigkeit destabilisierende N-terminale AS zu binden, wodurch sie als N-Rekognine wirken. Die biochemischen Eigenschaften von UBR3/6/7, welche die Wirkung als N-Rekognin erklären, sind jedoch nicht bekannt. Die Funktionen der einzelnen UBRs scheinen zumindest teilweise zu überlappen, da Defekte in bestimmten UBR Proteinen durch andere UBRs kompensiert werden können. Dennoch haben die meisten UBR-Proteine verschiedene Substrat-Pools. So haben UBR1 und UBR2 sehr ähnliche Funktionen, die sich gegenseitig in Teilen kompensieren können. Während der Knockout von UBR1 oder UBR2 verschiedene ähnliche Phänotypen hervorbringt (Herz-Kreislauf Beeinträchtigung), der Organismus aber lebensfähig bleibt, so sind Doppel-Knock-Out Mutationen letal. Auch ein ATE1- Knock-Out ist letal, da ATE1 (Arginylierung) upstream von UBR1/2 (Ubiquitinierung) agiert. UBR1 und UBR2 Substrate sind z.b. RGS Proteine, SCC1 und DIAP1 (siehe unten). UBR1 kann außerdem Substrate über ein internes Degron (I-Degron), das innerhalb der Proteinsequenz liegt, erkennen und binden. Substrate mit I-Degron sind z.b. CUP9 und GPA1 aus S.cerivisiae sowie c-fos aus Säugern. N-Rekognine haben zwei verschiedene Bindestellen für primär destabilisierende Reste. Die Typ1-Bindestelle vermittelt die Erkennung der Typ1 destabilisierenden Reste (Arg, Lys, His) und ist innerhalb der Ubr-box aller Rekognine konserviert. Die Typ2-Bindestelle interagiert mit Typ2 destabilisierenden Resten (Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp) und ist nur in einigen N-Rekogninen (z.b. UBR1) vorhanden, was die unterschiedlichen Substrat-Poole erklärt. Die RING-UBR Subfamilie UBR1/2/3 gehören zur RING-Klasse der UBR-Proteine, welche eine autoinhibitorische Domäne (AID) aufweisen. Typ1 und Typ2 Dipeptide in S.cerivisiae aktivieren UBR1 allosterisch, wodurch die CUP9- Degradationsrate erhöht wird. Die N-terminale Region von UBR1 enthält die Substrat-Bindestellen und ist aufgrund der intramolekularen Interaktion mit der C-terminalen AID geschlossen. Die Bindung von Typ1 und Typ2 Dipeptiden an UBR1 unterbricht diese inhibitorische Interaktion und leitet die UBR1-abhängige CUP9-Degradation (Transkriptionsrepressor des Peptidtransporters PTR2) und damit die Aufnahme von extrazellulären Peptiden ein. Die RING UBR-Familie kann damit durch kleine Molekül-Modulatoren wie Dipeptide kontrolliert werden und spielt bei der Regulation physiologischer Prozesse eine entscheidende Rolle.

60 RING-UBR Proteine bilden einen E2-E3 Komplex mit den homologen Enzymen HR6A und HR6B (funktional homolog zu UBC2/RAD6 aus Hefe). Die Ubiquitinierung erfolgt in Zusammenspiel mit dem E1 Enzym Uba1p. Im Gegensatz zu UBR1/2 bindet UBR3 jedoch nicht an N-Degrons, weshalb es nicht als N-Rekognin fungiert und andere Funktionen haben muss (wird in sensorischen Zellen exprimiert). Andere UBR-Proteine UBR4 und UBR5 sind nicht mit UBR1 und UBR2 verwandt. UBR4 ist mit 570 kda sehr groß und bindet Typ1 und Typ2 Reste synthetischer Peptide, wobei UBR5, mit 300 kda das zweitgrößte UBR, präferenziell an Typ1 Reste bindet. Das 90kDa UBR6 Protein hat eine F-box Domäne, die typischerweise eine Komponente des SCF-Typ E3 Komplexes darstellt. Das 50 kda UBR7 Protein enthält einen PHD-Finger (konservierter Zink- Finger), der strukturell die RING-Finger Domäne imitiert und daher als funktionelle Domäne für eine E3 Ub Ligase vermutet wird. N-Degron-Erkennung in anderen Organismen A.thaliana codiert für die E3-Ligase PRT1, welche aromatische Reste (Trp, Tyr, Phe) als N-Degrons erkennt. PRT1 ist jedoch von den N-Rekogninen zu unterscheiden, da es N-Degrons über seine ZZ-Domäne erkennt. PRT1 kann funktionell Ubr1 in Hefe ersetzen, obwohl es nicht evolutionär mit N-Rekogninen verwandt ist.

61 Das bakterielle Adaptorprotein ClpS weist eine begrenzte Homologie zur Typ2- Bindestelle in UBR1 auf. ClpS und eukaryotisches N-Rekognin haben damit eine gemeinsame Erkennungsstelle (siehe Abbildung). Diese Homologie-Region besteht aus einer Anhäufung saurer und hydrophober Reste, welche eine komplementäre Oberfläche für die Interaktion mit N-Degrons bilden. ClpS bindet ausschließlich Peptide mit primär destabilisierenden Resten (Phe, Tyr, Trp, Leu) am N-Terminus mit einer freien α- Aminogruppe. Sekundär destabilsierende Reste (Arg, Lys), die neben dem N-terminalen Rest lokalisiert sind, verstärken diese Interaktion, sodass sie direkt zur Bildung des N-Degrons beitragen und nicht nur Ziel der L/F-Transferase darstellen. Außerdem ist in Bakterien für die N-end rule Degradation ein flexibler Linker zwischen N-Degron und gefaltetem Substrat erforderlich, der die Übertragung des Substrats von ClpS auf ClpP erleichtert. Dies schränkt die Anzahl potentieller Substrate weiter ein und ermöglicht eine bessere Regulation. ClpS reguliert nicht nur die Substratspezifität für N-Degrons, sondern inhibiert auch die Degradation von Nicht-N-end rule Substraten, da ClpAP wegen ClpS mit der Degradation der N-end rule Substrate beschäftigt ist.

62 Cis- und trans Erkennung Liegt ein bestimmtes Protein, das einen destabilisierenden Rest exponiert in einem Komplex mit anderen Proteinen vor, so ist es möglich, dass dieses Protein durch N-Rekognin erkannt wird, die Ubiquitinierung jedoch an einem Protein des Protein- Komplexes stattfindet (trans-erkennung). Im Gegensatz dazu spricht man von cis-erkennung wenn die Ubiquitinierung am selben Protein stattfindet. Substrate und physiologische Funktionen des N-end rule Pathways Die SCC1-Untereinheit von Cohesin aus S.cerivisiae ist das erste identifizierte Substrat des N-end rule Pathways. Cohesin ist ein großer Proteinkomplex, der die Anziehung zwischen den Schwesterchromatiden während der DNA-Replikation vermittelt. Zu Beginn der Anaphase wird die Protease ESP1 (Separase) aktiviert und spaltet SCC1, wodurch ein instabiles C-terminales SCC1 Fragment generiert wird, das einen primär destabilisierenden Rest (Arg) am N-Terminus exponiert. Stabilisierung des C-terminalen SCC1 Fragments resultiert in massiven Chromosomen-Verlust, da das Fragment nicht mehr durch den N-end rule Pathway (UBR1) abgebaut werden kann. Der N-end rule Pathway ist also für die Mitose in Hefe essentiell. In Drosophila melanogaster spielt die N-end rule eine entscheidende Rolle in der Kontrolle der Apoptose. Der Schlüssel-Inhibitor DIAP1 (Drosohila inhibitor of apoptosis 1), welcher die Apoptose durch Bindung und Neutralisierung aktiver Caspasen inhibiert, kann durch aktive Caspasen gespalten werden, wodurch ein N-terminal verkürztes Fragment mit einem tertiär destabilisierenden Rest (Asn) gebildet wird. Dieser wird über Deamidierung/Arginylierung zu einem primär destabilisierenden Rest konvertiert, wodurch er über UBRs ubiquitiniert und der proteasomalen Degradation zugeführt werden kann (NTAN1-ATE1-UBR Pathway). Diese Konvertierung von DIAP1 zu einem N-end rule Target-Protein ist für seine anti-apoptotische Aktivität essentiell. Wahrscheinlich werden assoziierte pro-apoptotische Faktoren co-degradiert. Die ersten entdeckten N-end rule Substrate in Säugern sind Regulatoren des G-Protein Signalling (RGS4, RGS5, RGS16). Diese strukturell verwandten RGS-Substrate agieren als GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) für die G α -Untereinheit und inhibieren zugleich das G q /G i -aktivierende Signalling, was essentiell für die Kontrolle des Herzmuskel-Wachstums und der Gefäß-Reifung ist. Die letalen Phänotype der ATE1-Defizienz bzw. des UBR1/2 Doppel-Knock-Outs lassen sich damit wohlmöglich auf Einflüsse in diesem Pathway zurückführen.

63 Die RGS-Substrate haben eine N-terminale Met-Cys-Sequenz gemeinsam. Nach der Entfernung von Met durch MetAPs wird der reduzierte Cys-Rest exponiert, der in Säugern tertiär destabilisierend wirkt. Durch Oxidation des N-terminalen Cys wird ein sekundär stabilisierender Rest, entweder Cys- Sulfinsäure (CysO 2 H) oder Cys-Sulfonsäure (CysO 3 H), erzeugt, der Ziel für die ATE1-vermittelte Arginylierung ist. Die Cys- Oxidation erfordert zusätzlich zu Sauerstoff auch Stickstoffmonoxid sowie einen basischen Rest an Position 2 der Substrat-Sequenz. Cys-Sulfinsäure imitiert strukturell Asp, die klassische Erkennungs-Determinante von R-Transferasen, was die Funktion als sekundär destabilisierenden Rest erklärt. N-Degrons könnten auf diese Weise als NO-Sensoren fungieren und verschiedene Signaltransduktionswege kontrollieren, da Arginylierung durch ATE1 nicht ausschließlich der Ub-abhängigen Proteolyse dient, sondern auch für nicht-proteolytische Prozesse. In diesem speziellen Fall könnte der ATE1 Pathway einen NO-Sensor darstellen und auf Basis des NO-Gehalts das kardiovaskuläre Signalling regulieren. Weitere Substrate für die N-terminale Arginylierung durch ATE1 sind β-aktin, wodurch die Aktin- Filament Eigenschaften, Lokalisation und Lemella-Formation in sich bewegenden Zellen reguliert wird sowie Calretikulin, Neurotensin und Ornithin-Decarboxylase. Das Proteasom Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) kontrolliert fast alle zellulären Basisprozesse (Zellzyklus- Durchlauf, Signal-Transduktion, Zelltot, Immunantwort, Metabolismus, Transkription, DNA- Reperatur, Proteinqualitätskontrolle und Entwicklungs-Programme) durch Degradation kurzlebiger regulatorischer oder struktureller Proteine. Einige Substrate werden auch ohne vorherige Ubiqutinierung proteasomal degradiert. Das eukaryotische Proteasom ist ein großer Proteinkomplex, der für die ATP-abhängige Degradation intrazellulärer Proteine verantwortlich ist. Es ist sowohl im Zytoplasma, als auch im Zellkern lokalisiert. Ein Teil liegt an der äußeren Oberfläche des ERs vor, um für ERAD-Substrate zur Verfügung zu stehen. Außerdem können Proteasome mit Zytoskelett-Strukturen assoziieren, um Zellzyklus-abhängig bestimmte Regulatoren wie z.b. Cycline zu degradieren.

64 Struktur des 26S/30S Proteasoms in Eukaryonten Das 2,5 MDa schwere multikatalytische 26S Proteasom besteht aus zwei Subkomplexen, einem katalytischen Kern (core particle, CP, 20S- Komplex; ~700 kda; 14*2 Untereinheiten) und einem oder zwei terminale, regulatorische Komplexe (regulatory particles, RP, 19S-Komplex; ~700 kda => PA700; 19 Untereinheiten), die als Proteasom-Aktivator fungieren. Das 19S RP bindet als Deckel an einen oder an beiden Enden des Fass -förmigen 20S Proteasoms, wodurch das Proteasom enzymatisch aktiv wird. Maße des archealen Proteasoms: Der resultierende Hohlzylinder ist 15 nm lang und hat einen Durchmesser von 11 nm. Die zentrale Kammer (central cavity, CC) der β-ringe hat ein Volumen von 84 nm³, das gefaltete 70 kda Proteine füllen würden. Die Vorkammern (antechambers, AC), welche durch die α-ringe gebildet werden, haben ein Volumen von 60 nm³. Der Sedimentationskoeffizient des aktiven Proteasoms, bestimmt durch Dichtegradientzentrifugation, ist 26S. Der korrekte SK ist jedoch 30S (physikochemische Analysen). Der Unterschied kommt wahrscheinlich daher, dass bei 26S nur eine 19S Untereinheit gebunden hat, real aber 2 Untereinheiten für eine funktionelle Einheit binden müssen. Das 19S RP erkennt ubiquitinierte Client-Proteine und spielt eine Rolle in Entfaltung und Translokation ins 20S CP, das katalytische Threonin-Reste auf der Oberfläche der Kammer enthält, welche durch zwei β-ringe gebildet wird.

65 Komponenten und Struktur des 20S Subkomplexes (Core Particle) Die gepackte Fass-Struktur kommt durch die Zusammenlagerung zweier äußerer α-ringe (Tor zur proteolytischen Kammer) und zweier innerer β-ringe (proteolytische Aktivität) zustande, die je aus sieben strukturell ähnlichen α- bzw. β- Untereinheiten bestehen. Es bildet sich damit eine α 1-7 β 1-7 β 7-1 α 7-1 Struktur aus. Die Struktur und Funktion der Untereinheiten sind hoch konserviert zwischen eukaryotischen Spezies. In Prokaryonten bilden sich dahingegen homoheptamere α- und β-ringe aus. Die Untereinheiten des 20S Proteasoms sind innerhalb des Komplexes in C2 Symmetrie angeordnet. Die drei β-typ Untereinheiten 1, 2 und 5 der inneren Ringe haben katalytisch aktive Threonin-Reste an ihren N-Termini und zeigen N-terminale nukleophile (Ntn) Hydrolase Aktivität. Es handelt sich beim Proteasom demnach um eine Threonin-Protease. Jeweils ein Paar dieser drei aktiven Stellen ist damit Teil der inneren Wand des β-zylinders (6 katalytische Zentren). Isolierte β-untereinheiten haben jedoch keine proteolytische Aktivität! β1 zeigt Caspase-ähnliche Aktivität (= PGPH-Aktivität, Peptidylglutamyl-Peptid Hydrolysierende), spaltet also nach sauren Resten C-terminal. β2 zeigt Trypsin-ähnliche Aktivität, spaltet also nach basischen Resten C-terminal. β5 zeigt Chymotrypsin-ähnliche Aktivität, spaltet also nach hydrophoben Resten C-terminal.

66 Das Zentrum des α-rings ist fast vollständig geschlossen, was ein Eindringen von Proteinen in die katalytisch aktive Kavität verhindert. Die N-Termini der α-untereinheiten bilden zusätzlich eine physikalische Barriere (sie sind sehr flexibel; konnten nicht in Kristallstruktur des archealen Proteasoms aufgelöst werden). Die Proteine müssen damit vor ihrer Degradation den engen Spalt zwischen den α-ringen passieren. Die α- und β-untereinheiten haben die gleiche Basis-Struktur, mit Ausnahme der Helix H0 am N-Terminus der α-untereinheiten. Ungefaltete Proteine können durch Stressoren schnell gebildet werden. Durch Oxidation geschädigte oder unstrukturierte Proteine werden direkt durch das 20S Proteasom degradiert. Der Mechanismus der Spalt-Öffnung des geschlossenen α-rings ist jedoch unverstanden (Bindung der denaturierten Proteine teilinduziert Öffnung; möglich, dass andere Aktivitoren benötigt werden). Komponenten und Struktur des 19S Subkomplexes (Regulatory Particle)

67 Die RP-Untereinheiten erkennen das Poly-Ubmarkierte Client-Protein, entfernen die Ub- Kette, reduzieren die Protein-Beweglichkeit, entfalten das Substratprotein, öffnen den α-ring und transferieren das ungefaltete Substrat in den CP zur Degradation. Das 19S RP besteht aus 19 verschiedenen Untereinheiten (von denen 15 essentiell sind), die in zwei Klassen unterteilt werden können: Rpt (Regulatory particle of triple-atpase) und Rpn (Regulatory particle of non-atpase). Beide Klassifizierungen enthalten zahlreiche Proteine mit MG zwischen 10 und 110 kda. Das 19S RP lässt sich in zwei Subkomplexen gliedern: dem Deckel (lid) und der Basis (base). Es handelt sich um den einzigen Proteasom-Aktivator, der essentiell für die Lebenfähigkeit ist. Er bindet an ein oder beide Enden des CP. Lid-Subkomplex Der Lid besteht aus mindestens 9 nicht-atpase Untereinheiten (Rpn 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15). Hauptfunktion ist die Deubiquitinierung der eingefangenen Substrate (siehe unten). Einige der Rpn-Untereinheiten in diesem Subkomplex haben strukturelle Verwandtschaft zum COP9 (Constitutive Photomorphogenesis 9) Signalosom (CSN) und zum Translationsinitiations-Komplex elf3. Sechs Untereinheiten haben eine C-terminale PCI-Domäne (PCI = Proteasom, CSN, elf3). Es wird angenommen, dass TPR-ähnliche Repeats, welche den PCI Domänen vorangehen, zusammen mit einer helikalen Repeat-Struktur im N-terminalen Abschnitt der PCI-Domäne ein α-solenoid bilden. Dieser dient als Bindestelle für wichtige intrakomplexe Interaktionen, welche das Grundgerüst innerhalb des lid-komplexes bildet und/oder für die Rekrutierung zellulärer Liganden wichtig sind. Neben der Deubiquitinierung ist die Funktion des lids in Protein-Degradation unverstanden, wenn er auch zur Degradation essentiell ist. Es handelt sich um eine sehr dynamische Struktur, deren Zusammensetzung stark vom physiologischen Zustand der Zelle abhängig ist. Es liegt nahe, dass hier zahlreiche, regulatorische Proteine binden können. Base-Subkomplex besteht aus sechs homologen AAA + -ATPase Untereinheiten (Rpt1-Rpt6) zu je 50 kda und vier nicht- ATPase Untereinheiten (Rpn1, Rpn2, Rpn10, Rpn13). Er hat drei Funktionen (1) Einfangen der Client-Proteine über Ub-Erkennung durch Rpn1, Rpn13, Rpt5 und Rpn10. Die Bindung erfolgt entweder direkt oder über Proteine, die zugleich UBA- und UBL-Domänen aufweisen (z.b. RAD23). (2) Unterstützung der Substrat-Entfaltung (ATPase-abhängig). (3) Öffnung des Kanals im α-ring (ATPase-abhängig). Die funktionale Einheit aus Rpn1 und Rpn2 innerhalb des lid-komplexes dient als Docking-Stelle für Substrat-Rekrutierungsfaktoren (PIP-Bindestelle, siehe unten). Rpn1 und Rpn2 sind die größten Untereinheiten des 26S Proteasoms (ca. 100 kda) und bilden ein Toroid (Ringkern). Rpn2 interagiert

68 mit dem 20S-Kern und sitzt auf den α-ringen, wobei das Zentrum des Ringkerns auf den axialen Kanal des Proteasoms angepasst ist. Rpn1 sitzt dabei direkt über Rpn2. Die lid-atpasen sind zwischen dem Rpn1/2 Komplex und der 20S Oberfläche kreisförmig angeordnet. Für die Substrattranslokation und das Gating werden ATPasen und Rpn1/2 benötigt. Rpn10 und Rpn13 fungieren als integrale Ub-Rezeptoren und binden Poly-Ub-Substrate (mehr siehe unten). Proteasome unterschiedlicher Organismen Archeales Proteasom 20S Proteasome bestehen aus je einer oder zwei verschiedenen α- bzw. β-untereinheiten. Mit einer Ausnahme sind alle β-untereinheiten archealer Proteasome katalytisch aktiv (Aeropyrum pernix codiert eine inaktive). Die proteolytische Kammer hat damit 14 aktive Stellen. Alle β-untereinheiten (in Archeen und Bakterien) zeigen Chymotrypsin-ähnliche Aktivität (Spaltung nach hydrophoben Resten). Erste Kristallstruktur eines 20S Proteasoms von Thermoplasma acidophilum. 700 kda Komplex besteht aus 2 verschiedenen Untereinheiten (α hat 233 AS; β hat 211 AS). Sequenz und Struktur dieser Untereinheiten ist sehr ähnlich (in Evolution gleiches Ursprungs-Gen). Alle 20S- Untereinheiten anderer Spezies sind entweder mit der α oder der β Untereinheit von T. acidophilum verwandt. Archeale Proteasome zeigen wahrscheinlich kein reguliertes Gating, wie es bei eukaryotischen Proteasomen vorliegt. Bakterielles Proteasom Proteasome liegen nur in den gram positiven Actinomyceten vor. Es wird angenommen, dass diese die proteasomalen Gene durch horizontalen Gentransfer von Eukaryoten erhalten haben. Das erste bakterielle Proteasom wurde aus Rhodococcus erythropolis isoliert. Es besteht aus zwei ähnlichen α- und zwei verschiedenen β-untereinheiten (α1, α2 bzw. β1, β2). Unterschiedliche Kombinationen dieser Untereinheiten resultiert in verschiedenen kinetischen Parametern. Die Assemblierung dieses Proteasoms verläuft sehr ungewöhnlich. Das Proteasom aus Mycobacterium tuberculosis besteht aus je einer α- und einer β-untereinheit (65% identisch zu Rhodococcus). Das Proteasom scheint regulatorische Partner zur Öffnung des Gates zu benötigen. In Mycobakterien wird als tagging System für Substrate ein kleines, konserviertes Protein (Pup) verwendet. Pupylierte Substrate werden durch die Chaperon-Komponenten Arc/Mpa des bakteriellen Proteasoms erkannt. Pup wird kovalent an einen internen Lysin-Rest des Substrats über seinen C-terminalen, deamidierten Glutamin-Rest gebunden. Viele Bakterien, wie auch E.coli, besitzen statt der eukaryotischen 20S Proteasom-Komponente die Protease HslV/ClpQ (siehe unten), die Teil des bakteriellen Proteasoms ist. Sie ist aus zum eukaryotischen Proteasom homologen Untereinheiten aufgebaut. HslV hat auch den katalytischen Mechanismus mit dem 20S Proteasom gemein. HslV besteht jedoch aus zwei hexameren Ringen

69 (statt heptameren). Den einzelnen Untereinheiten fehlt in ihrer Faltung im Vergleich zu den Proteasom-Untereinheiten lediglich eine C-terminale α-helix. Durch die Assoziation von HslV mit der homohexameren ATPase HslU/ClpY bildet sich die bakterielle Degradations-Maschinerie. Weder HslUV noch das 20S Proteasom scheinen in Bakterien essentiell zu sein. Einige Bakterien weisen für beide Systeme keine Gene auf. Hefe Proteasom Besteht aus 14 verschiedenen Untereinheiten, von denen 13 essentiell für die Lebensfähigkeit sind (α3 kann im Proteasom durch α4 ersetzt werden). Daher ist die Assemblierung wesentlich komplexer. Nur 3 β-untereinheiten sind katalytisch aktiv (6 aktive Stellen). Es existieren keine Immuno- oder andere Untereinheiten. Es gibt kleine Unterschiede in den β-untereinheiten zwischen Hefe und Säugern, von denen angenommen wird, dass sie in Säugern den Einbau von Immunountereinheiten allosterisch beeinflussen. Eukaryotische Proteasome unterscheiden sich von den archealen und prokaryotischen durch die Fähigkeit den α-ring vollständig zu schließen. Die Öffnung des Gates (N-termini der α-untereinheiten verschließen dieses) erfolgt durch Aktivatoren. Mechanismus der Gate-Öffnung durch Aktivatoren Freies CP liegt in einer autoinhibierten Form vor, in der die N-Termini der α-untereinheiten ein Gate bilden, das die Substrataufnahme blockiert. Regulation der Gate-Öffnung kontrolliert Eintritt der Substrate in die Kammer, sowie den Ausgang der Peptid-Produkte. Hier spielt die α3 Untereinheit eine essentielle Rolle, da ihr N-terminaler Rest mit den N-terminalen Abschnitten der anderen sechs α-untereinheiten interagiert. Deletion des α3-n-terminus resultiert in einem konstitutiv geöffneten Zustand. Asp9 (Nummer aus Thermoplasma) in α3 bildet Wasserstoffbrücke mit Tyr8 aus α4, eine weitere mit der α3 Hauptkette und eine Salzbrücke mit Arg10 und gehört zu einem konservierten YDR Motiv. Die Mutante bildet mehr längere Peptide (20-30 Reste) als der Wildtyp (Peptide können aufgrund größerer Spalte früher aus Kavität heraus diffundieren). Der Base-Subkomplex enthält sechs ATPase-Untereinheiten (Rpt1-6), die in einem hexameren Ring organisiert sind und für das Öffnen des Gates essentiell sind. Das 20S Proteasom wird aktiviert (Gate öffnet sich), wenn ein Proteasom-Aktivator bindet. Der Haupt-Proteasom-Aktivator ist PA700 (19S RP). Andere Aktivatoren sind PA28 und PA200. PA26 (homolog zum Säuger-PA28) ist ein homoheptamerer Komplex, der an das 20S Proteasom bindet, indem er seinen C-Terminus in den Zwischenraum benachbarter α-untereinheiten insertiert. Nach dieser Bindung agiert die activation loop Domäne von PA26, die insgesamt neun loops enthält. Diese interagieren mit den reverse-turn loops der α-untereinheiten und bewirken so die Rotation der N-terminalen Bereiche, wodurch der open gate Zustand stabilisiert wird. Die Repositionierung von Pro17 durch den activation loop induziert die geordnete 7-fach symmetrische Poren-Konformation, die durch Interaktionen zwischen vier hochkonservierten Resten stabilisiert wird (Tyr8, Asp9, Pro17, Tyr26). Diese sind selbst in Archeen konserviert, die kein PA26 aufweisen!

70 PAN ( proteasome-asociated nucleosidase, homohexamere ATPase Komplex aus Archeen, verwandt mit eukaryotischen 19S ATPasen) hat ebenso einen solchen C-terminalen Rest, den es zur Aktivierung des 20S Proteasoms verwendet. Proteasomale ATPasen und PA26 scheinen daher ähnliche (aber nicht identische!) Mechanismen für die Gate-Öffnung zu verwenden. Der PAN ATPase-Komplex und vier 19S ATPase Untereinheiten (Rpt 1, 2, 3, 5) besitzen ein konserviertes Hydrophob-Tyrosin-X (HbYX) Motiv am C-Terminus, das für die Gate-Öffnung notwendig ist. Die C-Termini von PAN werden in die 20S Taschen insertiert, um Gate Öffnung zu induzieren (Mechanismus ähnlich eines Schlüssels und eines Schlosses). Multiple HbYX Motive (Rpt 1, 2, 3, 5) des 19S Komplexes induzieren die Gate-Öffnung, da Rpt5 (wechselwirkt mit α4) alleine die Degradation induzieren kann, Rpt2 (wechselwirkt mit α7) jedoch nicht. Beide Rpts, arbeiten sie synergistisch, können die Gate-Öffnung beschleunigen. Für diesen Prozess ist der ATP-gebundene Zustand der Rpts erforderlich, was die Konformation der Rpts so verändert, dass die C-Termini in die Bindestellen des CP passen. ATP-Hydrolyse wird jedoch weder für Gate-Öffnung, noch für die Translokation der ungefalteten Proteine benötigt (Prozesse geschehen in Anwesenheit von ATPγS). Symmetrischer hexamerer ATPase Ring und symmetrischer heptamerer 20S α-ring müssen interagieren, sodass der geöffnete Zustand stabilisiert wird. Dies könnte anhand von 2 Mechanismen stattfinden, die beide keine ATP-Hydrolyse verwenden:

71 (1) PAN-Mechanismus: Da nur 2 bis 4 Untereinheiten der hexameren ATPase Struktur simultan ATP binden, arbeiten nicht alle ATPasen synchron, um das Gate zu öffnen. Daher insertieren nur ein Teil der C-Terminalen Enden der ATPasen Untereinheiten in die 20S Taschen. Die Insertierung kann sequenziell erfolgen, um den geöffneten Zustand durch ein Taumeln der ATPasen zu stabilisieren. (2) Die ATPase Raten sind unterschiedlich, sodass ein Teil ständig im ATP-gebundenen Zustand bleibt und den geöffneten Zustand stabilisiert, während die anderen ATPasen den ATPase- Zyklus durchmachen, um die Proteinentfaltung zu stabilisieren. In diesem Modell ist das 26S Proteasom eher ein stabiler Komplex, da mehrere ATPase Untereinheiten das 20S Proteasom binden und das Gate öffnen. Mechanismus der Substrat-Entfaltung und Translokation Degradation gefalteter, ubiquitinierter Proteine benötigt dahingegen natürlich ATP-Hydrolyse. Der Base-Komplex des 19S RP ist ebenso für die Substrat-Entfaltung und Translokation verantwortlich. Rpts des Base-Subkomplexes agieren als reverse Chaperone, indem sie Substrate entfalten und damit den Eintritt in 20S CP erlauben. Für die Degradation eines SsrA-tag markierten GFP Moleküls benötigt PAN ca. 330 Moleküle ATP. ATP Hydrolyse wird für die essentielle mechanistische Kopplung von Substrat-Entfaltung, Deubiquitinierung und Translokation benötigt. Die ATPasen sind funktionell nicht redundant. Erkennung ubiquitinierter Substrate intrinsisch: Rpn10, Rpn13 extrinsisch: UBL-UBA Proteine (Rad23, Dsk2 und Ddi1) Es wurden verschiedene Targeting-Mechanismen aufgeklärt, die Untereinheiten des Proteasoms, sowie Ub-Shuttle-Systeme involvieren. Die involvierten Proteine enthalten Ubiquitin Binde-Domänen (UBD). Mehrere Untereinheiten des Base-Subkomplexes von 19S RP sind in Ub-Bindung involviert. Intrinisische Faktoren Der erste identifizierte Ub-Rezeptor ist Rpn10. Es ist einerseits Bestandteil des 19S RP, wo es die Bindung zwischen base und lid stabilisiert, und liegt andererseits auch in freier Form vor. Rpn10 bindet an Ub-Ketten mit mehr als 4 Untereinheiten. Die Erkennung von Ub-Ketten wird über Ubiqutin-Interaktions-Motive (UIM-Domäne) vermittelt. Hefe Rpn10 hat ein einzelnes UIM, während humanes Rpn10 zwei UIMs aufweist. Diese bestehen aus den ersten beiden helikalen Turns einer langen α-helix. Rpn13 ist ein neuartiger Typ eines Ub-Rezeptors. Die Ub-kontaktierenden Reste sind diskontinuierlich über mehrere Loops verteilt und in einer N-terminalen Pru-Domäne (Pleckstrin like receptor for Ub; auch Pleckstrin-homology domain, PHD), welche eine hohe Affinität für Diubiquitin zeigt, organisiert. Diese Domäne besteht aus einem sieben-strängigen β-sandwich, bedeckt durch eine C-terminale Helix. Die Loops aus Rpn13 binden spezifisch Lys48 aus Ubiquitin, was das Targeting von K48-verknüpften Ub-Ketten zum Proteasom erklärt. Die C-terminale Domäne von Rpn13 weist DUB-Aktivität auf, welche mit dem N-Terminalen Ub-Rezeptor im selben Molekül zusammenarbeitet, um die Proteolyse der Ub-Ketten zwecks Recycling zu katalysieren.

72 Rpn10 und Rpn13 liefern die größte intrinsische Ub-Binde-Kapazität im Proteasom. Beide binden eine hydrophobe Tasche in Ubiquitin, die aus L8, I44 und V70 gebildet wird, jedoch mit unterschiedlichen Mechanismen. Die Inaktivität der UIM- bzw. Pru-Domänen in Rpn10/13 bedeutet den Verlust eines Großteils der intrinsischen Ub-Bindekapazität. Dennoch wachsen solche Mutanten näherungsweise normal. Extrinsische Faktoren Rpn10/13 binden neben Ub selbst auch andere Proteine über ihre UBL-Domänen (Ubiquitin-like). UBL-UBA-Domänenproteine (es sind bisher drei bekannt: Rad23, Dsk2 und Ddi1) agieren als extrinsische Ub-Rezeptoren bzw. Shuttle-Faktoren, welche Poly-Ub-markierte Substrate über ihre N-terminale UBA-Domäne (Ubiquitin-associated) binden und über ihre UBL-Domäne zum Proteasom rekrutieren. Rpn1 und Rpn2 sind ähnlich wie Rpn10 ebenso für die Erkennung von verschiedenen UBL-Proteinen verantwortlich.

73 Rad23 transportiert polyubiquitinierte Proteine zum 26S Proteasom. Im Gegensatz dazu ist es über die UBA2 Domäne im Stande K48-Poly-Ub Ketten zu binden und damit ihre Elongation oder Deubiquitinierung zu verhindern, was Substrat-Degradation blockiert! Rad23 und Ddi1 können unter Steigerung der Poly-Ub-Affinität über die UBL- bzw. UBA-Domäne heterodimerisieren. UBL-UBA Proteine agieren desweiteren kooperativ mit verschiedenen intrinsischen und extrinsischen Rezeptoren um Poly-Ub Proteine zu erkennen. Humanes Rpn10 kann über die zweite UIM an UBL-UBA Proteine binden. In Hefe binden UBL-UBA Proteine dahingegen an Rpn1. - Die UBA-Domäne besteht aus ~45 AS, welche einen Bündel aus drei α-helices bilden. Die Bindung an Ub erfolgt durch eine konservierte hydrophobe Oberfläche. - Die UBL-Domäne ist eine nicht-enzymatische Domäne, die eine Ub-Struktur aufweist. Es existieren neben diesen 5 Rezeptoren weitere Rezeptoren (Inaktivität blockiert Proteasom- Aktivität nicht). Kandidat ist das intrinsische Rpt5. Die Funktion multipler Ub-Rezeptoren liegt in einer erhöhten Avidität für Substrate durch gleichzeitiges Binden, sowie in einer breiteren Substrat-Spezifität durch Erkennung des Substrates selbst (neben dem Ub-tag).

74 Das Protein p62 enthält eine PB1-Domäne, deren Tertiärstruktur der von UBL-Domänen sehr ähnelt und an die 26S Proteasom-Untereinheit Rpt1 binden kann, sowie eine C-terminale UBA-Domäne, welche Ubiquitin-markierte Proteine bindet. Da p62 auch den autophagosomalen Umsatz K63-verknüpfter Ub-haltiger Proteine kontrolliert, stellt p62 ein Bindeglied dieser zwei Abbauwege dar. Es ist anzumerken, dass eine Inhibition der Autophagie, was eine Akkumulation von p62 bewirkt, die proteasomale Degradation kurzlebiger Proteine verlangsamt. Dies geschieht, da p62 mit anderen proteasomale Shuttle-Faktoren (Rad23, Dsk2, Ddi1) um die Bindung ubiquitinierter Proteine kompetiert, aber nicht so effizient wie diese an das Proteasom bindet und ihre Degradation vermittelt. Cdc48, das vor allem ERAD-Substrate zum Proteasom dirigiert, dient ebenso als Shuttle-Faktor (siehe ERAD). Für eine effiziente Degradation durch das 26S Proteasom ist zusätzlich zur Polyubiquitinierung eine unstrukturierte Protein-Region notwendig, von der aus das Proteasom die Entwirrung und Degradation des Proteins beginnen kann. Dies wurde anhand des Komplexes zwischen der bakteriellen RNAse Barnase und seinem Inhibitor Barstar gezeigt. Barnase weist eine N-terminale unstrukturierte Region auf, die Ziel für die proteasomale Degradation ist, wenn Barstar im Komplex polyubiqutiniert vorliegt. Polyubiquitiniertes Barstar wiederum wird nicht degradiert sondern recyclet. Dies erinnert an die Art und Weise wir bakterielle Adaptoren (z.b. ClpS oder SspB) N-end rule bzw. ssra-markierte Substrate zur Degradationsmaschinerie dirigieren. Deubiquitinierung erfolgt vor der Degradation Intrinsisch: Rpn11 extrinsisch: DUBs (Usp14, Uch37) Die Entfernung manchmal komplexer Ub-Ketten in der Proteasom-assoziierten Deubiquitinierung (DUB) wird für effiziente Substrat-Degradation benötigt. Diese Ub-Ketten würden sonst vermutlich bei der Translokation ins CP sterisch hindern. Proteasomale DUBs scheinen zusätzlich eine Checkpoint Funktion zu haben, welche hinterfragt, ob Substrate gebunden haben. Zwei Proteine des Lid-Komplexes haben die MPN-Domäne. Die Zink-abhängige DUB- Metalloisopeptidase Rpn11 recyclet Ubiquitin, indem es Poly-Ub proximal (also die vollständige Kette mit einer Spaltung) abspaltet. Rpn11 ist daher essentiell für das Proteasom Seine Aktivität ist direkt mit der Substrat-Degradation gekoppelt und benötigt ATP. Monomeres Ub wird anschließend durch andere DUBs erzeugt. Rpn8 hat ebenso eine solche Domäne, der aber für die Metalloprotease- Aktivität essentielle Reste fehlen. In Säuger sind zwei weitere DUBs mit dem Base-Komplex assoziiert, welche Ub-Reste distal (also jeweils nur ein Ub Rest der Kette, bis alle abgespalten wurden) spalten. Durch die distale Spaltung wird die Bindung des Substrats an das Proteasom abgeschwächt. Es handelt sich in beiden Fällen um Cystein-Proteasen, wobei die Proteolytische Aktivität jeweils durch Proteasom-Bindung stimuliert

75 wird. Usp14 und Uch37 scheinen überlappende Funktionen zu haben, die wichtig für Protein- Degradation und Zellwachstum sind. Usp14 assoziiert über ihre N-terminale UBL Domäne mit Rpn1. Das Hefe-homolog Ubp6 erhöht bei Bindung an das Proteasom die Affinität zur E4 Ubiquitin Ligase Hul5, welche die Residenzdauer der Substrate am Proteasom durch Verlängerung der Ub-Ketten erhöht (Gegenspieler zu Ubp6). Es wird hier ein Proteasom-assoziierter Substrat-Checkpoint vermutet, indem Hul5 und Ubp6 gleichzeitig agieren. Dabei ermöglichen sie eine Feinkontrolle zu ermöglichen, ob das Substrat weiter am Proteasom gebunden bleibt und vollständig degradiert wird oder ob es freigesetzt wird. Usp14 spielt auch bei der Ub-Homeostase eine Rolle. So wird Infolge von niedrigen zellulären Ub-Konzentrationen die Menge von Ubp6 am 26S Proteasom erhöht, um die Effizienz im Ub-Recycling zu erhöhen. Uch37 assoziiert konstitutiv über die Rpn13 Ub-Rezeptor Untereinheit an das Proteasom. Deubiquitinierung durch Uch37 wird durch die Bindung an das Proteasom induziert, indem eine autoinhibitorische Extension in Uch37 repositioniert wird. Der Ub-Umsatz wird damit durch das Proteasom reguliert. Reaktionsmechanismen: Proteolyse und Intramolekualre Autolyse Der Inhibitor Ac-LLnL-al bindet kovalent an das N-terminale Threonin der aktiven β-untereinheiten. Die Hydroxylgruppe des N-terminalen Thr ermöglicht einen nukleophilen Angriff auf die Carbonyl- Gruppe der Peptid-Bindung. Diese Eigenschaft haben alle Mitglieder der Ntn-Hydrolasen (N-terminal nucleophile) gemeinsam. Die Faltung aller Ntn-Hydrolasen ist verwandt mit der Faltung der Proteasom Untereinheiten, Sequenz-Ähnlichkeiten liegen jedoch nicht vor (Vergleiche die Ntn Hydrolase Penicillin Acylase in Abbildung). Ntn-Hydrolasen werden als inaktive Vorläufer synthetisiert, die durch autokatalytisches Schneiden den N-terminalen Aminosäure-Rest mit der nukleophilen Seitenkette (Thr, Ser, oder Cys) exponieren. Der N-terminale Rest eines solchen Enzyms ist die aktive Stelle. Die Hydroxyl- bzw. Sulfhydryl-Gruppe der Seitenkette agiert als katalytisches Nukleophil und die freie Aminogruppe als Base für die Hydrolyse-Reaktion. Mutanten, in denen Thr durch Ser oder Cys ausgetauscht ist, zeigen entweder Defekte in Proteolyse oder in der autokatalytischen Prozessierung. Nur Thr kann beides katalysieren. Zwei weitere AS-Reste sind hochkonserviert (Nummerierung nach Thermoplasma β-untereinheit): Asp17 und Lys33. Das Nε-Atom

76 von Lys33 ist über eine Wasserstoffbrücke mit dem Sauerstoff der Hydroxylgruppe von Thr1 verbunden. Es ist für die katalytische Aktivität essentiell. Andere Reste in lokaler Umgebung des aktiven Zentrums (Ser129, Asp166, Ser169) stabilisieren die Konformation von Thr1 über Wasserstoffbrücken und sind ebenso für die katalytische Aktivität (strukturelle Integrität) essentiell. Es befindet sich ein nukleophiles Wassermolekül in der Umgebung der Atome Thr1-Oγ, Thr1-N, Ser129-Oγ und Gly47-N, das in intramolekularer Autolyse und Substrat-Proteolyse involviert ist. Reifung des aktiven Zentrums: Intramolekulare Autolyse Aktive β-untereinheiten werden als Vorläufer-Polypeptide mit N-terminalen Propeptiden synthetisiert. Nach Abspaltung des Propeptids ist der katalytische Rest Thr1 exponiert und die Einheit damit aktiviert. Das komplette Set aus Thr1, Asp17 und Lys33 ist nur in den β-untereinheiten 1, 2 und 5 vorhanden. Durch Prozessierung werden diese aktiviert. Die anderen β-untereinheiten sind inaktiv und liegen entweder in prozessierter Form (β6 und β7) oder in unprozessierter Form (β3 und β4) im reifen Proteasom vor. Die Reifung der β-untereinheiten geschieht während der Assemblierung (siehe unten), wenn die zwei Halb-Proteasom-Vorläufer dimerisieren. Im Vergleich zu der Autolyse von β1, 2 und 5 erfolgt die Prozessierung von β6 und 7 durch die proteolytische Aktivität der benachbarten aktiven Untereinheiten. Propeptide der aktiven β-untereinheiten sind in Größe und Sequenz hochdivergent. Ausnahme ist der Glycin-Rest (Gly-1), der direkt dem katalytischem Thr1 Rest folgt. Er ist für eine effiziente Autolyse erforderlich. Schritt 1: Das Propeptid ermöglicht die Konformation eines γ-turns von Leu-2 bis Thr1. In dieser Konformation ist die Hydroxylgruppe von Thr1 in der Lage einen nukleophilen Angriff auf das Gly1 Carbonyl-Atom durchzuführen, das in der inneren Seite des γ-turns lokalisiert ist. Während der Autokatalyse ist die N-terminale Aminogruppe nicht als Nukleophil verfügbar. Stattdessen agiert ein Wassermolekül, das im aktiven Zentrum lokalisiert ist, als Base für die Deprotonierung der Hydroxylgruppe von Thr1, um die Nukleophilie von Thr1 zu erhöhen. Schritt 2: Der nukleophile Angriff auf das Carbonyl-C-Atom von Gly-1 durch Thr1Oγ resultiert in einem tetraedrischen Oxazolidin-Intermediat. Der Zerfall dieses Intermediats macht aus dem Amid ein Ester (N-O Acyl Shift). Hier agiert ein protoniertes Wassermolekül als Protonendonor für das Amido-Nitrogen des Thr1-Restes. Schritt 3: Zuletzt kollabiert das Ester-Intermediat in ein freies N-terminales Thr1 und einen freien Carboxyl-Terminus am Gly-1 des Propeptids. Katalytischer Mechanismus der Proteolyse

77 Polypeptid-Substrat dockt an Thr1 über Wasserstoffbrücken an. Die Hydroxylgruppe von Thr1 muss durch einen Protonenakzeptor aktiviert werden. Lys33 könnte die Funktion haben den pk a Wert der Thr1 Aminogruppe so zu beeinflussen, dass die Gruppe als Protonenakzeptor während der Proteolyse fungiert. Das Thr1-Oγ Atom reagiert mit der Peptidbindung der Substrate oder mit elektrophilen funktionellen Gruppen von Inhibitoren. Ein Wassermolekül vermittelt den Protonentransfer zwischen Thr1-Oγ und Thr1-N während der Substrat-Bindung. Dies ermöglicht den nukleophilen Angriff des Thr1-Oγ an das Carbonyl-C der Peptidbindung und führt zur Bildung eines Acyl-Ester Intermediats. Ein Wassermolekül vermittelt auch die Hydrolyse der Acyl-Ester Bindung, sodass Thr1-Oγ regeneriert wird. Substrat-Spezifität der S1-Taschen von β1, 2 und 5 Eine Inaktivierung von β5 über Mutation resultiert in einer erheblichen Reduktion der Protein-Degradationsraten. Inaktivierung von β1 und β2 zeigen einen wesentlich geringeren Effekt. Die Spezifität der Bindung wird durch die S1 Tasche bestimmt. Die AS-45 hat hier den größten Einfluss auf die Spezifität dieser Tasche, da sie am Grund der Spalte lokalisiert ist. Die Untereinheit β1 hat an dieser Stelle ein Arginin (basisch), was eine Spaltung nach sauren Gruppen fördert. Die Untereinheit β2 hat einen kleinen Glycin Rest an dieser Stelle, wodurch die Tasche die großen basischen Reste aufnehmen kann. Die S1 Tasche von β5 hat wegen Methionin einen apolaren Charakter, wodurch es hydrophobe Reste aufnehmen kann. Die S1 Tasche ist alleine nicht für die Substrat-Spezifität determinierend. Es liegen weitere Reste um den Cleavage Punkt, die wichtig für die Auswahl der Cleavage-Stelle sind. Dabei werden bis zu 5 AS vor und nach der Cleavage Stelle des Substrats erkannt. Im Immunoproteasom ist in der Untereinheit β1i Arg45 mit Leu45 ausgetauscht. Dies macht die Tasche hydrophober, was die Spaltung nach verzweigten und aromatischen Resten erhöht. Dies ist konsistent damit, dass im Immunoproteasom die Chymotrypsin-Aktivität erhöht und die Spaltung nach sauren Resten resduziert ist. Die Untereinheiten β2i und β5i zeigen dagegen kaum Unterschiede in den S1 Taschen, obwohl sie relevant sind für die Änderung des Cleavage-Musters im Immunoproteasom. Substrat-Cleavage und Kooperativität der aktiven Zentren

78 Die Degradation der Client-Proteine produziert Oligopeptide zwischen 2 und 30 AS (mittlere Peptidlänge: 7-8 AS; identisch mit den archealen und bakteriellen Produkten). Die entstehenden Peptide werden durch Oligopeptidasen und/oder Amino-Carboxyl-Peptidasen zu AS abgebaut. Ein solches Enzym ist die Metalloendopeptidase Thimet Oligopeptidase (TOP), die mit dem 26S Proteasom assoziiert und eine effiziente Hydrolyseaktivität zeigt. In manchen Fällen werden Substrate nicht vollständig degradiert, sondern so prozessiert, dass biologisch aktive Proteine erhalten werden (z.b. p50 Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-κB). Dieser Prozess heißt regulierte Ubiqutin/Proteasom-abhängige Prozessierung (RUP). Unvollständige Degradation kann durch (1) fest gefaltete Domänen, die gegenüber Degradation resistent sind und/oder (2) Sequenz-Ausdehnungen wie Gly-Ala Repeats, die keine Entfaltung erlauben, ermöglicht werden. Die Anzahl der Schnitte in einem Polypeptid und die Degradations-Zeit steigen mit der Substratlänge. Die Anzahl der aktiven Stellen, ihre Spezifität oder Anordnung determinieren nicht die Produktlänge (diese ist in bakteriellen = 14 aktive Stellen und in eukaroytischen = 6 aktive Stellen identisch). Die durchschnittliche Produktlänge wird dadurch bestimmt, dass die Prozessierung solange fortschreitet, bis die Peptide klein genug sind, um durch das axiale gate des Proteasoms zu diffundieren. Die Proteasome zeigen 2-fache Symmetrie mit zwei möglichen Eingängen und zwei Ausgängen aus der proteolytischen Kammer. CPs mit zwei zugänglichen gates prozessieren zwei Substrate während eines Degradationszyklus mit einer positiven Kooperativität bei der Substrat-Bindung. Die Bindung des ersten Substrat-Moleküls beschleunigt somit die Aufnahme des zweiten durch die Öffnung des axialen Kanals auf der anderen Seite. Damit existiert kein unidirektionaler Fluss (Eingang Substrat oben / Ausgang Peptide unten), sondern Bindung und Auswurf der Peptide geschehen an beiden Enden gleichzeitig. Die Anwesenheit von Substraten und Abbauprodukten in der proteolytischen Kammer hat allosterische Effekte auf das aktive Zentrum, das Gate des CP und die Interaktion mit RP: Saure Peptide inhibieren die Chymotrypsin-Aktivität durch Bindung an nichtkatalytische Stellen. Das twosite modifier model beschreibt diesen Vorgang: Das saure Substrat-Peptid kann an das aktive Zentrum und an eine nichtkatalytische modifier-site binden. Die Bindung an die modifier-site resultiert in der Inhibition des Chymotrypsin-ähnlichen Zentrums. Besetzung der aktiven Zentren, die nach sauren Resten spalten, stimuliert die Trypsin-Aktivität des Proteasoms. Besetzung der aktiven Zentren durch Inhibitoren verringert die Dissoziations-Fähigkeit des 19S RPs vom CP. Die produzierten Peptide können auch als Antigene fungieren, welche durch MHC Klasse 1 präsentiert werden. Solche Oligopeptide haben 8-10 AS. Das Immunoproteasom macht daher längere Peptide, als das konstitutive. Die Assoziation mit PA28 stimuliert ebenso die Produktion von längeren Peptiden. Wahrscheinlich durch die Erhöhung des Öffnungszustandes (N-Termini der α-untereinheiten werden vermehrt zur Seite gezogen), wodurch schon größere Peptide herausdiffundieren können (Abbildung siehe unten). Die wichtigsten proteasomalen Bindepartner: PA28, PA200 und PI31

79 PA28 (11S Regulator) PA28 (28 kda) ist ein Regulator des 20S Proteasoms, der kegelförmige Kappen durch Assoziation an beiden Enden des zentralen 20 S CP bildet. PA28 Komplexe bestehen aus drei strukturell-verwandten Proteinen (α, β, γ), die 50% Identität zeigen. PA28α und PA28β assemblieren in heterooligomeren Komplexen (Indiz für Heptamere), in denen α- und β-untereinheiten alternierend auftreten und kommen hauptsächlich im Zytosol vor. PA28γ bildet homopolymere Komplexe, die im Zellkern, außerhalb des Nukleolus vorliegen. Der PA28-αβ-Komplex ist im Cytosol lokalisiert und stimuliert alle Peptidase-Aktivitäten des 20S Proteasoms (Peptide werden vermehrt gespalten) ohne die Zerstörung großer Protein-Substrate zu beeinflussen (auch wenn diese poly-ub markiert sind). PA28 spielt demnach keine zentrale Rolle im initialen Schritt der Protein-Degradation. Es hat vermutlich einen stimulierenden Effekt auf die Degradation mittel-großer Polypeptide. Daher könnten 26S Proteasom und PA28-Proteasom Komplex parallel oder kooperativ arbeiten. Das Proteasom fungiert als Prozessierungsenzym für MHC-Klasse-I Liganden, die für die Initiation Zellvermittelter Immunität in Vertebraten verantwortlich sind. IFNγ (immunomodulatory cytokine interferon) induziert die Überexpression von PA28α und PA28β, sowie weitere Proteinkomponenten des MHC Klasse 1 Ligand- Präsentations-Pathways (z.b. TAP). Knock-Out von PA28 bewirkt, dass keine Antigen-Prozessierung mehr stattfindet. Es wird daher vermutet, dass PA28-αβ der effizienten Produktion von Epitopen cytotoxischer T-Lymphozyten beiträgt (Überexpression von PA28-α beschleunigt Präsentation verschiedener Epitope). Der PA28-γ Komplex ist nicht in Antigen-Prozessierung involviert. Es hat scheinbar multiple spezifische Funktionen, die nicht durch PA28αβ ausgeführt werden können (u.a. in Proliferation und Wachstum). (1) PA28γ ist an Proteolyse im Zellkern und Umsatz von p53 über die MDM2-vermittelte proteasomale Degradation beteiligt. Das PA28γ-Polymer erleichtert die physikalische Interaktion zwischen MDM2 und p53, wodurch die MDM2-abhängige Ubiquitinierung und anschließende proteasomale Degradation von p53 erfolgt. Dieser Prozess verringert die p53 Akkumulation und inhibiert Apoptose nach DNA-Schäden. (2) Zusätzlich unterstützt PA28γ die Proteasom-vermittelte Degradation von SRC-3 (steroid receptor coactivator 3), einem Onkogen (bei Krebs überexprimiert). Dies deutet auf alternativen Proteasom-Degradations Mechanismus hin, der unabhängig von 19S RP ist.

80 (3) Außerdem beschleunigt PA28γ die Degradation des Zellzyklus Regulators p21 unabhängig von Ub. Es wird außerdem eine Rolle in der mitotischen Zellteilung vermutet (PA28 γ assoziiert mit Chromosomen in Telophase Zellen; stabilisiert Chromosomen) PA28 und PA700 können simultan an unterschiedliche Enden des 20S Proteasoms binden und formen dabei das PA700-20S-PA28 Hybrid-Proteasom. Das Hybrid-Proteasom trägt zur effizienten Proteolyse bei, Substrat-Proteine werden zuerst durch PA700 erkannt und dann in die Kavität des 20S Proteasoms transportiert, das eine beschleunigte Protease-Aktivität in Anwesenheit des PA28αβ Komplexes zeigt. Es katalysiert desweiteren die ATP-abhängige Degradation der Ornithin- Decarboxylase ohne Ub-tag! IFNγ beschleunigt die PA28αβ Expression und damit die Bildung des Hybrid-Proteasoms. Der Komplex ist in Prozessierung intrazellulärer Antigene involviert. Das Hybrid-Proteasom beschleunigt die Hydrolyse kleiner Peptide und bildet ein unterschiedliches Peptid-Muster im Vergleich zum 26S Proteasom. Dies könnte zugunsten der Antigen-Präsentation geschehen (geringfügig längere Peptide können aufgrund größerer Öffnung heraus diffundieren; zusätzlich ändert sich Spezifität der Proteolyse und damit Sequenz-Muster der Peptide). PA200 PA200 (Forschung an homologem Blm10 aus Hefe) reguliert die Proteasom-Assemblierung (Widersprüche: beschleunigt oder verlangsamt Proteasom-Reifung) und/oder die proteolytische Aktivität. Es aktiviert proteasomale Hydrolyse von Peptiden (4fache Erhöhung), aber nicht von gefalteten Proteinen. PA200 und Blm10 haben 20% Sequenzidentität. Sie sind strukturell durch HEAT-Repeats charakterisiert. Dies lässt annehmen, dass die Proteine eine Solenoid Faltung wie Rpn1 und Rpn2 aufweisen. Ein HEAT-Repeat umfasst AS und faltet in ein Hairpin, das aus 2 α-helices, getrennt durch einen Turn gebildet wird. Die Hairpins bilden kurvige Strukturen. Eine Helix ist auf der konkaven, die andere auf der konvexen Oberfläche lokalisiert. Der PA200-20S-PA700 Hybrid-Komplex bildet sich, indem PA200 mit seiner elongierten kurvigen Struktur an das Ende des CP Zylinders bindet, wo es fest bindet, um das autoinhibierte CP durch die Öffnung des axialen Kanals in die proteolytische Kammer zu aktivieren. Dies wird durch Wechselwirkungen mit allen α-untereinheiten des α-rings bewerkstelligt (allosterische Effekte auf CP), welche vermutlich die Freisetzung verdauter Produkte oder die Aufnahme von Substrate erleichtern. PA200 interagiert mit allen α-ue mit Ausnahme von α7, was im Vergleich zu Blm10 eine Öffnung des Kanals zur Seite hin bewirkt. PA200-CP zeigt erhöhte Hydrolyse-Aktivität. PA200-CP-PA200 zeigt jedoch reduzierte Hydrolyse- Aktivität. PA200 kann daher zwischen Gate-Konformationen unterscheiden und die Aktivierung von CP regulieren. Andere Studien haben gezeigt, dass PA200 an Proteasom-Vorläufer assoziiert ist, was eine Funktion in der Assemblierung vermuten lässt. Als Antwort auf ionisierende Strahlung bildet sich ein alternatives Hybrid Proteasom mit PA200 und PA700, das auf Chromatin akkumuliert und erhöhte proteolytische aktivität (Spaltung nach sauren AS wird verstärkt) zeigt. PA200 vermittelt einzigartigen Mechanismus für Genomische Stabilität nach ionisierender Strahlung, indem es post-glutamyl Cleavage von Proteasomen beschleunigt.

81 PI31 PI31 ist ein Inhibitor des 20S Proteasoms, der eine Aktivierung durch PA700 und PA28 verhindert. Es handelt sich um ein Prolin-reiches Protein, wobei die C-terminale Hälfte zu 26% aus Prolin besteht (ausgedehnte Sekundärsturktur). Proteasom-Inhibition wird durch diese Prolin-reiche Domäne ermöglicht. PI31 ist auch zellulärer Regulator der Proteasom-Reifung und der Proteasomvermittelten Antigen-Prozessierung, da es mit der Reifung von immunoproteasom Vorläufer Komplexen interagiert. PI31 besitzt eine FP-Domäne, welche die Heterodimerisierung mit SCF Fbxo7 vermittelt. Fbxo7 ist die Substrat-Erkennungs-Komponente des SCF Fbxo7 Proteins, das als E3 Ligase fungiert. Proteasom-Interacting Proteins (PIPs) PIPs sind Hilfsfaktoren (auxiliary factors) und können in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe enthält Proteinfaktoren, welche mit dem Ubiquitin-System verwandt sind. In diese Gruppe gehören Usp14 und Uch37, sowie die extrinsischen UBL-UBA Ubiquitin-Rezeptoren. Außerdem assozieren viele Ubiquitin E3 Ligasen (Hul5, E6AP, Parkin) transient mit dem 26S Proteasom. Außerdem assoziieren andere E3s (Ubr1, APC, Ufd4, SCF CDC4 ) und einige E2s mit dem 19S RP des Proteasoms. Die zweite Gruppe beinhaltet Faktoren, welche die Proteasom-Funktion über direkte Bindung beeinflussen (z.b. die 26S-Stabilisatoren Ecm29 und p27). Es interagieren aber viele andere Faktoren mit dem Proteasom (p28, Rpn14, S5b), die vermutlich in der Assemblierung oder Regulation des Proteasoms eine Rolle spielen PIPs, die mit 19S RP interagieren (Auswahl interessante Sachen dabei) 19S RP kann als Interaktions-Plattform für viele Proteine angesehen werden, die Substrate zum Proteasom eskortieren oder seine Funktion modulieren. Gankyrin (p28): Onkoprotein mit sieben Ankyrin-Repeats (33 AS große Domänen, die in zwei antiparallele α-helices, gefolgt von einem β-haripin, der von den Helices im 90 Winkel wegzeigt, falten). Interagiert mit Rpt3 im base Subkomplex von 19S RP über die ersten sechs der Ankyrin-Repeats. Bindung an Proteasom und die Mdm2 Ub-Ligase soll der Beschleunigung der Degradadtion von p53 Tumorsuppressoren dienen. Gankyrin ist für das Targeting spezifischer Substrate zum Proteasom verantwortlich. Int6: PCI-Domänen Protein, das mit den PCI-Domänen Komplexen (19S RP, elf3a, CSN) interagiert. In Abwesenheit von Int6-homolog Yin6 in Hefe assembliert Rpn5 nicht korrekt, wodurch die Proteasom-Funktion gestört ist. Cut8: Hefeprotein, das für Ub-abhängige Proteolyse essentiell ist. Bindet an 26S, wenn Ubmarkiert und fördert damit Kernlokalisation. PAAF1: (proteasomal ATPase-associated factor 1), 43 kda Protein, das an 19S RP bindet und die Assemblierung zum 26S Proteasom inhibiert. PAAF1-Rekrutierung wird durch HIV Tat gefördert. HIV-1 Transaktivator Protein (Tat): interagiert mit 20S CP (inhibiert seine Aktivität und verhindert Interaktion mit PA28; dadurch wird vermutlich Antigen-Präsentation inhibiert) und 19S RP (Tat rekrutiert PAAF1 und fördert Dissoziation vom CP; 19S agiert als Coaktivator für Tat, indem es seine Transkription fördert)

82 Rpn4: Interagiert mit 19S RP und ist Substrat des 26S Proteasoms. Rpn4-Degradation involviert Ub-abhängige und Ub-unabhängige Mechanismen. Rpn4 ist Transkriptionsfaktor, der Expression von Proteasom-Untereinheiten und anderen Genen, die in Stress-Antworten involviert sind, reguliert. Mainplayer im regulatorischen Feedbacksystem, das Proteasom- Funktion und Verfügbarkeit detektiert und seine Menge kontrolliert. AIRAP: (arsenite-inducible proteasomal 19S regulatory-associated protein) Expression induziert durch Arsenit (Arsen-Oxid Verbindungen). Bindet an Rpn1/2 des 19S RP. AIRAP scheint CP so zu adaptieren, das die Protein-Degradationsmaschinerie der Toxizität von Arsenit entgegenwirken kann (ohne AIRAP liegen mehr Poly-Ub markierte Proteine vor, wenn Arsenit einwirkt => niedrigere Peptidase-Aktivität). Bindung von AIRAP benötigt N- terminale Zinkfinger-Domäne und wird durch Abwesenheit von ATP beschleunigt. AIRAPL: konstitutv exprimiertes Analogon zu AIRAP. Assoziation mit Proteasom wird posttranslational reguliert. Assoziiert mit ER (könnte Rolle in ERAD spielen). Hat UIM Domäne und könnte somit die Proteasomalen Degradationseigenschaften modulieren, indem es als Ub- Adaptor fungiert. Proteasomale Diversität Hefe hat sieben α und sieben β-untereinheiten, konsistent mit der Anzahl an Untereinheiten im 20S Proteasom. Vertebraten haben bedeutend mehr als sieben β-untereinheiten, weshalb das Proteasom-System in Vertebraten eine gewisse Diversität in den katalytischen Untereinheiten aufweist, die in Zusammenhang mit der adaptiven Immunität entstanden ist. Das Immunoproteasom Im Immunoproteasom sind die β-untereinheiten 1,2 und 5 (Konstitutives Proteasom) durch die verwandten β-untereinheiten 1i, 2i und 5i ersetzt, deren Expression durch IFNγ induziert wird. Die IFNγ-regulierten Immuno-Untereinheiten enthalten aktive Threonin-Reste. Der Austausch der Untereinheiten bewirkt damit eine Veränderung der proteolytischen Spezifität des Proteasoms: Die Chymotrypsin- (Peptidspaltung auf Carboxyl-Seite hydrophobischer AS) und Trypsin- (Peptidspaltung auf Carboxyl-Seite basischer AS) Aktivität wird erhöht, während die Caspase-ähnlichen (saure AS) Aktivitäten verringert werden. Dadurch entstehen mehr Peptide mit hydrophoben oder saure

83 basischen Carboxyl-Termini, als mit sauren Carboxyl-Termini. Damit können Peptide, die vom Immunoproteasom gebildet werden eher in die Peptidbindetasche von MHC Klasse I binden, da hydrophobe oder basische (in geringerem Ausmaß) Carboxyl-Terminale Reste von Peptiden als Anker für eine Bindung an MHC-I Molekülen fungieren. Knock-Out der Immunountereinheiten führt zu einem Defekt in Antigen-Prozessierung. Das Thysmoproteasom Im Thymoproteasom liegen die β-untereinheiten 1i, 2i und 5t vor. Die katalytische β-untereinheit 5t wird ausschließlich in ctecs (cortical thymic epithelial cells) exprimiert. Diese Zellen sind für die positive Selektion sich entwickelnder Thymocyten verantwortlich. Verwendung von β5t statt β5 oder β5i im Proteasom reduziert selektiv die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität. β5t hat eine Schlüsselrolle in der Entwicklung des MHC Klasse I-abhängigen CD8+ T-Zell- Antigenrepertoires während der Selektion im Thymus. - Positive Selektion: Doppel-positive Zellen, die mit selbst-peptid-mhc Komplexen auf der Oberfläche von ctecs mit einer relativ geringen Avidität (MHC-TCR Interaktion mal MHC Dichte) interagieren, werden zur Differenzierung in CD4+ oder CD8+ positiven Thymozyten induziert. - Negative Selektion: Doppel-positive Zellen, die mit hoher Avidität mit selbst-mhc Komplexe interagieren werden über Apoptose eliminiert. - Null Selektion: Thymocyten, die keine funktionale T-Zell Rezeptoren aufweisen werden ebenso über Apoptose eliminiert. Wie ctecs die Signale zur positiven Selektion geben ist unbekannt. Es ist möglich, dass Thymoproteasome in ctecs mehr MHC-Klasse-I Liganden mit moderater Avidität produzieren (zumal Chymotrypsin-Aktivität reduziert, was Affinität der entstehenden Peptide zu MHC Klasse 1 reduziert), als solche mit hoher Affinität. Andere Proteasome Viele Organismen haben eine achte α-untereinheit (PAMA8), die stark verwandt mit der α4 Untereinheit im Menschen (PAMA7) ist. Die α8 Untereinheit wird in Zellen und Geweben (hauptsächlich Hoden, mammalian testis-specific proteasome) nur sehr limitiert exprimiert. Daher spielt das Proteasom, welches die α8 statt die α4 Untereinheit verwendet, in r äumlich und zeitlich begrenzten regulatorischen Programmen eine Rolle. Drosophila melanogaster exprimiert je drei Hoden-spezifische α und β Untereinheiten. Inaktivierung resultiert in Sterilität. Proteasom ist vermutlich in Spermatogenese involviert. Im Stress-spezifischen Proteasom ist AIRAP (siehe PIPs) an das Proteasom assoziiert. Proteasom-Assemblierung

84 Assemblierung des 20S Proteasoms Das archeale 20S Proteasom (homooligomere Ringe) kann autonom in ein funktional reifes Proteasom assemblieren, indem sich zunächst der α-ring bildet, an dem dann die β-untereinheiten assemblieren. Die α-ring-bildung basiert auf der N-terminalen H0-Helix der α-untereinheit, welche den Loop der H0-Helix der benachbarten α-untereinheit kontaktiert. Die β-untereinheiten weisen Propeptide auf, die während der Assemblierung abgespalten werden. Bakterien haben kein 20S Proteasom (Ausnahme: Actinomycetales hat je zwei verschiedene α und β Untereinheiten), sondern das strukturell verwandte Heat-Shock Locus Gene V (HslV). Die Assemblierung des eukaryotischen 20S Proteasoms benötigt extrinsische (Proteasom assembling chaperones: PAC 1-4; Ump1) und intrinsische (Propeptide und C-tail von β- Untereinheiten) Chaperone. Kurzfassung 20S-Assemblierung: (1) PAC1-PAC2 und PAC3-PAC4 sind für die Formation des α-rings verantwortlich. (2) Anschließend erfolgt die sequenzielle Inkorporation der β-untereinheiten, beginnend mit der Bindung von β2 und hump1 an den α-ring. hump1 wird für die Assoziation von β2 in frühen Assemblierungs-Intermediaten benötigt. (3) PAC3-PAC4 dissoziiert vom α-ring, wenn die Assemblierung des β-ringes bis zur β3- Assoziation fortgeschritten ist. Bis dahin sorgt der Heterodimer für die strukturelle Integrität des α-ringes. (4) Die folgende Inkorporation der weiteren β-untereinheiten wird durch intramolekulare Chaperone (Propeptide von β2 und β5) vermittelt. Die Dimerisierung der Halb-Mere, denen noch die β7 Einheit fehlt, wird durch den C-terminalen Schwanz von β7 katalysiert. (5) Daraufhin folgt die Entfernung der Propeptide der β-untereinheiten 1, 2, 5, 6 und 7, sowie die Degradation von hump1 und zuletzt PAC1-PAC2. Der erste Assemblierungsschritt ist die α-ring Formation, welche durch extrinsische Chaperone mediiert wird. In humanen Zellen sind dies die Heterodimeren Komplexe PAC1-PAC2 und PAC3-PAC4. PAC1-PAC2 sind nur im Heterodimer stabil, PAC3 kann auch als Homodimer vorliegen. PAC1-PAC2 ist mit einem α-untereinheit-proteasom-assemblierungsintermediat assoziiert, um ungewollte Dimerisierungen der α-ringe zu verhindern (reduziert off-pathway Assemblierungs- Produkte). Der Heterodimer bleibt bis zur Fertigstellung des 20S Proteasoms an den α-ringen assoziiert und wird dann direkt durch das fertig-gestellte 20S Proteasom degradiert (PAC1-PAC2 hat

85 damit HWZ von Minuten = Reifungsdauer des 20S Proteasoms). PAC1-PAC2 bildet wahrscheinlich einen Oligomerisierungs-Keim mit α5 und α7 (könnte auch nur Ort der Stabilisierung im späteren Assemblierungsintermediat sein). Es bindet mit geringerer Affinität andere α- Untereinheiten. PAC3-PAC4 (PAC3 ist β-sandwich aus zwei sechs-strängigen β-faltblättern. Dieser Sandwich wird durch je 4 α-helices umgeben) bindet spezifisch an Proteasom-Vorläufer, die alle 7 α-untereinheiten und die unprozessierte β2-untereinheit aufweisen. Eine PAC3-PAC4 Defizienz resultiert in geringeren Mengen des 20S Proteasoms. PAC3-PAC4 scheint demnach die korrekte Anordnung der Untereinheiten im α-ring zu katalysieren, indem es mit PAC1-PAC2 interagiert und die α-untereinheiten rekrutiert. PAC3-PAC4 bindet an der Oberfläche der α-untereinheiten, dort wo auch die β-untereinheiten assemblieren, und zwar an der inneren Oberfläche des α-rings, was die Interaktion mit drei verschiedenen α-untereinheiten (4, 5, 6) ermöglicht, während die β-untereinheiten mit zwei benachbarten α-untereinheiten interagieren. Der zweite Assemblierungsschritt ist die β-ring Formation, welche durch intramolekulare Chaperone mediiert wird. Der α-ring dient als Grundgerüst, an das nun die β-untereinheiten assemblieren. Das Resultat ist ein Halb-Proteasom, bestehend aus einem α- und einem β-ring. Die Reihenfolge der β- Untereinheiten Assemblierung ist β2, β3, β4, β5, β6, β1, β7. Mit der Assoziation von β3, dissoziiert PAC3 (manchmal mit PAC4) vom Assemblierungs-Intermediat ab. N-Terminale Propeptide der katalytischen Untereinheiten, sowie von β6 und β7 und C-Termini der β-untereinheiten beschleunigen die Proteasom-Assemblierung aufgrund von Wechselwirkungen zwischen cis und trans β-ringen. Die entsprechenden Domänen werden intramolekulare Chaperone genannt. Das Propeptid β2 beeinflusst kooperative Proteasom-Assemblierung. Das Propeptid β5 beschleunigt die Inkorporation derselbigen Untereinheit und rekrutiert β6. Es ist für die Lebensfähigkeit von Hefe essentiell. Die Propeptide von β1 und β2 sind für die Lebensfähigkeit von Hefe erlässlich, wobei kleine Defekte in der Proteasom Biogenese resultieren, wenn diese fehlen (im Menschen ist das β2 Propeptid essentiell für die Rekrutierung von β3). Der C-terminale Schwanz von β2, welcher am β3 desselben β-rings bindet, ist essentiell für die Proteasom-Biogenese in Hefe und im Menschen. Die AS-Sequenzen der humanen β-propeptide und der aus Hefe sind sehr verschieden, im Vergleich zu den reifen β-untereinheiten, die sehr konserviert sind. Ump1 (Ubiquitin mediated proteolysis) war der erste identifizierte extrinsische Assemblierungsfaktor für das 20S Proteasom. Er tritt in das Assemblierungs-Intermediat ein, nachdem β2, β3 und β4 in Hefe assoziiert haben. Nach der Dimerisierung der Halb-Proteasome wird Ump1 innerhalb des 20S Proteasoms genau wie PAC1 und PAC2 eingekapselt und degradiert. Ump1 koordiniert wahrscheinlich die Prozessierung der β-untereinheiten und die Dimerisierung der Halb-Proteasome (Ump1-Defizienz = Anhäufung von Halb-Proteasomen und Assemblierungs-Intermediaten). Es könnte auch als Assemblierungs-Checkpoint Faktor fungieren, der Dimerisierung inhibiert, bis alle β-untereinheiten assoziiert haben.

86 Das humane Homolog von Ump1 (hump1) ist in Vorläufer-Proteasomen lokalisiert, die unprozessierte β-untereinheiten enthalten und hat ähnliche HWZ wie PAC1-PAC2. Knock-Down inhibiert β5-rekrutierung. hump1 kann in Abwesenheit von β-untereinheiten an α-ring binden. Die Bindung von hump1 ist gekoppelt mit β2 Bindung. hump1 bindet damit früher als das Hefe Homolog in das Assemblierungs-Intermediat und ist im Menschen damit für die Initiation der β-ring Formierung verantwortlich. Im finalen Schritt der β-ring Assemblierung wird der C-terminale Schwanz von β7 in eine Spalte zwischen β1 und β2 des gegenüberliegenden Halb-Proteasoms insertiert, was die Dimerisierung vermittelt (im Menschen und in Hefe). Korrekte Dimerisierung der Halb-Proteasome ist gefolgt von der Entfernung der β-propeptide und der Degrdation von Ump1 und PAC1-PAC2. Assemblierung des Immuno- und Thymus-Proteasoms Liegen sowohl die Konstitutiven Untereinheiten, als auch die Immuno- Untereinheiten vor, werden die Immunoproteasome bevorzugt assembliert. Die Propeptide der Immuno-Untereinheiten und hump1 spielen bei dieser kooperativen Assemblierung eine Schlüsselrolle. Die Untereinheit β1i tritt früher als β1 in den Assemblierungs-Pathway ein, wodurch ein Intermediat aus α-ring und den β-untereinheiten 1i, 2i, 3 und 4 entsteht. In diesem Intermediat ist der Einbau von 2i abhängig von 1i und umgekehrt (Allosterie). Die 5i Untereinheit wird aufgrund des Propeptids bevorzugt gegenüber der Standard-Untereinheit eingebaut, wenn bereits 2i und 1i vorliegen. IFNγ Stimulation erhöht die Transkription von hump1, verringert aber die hump1 Proteinmenge wegen des 4-fachen Protein-Umsatzes, der direkt mit der Reifung aktiver Immunoproteasome korreliert. Das Immunoproteasom wird scheinbar 4-mal schneller assembliert, als das konstitutive Proteasom. hump1 hat eine wesentlich höhere Affinität zu 5i, als zur konstitutiven Untereinheit, was die Reifung der Immunoproteasome begünstigt. Die Untereinheit β5t wird bevorzugt gegenüber β5 eingebaut. Die Immunountereinheiten 1i und 2i werden jedoch hierzu nicht benötigt. Da in ctecs mehr Thymoproteasome vorliegen, als Immunoproteasome, muss 5t auch bevorzugt zu 5i eingebaut werden. Der Mechanismus ist nicht bekannt. Assemblierung von 19S RP Es wird davon ausgegangen, dass lid und base unabhängig assemblieren und anschließend verbunden werden. Der lid Komplex aus Hefe des 19S RP Subkomplexes kann in zwei Cluster aufgeteilt werden. Das eine Cluster besteht aus Rpn 5, 6, 8, 9 und 11, während das andere Rpn 3, 7, 12 und 15 enthält. Die Interaktion dieser Cluster wird durch Rpn3 und Rpn5 vermittelt. Hsp90 scheint in Assemblierung und Stabilisierung des lid Komplexes eine Rolle zu spielen. Es wird angenommen, dass die Anordnung der ATPase Untereinheiten im Base-Komplex durch Chaperone vermittelt wird. Base und Lid werden über Rpn10 verknüpft. Es wird angenommen, dass das 20S Proteasom als Assemblierungsfaktor für RP fungiert, da keine RP-Formierung in Anwesenheit defekter 20S Proteasome stattfindet. Assemblierung des 26S Proteasoms

87 Es wird angenommen, dass Hsp90 für die Assemblierung des 26S Proteasoms verantwortlich ist. Die Bindestelle zwischen RP und CP ändert sich in Abhängigkeit von der Aktivität des 20S Proteasoms. In Hefe wurde Deassemblierung des 26S Proteasoms und Dissoziation des RP in Subkomplexe als Reaktion auf die ATP-abhängige Degradation von Substrat-Proteinen gefunden. Im Säuger jedoch kann das 26S Proteasom Poly-Ub markierte Proteine ohne Deassemblierung oder Freisetzung einzelner Untereinheiten degradieren. Das 200 kda Protein Ecm29 kann an RP und das 20S Proteasom binden und stabilisiert damit den 26S Komplex in Hefe. Knock-Down von Ecm29 bewirkt Dissoziation des 26S Proteasoms in 19S und 20S. In Säugern agiert der Modulator-Komplex, bestehend aus Rpt4, Rpt5 und p27 als Beschleuniger für die Assoziation zwischen RP und CP. ClpAP/ClpXP/HslUV Proteasen und Adaptoren Chaperon-Protease Komplexe: ClpAP und ClpXP Die Caseinolytische Protease (ClpP) bildet mit verschiedenen ATPasen der Hsp100 Familie wie ClpX und ClpA (Ausnahme: ClpB) Komplexe, welche für die Degradation verschiedener Substrate verantwortlich sind. Die ClpAP- und ClpXP-Proteasen sind im Design sehr ähnlich zum eukaryotischen 26S Proteasom, bei dem die ATPase Untereinheiten den Eingang der proteolytischen Kammer bewachen. ClpP ist eine hochkonservierte Serin-Protease, die Bakterien und Eukaryoten, aber nicht in Archeen vorkommt. Die Protease besteht aus 14 Untereinheiten, die zylindrisch in zwei heptameren Ringen organisiert sind. Innerhalb dieser Kavität befindet sich die proteolytisch aktive Stelle. Der Eingang in diese Kavität erfolgt durch axiale Poren im Zylinder. Die Chaperone der AAA + -Familie, ClpA bzw. ClpX, denaturieren das Substrat und translokieren es durch die axialen Poren in die proteolytisch aktive Kavität. Sowohl Protease-, als auch Chaperon-Komplex zeigen damit Rotationssymmetrie und eine zentrale Pore. Im Komplex bildet sich ein gestapeltes Fass mit einem zentralen Kanal. Die regulatorischen ATPasen flankieren die Enden der Peptidasen. Sie regulieren welche Proteine Zugang zur Peptidase- Kavität bekommen. Die E.Coli Clp Proteine ClpX und ClpA dirigieren unterschiedliche Substrate zur ClpP Peptidase. ClpA und ClpX erkennen beide den SsrA Degradations-tag bestehend aus 11-AS in der Nähe des C- oder N-Terminus, aber durch unterschiedliche Bereiche.

88 Nukleotidbindung Der wesentliche Bestandteil der AAA + -Chaperone ist ein hochkonserviertes ATP-Binde-Modul, bestehend aus einer α/β Rossman-Faltung (enthält Walker A und Walker B) sowie einer α-helikalen Subdomäne. In der hexameren Form ist das Nukleotid, gebunden durch Walker A und B der einen Untereinheit, zusätzlich über einen Sensor der α-helikalen Subdomäne derselben Untereinheit und durch einen Sensor der benachbarten Untereinheit gebunden. Die Untereinheiten eines Hexamers haben nicht alle denselben Nukleotid-Zustand und dieselbe Konformation. Vielmehr liegen nur drei bis vier Moleküle ATP gleichzeitig im Hexamer gebunden vor. Substraterkennung durch ClpA und ClpX Intrazelluläre Proteasen müssen im Gegensatz zu extrazellulären Proteasen (wie Trypsin) wesentlich spezifischer Substrate degradieren. Zelluläre Proteine werden vor ihrer Degradation geschützt, da nur entfaltete Peptide durch den engen Spalt des ClpP Fasses hindurch kommen. Gefaltete Proteine müssen zunächst mit den Chaperon-Komponenten interagieren, welche das Protein entfaltet und in die Protease-Kammer translokiert. Die Chaperon-Untereinheit ist damit für die spezifische Erkennung der Target-Proteine verantwortlich, wobei als Mediatoren zwischen den unterschiedlichen Substraten und den Chaperon-Bindestellen verschiedene Adaptoren (ClpS, RssB, SspB) fungieren. ClpA ist vom Typ 2 der AAA-ATPasen und besitzt damit eine N-Domäne. Es ist hauptsächlich für die Degradation von N-end rule Substraten verantwortlich. Diese binden an den Adaptor ClpS, welcher von der N-Domäne gebunden wird. Substrate können aber auch direkt an die N-Domäne binden. ClpX und (in geringerem Ausmaß) ClpA erkennen ssra-markierte Proteine direkt durch ihre Poren- Region. ClpX gehört zum Typ 1 der AAA ATPasen und besitzt daher keine N-Domäne. Hier fungiert die ZBD neben der Poren-Region selbst als zusätzliche Bindestelle für Substrate. So kann der ssra-tag auch durch den Shuttle-Faktor sspb gebunden und auf ClpX durch die Interaktion zwischen sspb und seiner ZBD übertragen werden. Translokation und Entfaltung durch ClpA und ClpX Es wurde gezeigt, dass ClpA und ClpX ihre Substrate entfalten, indem sie diese durch den Kanal, gebildet durch den hexameren Ring, transportieren. Der Kanaldurchmesser misst am Eingang 2,4 nm (die engste Stelle nur 0,9 nm breit), weshalb gefaltete Proteine hier nicht durchpassen (auch wenn durch den ATPase Zyklus kurzzeitige Vergrößerungen des Durchmessers resultieren). Der Kanal selbst ist groß genug, um zwei unstrukturierte Polypeptide aufzunehmen. Substrat-Entfaltung wird durch Energie-getriebenes Ziehen des Substrats in das Zentrum des oligomeren Rings bewerkstellig (Kopplung zwischen Entfaltung und Translokation). Dabei interagiert das Substrat mit konservierten, unstrukturierten Loop-Segmenten innerhalb der zentralen Pore (in Abbildung: orange), die zwischen Up-Konformation und Down-Konformation in Folge der ATP-Hydrolyse hin und her wechseln und damit das Substrat in die Pore ziehen. Dieses Modell nimmt an, dass der Loop in der Down-Konformation eine geringere Affinität zum Substrat

89 aufweist. Dieser unstrukturierte Loop (Kanal-Motiv) besteht aus Tyrosin-Resten, die durch Glycin- Paare flankiert sind (oft GYVG-Motiv) und liegt genau zwischen den Motiven Walker A und Walker B. Die Glycine gewähren die Flexibilität der Loop-Struktur. Die Entfaltung des Substrat-Proteins ist nicht direkt erfolgreich. Oft resultiert eine Freisetzung des Substrats, nach einigen Entfaltungs-Versuchen, die ATP-Hydrolyse benötigen. Durch diese Faltungs-Versuche wird viel ATP verbraucht. Die Entfaltung von 100 AS benötigt ca. 30 bis 80 ATP, besonders stabile Proteine benötigen bis zu 550 ATP. Ist das Protein über Mutationen destabilisiert, werden nur ca. 12 ATP benötigt. Das Adaptorprotein RssB RssB ist sehr spezifisch und interagiert mit dem Haupt-Transkriptions-Regulator und Wachstumsfaktor RpoS (Sigma-38) unter verschiedenen Stress-Bedingungen. RpoS ist u.a. in die Regulation der Protein-Stabilität gegenüber Proteolyse involviert. Während der exponentiellen Wachstumsphase und unter normalen Bedingungen bindet RssB an RpoS, um es zu ClpXP zwecks Degradation zu dirigieren, da RpoS nicht durch ClpX direkt erkannt und gebunden wird. Unter Stress- Bedingungen wie DNA-Schäden oder Phosphat-Mangel, binden spezifische Antiadaptoren an RssB und verhindern damit die Interaktion mit RpoS. Damit wird RpoS nicht abgebaut und kann als Transkriptions-Regulator agieren. SspB als Adaptor für ClpX-abhängige Degradation ssra-markierter Proteine SspB/ClpX/ClpA-Bindemotive in ssra SspB (stringent starvation protein B) verstärkt die Degradation von ssra-markierten Proteinen durch ClpXP, obwohl diese auch ohne SspB gute Substrate für ClpXP darstellen (RssB dagegen ist für die Degradation von RpoS notwendig). Der Grund dafür ist, dass in ssra auch ein ClpX-Bindemotiv vorliegt (rote Sequenz in Abbildung), das zudem nicht mit dem SspB Bindemotiv überlappt. Der ssra-tag bindet auch direkt an ClpA (blaue Sequenz in Abbildung), wobei hier mehr AS an der Interaktion beteiligt sind als an der ssra-clpx Interaktion. Ohne sspb wäre damit die Interaktion

90 zwischen ssra-markierten Proteinen und ClpA größer. Dadurch, dass die ssra-bindestelle von sspb eine Überlappung zur ssra-bindestelle aus ClpA zeigt, blockiert die Wechselwirkung zwischen ssramarkiertem Protein und SspB die Interaktion mit ClpA, wodurch das Substrat nur noch durch ClpXP abgebaut werden kann. SspB erhöht damit die Degradationsrate durch Bindung von ssra sowie ClpX, wodurch die effektive Konzentration an ClpXP erhöht und der KM Wert verringert wird. SspB kann auch als Inhibitor für die ClpXP-abhängige Degradation von nicht-ssra-markierten Proteinen fungieren, da sie ohne die SspB-vermittelte Degradation von ssra-markierten Proteinen vermehrt degradiert werden. Außerdem kann SspB auch Proteine ohne ssra-markierung zur ClpXP Protease dirigieren. Relevanz der ssra-degradation mit und ohne SspB Insgesamt werden in E.coli mehr als 1 Protein von 200 mit dem ssra-tag versehen, wobei ClpXP für die Degradation von über 90% dieser Proteine verantwortlich ist. Die Degradationsrate durch ClpXP liegt über 1,4 Substrate pro Minute und wird um das dreifache reduziert, wenn der Adaptor SspB fehlt. Gleichzeitig wird jedoch die Degradationsrate durch ClpAP um das 3-5 fache gesteigert, da SspB mit ClpAP um dieselbe ssra-erkennungsstelle kompetiert. Wegen ClpA-spezifischer Substrate ist die Degradationsrate ssra-markierter Proteine auch in Abwesenheit von SspB geringer als die von ClpXP. Struktur von SspB SspB ist ein dimeres Protein, bestehend aus einer kompakten ssra- Bindedomäne mit Dimerisierungsoberfläche (dimere Bindestelle) und einen flexiblen 50 AS langen C-terminalen Schwanz mit einem ClpX- Bindemotiv (XB) am C-Terminus. Beide C-Termini werden für eine effiziente Bindung an ClpX benötigt. Die Abbildung zeigt ein sspb-dimer im Komplex mit zwei ssra-peptiden, wobei der flexible C-terminale Schwanz nicht dargestellt ist (in Kristallstruktur nicht sichtbar). Das ssra Peptid bindet in eine Tasche, die durch verschiedene hydrophobe Reste ausgebildet wird. Struktur von ClpX ClpX (46 kda) besitzt im Gegensatz zu ClpA nur ein einzelnes AAA + -Modul, weshalb es zum Typ 1 der AAA + -ATPasen zählt und keine N-Domäne aufweist. Stattdessen existiert eine N-terminale ZBD (C4 type zinc binding domain), welche die Substratbindung in ClpX vermittelt. Die ZBDs liegen als stabile Dimere vor und bilden eine separate Domäne, die aufgrund eines flexiblen Linkers großen ATPabhängigen Bewegungen in Richtung des ATPase Kerns unterliegt. ClpX bindet mit diesen ZBDs an den SspB-Dimer, wobei die Interaktion hauptsächlich zwischen einer hydrophoben Tasche aus ClpX und einem auch in RssB und weiteren Substraten konservierten Leucin-Rest stattfindet (Leu161 in SspB). Insgesamt hat das ClpX-Hexamer drei SspB-XB Bindestellen, eine pro ZBD Dimer. Da der SspB-Dimer zwei XB-Motive aufweist (eine pro C-Terminus), kann das ClpX Hexamer nur ein SspB-Dimer zur

91 selben Zeit binden. Aufgrund der ATPase-induzierten Bewegung des Linkers können so Substrate, die an die ZBD binden in Richtung Pore zwecks Entfaltung translokiert werden. Die Abbildung zeigt die Struktur eines ZBD-Dimers im Komplex mit zwei SspB-C-Termini-Peptiden. Substratspezifität: Die Substratspezifität läst sich im Experiment leicht testen: ClpXP Mutante, die katalytisch inaktiv ist exprimieren. Substrate werden zu ClpXP transportiert, sind aber in proteolytische Kammer gefangen. Aufreinigung von ClpXP-Oligomere, Trennung der Oligomere, die Target-Proteine gefangen haben über 2D Gele, Massenspektrometrie zur Identifizierung individueller Proteine. Alle auf diese Weise identifizierten Substrate haben bestimmte ClpX-Erkennungsmotive. Insgesamt wurden fünf solcher Peptid-Motive in ClpXP Substraten charakterisiert, die durch ClpX erkannt werden und die Degradation eines Target-Proteins vermitteln. Davon sind drei am N-Terminus und zwei am C-Terminus der Substrate lokalisiert. Insgesamt binden diese Motive entweder an die AAA + -Domäne oder an die ZBD, wobei die ZBD wesentlich spezifischer Substrate bindet, als die Porenregion der AAA + -Domäne. Beide Domänen bevorzugen hydrophobe Reste, haben jedoch unterschiedliche Sequenz-Spezifitäten. Translokationsmechanismus durch ClpX Da ClpX keine zwei ATPase-Domänen aufweist, um auch stark gefaltete Domänen zu entfalten, arbeitet es mit einem 2-Geschwindigkeits-Getriebe. Die ATP-Hydrolyserate ist während der Translokation ungefalteter Substrate hoch, da diese kaum Widerstand entgegen bringen. Je translokiertem Rest wird hier ein Molekül ATP hydrolysiert. Gefaltete Substrate zeigen erhöhten Widerstand gegen die Translokation, was mit der lokalen Stabilität direkt neben dem Degradations-Tag zusammenhängt. Hier wechselt ClpX zu einer niedrigeren Geschwindigkeit und ATP-Hydrolyserate, dennoch ist der ATP-Verbrauch höher als für entfaltete Proteine. Es scheint, dass die ATP-Hydrolyse innerhalb der einzelnen Untereinheiten stark asymmetrisch verläuft und jede Untereinheit für sich arbeitet. Dies wird dadurch gestützt, dass auch ein Hexamer mit nur einer aktiven Untereinheit die Protein-Translokation bewerkstelligt (jedoch mit niedrigerer Geschwindigkeit). Simultane Hydrolyse ist nicht notwendig. Auch in ClpX liegen jedoch kleinere, sekundäre Loops vor, welche zur Substrat-Translokation beitragen.

92 Das Adaptorprotein ClpS und die Degradation von N-end rule Substraten Modulation der ClpAP Substratspezifität durch ClpS Das Adaptorprotein ClpS reguliert den Substrat-Fluss zur ClpAP Protease, wodurch die Degradation einiger Substrate verhindert und die Degradation aggregierter Proteine gefördert wird. ClpS moduliert die Substratspezifität von ClpAP so, dass nicht mehr ssra-markierte Proteine, sondern N- end rule Substrate erkannt werden. N-Degron Bindung durch ClpS Es wurde gezeigt, dass ClpS an das bakterielle N-Degron bindet, das aus einem N-terminalen aromatischen Rest oder Leucin besteht, dem Arginin oder Lysin folgt. Die Bindung erfolgt über eine komplementäre Bindestelle aus negativ geladenen und hydrophoben Resten, die im bakteriellen ClpS hochkonserviert ist und Homologien zur Bindestelle von eukaryotischem N-Rekognin (UBR1) zeigt. Die erfolgreiche Rekrutierung eines N-end rule Substrats ist ebenso davon abhängig, wie gut es von ClpS zu ClpA transferiert werden kann. Dies benötigt eine unstrukturierte Region zwischen destabilisierenden N-terminalen Resten und dem gefalteten Teil des Substrats (z.b. flexibler Linker). Die Rekrutierung via N-end rule zum ClpAPS-Komplex benötigt damit zwei Ereignisse: Bindung des destabilisierenden N-Terminus des Substrats an ClpS und Transfer des Substrats in die ClpA-Pore (Mechanismus unbekannt). Struktur von ClpS und Wechselwirkung mit der N-Domäne aus ClpA Der Adaptor ClpS ist ein Kegel-förmiges Molekül mit einer N-terminalen Verlängerung. Die N- Degron Bindestelle (N-Degron in Abbildung rot markiert) ist in der Basis des Kegels lokalisiert, während die Spitze an die N-Domänen von ClpA andockt. Für die Substrat-Degradation ist ein flexibler Linker im Substrat zwischen gefalteter Struktur und N-Degron erforderlich (in Abbildung grün gepunktet). Die volle Länge der N-terminalen Verlängerung aus ClpS ist für den Transport von N-end rule Substraten notwendig, während der mittlere Bereich notwendig ist um die ssraabhängige Degradation zu inhibieren. Die N-Domänen aus ClpA, welche die Interaktion mit ClpS vermitteln, werden über einen flexiblen 25 AS langen Linker mit dem ClpA Ring verknüpft, was den Transport der Substrate zur ClpA Pore erleichtert. N-end rule Substrate werden vom N- zum C-Terminus prozessiert, also nicht wie ssra-substrate vom C- zum N-Terminus (ClpA Paper 2009). Die Abbildung zeigt die Degradation von N-end rule Substraten durch ClpAPS. Die N-terminalen Reste des N-end rule Substrats werden durch ClpS (in Abbildung S ) gebunden und an die N-Domäne (in Abbildung N ) von ClpA dirigiert. Der flexible

93 Linker zwischen N und D1 beschleunigt den Versuch das Substrat-Molekül zur ClpA Pore zu überreichen. Der unstrukturierte und hochflexible Linker zwischen FR und dem gefalteten Substrat bildet einen Loop, der durch die ClpA Poren-Loops gebunden wird. Infolge der Substrat-Entfaltung und Degradation vom N- zum C-Terminus wird der FR-Rest von ClpS freigesetzt. Translokationsmechanismus durch ClpA Jedes ClpA Monomer (83 kda) beinhaltet zwei AAA + -Module (D1 und D2) und gehört damit zur Klasse-I der AAA-Proteine. D1 weist zwei kleinere sekundäre Loops auf, während D2 einen größeren Loop aufweist, der das Kanal-Motiv GYVG enthält. In der ersten Variante des Loop-Motivs befindet sich vor dem Tyrosin-Rest ein Lysin und dem flankierenden Glycin folgt ein saurer Rest. Es ist am Eingang der Kanäle ClpA, ClpB, Hsp104 (Hefe- Homolog zu ClpB) und der proteasomalen ATPasen (Rpt 1,2,6) zu finden. Die zweite Loop-Variante beinhaltet ein konserviertes GYVG Motiv, gefolgt von sauren Resten. Diese findet man in der unteren Hälfte von ClpA, ClpB, Hsp104, sowie in ClpX und Hs1U. Beide Loop-Varianten leisten ihren Beitrag zur Substrat-Translokation. Im hexameren ClpA wird damit die Breite des Kanals durch zwei Wände (in D1 und D2) beschränkt, die aus 6 bzw. 12 Loops bestehen (einer bzw. zwei pro Untereinheit). Die ATPase-Domänen in D1 und D2 agieren unabhängig voneinander. Beide ATPase Aktivitäten werden benötigt, um stabile Proteine zu entfalten, während die D1-Aktivität ausreichend ist, um Substrate mit moderater lokaler Stabilität zu entfalten (Paper September 2009). Die Hexamerisierung der Monomere wird durch ATP-Bindung induziert. Dabei induziert die ATP-Bindung an D1 die Hexamerisierung, während der ATP-Umsatz hauptsächlich in D2 stattfindet und für die Translokation und Entfaltung verantwortlich ist. Durch Bindung von ClpA an ClpP oder dem Adaptorprotein ClpS wird die Aktivität der D2 ATPase Domäne moduliert, nicht aber die der D1 Domäne.

94 Es ist anzumerken, dass der Translokations-Mechanismus höchstwahrscheinlich nicht auf die Bewegung eines einzelnen Loops reduziert werden kann, da größere Konformationsänderungen und Domänen-Rotationen infolge einer Änderung des Nukleotid-Zustands für HslU und FtsH beobachtet wurden. Autodegradation Das ClpAP-System ermöglicht die ClpAP-abhängige ClpA-Autodegradation über einen intrinsischen tag am ClpA C-Terminus. Die Degradation von N-end rule Substraten über die Interaktion mit ClpS inhibiert Autodegradation. Außerdem wird die Autodegradation durch ssra-markierte Substrate inhibiert, da sie für die Bindestelle innerhalb der ClpAP Pore kompetieren. Wenn ssra-markierte Proteine sehr häufig sind, wird der Anteil von freiem ClpAP, das nicht im Komplex mit ClpS vorliegt, erhöht. Damit ist gewährleistet, dass ClpAP unter Stress-Bedingungen signifikant zur Degradation von ssra-markierten Proteinen beiträgt, die dann häufiger vorkommen. Die Protease-Komponente ClpP ClpP in verschiedenen Organismen Bakterielles ClpP: Die meisten Bakterien haben nur eine Form von aktivem ClpP, wenn auch einige mehrere Isoformen codieren. Darüberhinaus liegt in Pflanzen und Cyanobakterien eine inaktive Version von ClpP vor, die keinen der drei Reste Ser-His-Asp in der katalytischen Triade aufweist und als ClpR bezeichnet wird. Das E.coli ClpP besteht aus 207 AS, inklusive einer N-terminalen Prosequenz, die als regulatorisches Peptid fungiert und autokatalytisch während dem Faltungsprozess abgespalten wird, um das Reife ClpP, bestehend aus 193 AS zu erhalten. Acyldepsipeptide (ADEPs) verleihen ClpP die Fähigkeit Substrate ohne Anwesenheit der Chaperone unspezifisch zu degradieren. Verwendung als Antibakterielles Reagenz (Letalität für Gram-positive Bakterien). Die ClpP-Proteasen akkumulieren in Bakterien während der Wachstumsphase an den Polen. Interessanterweise akkumulieren z.b. ClpXP und ClpCP an verschiedenen Stellen, um selektiv bestimmte regulatorische Proteine, welche in Entwicklungsprozessen beteiligt sind, zu degradieren. Humanes ClpP: Humanes ClpP ist innerhalb der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Im reifen Protein werden N-terminal 56 AS entfernt, darunter die Prosequenz und die mitochondriale Targeting- Sequenz. Der C-Terminus ist um 28 AS im Vergleich zu den bakteriellen ClpPs verlängert (Funktion unbekannt). Im Menschen existiert ausschließlich ClpX, das ebenso die mitochondriale Targeting- Sequenz enthält, um die ATPase Funktion im Komplex zu erfüllen. Im Menschen liegt ClpP als ein einzelner heptamerer Ring vor (kein tetradecamerer Zylinder, wie in Bakterien). Außerdem wird die

95 katalytische Triade nach außen exponiert und befindet sich nicht im Zentrum des Kanals. Es liegt jedoch keine Protease-Aktivität und eine sehr geringe Peptidase-Aktivität vor. Wegen hoher Mobilität ist die für die katalytische Aktivität essentielle Orientierung der katalytischen Triade zerstört. Das heptamere ClpP bildet einen Doppel-Ring, wenn es an ClpX in Anwesenheit von ATP bindet. In diesem Zustand ist die katalytische Aktivität wieder hergestellt. Humanes ClpXP und E.coli ClpXP degradieren unterschiedliche Substrate. Es ist möglich humanes ClpP mit E.coli ClpX zu verbinden, wodurch E.coli-Substrate erkannt und degradiert werden, was beweist, dass die Chaperon-Komponente für die Substratspezifität verantwortlich ist. Pflanzliches ClpP: Die Diversität und Komplexität der Clp-Familie ist in höheren pflanzlichen Organismen erkennbar, welche mindestens 10 ClpP-ähnliche Proteine codieren (A.thaliana). Genauso wurden auch 10 verschiedene Hsp100 Chaperone entdeckt, die mit diesen assoziieren und verschiedene Spezifitäten vermitteln. Die meisten Clp ATPasen liegen im plastidären Stroma vor. Es ist möglich, dass verschiedene Clp Proteaen zu einem heterotetradecameren zylindrischen Komplex (z.b. ClpPR) assoziieren. Die Struktur der Protease ClpP Das E.Coli ClpP-Tetradecamer wiegt insgesamt 300 kda und misst 90 Å in Höhe und Durchmesser. Jedes Monomer besteht hauptsächlich aus sechs Wiederholungen einer α/β-faltung, die über hydrophobe Interaktionen zusammengehalten werden, mit einer zusätzlichen, hervorstehenden α/β Einheit (handle Region). Jedes Monomer kann in eine handle Region (β9 und αe), welche die Ring-Interaktion vermittelt sowie in eine Head-Domäne mit axialem Loop eingeteilt werden. Der heptamere Ring entsteht durch die seitliche Interaktion zwischen Kopf-Domänen unter Bildung von dimeren und tetrameren Zwischenprodukten, wodurch sieben handle Regionen exponiert werden, die mit den sieben handle Regionen des zweiten heptameren Rings interkalieren und damit die Oligomerisierung zum Tetradecamer vermitteln. Im Tetradecamer misst die interne Kammer 51 Å. Verkürzungen der handle Domäne führt jedoch nicht zur Dissoziation des Komplexes, was eine hohe Plastizität dieser Region vermuten lässt. Es wird angenommen, dass durch die Bewegung der E-Helix die Bildung einer transienten äquatorialen Pore für den Austritt der Peptide ermöglicht (Stand 2007). Die Interaktion mit den ATPasen wird durch axiale Loops vermittelt. Diese Interaktion ist kooperativ, sodass die bi-capped ClpAP bzw. ClpXP Komplexe dominieren. Außerdem sind dieselben Loops für die Ausbildung der axialen Poren verantwortlich. Zwischen den verschiedenen ClpP Proteinen unterschiedlicher Organismen gibt es zahlreiche Unterschiede. Diese Unterschiede werden durch Hinzufügen verschiedener Modifikationen an

96 dieselbe Kern-Struktur von ClpP vermittelt. Humanes ClpP hat 28 weitere AS-Reste am C-Terminus, die an der Peripherie des Heptamers lokalisiert sind und einen flexiblen Loop bilden. Diese Verlängerung beeinflusst die Assemblierung des humanen ClpP. Eine Verkürzung führt zu instabilen ClpP Heptamere sowie zu einer erhöhten Affinität zu ClpX. Mechanismen der ClpP Funktion ClpP ist eine klassische Serin-Protease, wobei jede Untereinheit des Tetradecamers ein aktives Zentrum bestehend aus den drei Resten Ser-His-Asp aufweist. Die Katalytische Triade ist am Übergang zwischen Head und Handle Domäne lokalisiert. Innerhalb der proteolytischen Kammer liegen damit 14 aktive Zentren vor. Im Falle von ClpPR ist die Anzahl der aktiven Zentren reduziert. E.Coli ClpP schneidet Polypeptidketten bevorzugt nach geladenen oder verzweigten AS. Der einzige Zugang zur katalytischen Kammer erfolgt durch die engen axialen Poren, durch die kleine Peptide von maximal 30 AS eindringen können. Die axialen Loops bestehen aus 7-8 hydrophoben Resten ( axial pore lining ), welche die axialen Poren ausbilden und begrenzen, gefolgt von 9 Resten ( axial protrusion ), welche aus der apikalen Oberfläche des ClpP Zylinders hervorstechen und die Interaktion mit den ATPasen vermittelt. Auf der apikalen Oberfläche von ClpP, 54Å von den axialen Poren entfernt, befinden sich sieben Taschen von je 10 Å Durchmesser, die aus konservierten, hydrophoben Resten aufgebaut sind und Bindestellen für spezifische Loop-Regionen innerhalb der Chaperone darstellen. Diese Loop- Regionen sind in AAA + -Chaperonen hoch konserviert. In E.Coli sind dies die Loop-Sequenzen IGF in ClpX bzw. IGL in ClpA. Die Interaktion wird damit nicht durch große Oberflächen sondern durch loopgroove Interaktionen vermittelt, obwohl dies aufgrund der Symmetrie-Diskrepanz zwischen Protease und Chaperon nicht erwartet worden wäre. Die Anzahl der loop-groove Interaktionen sind ebenso unbekannt. Durch loop-groove Interaktionen bleibt der Komplex flexibel, was evtl. für die Substratentfaltung erforderlich ist. Dass ClpP eine siebenfache, die Chaperone aber eine sechsfache Symmetrie aufweisen, könnte eine Rotation der beiden Komplexe gegeneinander bewirken, welche die Translokationsrate entfalteter Substrate erhöht (experimentell nicht gestützt). Das Substrat-Protein wird wahrscheinlich durch ein Netzwerk von Wasserstoffbrücken durch β4 und β9 in der Nähe der aktiven Zentren gefangen. Diese Interaktionen werden dann durch hydrophobe Interaktionen mit der Wand der ClpP Kammer stabilisiert. Es wird angenommen, dass das Substrat horizontal in der proteolytischen Kammer in der Nähe des ClpP-Äquators positioniert wird. Die Polypeptidkette sei dabei im Uhrzeigersinn vom N- zum C-Terminus orientiert, da die Translokation vom C-Terminus beginnt. Die Degradationsprodukte sind etwa 7-8 AS lange Peptide, welche nach und nach aus der Kammer entlassen werden. Es existieren mehrere Hypothesen für einen Mechanismus nach dem die Peptide freigesetzt werden. (1) Eine Möglichkeit ist, dass die Peptide durch passive Diffusion dieselbe axiale Pore für den Ausgang nutzen, wie das Substrat auch eingetreten ist. Dies erfordert jedoch die Dissoziation des Chaperons vom ClpP-Komplex, was sehr ineffizient wäre. Dennoch wird dieses Modell auch für das Proteasom angenommen.

97 (2) Das zweite Modell beschreibt die Freisetzung der Peptide durch seitliche Poren, die transient an der Kontaktstelle zwischen zwei heptameren ClpP Ringen gebildet werden. Dieses Modell wird u.a. durch die hohe Plastizität der Handle-Region sowie dadurch unterstützt, dass die E-Helix zwischen mindestens zwei verschiedenen Konfirmationen dynamisch wechseln kann. Die HslVU Protease HslUV (= ClpYQ) ist das bakterielle Homolog zum eukaryotischen Proteasom und wird daher auch als bakterielles Proteasom bezeichnet. Der Komplex besteht aus der (im Gegensatz zur heptameren ClpP) hexameren HslV-Protease (ClpQ) sowie der hexameren HslU-ATPase (ClpY, 50% identisch zu ClpX). Die hexamere HslU ATPase gehört ebenso wie ClpA und ClpX zu der Hsp100-Familie und bindet entweder ein oder beide Enden des HslV Dodecamers, um einen HslUV-Komplex zu bilden. HslU transferiert Polypeptidketten durch die zentrale Pore in die proteolytische Kammer von HslV. Dabei ist HslV mit der β-untereinheit des 20S Proteasoms verwandt und nutzt genauso den N-terminalen Threonin-Rest zur katalytischen Aktivität. ATP-Bindung und Hydrolyse durch HslU sind für die Entfaltung der Protein-Substrate sowie die proteolytische Funktion und die Interaktion zwischen HslV und HslU essentiell. Das HslU Chaperon besitzt ebenso das konservierte GYVG Motiv in einem unstrukturierten Loop innerhalb des zentralen Kanals. In der Abbildung ist dieser in der Nukleotid-freien (rot) und dem ADP-gebundenen Zustand (grün) dargestellt. Die Peptidase-Aktivität von HslV ist sehr gering und steigt um ein bis zwei Größenordnungen, wenn es in Anwesenheit von ATP an HslU gebunden vorliegt (Getestet an einem kleinen, fluorogenen Peptid-Substrat: Carbobenzoxy-Gly-Gly-Leu-7-amido-4-methyl Coumarin: Z-GGL-AMC). Auch ATPγS stimuliert die Peptidase-Aktivität, weshalb die Aktivierung der HslV aktiven Zentren durch HslU lediglich die ATP-Bindung, aber nicht die ATP-Hydrolyse erfordert. Nur die Degradation von Protein-Substraten benötigt auch die ATP-Hydrolyse, da diese vor der Translokation in die proteolytische Kavität aktiv entfaltet werden müssen. Während dem ATP-Hydrolyse-Zyklus erfolgen vermutlich dynamische Konformationsänderungen, da nur ATP-gebundenes HslU an HslV bindet, nicht aber ADP-gebundenes. Nach der ATP-Hydrolyse dissoziiert HslU im Falle fortschreitender Substrat-Degradation jedoch nicht ab, weil die Bindung des Substrats an die aktiven Zentren die Bindung zwischen HslU und HslV verstärkt, sodass diese Interaktion nicht mehr von der Anwesenheit von ATP abhängig ist. Mutanten ohne den katalytisch aktiven Rest Thr1 zeigen ebenso eine wesentlich stärkere HslU-HslV Interaktion.

98 Im Unterschied zum eukaryotischen Proteasom, das 6 aktive Zentren auf 14 Untereinheiten verteilt hat, weist das bakterielle Proteasom 12 aktive Zentren auf, eines in jeder Untereinheit. Dennoch sind für die volle Aktivität lediglich 6 aktive Zentren erforderlich, weshalb angenommen wird, dass zur selben Zeit maximal 6 katalytische Zentren aktiv sind (Paper, Oktober 2009). Die Abbildung zeigt hexameres HsI-U links, das zur Proteinfamilie Hsp100 der AAA + -ATPasen gehört und rechts den monomeren Ausschnitt. Die Pfeile deuten die Kontaktstelle zur HsIV Protease an. Proteolytischer Zyklus für HslUV Die ATP-Bindung an HslU könnte die Bewegung C-terminaler Schwänze von der Kontaktstelle zwischen HslU-Untereinieten zur Kontaktstelle zwischen HslV- Untereinheiten induzieren. Dies führt zu intrinsischen basalen Interaktionen zwischen HslV und HslU und somit zur Bildung eines transienten, schwachen HslVU Komplexes. Infolge der Bindung eines strukturierten Protein-Substrats beginnt die Entfaltung und Translokation des Substrats durch HslU in die proteolytische Kammer von HslV. Die Umhüllung des aktiven Zentrums Thr1 durch das Substrat induziert eine Erhöhung der Affinität zwischen HslIV und HslU, wodurch ein starker HslUV Komplex gebildet wird, der prozessives Schneiden von Peptidbindungen erlaubt. Während diesem Prozess unterstützt andauernde ATP- Hydrolyse die Entfaltung und Translokation des Proteins, was nun keinen Effekt mehr auf die Stabilität des Komplexes hat. Nach der vollständigen Degradation des Substrats, wenn keine geschnittenen Produkte mehr innerhalb der HslV Kammer vorliegen, dissoziieren HslV und HslU voneinander ab und werden in einen schwach assoziieren HslUV Komplex konvertiert.

99 FtsH, m-aaa, i-aaa Struktur von FtsH FtsH ist ein 647 AS langes und 71 kda schweres inneres Plasmamembranprotein mit einer kurzen N-terminalen cytoplasmatischen Region, gefolgt vom ersten Transmembransegment, einer 70 AS großen periplasmatischen Region, dem zweiten Transmembransegment und einem 520 AS großen zytosolischen Anteil. Letzterer enthält eine typische AAA-ATPase-Domäne mit SRH-Motiv (charakteristisch für die AAA-Klasse der AAA+ Superfamilie), sowie weiter C-terminal eine Zink- Metalloprotease-Domäne, welche aus dem proteolytischen Zentrum, der Zink-Bindestelle und einer α-helikalen coiled-coil Leucin-Zipper Sequenz besteht. Es existieren über 400 FtsH-Kopien im E.coli Genom, deren Expressionsraten infoge von cytosolischem Stress erhöht sind. FtsH bildet einen rotationssymmetrischen Homohexamer, der durch den oligomeren, Membran-gebundenen Modulationsfaktor HflKC komplexiert wird. Die ATPase Domäne Die ATPase Domäne besteht aus einer typischen Nukleotid-Bindetaschen-Faltung und einer zusätzlichen α-helix-reichen C-terminalen Subdomäne. Walker A und Walker B sind so orientiert, dass sie ATP in Konjugation mit Mg 2+ und Wasser-Molekülen so koordinieren, dass Bindung und Hydrolyse des Nukleotids erleichtert ist. Die SRH Reste fungieren als Sensoren für ATP γ-phosphat innerhalb einer Untereinheit (Asn301) und zwischen Untereinheiten (Arginin Finger: Arg312, Arg315).

100 Allgemeine zelluläre Funktion FtsH degradiert einen bestimmten Anteil kurzlebiger löslicher Proteine aus dem Cytosol (zelluläre Regulation auf Basis der Protein-Stabilität), sowie fehlgefaltete Membranproteine in Prokaryoten, sowie Mitochondrien und Chloroplasten eukaryotischer Zellen (Qualitätskontrolle). Obwohl fehlgefaltete Proteine zelltoxisch sein können, sind fehlgefaltete Membranproteine speziell wegen ihrer Unfähigkeit die Membranfunktionen zu erfüllen schädlich. Daher müssen solche im Zuge der Qualitätskontrolle eliminiert werden. FtsH ist eine Energie-abhängige Endopeptidase mit der speziellen Fähigkeit Membranprotein- Substrate aus der Membran zu transportieren. Hierfür ist die Membran-gebundene Struktur von FtsH notwendig. Oligomerisierung Die 3D-Struktur der ATPase-Domäne erlaubt plausible Modelle für die Assemblierung zum Hexamer. Die Wechselwirkung des SRH Arginin-Fingers mit der γ-phosphatgruppe des ATP-Moleküls in der benachbarten Untereinheit bewirkt die Stabilisierung des ATP-Übergangszustandes. Die ATPase Aktivität ist damit von der Quartiärstruktur abhängig und nur im homooligomeren Zustand vorhanden. Bildung des Homo-Hexamers Es existieren elektrostatische und hydrophobe Kontakte zwischen spezifischen α-helix-paaren verschiedener Untereinheiten, wodurch die hexamere Struktur stabilisiert wird. Die N-terminale Membran-ständige Region von FtsH ist zur Selbstassemblierung fähig. Auch die ATPase Domäne hat die Fähigkeit die hexamere Ring-Struktur zu bilden, die aber ohne Transmembrandomäne nicht zur Oligomerisierung ausreichend ist (FtsH TM 1 Mutante liegt als Monomer vor). Hinzu kommt die Protease-intrinsische Fähigkeit zur Oligomerisierung, welche durch die Dimerisierungsfähigkeit des Leucin-Zipper Motivs vermittelt wird. Die zweite Transmembranregion hat einen ähnlichen Effekt wie das Leucin-Zipper Motiv. Durch die Dimerisierung wird die ATPaseund Protease-Aktivität teilweise, zumindest gegen lösliche Substrate, wiederhergestellt (FtsH TM 1 Mutante liegt als Dimer vor). Die Dimerisierung durch das Leucin-Zipper Motiv und die Transmembransegmente unterstützen vermutlich die Hexamerisierungsfähigkeit der ATPase- Domäne. Heterodimerisierung mit HflKC HflK und HflC haben je ein einziges Transmembransegment nahe ihrer N-Termini, gefolgt von einer großen periplasmatischen Domäne, die zur Heterodimereisierung zum HflKC Komplex fähig ist. HflKC selbstassoziiert weiter zu einem HflKC-20S-Komplex. Der FtsH-haltige 30S-Heterokomplex (FtsH Holoenzym) ist ca. 1MDa schwer und besteht vermutlich aus 6 Molekülen FtsH und 6 Molekülen HflKC. Das FtsH Holoenzym ist die physiologische Form vom FtsH, wobei FtsH ausschließlich in Form des Hexamers studiert wurde. Die periplasmatische Domäne ist für die Interaktion zwischen FtsH und HflKC und damit für die korrekte Regulation der Substratspezifität notwendig, aber nicht für die Protease-Aktivität

101 essentiell. Außerdem ist die periplasmatische Domäne zum Teil an der Fähigkeit der Selbstassemblierung des N-terminalen Transmembransegments beteiligt. Die mit HflKC entfernt verwandte Proteinfamilie der Prohibitine kommt in Mitochondrien der Eukaryoten vor. Prohibitine bilden ebenso einen großen Komplex und interagieren mit der m-aaa-protease in der inneren mitochondrialen Membran. HflKC und Prohibitine inhibieren die proteolytischen Funktionen der m-aaa Protease. Prohibitine weisen zusätzlich eine Membran- Chaperon-Aktivität auf. Konformationsänderungen FtsH zeigt eine Konformationsänderung in Anwesenheit von ATP, welche die ATPase Domäne stabilisiert, da eine stärkere Assoziation zwischen Nukleotid-Bindedomäne und α-helikaler Subdomäne resultiert. Dies deutet auf eine flexible Subdomänen-Orientierung hin, welche die Hauptrolle bei der für die Funktion essentiellen Konformationsänderung spielen könnte. Der N-terminale Bereich von SRH, welche den intramolekularen γ-phosphat Sensor beinhaltet, erfährt infolge der ATP-Hydrolyse ebenso eine Konformationsveränderung. Diese Region der SRH Sequenz zeigt ebenso in Richtung Protease-Domäne, weshalb SRH mit der Protease-Domäne kommunizieren könnte, um die zwei enzymatischen Aktivitäten von FtsH zu koppeln. Route des Substrat-Polypeptids Das Hexamer-Modell sagt zwei Orientierungen vorher: (1) Das N-terminale Ende der ATPase Domäne zeigt in Richtung Membran-integralem Protein-Bereich (2) Das C-terminale Bündel aus vier α-helices liegt direkt neben der Protease-Domäne des Komplexes. Das Substrat-Polypeptid könnte daher in die Kavität eindringen, deren Öffnung durch den N-terminalen hexameren Ring gebildet wird. Vor dem Eindringen könnte eine Interaktion mit der äußeren Oberfläche der helikalen Subdomäne erfolgen (pre-entry route). Innerhalb des Hexamers befindet sich ein N-terminales entrance gate (Pore 1), das durch konservierte Poren-Reste (M 227 FVG) gebildet wird. Dieses wurde zuerst im HslU Hexamer entdeckt. Das in dieser Sequenz vorkommende F228 ist auch wichtig für die ATP-abhängige Substrat-Degradation. Auf der Protease-Seite befindet sich ein weiteres Sequenzmotiv (G 264 AGLGGGH), das mit der Pore 2 von HslU korrespondiert, die für den Substrat-Transport zur Protease-Kammer genutzt wird. Substrat-Bindung: Entry-Route für lösliche und Membran-gebundene Proteine Die initiale Bindung des Substrats könnte an der äußeren Oberfläche der α-helikalen ATPase- Subdomäne von FtsH stattfinden (in Abbildung violett). Diesem initialen Schritt der Substraterkennung sollten dann (im Falle eines degradierbaren Substrats) mehrere Bindungsschritte folgen, die das Substrat über die N-terminale Poren-Region der ATPase Domäne (orange) in die ATPase-Kavität überführt. Das Polypeptid wird dann weiter in die Protease-Kammer für sukzessive Endoproteolyse transportiert. Die erste Bindung ist ATP-unabhängig, wobei die nachfolgenden Transport-Schritte mit ATP-Hydrolyse gekoppelt sind. Folgende Abbildung zeigt die Entry-Route von löslichen Proteinen.

102 Die Entry-Route für Membransubstrate scheint sich von der Entry-Route löslicher Substrate zu unterscheiden. Die erste Interaktion geschieht in der Membran über ein Transmembransegment des Substrats mit dem FtsH TM-Regionen sowie mit HflKC, wobei die Wechselwirkung mit HflKC zu einer Verlangsammung der nachfolgenden Schritte führt. HflKC ist damit ein Inhibitor für die Degradation von Membranproteinen durch FtsH (damit wird die Degradation löslicher Proteine beschleunigt). Nach dieser initialen Bindung, wird das Membranprotein auf die Interaktion mit der α-helikalen Subdomäne bzw. das Vorhandensein eines Degradations-tags getestet. Ist die Bindung erfolgreich, wird das Membranprtein in die Kammer transportiert. Es wird spekuliert, dass sich diese Bindungsstelle in einer bestimmten Entfernung zur Membranoberfläche befindet, sodass nur zytosolische Bereiche mit über 20 AS binden können. Die nachfolgenden Schritte erfolgen auf ähnliche Weise wie für lösliche Proteine. Die C-terminale Coiled-Coil-Region könnte ebenso einen Beitrag zur Bindung leisten. Energie-Verbrauch und Prozessivität Die Hydrolyse der Peptidbindung selbst ist nicht Energie-abhängig. Die vollständige Protein- Degradation benötigt jedoch in fast allen Fällen Energie in Form von ATP. Zunächst beginnt eine ATPabhängige Protease die Proteolyse an einem spezifischen Inititiationspunkt und degradiert anschließend das gesamte Molekül (prozessiv, d.h. ohne vom linearen Substrat abzudissoziieren). Die Energie der ATP-Hydrolyse wird möglicherweise zur Modulation des Substrat-Faltungszustandes benötigt, damit die sequentiell entfaltenden Polypeptid-Bereiche zum aktiven Zentrum der Protease hin ausgerichtet sind. Die FtsH-katalysierte Degradation von Protein-Substraten ist abhängig von Zn 2+ und ATP-Hydrolyse, wobei die Bindung eines Nukleotids ausreichend für das Schneiden kleiner Peptide sein könnte. Die Proteolyse selbst ist nicht Energie-abhängig. Die ATP-Hydrolyse wird wahrscheinlich für die

103 Präsentation des Substrat-Polypeptids zum aktiven Zentrum benötigt, was Entfaltung und Translokation beinhaltet. Prozessivität Es existieren keine Degradationsintermediate, sodass die proteolytische Reaktion prozessiv und gerichtet sein muss. Damit ist die Initiation der Degradation der Raten-limitierende Schritt. Nach dem Beginn der Proteolyse, wird das gesamte Molekül schnell degradiert, wobei die Prozessivität vermutlich durch die ATPase Funktion vermittelt wird. Die Initiation der Proteolyse erfolgt innerhalb einer zytosolischen Region des Substrats, wonach das gesamte Molekül degradiert wird, inklusive der transmembranen und periplasmatischen Regionen. Direktionalität Die Degradation kann sowohl am C- als auch am N-Terminus beginnen. Dennoch ist es unwahrscheinlich, dass Moleküle mit intrinsischer Polarität in beiden Orientierungen in das aktive Zentrum passen. Daher ist es möglich, dass ein Polypeptid-Segment innerhalb des AAA-Hexamers abhängig von der Direktionalität umorientiert wird (stand: 2005; man hat kein plan). Die Reaktionsprodukte sind Oligopeptide kleiner als 3 kda, meist zwischen 10 und 20 AS. Substraterkennung Es wurden keine spezifischen Regeln für die Auswahl des Schnittpunktes im Peptid gefunden, wobei hydrophobe und basische AS N-terminal der Peptid-Schneidestelle präferiert werden. Durch das C-terminale Anheften der SsrA tag-sequenz wird das λ ci Protein in ein FtsH Substrat umgewandelt. Im Fall von σ32 ist die C-terminale Region nicht essentiell für die Degradation. Es wird beginnend vom N-Terminus zum C-Terminus degradiert. FtsH kann unstrukturierte Proteine wie Casein und Pepsin leicht degradieren, während die Degradation funktional nativer Substrate abhängig von Initations-Signalen ist. Die Degradation funktional nativer Substrate benötigt das sequentielle Entfalten des Substrats, das am Initations-Signal beginnt und weiter entlang der Polypeptidkette propagiert. Das proteolytisch aktive Zentrum von FtsH befindet sich auf der zytosolischen Seite, weshalb die transmembranen und periplasmatischen Domänen aus bzw. durch die Membran gezogen werden müssen, um vollständig degradiert zu werden. Stark gefaltete Domänen oder TM-Regionen von Substraten, die mit anderen Proteinen stark assoziiert sind, können nicht durch FtsH entfaltet werden (schwache Unfoldase-Aktivität). Im Falle einer z.b. stark gefalteten periplasmatischen Domäne (Disulfidbrücken) bricht die Degradation ab. Die FtsH AAA Funktion wurde daher primär als Dislokase, nicht als Unfoldase konzipiert. Die Länge der cytosolischen Termini von Substrat-Proteinen ist entscheidend für die Erkennung durch FtsH. Die Initiationsregion muss mindestens 20 AS enthalten. Eine spezifische Sequenz für die FtsH-Erkennung existiert jedoch nicht. Nicht-Substrate können zu Substraten umgewandelt werden, wenn ihr zytosolischer Schwanz am C oder N-Terminus verlängert wird. Funktionen als Membran-gebundenes Enzym Die TM-Domäne wird für den proteolytischen Verdau von Membranproteinen zwecks initialer Erkennung benötigt. Die Degradation von löslichen und Membran-gebundenen Proteinen ist von

104 der Protonen-motorischen Kraft abhängig. Ohne periplasmatische Domäne oder mit veränderter TM-Sequenz wird die Degradation nicht mehr durch die PMF stimuliert. Im ER erfolgt eine retrograde Translokation von abnormalen Proteinen, in der die AAA-ATPase p97, Derline und möglicherweise Sec61 als Translokon involviert sind. FtsH könnte hier als Translokations-Kanal, Dislokations-Motor und Peptidase fungieren. Regulatorische Faktoren FtsH hat Substrat-spezifische Modulatoren. HflD präsentiert das Substrat cii zu FtsH zwecks Proteolyse. Es handelt sich um ein peripheres Membranprotein, das cii bindet, es inaktiviert und seine Degradation beschleunigt. DnaK präsentiert dagegen das Substrat σ32 an FtsH. Weitere Funktionen neben der Proteolyse FtsH kann zytosolische Bereiche von Membranproteinen, die an die alkalische Phosphatase gekoppelt sind, auf die periplasmatische Seite translokieren. Fusioniert man gleichzeitig eine Stopp-Transfer-Sequenz an die alkalische Phosphatase, so wird diese Translokation verhindert. Die alkalische Phosphatase sollte in diesen chimeren Proteinen wegen der reduzierenden Umgebung des Zytosols denaturiert vorliegen. Dadurch wird sie durch FtsH erkannt und gebunden, was nicht zur Degradation sondern zur Stabilisierung der zytosolischen Lokalisation führt. Ähnliche Membranprotein-Segmente, die FtsH binden, aber nicht degradiert werden, könnten auch in ihrer Lokalisation und Faltung stabilisiert werden. Diese transiente Interaktion könnte die Biogenese von Membranproteinen beeinflussen. Die FtsH Protease scheint damit auch Chaperon-ähnliche Funktionen zu haben und spielt damit in Biogenese-Prozessen von Membranproteinen und in vielen zellulären Prozessen eine Rolle (Charonine sind Proteasen mit Chaperon-Funktion). Ausgewählte Beispiele für Substrate der FtsH-Protease Virale Proteine Viele der durch FtsH degradierten kurzlebigen Proteine, werden von Bakteriophagen codiert (z.b. mind. 3 Genprodukte der λ-phage: cii, cii und Xis). Einige der viralen Genprodukte werden ausschließlich durch FtsH abgebaut (cii-genprodukt der λ-phage: Transkriptionsfaktor für Gene, die zum Einbau des Phagen in das Host-Genom erforderlich sind). Damit beeinflusst FtsH maßgeblich den Lebenszyklus der Phage und damit die Entscheidung, ob der Phage lytisch wächst oder ins Genom integriert. E.coli Transkriptionsfaktoren FtsH degradiert den Transkriptionsfaktor σ32 (heat shock sigma factor), der bei Abwesenheit von Hitzeschock oder anderen Stress-Bedingungen auch durch andere Proteasen abgebaut wird. In Abwesenheit von FtsH ist σ32 überakkumuliert, wobei es mit DnaKJ assoziiert und damit nicht als Transkriptionsfaktor aktiv ist. DnaK könnte die Degradation von σ32 durch Präsentation an FtsH beschleunigen. FtsH stellt die Basis für die zelluläre Instabilität von σ32 dar und kontrolliert damit teilweise die Hitze-Schock Antwort von E.coli. LpxC Deacetylase

105 Die Biosynthese von Lipid A (LPS-Komponente) über die LpxC-Deacetylase und die Biosynthese von Fettsäuren (Phospholipid-Komponente) über die FabA-Dehydrase nutzen dasselbe Substrat. Das GG zwischen den Enzymen ist wichtig für das LPS/Phospjolipid Verhältnis in E.coli. Die LpxC-Deacetylase hat eine kurze HWZ von 4 Minuten wegen der FtsH-katalysierten Degradation. Eine Fehlfunktion von FtsH ist wegen Überakkumulation von LPS letal. Die Letalität kann durch Überexpression der FabA-Dehydrase ausgeglichen werden. Selbstprozessierung FtsH zeigt einen autokatalytischen Mechanismus, indem es zwischen M640 und S641 schneidet und sieben C-terminale Reste entfernt. Dies geschieht sehr langsam, wobei die prozessierte Form während der stationären Phase im Wachstumszyklus akkumuliert. Beginnt das Wachstum, so wird das prozessierte Protein wieder durch das unprozessierte ersetzt. Beide Formen sind voll aktiv, weshalb der Zweck der Prozessierung unverstanden ist. Nicht-assemblierte Membranproteine SecY ist ein integrales Membranprotein, das mit SecE und SecG einen Translokon-Komplex bildet. Dieser muss hochdynamisch sein, damit Proteine transportiert und in die Lipiddoppelschicht integriert werden können. Unvollständige Assemblierung des Translokons ist schädlich für die Zelle. Die SecY Untereinheit ist ohne SecE instabil (HWZ: 2 Minuten), da sie von FtsH degradiert wird. FtsH ist für die Qualitätskontrolle von Membranproteinen essentiell In Abwesenheit von FtsH (und Anwesenheit von sfhc21) werden extrazytoplasmatische Stressantworten induziert, die bei Überexpression von FtsH-Substraten weiter verstärkt werden. FtsH scheint damit stetig an der Degradation von Membranprotein-Substraten beteiligt zu sein, deren Akkumulation Membran-Stress hervorrufen. Abwesenheit von FtsH und HtpX (Membran-gebundene, Stress-induzierbare Zink-Metalloprotease) resultiert in einem Wachstumsdefekt. Sie haben komplementäre oder überlappende zelluläre Funktionen, vermutlich in der proteolytischen Qualitätskontrolle von Membranproteinen. In Hefe- Mitochondrien spielen m-aaa- und i-aaa-proteasen mit Sequenz-Ähnlichkeiten zu FtsH, sowie Oma1 (verwandt mit HtpX) eine ähnliche Rolle. Degradation von Peptiden Nach der Degradation durch ATP-abhängige Protease-Komplexe entstehen Peptide unterschiedlicher Größen, die weiter zu den einzelnen AS abgebaut werden müssen. Dies geschieht durch verschiedene Energie-unabhängige Peptidasen, die auch direkt an den größeren Degradationsmaschinerien assoziieren.

106 In dem Modellorganismus T.acidophilum scheint die Serin- Protease Tricorn eine Hauptkomponente für das Schneiden von Oligopeptiden darzustellen, die vom 26S Proteasom produziert werden. Tricorn ist eine Käfig-ähnliche Protease, welche Peptide prozessiv spaltet. In T.acidophilum existieren drei Faktoren (F1, F2, F3), die mit Tricorn interagieren. So ist z.b. die Aminopeptidase F1 für das Schneiden hydrophober Peptide, die von der Tricorn Protease erzeugt werden, verantwortlich. F1 gehört zur α/β Hydrolase Superfamilie und ist strukturell verwandt mit gut charakterisierten homologen Proteinen in Bakterien (Prolyl-Imonopeptidase, PIP; Prolyl- Aminopeptidase, PAP) und Säugern (Prolyl-Oligopeptidase, POP; Dipeptidyl-Peptidase IV). Auch für F2 und F3, die kleine geladene und polare Oligopeptide spalten, existieren entsprechende homologe Proteine. F1 bevorzugt Peptide mit zwei bis vier AS, welche das aktive Zentrum über einen engen Tunnel erreichen können. Die Spezifität wird durch eine große hydrophobe Tasche bestimmt. Protein-Kinesis und globale Protein-Stabilität

107 Global Protein Stability (GPS) Profiling in Mammalian Cells Traditionelle Methoden zur Messung der Proteinstabilität beruhen entweder auf Pulse-Chase metabolic labeling oder auf der Gabe von Proteinsynthese-Inhibitoren und einer biochemischen Analyse der Proteinhäufigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten. Dies ist jedoch nur für einzelne Zielproteine möglich. Um die HWZ der globalen Protein-Population unter verschiedenen physiologischen oder Krankheits-Stadien zu messen, ist diese Vorgehensweise nicht praktikabel. Die Kombination des pulse-chase Experiments mit Massenspetrometrie, um den Durchsatz zu erhöhen ist ebenso ungeeignet, da Proteine mit niedriger Häufigkeit nicht detektiert werden können. Ein neu entwickeltes Hochdurchsatzverfahren für den Protein-Umsatz auf Proteom-Skala in einzelnen Säugerzellen wird GPS-Analyse genannt. Es besteht aus einem Zell-basierenden System, das die GPS misst. Dazu wird ein retrovirales Reporter-Konstrukt verwendet, dessen Expressions-Kassette einen einzelnen Promoter enthält, der mithilfe einer IRES (interne ribosomale Bindestelle) die Translation von zwei fluoreszenzen Proteinen aus einem mrna Transkript ermöglicht. Das erste fluoreszierende Protein (DsRed), dient als interne Kontrolle, während das zweite (egfp) als Fusionsprotein mit dem Target-Protein X exprimiert wird. DsRed und egfp-x werden in gleicher Rate exprimiert, da sie von derselben mrna stammen. Die Rate egfp/dsred innerhalb der Zelle repräsentiert die Stabilität des Proteins X in diesem System und kann über FACS quantifiziert werden. Die egfp/dsred Rate wird nicht durch Transkriptionsregulation beeinflusst, da beide Proteine auf derselben mrna liegen. Des Weiteren ermöglicht dieses Verfahren eine Beobachtung der Proteinstabilität in Echtzeit innerhalb von lebenden Zellen und hat Potential für Automatisierung und somit für Hochdurchsatz-Analysen.

108 Wegen den unterschiedlichen Integrationsstellen unterscheiden sich die Mengen der fluoreszierenden Proteine zwischen verschiedenen Zellen, wobei das egfp/dsred Verhältnis immer gleich ist (siehe Abbildung). Um GPS in einer globalen Skala anzuwenden, wurde eine Multiplex- Strategie entwicklet, welche die Analyse fluoreszenz-basierter Protein- Stabilität mit der DNA-Microarray-Technologie verbindet (siehe Abbildung links). Um eine Reporter-Zell-Bibliothek zu entwerfen. Multiplex GPS profiling by using DNA microarray deconvolution Lysosomale Degradation und Autophagie Bedeutung und Arten der Autophagie Bedeutung der Autophagie Das Proteasom ist ein subzelluläres Nano-Kompartiment, das in Zusammenarbeit mit dem Ubiquitin- System für die Degradation kurzlebiger (Minuten bis wenige Stunden) Proteine zuständig ist. Ungefähr 90% des Gesamtproteingehalts einer Zelle stellen jedoch langlebige Proteine dar. Solche Proteine, sowie Zellorganellen werden über den lysosomalen Weg degradiert. Autophagie dient neben dem biosynthetischen Cvt-Pathway dem lysosomalen Targeting und macht dadurch Proteine und Organellen für die lysosomale Degradation zugänglich. Es handelt sich um einen hochkonservierten und für das Überleben essentiellen Mechanismus, der in allen eukaryotischen Zellen stattfindet und in Hefe sehr intensiv studiert wurde. Autophagie hat zwei Hauptfunktionen, die das Überleben sichern: (1) Abbau alternder Organellen, wodurch ihre zytotoxische Wirkung bekämpft wird.

109 (2) Abbau nicht-essentieller Proteine infolge von Aminosäure-Mangel, um die Proteinbiosynthese essentieller Proteine aufrecht zu erhalten. Zusätzlich hat Autophagie über zwei Mechanismen Einfluss auf den Zelltod: (1) Autophagie vermittelt direkt den PCD Typ 2 (autophagischer Zelltod). (2) Autophagie interagiert direkt mit der Apoptose-Maschinerie (PCD Typ 1). Autophagie beeinflusst außerdem angeborene und adaptive Immunität, Regulation von Zellwachstum, Differenzierung und Entwicklung, sowie Alterungsprozesse und korreliert mit zahlreichen humanen Erkrankungen wie Krebs, Kardiomyopathien und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington. Selektive und Nicht-Selektive Autophagie Man unterscheidet verschiedene Formen der Autophagie, von denen die Makroautophagie (MA), die Mikroautophagie, sowie die Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA) am bekanntesten sind.

110 Man unterscheidet zwischen selektiven und nicht-selektiven Autophagie-Arten. Während die CMA selektiv Substrate durch das exponierte KFERQ-Motiv erkennt, können MA und Mikroautophagie sowohl selektive als auch nicht-selektive Prozesse darstellen. Ein Beispiel für eine selektive Mikroautophagie ist die stückweise Mikroautophagie des Nukleus (PMN) in der Hefe, wodurch Teile des Zellkerns durch Aufnahme in die Vakuole degradiert werden. Nicht-selektive Makroautophagie findet basal in geringem Ausmaß statt, wird aber durch Nahrungsmangel nochmals verstärkt. Das Zellüberleben ist stark abhängig von der MA-Rate: Zu geringe Autophagie-Raten erhöhen das Zelltod-Risiko aufgrund einer höheren Anfälligkeit gegenüber Stress. Zu hohe Autophagie-Raten steigert das Zelltod-Risiko aufgrund von Selbst-Verdauung. Man kennt mittlerweile zahlreiche Beispiele für selektive Makroautophagie, darunter: Pexophagie: Autophagie von Peroxisomen aufgrund metabolischer Anpassung auf physiologische Änderungen. Ribophagie: Selektiver Abbau von Ribosomen bei Aminosäure-Mangel. Mitophagie: Autophagie beschädigter Mitochondrien zur Vermeidung von Apoptose und Nekrose. ER-Phagie: Autophagie des ERs infolge der UPR. Xenophagie: Gezielte Autophagie von Fremdstoffen wie viralen Partikeln oder Bakterien. Beispiel: Aas Oberflächenprotein VirG von Shigella flexneri wird durch Atg5 erkannt, wodurch das Bakterium in Autophagosomen gefangen wird. Der Virulenzfaktor IscB, welcher von Shigella flexneri sekretiert wird maskiert jedoch VirG, wodurch sich das Bakterium effizient vor der Autophagie-Maschinerie schützt. Aggrephagie: Selektiver Abbau von ALIS als Schutz vor Zelltod. ALIS sind große Aggregate aus polyubiquitinierten Proteinen, die über p62 (Sequestosom-1) zusammengehalten und dem Autophagie-Pathway zugeführt werden. Die Abbildung zeigt die Domänenarchitektur von Proteinen, die in die selektive Makroautophagie involviert sind.

111 Die Chaperon-vermittelte Autophagie Die CMA wird 6-8h nach der MA durch Nährstoffentzug, oxidativen Stress oder UV-Licht aktiviert. Gleichzeitig wird die MA inhibiert, da Selbstverdauung zum Zelltod führen könnte (umgekehrt führt eine Inhibition der CMA über RNAi zu einer Aktivierung der MA). Sie ist unter diesen Bedingungen für die Verdauung von 30% der zytosolischen Proteine verantwortlich, wobei sie im Gegensatz zu allen anderen lysosomalen proteolytischen Pathways (Endozytose, Crinophagie, MA, Mikroautophagie, Cvt) die selektive Aufnahme einzelner Proteine unabhängig von vesikulärem Transport ermöglicht. Die CMA wird durch molekulare Chaperone im Zytosol und im lysosomalen Lumen stimuliert, wobei die zytosolischen Chaperone die Target-Proteine entfalten und in einem ungefalteten Zustand stabilisieren und die lysosomalen Chaperone diese über ein Translokon ins Lumen ziehen. Die Selektivität der CMA wird vermittelt durch die Fähigkeit Proteine zu erkennen, welche das Sequenzmotiv KFERQ, oder ein verwandtes Motiv exponieren. Solche Motive sind in 30% aller zytosolischen Proteine vorhanden, werden aber bei korrekter Faltung im Proteininneren vergraben. Bei Proteinfehlfaltungen kommt es zur Exponierung dieser Sequenz, die dann von konstitutiv exprimiertem, zytosolischem Hsc70 erkannt wird. Dieses molekulare Chaperon liegt im Komplex mit weiteren Kofaktoren vor, welche das Substrat-Protein in einem entfalteten Zustand stabilisiert: o o o o Hsp40 stimuliert Hsc70-ATPase-Aktivität (erhöhte Substrat-Bindungs-/Freisetzungs-Rate) HIP stimuliert die Assemblierung von Hsc70-Hsp40-Substrat-Komplexen Hsp90 verhindert Aggregation ungefalteter Proteine und verbessert ihre Faltungseffizienz HOP verbindet Hsc70 mit Hsp90

112 o BAG-1 (Isoforme Proteine, welche positive oder negative Regulatoren von HSc70 enthalten) Da das Substrat-Protein eine Affinität zu dem lysosomalen Protein LAMP-2A (lysosome-associated membrane proteine type 2A) hat, wird der Komplex zur lysosomalen Membran dirigiert. LAMP-2A ist ein 96 kda schweres Membranprotein mit einer einzelnen Transmembrandomäne, einem kurzen cytosolischem Schwanz, sowie einer hochglykosylierten luminalen Domäne. Lysosomales Hsc70 liegt nicht im Komplex mit anderen Chaperonen vor und entspricht der sauersten der vier bekannten zytosolischen Hsc70 Isoformen; vermutlich sind die übrigen im Lysosom nicht stabil. Lysosomen können aufgrund der Hsc70-Dichte in zwei Populationen eingeteilt werden, von der nur eine zur CMA fähig ist. Es wird vermutet, dass lysosomales Hsc70 für das Ziehen von Substrat-Proteinen durch LAMP-2A in das Lumen verantwortlich ist. Die Menge des Rezeptors LAMP-2a innerhalb der lysosomalen Membran ist limitierend für die CMA-Rate und wird über mehrere Wege reguliert: (1) Der Gehalt von LAMP-2A wird infolge von oxidativem Stress über Transkriptionsregulation erhöht. (2) Membran-ständiges LAMP-2A kann in Cholesterin-reichen Mikrodomänen akkumulieren, wo es inaktiviert vorliegt. Infolge der CMA-Aktivierung bewegt sich LAMP-2A aus diesen Domänen heraus. (3) Ein gewisser Anteil von LAMP-2A befindet sich im lysosomalen Lumen, wahrscheinlich mit Lipiden komplexiert. Durch Aktivierung der CMA reinserieren sie in die lysosomale Membran. (4) Zusätzlich wird die Degradationsrate von LAMP-2A durch Cathepsin A so reguliert, dass während CMA eine erhöhte Stabilität resultiert. (5) Mit dem Alterungsprozess nimmt die CMA-Rate stetig ab, was mit einer erhöhten Degradationsrate und zugleich mit der reduzierten Fähigkeit LAMP-2A in die lysosomale Membran zu reinserieren zusammenhängt. Es existieren drei verschiedene LAMP-2 Isoformen, die durch alternatives Spleißen entstehen (LAMP-2A, LAMP-2B, LAMP-2C) und sich nur in der TM- und zytosolischen Domäne unterscheiden, wobei lediglich LAMP-2A als Rezeptor für die CMA agieren kann. Ausschließlich LAMP-2A bildet Homomultimere (maximal Oktamere), was für die Funktion als Rezeptor und Translokon vermutlich essentiell sein könnte. Mikroautophagie Die Mikroautophagie ist die am wenigsten charakterisierte und bisher nur in Hefe und in vitro analysiert worden. Sie wird durch Nährstoffentzug induziert, wobei keine Mikroautophagiespezifischen Gene bekannt sind. Auch ihre physiologische Relevanz ist bisher noch unklar. Während der Mikroautophagie schnürt sich die Membran des Lysosoms nach Innen ab und bildet ein Vesikel im Inneren des Lysosoms (ähnlich dem autophagischen Körper während der MA), das zytoplasmatische Bestandteile enthält. Im Gegensatz zur MA erfolgt hier eine direkte Aufnahme des zu verdauenden Materials in das Lysosom. Für die Mikroautophagie ist der VTC- (vacuolar transporter chaperone) Komplex essentiell. Er ist am ER und in Vakuolen an der Zellperipherie lokalisiert und wird nach Induktion der Autophagie zu den Vakuolen rekrutiert. Es wird vermutet,

113 dass er das Schneiden der mikroautophagischen Vesikel steuert. Die Mikroautophagie wird durch die Signalkomplexe TOR und EGO kontrolliert. Die Makroautophagie Ablauf der Makroautophagie Die MA ist die häufigste Form der Autophagie. Sie wird u.a. durch Nährstoffentzug, bakterielle/virale Infektionen, UV Bestrahlung, ER-Stress und oxidativen Stress induziert. Sie beginnt mit der de novo Synthese eines Vesikels mit Doppel-Membranstruktur am PAS (phagophore assambly site), einem Hybriden aus dem sich bildenden Phagophor und den Proteinen der Kern-Maschinerie. Der Phagophor wird durch isolierte Membran-Fragmente verlängert, bis die Membran-Enden fusionieren. So entsteht das Autophagosom (0,5-2µm) mit seiner spezifischen Protein und Lipid- Zusammensetzung. Während dieser Autophagosom-Biogenese werden zytosolische Komponenten aufgenommen (autophagiert). Das Autophagosom kann nun mit späten Endosomen, multivesikulären Endosomen oder Lysosomen fusionieren, wodurch das Amphisom bzw. Autolysosom entsteht. Amphisomen reifen mit der Zeit zum Autolysosom, wie auch Endosomen zu Lysosomen maturieren. Im Autolysosom wird der autophagische Körper (innere Membran mitsamt autophagierter Substanzen) durch saure Hydrolasen degradiert und die äußere Membran recycelt. Die Autophagie-Kernmaschinerie ATGs: Autophagie Related Genes Da Autophagie am besten im Modellorganismus S.cerevisiae studiert wurde, werden Gene aus der Hefe, welche ausschließlich in der Autophagie eine Rolle spielen, autophagy-related-genes (ATG) und ihre Produkte Atg s genannt. Es sind bereits über 30 verschiedene Atgs, sowie über 45 Proteine, die für Autophagie notwendig sind, aber auch in anderen Prozessen eine Rolle spielen, bekannt. In Säugern existieren entsprechende Atg-Homologe Proteine. Die Atgs können in drei Gruppen eingeteilt werden: Man unterscheidet Atgs, die ausschließlich in nichtselektiver Autophagie, in selektiver Autophagie oder in

114 beiden Mechanismen beteiligt sind. Die Autophagie-Kernmaschinerie gliedert sich in vier Systeme: zwei Ubiquitin-ähnliche Konjugationssysteme (Atg12-Atg5 und Atg8-PE), dem PI3K-Komplex, sowie dem Atg9-Cycling- System. Mechanistisch wird die Autophagie-Initiation, bei der isolierte Membranen mithilfe von Atg9 aus der Peripherie zum PAS transportiert werden und sich der Phagophor ausbildet, von dem Expansionsschritt, indem die beiden UBL-Konjugationssysteme für die Verlängerung der Membran zuständig sind, unterschieden. Das Atg12-Atg5-System Das Atg12-Atg5 System ist das chronologisch erste UBL-System, das nach Induktion der Autophagie aktiviert wird. Atg12 ist in der Lage kovalent an Atg5 zu binden, wobei die Art der Bindung identisch zur Ubiquitinierung von Target-Proteinen ist. (1) Atg12 wird zunächst durch Atg7 (Ub-aktivierendes Enzym E1) unter ATP-Verbrauch aktiviert, wodurch ein kovalenter Atg12-Atg7-Komplex entsteht. (2) Im Atg12-Atg7-Komplex wird Atg12 auf Atg10 (Ub-konjugierendes Enzym E2) übertragen, wodurch ein kovalenter Atg12-Atg10-Komplex entsteht. (3) Atg10 (E3) vermittelt nun die Bindung von Atg5 an Atg12, wodurch der Atg5-Atg12-Komplex entsteht. Diese Konjugation ist irreversibel und findet konstitutiv statt, da zwar die Autophagie durch bestimmte Reize inhibiert wird, nicht aber die Expression der Atg s (basale Expression). Atg16 assoziiert nach der Atg5-Atg12 Konjugation zusätzlich über eine Interaktion mit Atg5 an den Komplex. Der Atg12-Atg5-Atg16-Komplex ist für Elongation der Membranen notwendig, die zum PAS transportiert werden. Er ist jedoch nicht im reifen Autophagosom zu finden, da er nach vollständiger Autophagosomen-Bildung abdissoziiert. Das Atg8-PE-System Das zweite UBL-System ist das Atg8-PE System. Atg8 ist in frühen isolierten Membranen, Autophagosomen und Autophagischen Körpern präsent. Es ist das einzige Atg, das im reifen Autophagosom vorkommt, weshalb es auch methodisch als autophagosomaler Marker (z.b. gekoppelt an GFP) verwendet wird. Alle anderen Atgs werden nach der Autophagosomen-Reifung recycelt. Naszierende Atg8-Moleküle werden im Atg8-System zunächst durch Atg4, einer spezifischen Cystein-Protease, am C-terminalen Arginin-Rest geschnitten, wodurch ein Glycin-Rest als neuer C-Terminus exponiert wird. Dies erlaubt die Konjugation von Atg8 an

115 Phosphatidylethanolamin (PE) durch Atg7 (E1-ähnlich), das Atg8 aktiviert und Atg3 (E2-ähnlich), das es auf PE überträgt. Diese Bindung ist für die Membrandynamik während der Makroautophagie erforderlich. Es handelt sich dabei um eine einzigartige Ubiquitin-Modifikation, die sonst in keinem anderen, bekannten UBL-Protein vorkommt. Das Atg8-System ermöglicht die Modifikation eines Lipids, während andere UBL-Systeme ausschließlich Proteine modifizieren. Der PI3K-Komplex Der PI3K-Komplex besteht aus Vps34 (PI3K der Hefe) und seinem Regulator-Protein Vps15, die zusammen einen stabilen, Membran-assoziierten Komplex bilden. Der Vps34-Vps15-Komplex liegt unter anderem in Assoziation mit Atg6 und Atg14 vor, in dem er die Autophagie kontrolliert. Dieser Komplex agiert direkt am PAS und reguliert die Autophagie-Rate über die Bildung von PI3P innerhalb der isolierten Membran, da die Proteine Atg18, Atg20, Atg21, Atg24 und Atg27 direkt durch PI3-P an die PAS rekrutiert werden. So ist Atg21 als Phosphoinositol-Bindeprotein für die effiziente Lipidierung und Lokalisation von Atg8 essentiell. Das Atg9-Cycling-System Das Atg9-System wird auch cycling -System genannt, da Atg9 die Membranen zur de novo Synthese des Autophagosoms von der Peripherie zum Synthese-Ort transportiert. Atg9 ist ein Membranprotein, das einserseits im PAS, andererseits in Mitochondrien lokalisiert ist und zwischen Mitochondrien und PAS hin und her transportiert wird. Der Atg9-Tranpsort zum PAS erfordert Atg23 und Atg27, die als Atg9-Transportfaktoren bezeichnet werden. Atg18 und Atg2 werden für den Transport vom PAS zur Peripherie benötigt. Atg9 sorgt des Weiteren für die Rekrutierung der Ubiquitin-ähnlichen Proteine (UBPs). Atg1, eine Serin/Threonin Proteinkinase, bildet einen Atg1-Kinase-Komplex mit regulatorischen Proteinen, der den Wechsel zwischen Cvt-Pathway und Autophagie kontrolliert. Unter Nährstoffreichen Bedingungen ist Atg13 hyperphosphoryliert, wodurch die Bindung an Atg1 blockiert ist. Aminosäure-Mangel induziert die teilweise Dephosphorylierung von Atg13, das in diesem Zustand den Atg13-Atg1-Komplex ausbildet, der die Autophagosomen-Biogenese aktiviert und gleichzeitig die Cvt Vesikel inhibiert. Die Interaktion zwischen Atg1 und Atg13 wird durch Atg17 vermittelt. Autophagie findet demnach unter Nährstoff-armen, Cvt unter Nährstoffreichen Bedingungen statt. Die Aktivierung der Autophagie über den Atg13-Atg1 Komplex erfolgt durch die Aktivierung von Atg9 und Atg23. Fusion zum Autolysosom und Degradation Die Fusion zwischen Autophagosom und Lysosom wird durch die Spaltung des Autophagosom- Membran-ständigen Atg8-PE durch Atg4 vermittelt. Für die Autophagosomen-Reifung werden zahlreiche Proteine benötigt, darunter monomere GTPasen der Rab-Familie, SNAREs und Sec17/18/19. Das Zytoskellett (Mikrotubuli und Aktin) ist sowohl an der Fusion, als auch an der Reifung der Autophagosomen beteiligt. Die nach der Fusion stattfindende Degradation des Autophagie-Körpers erfordert einen niedrigen ph, sowie Proteinase B und den Atg15-Cvt17 Komplex, sowie Atg22. Proteinase B ist eine Hydrolase, die Zymogene aktiviert, welche den Vesikel-Abbau induzieren. Der Atg15/Cvt17-Komplex kann durch seine Lipase-Aktivität direkt den Vesikel-Abbau vermitteln.

116 Regulation der Autophagie Der folgende Abschnitt soll einige Grundlagen der Autophagie-Regulation einführen. Sowohl extrazelluläre Stimuli (Nahrungsmangel, Hormone, therapeutische Behandlung), als auch intrazelluläre (Akkumulation fehlgefalteter Proteine, Invasion von Mikroorganismen) modulieren die Autophagie-Antwort, wobei jeder Stimulus gezielt bestimmte Autophagie-Arten reguliert. TOR als zentraler Spieler Es gibt eine Vielzahl von Signal- Pathways und -Komplexen, welche in die Regulation der Autophagie involviert sind. Eine zentrale Rolle spielt jedoch TOR in Hefe bzw. mtor in Säugern (mammalian target of rapamycin), eine Serin/Threonin-Kinase, welche über zwei Wege einen inhibitorischen Effekt auf die Autophagie hat: (1) TOR kontrolliert indirekt die Transkription durch Aktivierung einer Signaltransduktionskaskade. TOR phosphoryliert Tap42, wodurch der Tap42-PP2A (Proteinphsophatase 2A) Komplex entsteht, in dem PP2A eine verringerte Aktivität aufweist. wenn PP2A aktiv, also außerhalb des Komplexes vorliegt, dephosphoryliert es u.a. das Enzym Glutaminase, wodurch es aus dem Komplex mit Urease2 abdissoziiert und in den Zellkern translokiert. Hier aktiviert Glutaminase die Transkription von ATGs, u.a. von ATG8. (2) TOR kontrolliert auch die Translation: mtor phosphoryliert das 4E Bindeprotein-1 (4E-BP1), ein Inhibitor der Translation, wodurch er von elf4e abdissoziiert. Freies elf4e bindet an die 5 -terminale cap Struktur der RNA und fördert damit die Translation. (3) TOR hat direkte oder indirekte Effekte auf einige Atg Proteine. TOR inhibiert direkt die Assoziation zwischen Atg1 und Atg13 durch Hyperphosphorylierung von Atg13 und verhindert somit direkt die Autophagie-Initiation. TOR wird direkt durch Rapamycin oder indirekt über Nährstoffmangel inhibiert, was zur Aktivierung der Autophagie führt. Bei Nährstoffmangel wird Glucagon ausgeschüttet, das an einen

117 Rezeptor der Plasmamembran andockt, und einen Signalweg aktiviert, welcher TOR inhibiert. Insulin hingegen aktiviert bei hohem Nahrungsangebot TOR über eine antagonistische Signalkaskade. Der PI3K-1/PKB Pathway Neben TOR hat auch der PI3K-1/PKB Pathway einen Einfluss auf die Autophagie. Wenn PI3K-1 durch äußere Stimuli aktiviert ist, phosphoryliert es seine Substrate PI4P und PI(4,5)P 2. Die phosphorylierten Lipide rekrutieren Proteine, die für die Autophagosomen-Bildung notwendig sind, an die Plasmamembran, wodurch die Autophagie am PAS inhibiert ist. Die phosphorylierten Lipide binden außerdem an AKT/PKB und PDK1 und aktivieren diese. PDK1 phosphoryliert und aktiviert weitere Kinasen, deren Aktivierung die Autophagie inhibiert. PTEN ist der Antagonist zu PI3K, indem er die Lipide wieder dephosphoryliert und dadurch die Autophagie aktiviert. Der PI3K-Klasse-III-Komplex und weitere Regulatoren Ein Komplex aus Beclin1 und PI3K-III (Atg6) induziert die Autophagie-Initiation. Aminosäuren, insbesondere Leucin, inhibieren PI3K-III und damit auch die Autophagie. Weil Aminosäuren die Endprodukte der Autophagie darstellen, handelt es sich um eine negative Feedback-Regulation. Auch AMP inhibiert die Autophagie, da ein hoher AMP-Spiegel auf ATP-Mangel hinweist und Autophagie ein ATP-abhängiger Prozess darstellt. Weitere Faktoren wie heterotrimere G-Proteine, monomere G-Proteine und Calcium kontrollieren die Autophagie an unterschiedlichen Stellen. Crosstalk zwischen Apoptose und Autophagie-Regulation Außerdem ist die Regulation von Apoptose und Autophagie über mehrere Proteine miteinander gekoppelt, da beide Wege unterschiedliche Arten des programmierten Zelltods auslösen können. So inhibiert BCL2, ein antiapoptotisches Protein, die Autophagie, während HSPIN1, ein auch mit BCL2 interagierendes mitochondriales Transmembranprotein den Caspase-unabhängigen autophagischen Zelltod induziert. BNIP3 bildet infolge der zellulären Stressantwort auf Sauerstoffmangel Dimere und assoziiert an die mitochondriale Membran, wo es den Zelltod über Apoptose oder Autophagie induziert. Eine weitere Rolle spielen die Proteine der DAPK (Death-associated Protein kinase) Familie, darunter DAPk und DRP-1. Es handelt sich um Serin/Threonin-Kinasen, die multimere Proteinkomplexe bilden und dadurch ebenso in der Lage sind als Antwort auf zellulären Stress apoptotischen oder autophagischen Zelltod zu induzieren. Auch bei der Interaktion zwischen GABARAP, einem Atg8-homologen Protein in Säugern, und Nix (BNIP3-L), das in die Apoptose involviert ist, erkennt man das Zusammenspiel dieser beiden Pathways. Atg8 und Homologe Proteine Die UBL-Proteinfamilie und Atg8-homologe Proteine Alle Mitglieder der Atg8 Familie gehören zur weit-verbreiteten Familie der UBL-Proteine, welche zwar nur geringe Sequenz-Homologien, aber eine identische dreidimensionale Struktur (Ubiquitinähnliche Faltung) aufweisen und den C-terminalen Glycin-Rest zur Substratkonjugation verwenden.

118 Alle UBL-Proteine, so auch SUMO, ISG15, Nedd8 und Atg12, sind an der Regulation vieler zellulärer Prozesse beteiligt, indem sie andere Proteine modifizieren und somit ihre Funktion beeinflussen. Atg8 zeigt zu einigen Proteinen der UBL-Familie auch eine hohe Sequenz-Identität, nicht aber zu Ubiquitin selbst (nur 7% Sequenzidentität zwischen GABARAP und Ub). Diese Proteine werden als Atg8-Homologe Proteine bezeichnet. Atg8-Homologe Proteine im Menschen sind LC3 und GABARAP-L. Es existieren drei LC3-Isoformen (LC3A, LC3B, LC3C) und vier GABARAP-Isoformen (GABARAP, GABARAP-L1/GEC1, GABARAP-L2/GATE16, GABARAP-L3). Ihre Sequenzen sind in allen Eukaryoten, von Pflanzen bis zu Säugern, hochkonserviert. Atg8 ist das einzige Protein dieser Familie, das in Hefe vorkommt und wurde wegen der Eignung von Hefe als Modellorganismus extensiv studiert. Das in die Autophagie involvierte Atg8-ähnliche Konjugationssystem in Säugern wird als LC3-System bezeichnet und ist dort essentiell für die Biogenese der Autophagosomen. Interessanterweise ist das Atg8/LC3 System das einzige UBL- Konjugationssystem, das keine Proteine, sondern das Lipid PE konjugiert. Eine Funktion der GABARAP-Isoformen während der Autophagie ist nicht bekannt. LC3 und Isoformen Alle LC3 Isoformen gehören zur MAP1-LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) Proteinfamilie. LC3 wurde zusammen mit LC1 und LC2 als Wechselwirkungspartner von MAP1A und MAP1B entdeckt. Die LC3-Isoformen LC3A, LC3B und LC3C zeigen verschiedene Expressionsmuster in unterschiedlichen Geweben und außerdem verschiedene subzelluläre Lokalisationen, sodass unterschiedliche physiologische Funktionen vermutet werden. Die Modifikation von pro-lc3 am C-Terminus durch das Atg4-Homologe Protein Atg4B (Autophagin-1) verläuft auf ähnliche Weise wie die von Atg8 und ist essentiell für die Bildung von Autophagosomen in Säugern. Die prozessierte LC3-Form hat einen C-terminalen Glycin-Rest, ist im Zytosol lokalisiert und wird als LC3-I bezeichnet. Durch Atg7- und Atg3-Homologe Proteine wird LC3- I an PE konjugiert. PE-konjugiertes LC3 wird als LC3-II bezeichnet. PE-konjugierte Formen sind an autophagosomale Membranen gekoppelt. Zusätzlich wurde die Kopplung von Atg8-homologen Proteinen wie LC3 und GABARAP an Phosphatidylserin beschrieben. Dies ist aber nur in vitro beobachtet worden. Alle Mitglieder der Atg8-Familie haben eine ähnliche Struktur, die aus einer UBL-Domäne (AS in LC3-I) mit C-terminalem Schwanz und zwei zusätzlichen, N-terminalen α-helices (α1, α2; AS 1-29) besteht. Atg8/LC3 ist im Vergleich zu anderen UBL-Proteinen in UBL-Systemen einzigartig, da es nicht die in anderen UBL-Proteinen konservierte Gly-Gly Sequenz aufweist, die durch DUBs und ULPs gespalten wird. Dafür ist eine N-terminale Sequenz aus aromatischer Aminosäure und einem Glycin, konserviert, die durch Atg4 gespalten werden kann. So ist Atg4/Atg4B in der Lage zwischen Atg8/pro-LC3-Proteinen und anderen UBL-Proteinen mit Gly-Gly N-Terminus zu unterscheiden. Durch diese Unterscheidung ist die spezifische Kopplung an das Membranlipid PE möglich. Die UBL-Domäne von LC3 ist ausreichend für die C-terminale LC3-Prozessierung durch die Konjugations-Maschinerie und das darauf folgende Targeting zur autophagosomalen Membran. Die strukturelle Basis für die Interaktion mit Atg4 und der Konjugations-Maschinerie ist damit vollständig in der UBA-Domäne codiert. Die N-terminale Region hingegen ist essentiell für die Interaktion zwischen LC3 und p62, wobei auch hier spezifische Reste innerhalb der UBL-Domäne in

119 die Wechselwirkung involviert sind. Diese Funktion ist jedoch nicht für die Autophagie an sich notwendig. Umorientierung der Membranen während der Autophagie Das Atg8-PE-Konjugat spielt die entscheidende Rolle bei der dynamischen Umorientierung von Membranen, die zur Bildung eines Autophagosoms führt. Es vermittelt die Anlagerung und Fusion isolierter Lipid-Membranen, die von Atg9 zum Phagophor transportiert wurden und trägt damit als treibende Kraft maßgeblich zur Bildung des Autophagosoms bei. Es agiert damit während der Expansionsphase der Autophagie. Es wurde gezeigt, dass die Biogenese des Autophagosoms von der zyklischen Atg8-Rekrutierung zum expandierenden Phagophor und der anschließenden Atg8- Freisetzung abhängig ist. Die Freisetzung durch Atg4-vermittelte Dekonjugation ist auch für die Beendung der Autophagosomen-Bildung notwendig, vermutlich an der Stelle der Hemifusion beider Membran-Enden, da Atg8 als einziges Atg-Protein in reifen Autophagosomen vorhanden ist. Substraterkennung und Regulation während der Autophagie Neben der Funktion in der Membran-Biogenese ist Atg8 während der Expansionsphase auch für die Target-Erkennung zuständig. Dabei wechselwirken Atg8 und Atg19 (Rezeptor für Aminopeptidase-1) bzw. LC3 und p62 oder NBR1 (Rezeptoren für ubiquitinierte Proteine). Diese Wechselwirkungspartner sind Rezeptor-Proteine für vakuoläre Enzyme und Protein-Aggregate, welche so zum Autophagie-Pathway dirigiert werden. Die LC3-II Form wird nach Induktion der Autophagie aus LC3-I vermehrt gebildet. Zusätzlich wird nach Autophagie-Aktivierung die Expression von pro-lc3 induziert, um vermehrt LC3-II produzieren zu können. Die Menge LC3-II reguliert das Ausmaß der selektiven Autophagie während der Substrat- Erkennung, sowie die Größe der Autophagosomen bei der Membran-Biogenese. Die LC3-II Menge beeinflusst jedoch nicht die Anzahl der Autophagosomen. LC3 als Mikrotubuli-assoziiertes Protein und weitere Funktionen Proteine der MAP1-Familie sind klassische Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs), können jedoch auch Aktin und Signalmoleküle binden. Es existieren drei MAP1-Proteine in Säugern: MAP1A, MAP1B und MAP1S (weniger charakterisiert). MAP1A und MAP1B werden nach ihrer Expression am C-Terminus in ~30 kda leichte (LC1 aus MAP1B und LC2 aus MAP1A) und ~ kda schwere (HCs) Ketten gespalten, welche dann in einen reifen Komplex mit der separat codierten LC3- Untereinheit assemblieren. Durch diese Wechselwirkung, die mit beiden Formen LC3-I und LC3-II stattfindet, wird die Anzahl reifer und aktiver LC3-haltiger Autophagosomen negativ beeinflusst. Alle drei LCs interagieren dabei mit beiden HCs und weiterhin, über ihre N-terminale Tubulin- Bindedomäne, mit den Mikrotubuli, wodurch deren dynamische Instabilität gebrochen und das Polymer gefestigt wird. Außerdem agieren MAP1 Proteine als Adaptor-Proteine und vermitteln die Bindung verschiedener Proteine, u.a. mit Mikrotubuli. MAP1 Proteine haben des Weiteren spezifische Expressionsmuster im Nervensystem und erfüllen dort spezifische Aufgaben bei der Bildung und Entwicklung von Axonen und Dendriten. LC3 reguliert durch seine Interaktion mit Mikrotubuli die Mikrotubuli-Bindung von MAP1A und MAP1B und somit die Stabilisierung der Mikrotubuli-Filamente. Außerdem bindet LC3 Caldendrin und steuert somit die Transduktion von Calcium-Signalen. Atg8 spielt auch in weiteren Membran-

120 Trafficking Ereignissen eine Rolle. Es ist darüber hinaus dazu in der Lage die Trafficking-Funktion von GATE-16 während dem intra-golgi Transport zu übernehmen. Autophagosomales Targeting: Proteinaggregate und Organellen Protein-Aggregate Kommt es zur Akkumulation fehlgefalteter Proteine aufgrund verschiedener Stressoren, bilden sich ubiquitinierte Proteinaggregate, die ALIS (Aggresome-like induced structures) oder Einschlusskörperchen (inclusion bodies) genannt werden. In diesen reichern sich neu synthetisierte ubiqutinierte Proteine transient an, von denen viele defekte ribosomale Produkte darstellen. Es werden jedoch auch langlebige Proteine zum ALIS transportiert. Die Polymerisierung der Proteine geschieht über unspezifische hydrophobe Interaktionen, die aufgrund der Überzahl fehlgefalteter Proteine nicht mehr durch molekulare Chaperone unterdrückt werden können. ALIS können an unterschiedlichen Stellen innerhalb des Zytosols gebildet werden und sind streng von Aggresomen zu unterscheiden, welche sich durch den retrograden Transport aggregierter Proteine entlang der Mikrotubuli hauptsächlich am MTOC (Microtubule organizing center) anreichern. MTOC-asoziierte Aggresome entstehen, wenn die Bildung von Aggregaten in ALIS wesentlich schneller stattfindet, als die Zerstörung; dann werden sie zu größeren Aggregaten auf dem Weg zur Autophagie entlang der Mikrotubuli angereichert. Proteinaggregate sind auch oft mit neurodegenerativen Krankheiten (Lewy-Körperchen in Parkinson, neurofibrillärem Tang in Alzheimer, Huntington Aggregate in Huntington), sowie Lebererkrankungen (Mallory-Körperchen bei Fettleber-Hepatitis, Hyaline-Körperchen bei Leberzellkarzinomen) assoziiert. Der Transport fehlgefalteter, ubiquitinierter Proteine zu Aggregaten entspricht einem Schutzmechanismus der Zelle. Dieser führt zu einer verringerten Zytotoxizität und beschleunigten Autophagie-abhängigen Degradation reaktiver Proteine. p62 und NBR1 binden ubiquitinierte Proteine und verknüpfen sie durch Selbstpolymerisierung, spielen aber eine größere Rolle beim Targeting der Proteine zur Autophagie-Maschinerie. Die Bildung der Aggregate wird daher hauptsächlich durch die nicht-kanonische Histon-Deacetylase HDAC6 vermittelt. HDAC6 wird, wie auch p62 und NBR1, zu Ubiquitin-haltigen Protein-Aggregaten rekrutiert und ist notwendig für ihre Bildung. HDAC6 bindet Ub über seine C-terminale BUZ-Domäne, die eine Tendenz für K63-verknüpfte Ub Ketten zeigt. Im Gegensatz zu p62 und NBR1 besitzt HDAC6 jedoch keine LIR, sondern interagiert direkt mit Dynein-Motoren, welche für den Transport aggregierter, fehlgefalteter Proteine zum MTOC notwendig sind. Der aktive Transport entlang der Mikrotubuli ist essentiell für die Bildung der Aggresome. Da sich Lysosomen am MTOC anreichern und reife Autophagosomen auch entlang der Mikrotubuli zwecks Fusion mit Lysosomen transportiert werden, trägt HDAC6 über die Wechselwirkung mit Dynein, ähnlich wie p62 und NBR1 über die Wechselwirkung mit LC3, zur effizienten Autophagieabhängigen Degradation der Aggregate bei. Zusätzlich ist die Aggresomen-Bildung und ihre Autophagie-abhängige Degradation von der Deacetylase-Aktivität von HDAC6 abhängig, welche die Dynamik der Mikrotubuli beeinflusst.

121 Autophagosomales Protein-Targeting über Ub-Rezeptoren Aktuell wird die Ubiquitinierung als Markierung für die selektive Autophagie diskutiert, die noch bis vor wenigen Jahren ausschließlich als Markierung für die proteasomale Degradation verstanden wurde. Während K48-verknüpftes Ub proteasomales Targeting vermittelt, so ermöglicht K63- verknüpftes Ub das Targeting von Protein-Aggregaten zum Phagophor. Darüberhinaus ist eine Monoubiquitinierung für das autophagosomale Targeting ausreichend, für das proteasomale sind mindestens 4-Ub Reste erforderlich. Die Ub-Rezeptoren p62 und NBR1 Die Autophagie-abhängige Degradation von Protein-Aggregaten benötigt z.b. die Ubiquitin- Rezeptoren p62 und NBR1, welche in der Lage sind einerseits ubiquitinierte Proteine, die sich in Protein-Aggregaten anhäufen, andererseits Autophagosom-assoziierte ULPs (Atg8/LC3) direkt zu binden, wodurch das selektive Targeting zum Autophagie-Pathway erklärt wird. Die Bildung von ALIS kann also durch Defekte im Autophagie-Pathway induziert werden. ALIS und p62 kolokalisieren innerhalb der Zelle und an isolierten Membranen, wenn Autophagie induziert ist. NBR1 und p62 unterscheiden sich in Sequenz und Größe, haben aber eine identische Domänenarchitektur, was die gemeinsame Funktion erklärt. Da die UBA-Domäne von p62 eine geringe Affinität zu Monoubiquitin aufweist, spielen beim autophagosomalen Tagreting wahrscheinlich mehrere Faktoren, sowie die Rezeptor-Oligomerisieurng eine entscheidende Rolle. Die Inhibition des Proteasoms bewirkt eine Erhöhung der Autophagie-Rate. Dies stellt einen kompensatorischen Mechanismus für die Akkumulation polyubiquitinierter fehlgefalteter Proteine dar. Targeting über Alfy Neben diesen Proteinen existieren weitere Proteine, welche in die selektive Autophagie involviert sind, jedoch nur indirekt Ub und LC3 binden. Alfy ist ein 400 kda schweres Protein, das eine PtdIns(3)P-Binde FYVE Domäne enthält. Da PtdIns(3)P für den endosomalen und autophagosomalen Membran-Verkehr verantwortlich ist, könnte über diese Domäne die Interaktion mit autophagosomalen Membranen erklärt werden. Alfy interagiert außerdem mit Ubiquitin, obwohl eine UBD nicht vorhanden ist. Es müssen daher weitere Faktoren existieren, welche Alfy zu Ubmarkierten Target-Proteinen rekrutiert. Targeting über BAG3 Außerdem steht das Seneszenz-aktivierte Hsp70 Chaperon BAG3 in Verdacht die Autophagieabhängie Degradation Ubiquitin-markierter Proteine in alternden Zellen zu vermitteln. BAG3 kolokalisiert mit p62-positiven Protein-Aggregaten und Autophagie-Markern und stimuleiert den Transport zum Autophagie-Pathway. BAG3 interagiert mit p62, wird aber nicht durch Autophagie degradiert. In jungen Zellen wird BAG3 nur gering basal exprimiert, weshalb das verwandte Cochaperon BAG1 eine größere Rolle als Vermittler der proteasomalen Degradation ubiquitinierter Proteine spielt. Das Verhältnis BAG1/BAG3 entscheidet zwischen proteasomaler oder autophagischer Degradation und ist scheinbar Teil des Seneszenz-Programmes. Einfluss von Ubiquitin auf die Autophagie größerer, zellulärer Strukturen

122 Auch Organellen, Ribosomen oder virale Partikel stehen in Verdacht selektiv, ähnlich wie Ubiquitinhaltige Protein-Aggregate und ubiquitinierte Proteine, über Ubiquitinierung zum Autophagie- Pathway dirigiert zu werden. Mitophagie Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials induziert die autophagosomale Degradation, indem sich die MPT (mitochondrial permeability transition) Pore öffnet, die äußere mitochondriale Membran aufreißt und noch unbekannte Autophagie-induzierende Faktoren freigesetzt werden. Es wird vermutet, dass die Depolarisation des Mitochondriums zur Exponierung mitochondrialer Membranproteine führt, welche durch E3-Ligasen, entweder Membran-ständig oder aus dem Zytosol rekrutiert, ubiquitiniert werden. Diese Ubiqutinierung dient dem autophagosomalen Targeting durch zytosolische Ub-Rezeptoren. Die E3 Ligase Parkin wird von depolarisierten Mitochondrien rekrutiert und vermittelt die Autophagie-abhängige Degradation. Es konnte auch gezeigt werden, dass die mitochondrialen Membranproteine Uth1p und Aup1 für die Mitophagie essentiell sind, wobei ihre Funktion unklar ist. In Säugern ist das mitochondriale Membranprotein BNIP3L/NIX (BH3 domain-only protein) für das Targeting zum Autophagosom notwendig. NIX enthält wie auch p62 und NBR1 ein LIR Motiv, wodurch es LC3 binden kann und ist über eine Transmembrandomäne an die mitochondriale Membran gekoppelt. Auch hier könnten p62 und NBR1 als Ub-Rezeptoren agieren, welche zwischen Phagophor und Mitochondrium vermitteln. Andererseits wurde erst kürzlich gezeigt, dass Atg32 für die Mitophagie in Hefe essentiell ist und zwischen Mitochondrium und Phagophor unabhängig von Ubiquitinierung vermittelt. Atg32 wird während respiratoischem Wachstum, vermutlich infolge von oxidativem Stress, vermehrt exprimiert und wird an der mitochondrialen Oberfläche verankert. Dort interagiert es mit Atg8 und Atg11, welche für die Substraterkennung während der selektiven Autophagie eine Rolle spielen, über das in Atg32 konservierte Motiv WXXI/L/V. Atg32 ist daher ein sehr guter Kandidat für einen Membranrezeptor, der die Autophagosomen-Biogenese zum Mitochondrium dirigiert. Pexophagie In Hefe kann die Mikropexophagie (Peroxisomen werden direkt in die Vakuole aufgenommen), unterschieden werden von der Makropexophagie (Peroxisomen werden durch Autophagosomen zur Vakuole transportiert). Beide Arten werden durch die Adaption an eine alternative Kohlenstoff und Energiequelle induziert. Verschiedene peroxisomale Proteine sind für beide Arten der Pexophagie essentiell. Zytosolisches Atg30 bindet sowohl die peroxisomalen Proteine (Pex3 und Pex14), als auch die für die Biogenese des Autophagosoms essentiellen Proteine Atg11 und Atg17 und könnte damit eine wichtige Rolle während der selektiven Pexophagie spielen. Auch Ubiqutin scheint eine Rolle zu spielen. Verschiedene PTS-Rezeptoren (peroxisomal targerting signal; Pex5, Pex18, Pex20) werden durch zytosolische und peroxisomale Ub- Konjugationsmaschinerien mono- und polyubiquitiniert. Pex5-Polyubiquitinierung fördert die Degradation von Pex5, während seine Monoubiquitinierung die Exktratkion des PTS-Rezeptors aus der peroxisomalen Membran induziert. Letzteres ist ein Recycling-Mechanismus, damit der Rezeptor für die nächste Runde des Imports peroxisomaler Proteine zur Verfügung steht. Pexophagie könnte durch verlängerte Residenz ubiquitinierter Proteine innerhalb der peroxisomalen Membran induziert

123 werden, wie die Induktion der p62-abhängigen Macropexophagie in Säugerzellen durch Monoubiquitinierung des peroxisomalen Membranproteins PMP34 vermuten lässt. Ribophagie Selektive Ribophagie wird durch Aminosäure-Mangel induziert, um den größten zellulären Aminosäure-Pool, die Ribosomen, wieder für die Synthese wichtiger Proteine zugänglich zu machen. Die Ubiquitin-spezifische Protease Ubp3 und ihr assoziierter Faktor Bre5 sind für die Ribophagie essentielle Proteine. Ubp3-defiziente Zellen zeigen erhöhte Ubiquitinierungs-Raten von Ribosomassoziierten Proteinen. Dies deutet darauf hin, dass Ubiquitinierung der Ribosomen ihre Autophagie-abhängige Degradation vermittelt und Ubp3 als Deubiquitinierendes Enzym das Überleben der Ribosomen reguliert. Der Ub-Rezeptor p62 p62 (auch Sequestosome 1 = SQSTM1) ist ein multifunktionelles 440 AS großes Adaptor-Protein. p62-domänenarchitektur und assoziierte Funktionen Das Protein p62 besteht aus der N-terminalen PB1 (Phox und Bem1p) Domäne, einer Zink-Finger Domäne und einer C-terminalen UBA-Domäne. Weiterhin befindet sich zwischen Zink-Finger Domäne und UBA-Domäne die LIR-(LC3-interacting region) Sequenz (von RR321 bis SS342), welche bei der Interaktion mit LC3 eine Rolle spielt. Am N-Terminus von p62 befindet sich eine PB1-Domäne, welche strukturelle Homologien zur UBL- Domäne aufweist. Die PB1 Domäne ist in 29 humanen Proteinen präsent und vermittelt die spezifische Hetero-Dimerisierung zwischen solchen Proteinen, indem ein basisches Cluster konservierter Lysin- und Arginin-Reste der einen PB1-Domäne mit dem hoch-konservierten sauren OPCA Motiv der anderen PB1-Domäne wechselwirkt. p62 gehört mit PKC zur kleinen Gruppe der PB1-Domänen-Proteine, welche sowohl das basische Cluster, als auch das OPCA Motiv aufweisen. Das basische Cluster aus p62 interagiert mit dem OPCA Motiv von PKC, wobei die anderen beiden Bindestellen frei sind und eine Oligomerisierung vermitteln können. Die Funktion der PB1 Domäne ist vielseitig. Einerseits wird die Produktion homo-oligomerer p62-komplexe, welche die Bildung von ALIS beschleunigen, begünstigt, andererseits werden durch die Interaktion mit anderen Molekülen spezifische zelluläre Funktionen vermittelt. p62 hat zusätzlich eine C-terminale UBA-Domäne, die sowohl K48- als auch K63-verknüpfte Poly-Ub- Ketten nicht-kovalent bindet, jedoch mit höherer Affinität zu K63-Poly-Ub. Sie zeigt auch eine gewisse Affinität zu Ubiquitin, bevorzugt aber Polyubiquitin-Ketten. Die Struktur der UBA-Domäne besteht aus einem dreigliedrigen, kompakten Helix-Bündel mit einem konservierten hydrophoben Bereich (MGF), der für die Interaktion mit Polyubiquitin essentiell ist. Infolge der Poly-Ubiquitin Bindung wird p62 stabilisiert und seine Halbwertszeit verlängert. p62 induziert die K63-Polyubiquitinierung P62 bindet sowohl K48- (häufigstes Signal für proteasomale Degradation), als auch K63-verknüpfte Poly-Ub-Ketten, reguliert aber ausschließlich selektiv die Verlängerung der K63-verknüpften Poly-Ub Kette durch die Interaktion mit der E3-Ub-Ligase TRAF6, welche K63-Poly-Ub Ketten synthetisiert.

124 P62 dient damit als Gerüst für die Regulation der K63-Polyubiquitinierung über die Interaktion mit TRAF6. Proteasomales Targeting Die PB1-Domäne interagiert mit der 26S Proteasom-Untereinheit Rpt1, welche als Docking-Stelle für proteasomale Shutlle-Faktoren fungiert, während die UBA-Domäne mit polyubiquitinierten Proteinen, auch K48-verknüpften, wechselwirkt. Damit dient p62 als Shuttle-Faktor, der den proteasomalen Umsatz polyubiquitinierter Proteine kontrolliert. Dabei interagiert p62 über seine UBA Domäne mit Tagret-Proteinen und mit seiner PB1 Domäne mit der AAA-ATPase innerhalb der C-terminalen Region von Rpt1. Da p62 auch den autophagosomalen Umsatz K63-verknüpfter Ub-haltiger Proteine kontrolliert, stellt p62 ein Bindeglied dieser zwei Abbauwege dar. Es ist anzumerken, dass eine Inhibition der Autophagie, was eine Akkumulation von p62 bewirkt, die proteasomale Degradation kurzlebiger Proteine verlangsamt. Dies geschieht, da p62 mit anderen proteasomale Shuttle-Faktoren (Rad23, Dsk2, Ddi1) um die Bindung ubiquitinierter Proteine kompetiert, aber nicht so effizient wie diese an das Proteasom bindet und ihre Degradation vermittelt. Rezeptor-Internalisierung Ein Beispiel für das Zusammenspiel proteasomaler und lysosomaler Pathways ist die Degradation des Membranrezeptors für Nervenwachstumsfaktoren (NGFs) TrkA. Die NGF-Bindung an Trk aktiviert eine entsprechende Signalkaskade, die zum Nervenwachstum führt. Parallel wird die Rezeptor-Poly- Ubiquitinierung, Internalisierung und anschließende Degradation induziert. Die Internalisierung und das anschließende Trafficking von TrkA werden durch p62 vermittelt. Die NGF-stimulierte Bildung eines TrkA/p75 Komplexes, vermittelt über das p62-gerüst, sorgt für die Rekrutierung von TRAF6 (E3) und UbcH7 (E2), welche die Polyubiquitinierung des Rezeptors vermitteln. Ohne diese p62 abhängige Polyubiquitinierung ist weder Internalisierung, noch Signalweiterleitung (Nervenwachstum) möglich. Interessanterweise wird TrkA durch das Proteasom deubiquitiniert, indem p62 als Shuttling Faktor agiert und die Interaktion zwischen TrkA und Rpt1 des Proteasoms vermittelt. Dennoch wird TrkA nicht proteasomal, sondern lysosomal über den Autophagie-Pathway degradiert, was durch die Wechselwirkung zwischen p62 und LC3 vermittelt wird. Rolle von p62 während der Autophagie Polyubiquitiniertes p62 wird über den Autophagie-Pathway abgebaut und kolokalisisert mit ubiquitinierten Protein-Aggregaten wie ALIS. Die Bildung (infolge der Autophagie-Inhibition) und autophagische Degradation dieser Aggregate ist von p62 abhängig. Damit fungiert p62 als Vermittler zwischen den Aggregaten und dem Autophagie-Pathway, indem es über seine C-terminale UBA-Domäne mit Ubiquitin und über die 22-AS lange LIR-Sequenz mit LC3 interagiert. Da p62 zusätzlich aufgrund der N-terminalen PB1 Domäne zur Selbstassemblierung fähig ist, bildet er große Aggregate, die Ubiquitin-markierte Proteine enthalten, und bringt sie selektiv zur Autophagie- Maschinerie.

125 LC3 ist essentiell für den autophagosomalen p62-import und die anschließende lysosomale Degradation. Somit führt der Knockdown von LC3 auch zur Akkumulation polyubiquitinierter Aggregate. P62 ist jedoch nicht essentiell für die durch Nahrungsmangel induzierte Autophagie, da ein Knockdown keine Auswikrung auf die Autophagie-vermittelte Degradation hat. Es beeinflusst demnach weder LC3-Lipidierung, Autophagosomen-Bildung oder lysosomales Targeting nichtubiquitinierter Proteine oder anderer Substanzen. Es ist jedoch für das LIR-abhängige, konstitutive Targeting ubiquitinierter Proteine zum lysosomalen Pathway verantwortlich und notwendig. P62 wechselwirkt dabei lediglich mit pro-lc3 und LC3-I, sodass die polyubiquitinierten Aggregate entweder während oder vor der Lipidierung mit LC3 wechselwirken. Tatsächlich kolokalisiert auch ein bestimmter Anteil lösliches LC3 mit p62 und den ubiquitinierten Protein-Aggregaten. LC3-p62 Interaktion Die LIR in p62 (AS RR321 bis SS342) ist eine saure Peptidsequenz mit drei Glutamat- und vier Aspartat- Resten, die gehäuft am C- und N-Terminus der 22-AS-Sequenz lokalisiert sind. Die Bindungsaffinität zwischen LIR und LC3 ist stark vom C-terminal liegenden AS-Motiv DDDWTHL dieser Sequenz abhängig. Das DDD-Motiv wechselwirkt dabei mit Arg10 und Arg11 von LC3. Das WTHL-Tetrapeptid der LIR-Sequenz von p62 nimmt eine ausgedehnte β-konformation ein und bildet ein intermolekulares paralleles β-faltblatt mit β2 aus LC3. Der Indol-Ring von Trp338 des WTHL-Motivs ist tief in eine hydrophobe, konservierte Tasche zwischen der N-terminalen Domäne (α2) und der UBL-Domäne gebunden, während die AS Leu341 des WTHL-Motivs in eine hydrophobe Tasche innerhalb der UBL-Domäne gebunden ist. Trp338 und Leu341 sind essentiell für die Interaktion mit LC3 und daher hochkonserviert. Diese AS sind für die p62-degradation über Autophagie essentiell. P62 bindet ausschließlich an LC3-Moleküle mit voller Länge, jedoch nicht an die N-terminale oder C-terminale Subdomäne, wenn diese isoliert vorliegen, weshalb beide LC3-Domänen an der Interaktion beteiligt sein müssen. Es sind also sowohl die konserviertten hydrophoben Taschen als auch die ersten 10 Aminosäuren der N-terminalen α-helix für die Interaktion essentiell. Die Affinität zwischen LIR und LC3 wird damit durch das saure Motiv DDD bzw. DEE und das hydrophobe Motiv WXXL bzw. WXXV (je nach Protein, in dem die LIR vorkommt) vermittelt. Dies

126 scheint ein allgemeines Konzept für die Wechselwirkung zwischen Atg8-Homologen Proteinen und LIR-haltigen, aber strukturell ansonsten nicht verwandten Proteinen zu sein (Atg19, NBR1, Atg4, Atg32, NIX) und dient in den meisten Fällen zum lysosomalen Targeting. Ähnlichkeiten sind sogar in der Interaktion zwischen dem nicht-atg8-homologen UBL-Protein SUMO und dem SUMO-Interacting Motif (SIM) zu finden, welche in die Regulation der Transkription und des nukleären Protein-Imports involviert ist. Der Ub-Rezeptor NBR1 NBR1 (Neighbor of BRCA1 Gene 1) ist ein 966 AS großes, humanes Protein, welches an der von der Kinase Titin ausgehenden Signalkaskade in Muskelzellen beteiligt ist. NBR1 hat eine ähnliche Domänenarchitektur wie p62, bestehend aus einer N-terminalen PB1- Domäne, gefolgt von einer Zink-Finger-, sowie zwei Coiled-Coil-Domänen und einer C-terminalen UBA-Domäne. NBR1 bindet zusätzlich spezifisch Atg8 und Homologe Proteine über die LIR-Sequenz, welche ein modifiziertes WXXL Motif enthält, das dem Tetrapeptid YIII (AS ) entspricht. Durch diese Wechselwirkung und der UBA-Domäne ist NBR1 in der Lage, wie auch p62, ubiquitinierte Proteine zum Autophagie-Pathway zu dirigieren, wobei eine Tendenz für K63- verknüpfte poly-ub Ketten vorliegt. Wie p62, polymerisiert auch NBR1 und kreuzverknüpft damit Ubhaltige, fehlgefaltete Proteine zu Protein-Aggregaten, die sich nach einer Inhibition der Autophagie anhäufen. Diese Polymerisierung erfolgt jedoch über die Coiled-Coil Domänen und teilweise über die Interaktion mit oligomerem p62 und ubiquitinierten Proteinen. Damit ist die Rekrutierung Ubiquitin-haltiger Fracht für die lysosomale Degradation von beiden Proteinen, p62 und NBR1, abhängig. Atg19 und der Cvt-Pathway Atg19 umfasst 415 AS, ist im biosynthetischen Cvt-Pathway der Hefe involviert und spielt bei der Reifung der Aminopeptidase-1 eine essentielle Rolle. Funktion von Atg19 im Cvt Pathway In S.cerevisiae wird der Vorläufer der vakuolären Hydrolase Aminopeptidase 1 (Ape1) selektiv und konstitutiv über den Autophagie-ähnlichen Cvt (cytoplasm-to-vacuole targeting) Pathway in die Vakuole transportiert. Es handelt sich um einen biosynthetischen Prozess, der als Modell für selektive Autophagie dient. Der Cvt Pathway bedient sich größtenteils derselben Maschinerie wie auch der Autophagie-Pathway. Direkt nach der Translation von prape1 im Zytosol bildet sich ein Homo-Dodecamer aus, der dann mit dem Rezeptor-Protein Atg19 interagiert und zusammen den Cvt-Komplex bildet. Der Cvt Komplex wird nun in einem Atg11- und Atg9-abhängigen Prozess zum PAS transportiert. Dabei interagiert Atg19 direkt mit Atg11 und Atg8.

127 Es wird angenommen, dass die Interaktion von Atg19 mit Atg11 einen Signalweg für die Beladung der Vesikel auslöst und damit den Atg9-abhängigen Transport von Membranen induziert, um die Vesikel-Bildung einzuleiten. Atg11 ist ein relativ großes Protein mit vier potentiellen Coiled-Coil Domänen. Die C-terminale Coiled-Coil Domäne in Atg11 ist für die Wechselwirkung mit Atg19 verantwortlich, während die anderen Bereiche in Homo-Oligomerisierung und Interaktion mit anderen Atg-Proteinen (Atg1, Atg17, Atg20) involviert sind. Diese Bereiche könnten die Membran-bildende Maschinerie zum Cvt- Komplex dirigieren. Atg11 interagiert auch direkt mit Atg9, was die Bildung der Cvt-Vesikel induziert. Atg9 interagiert mit Atg2 und Atg18, wodurch die Membran-bildende Maschinerie vollständig ist. Vermutlich bildet sich ein großer Komplex aus wechselwirkenden Atg-Proteinen, die für die Cvt- Vesikel Biogenese essentiell sind. Die Wechselwirkung zwischen Atg8 und Atg19 bzw. LC3 und p62 erfolgt auf sehr ähnliche Art und Weise. In beiden Fällen werden die Seitenketten von Trp und Leu in dem Aminosäure-Motiv WXXL aus Atg19/p62 durch eine in Atg8-Proteinen konservierte hydrophobe Tasche erkannt. Atg4 und die Atg8-Konjugation Atg4 ist für die Prozessierung von Atg8, sowie für die Dekonjugation von Atg8-PE verantwortlich. Durch diese reversible Modifikation spielt Atg4 eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Autophagie. Es existieren vier Atg4-Säuger-Homologe (Autophagin 1-4), von denen lediglich Autophagin-1 in die effiziente Prozessierung von LC3-Vorläufern und Dekonjugation von LC3-PE involviert ist. Atg4 und Homologe Proteine bestehen aus einer klassischen Papain-ähnlichen Domäne, sowie einer kleinen Finger-Domäne, die ausschließlich in Proteasen der Atg4-Familie vorkommen. Das aktive Zentrum der Protease befindet sich in der Mitte der Papain-ähnlichen Domäne. Bei Bindung von Atg4 an LC3 erfolgen große Konformationsänderungen im N-Terminus und einem regulatorischen Loop von Atg4. Der regulatorische Loop ist topologisch in DUBs und ULPs konserviert, wobei er in den anderen Proteasen eine fixe Konformation einnimmt und nicht das aktive Zentrum der Enzyme blockiert. In freiem Atg4 verdeckt der regulatorische Loop den Eingang zum aktiven Zentrum. Er wird durch die Interaktion mit Phe119 in LC3 weggeschoben, sodass eine enge Spalte zugänglich wird, über die der LC3 C-Terminus zum aktiven Zentrum (Cys74) gelangen kann. Aufgrund der engen Spalte, kann sich lediglich Glycin als N-Terminus der spaltbaren Bindung ausrichten. In anderen DUBs und ULPs liegen bereits große Aminosäure-Reste in der Nähe des konservierten Loops vor, die ihn in eine konstitutiv offene Konformation zwingen. In Atg4 liegen an dieser Position nur kleine AS vor (Gly257, Gly258 und Ala263) und zusätzlich sorgt eine intramolekulare Interaktion zwischen Trp142 und Pro260 für die konstitutiv geschlossene Konformation des Loops. Durch Bindung von LC3 verdrängt Phe119 aus LC3 Trp142 und zwingt den regulatorischen Loop in die offene Konformation. Mechanistisch erfolgt zunächst die Bindung von Atg4 an die UBL-Domäne von LC3. Dieses Interaktions-Grundgerüst ermöglicht, dass der C-terminale Schwanz von LC3 den regulatorischen Loop bindet und das aktive Zentrum erreicht. Der N-terminale Schwanz versperrt den Ausgang vom aktiven Zentrum in freiem Atg4. Nach Assoziation mit LC3 löst er sich ab und nimmt eine offene Konformation ein. Dies geschieht über die

128 Wechselwirkung mit einem LC3 Molekül, das nicht als Substrat fungiert, wobei der N-terminale Schwanz von Atg4 ein intermolekulares β-faltblatt mit β2 des LC3 Moleküls bildet. Da Atg8-PE in der Membran verankert ist, muss Atg4 vor der Dekonjugation in die Membran eindringen. Hierfür sind strukturelle Fähigkeiten verantwortlich, die in keinen anderen Deubiquitinierenden Enzymen vorkommen. Durch die Konformationsänderung infolge der LC3- Assoziation wird im N-Terminus eine hydrophobe Oberfläche exponiert, wodurch das Enzym Zugang zum Membran-gebundenen LC3-PE bekommt. Atg8-Atg4 Interaktion Es gibt mehrere Interaktionsstellen zwischen Atg4 und Atg8, wobei zwischen Atg8-Substraten und Atg8-Nichtsubstraten unterschieden werden muss. Die Wechselwirkung zwischen Atg4-N-Terminus und Nicht-Substrat-LC3 ist sehr ähnlich zu den Interaktionen zwischen Atg8/LC3 (zwei hydrophobe Taschen) und dem WXXL Motiv. Die Wechselwirkung mit dem Substrat- LC3 erfolgt jedoch über andere Kontakte. ERQC und ERAD

129 Über ein Drittel aller Proteine in Eukaryonten werden zum sekretorischen Pathway geleitet. Das erste Kompartiment, das diese Proteine erreichen ist das ER. Es enthält Chaperone und einzigartige Enzyme, welche den Oxidationszustand relativ zum Zytoplasma aufrechterhalten, sowie co- und posttranslationale Modifikationen katalysieren. Um eine korrekte Protein-Produktion zu gewährleisten, existiert die ER-Qualitätskontrolle (ERQC), die hauptsächlich über Chaperone agiert. Wenn ein Polypeptid seine native Konformation erreicht hat, wird es zu seinem Zielort geführt. Wenn die Faltung verzögert oder eine nicht-native Konformation stabilisiert wird, erfolgen entweder weitere Faltungszyklen oder das Protein wird für die ER-asoziierte Degradation (ERAD) ausgewählt. Wenn die Konzentration dieser potentiell toxischen Protein-Spezies ansteigt, werden weitere kompensierende Pathways wie die UPR (unfolded protein response) induziert. ERAD repräsentiert den wichtigsten Schritt in der Qualitätskontrolle des sektretorischen Pathways. Sie gliedert sich in die Schritte: Substrat-Erkennung, - Targeting, -Retrotranslokation, -Ubiquitinierung und die proteasomale Degradation. ERAD ist der Hauptmechanismus, um fehlgefaltete Proteine im sekretorischen Pathway zu entsorgen. Es existiert jedoch ein zusätzliches Qualitätskontrollsystem in nachfolgenden sekretroischen Organellen (Re-Routing führt in den ER nachgeschalteten Organellen zur Lysosomalen Degradation) ER-abhängige Degradation Substrat-Erkennung

130 Potentielle ERAD Substrate sind (1) lösliche und integrale Membranproteine (2) Polypeptide, deren posttranslationale Modifikation fehlgeschlagen ist, die beschädigt oder fehlgefaltet sind (3) nichtassemblierte Proteine aus Multiproteinkomplexen. Einige Proteine werden auch fälschlicherweise zum ERAD-Pathway geleitet, was besser ist, als potentiell gefährliche Substrate nicht zu erkennen. Erkennung hydrophober Oberflächen Der im ER-Lumen lokalisierte Hsp70-Vertreter BiP (immunoglobulin binding protein; auch: GRP78) assoziiert mit den exponierten hydrophoben Bereichen der ERAD-Substrate. In einigen Fällen spielen dabei auch ER-residente Hsp40-Mitglieder eine Rolle, um die Löslichkeit der ERAD-Substrate zu erhalten. Dadurch werden fehlgefaltete Substrate vor Aggregation geschützt und in Lösung gehalten, um dem ERAD-Pathway zugeführt werden zu können. Es ist nicht bekannt ob BIP/Hsp40 für die Erkennung aller ERAD Substrate erforderlich ist und ob die BiP-assoziierten Nukleotidaustauschfaktoren im ERAD-Pathway eine Rolle spielen. Hsp70 haben zentrale Rolle bei der Wahl der Substrate. Nach einem Modell ist die anhaltende Interaktion zwischen ERAD-Substrat und Hsp70 ausreichend um eine E3 Ub-Ligase zu rekrutieren. Wenn das Substrat Poly-Ub markiert wurde, kann der ERAD-Pathway beginnen. Dieses Modell ist konsistent mit der Tatsache, dass sich BIP in einem Multiproteinkomplex innerhalb der ER-Membran befindet, der auch E3 enthält. Erkennung N-verknüpfter Glykane Der CNX/CRT-Pathway und der ERAD-Pathway sind eng miteinander verknüpft. Wenn hydrophobe Bereiche eines Glykoproteins exponiert werden, wird dies durch UDP-Glucose-Glykoprotein- Glucosyltransferase (UGGT) erkannt. UGGT fügt einen Glucose-Rest an das N-verknüpfte Glykan an, wenn bereits die terminalen Glucose-Reste durch Glucosidasen abgespalten wurden. Die monoglucosylierte nicht-native Spezies tritt dann erneut in den Calnexin-Calretikulin Zyklus ein. Einige vom ER einbehaltene Proteine werden mithilfe von Mannosidasen modifiziert. Diese agieren als Timer für die Glykoprotein-Degradation und schützen davor, dass Glykoproteine permanent im

131 Reglucosylierungs- und Faltungs-Zyklus gefangen werden. So werden Mannose-Reste von irreversibel fehlgefalteten Proteinen abgespalten, wodurch die Effizienz der Calnexin-Bindung reduziert und zugleich die Affinität für das Lektin EDEM (ER Degradation enhancing α-mannosidaselike protein) geschaffen wird. Mannose-Abspaltung durch verlängerte Faltungszyklen erfolgt durch die ER-α-Mannosidase I, wodurch ein spezifisches Man 8 GlcNAc 2 Isomer entsteht. Dies beschleunigt ERAD auf zwei Wegen: (1) Austritt aus dem CNX/CRT Zyklus wird beschleunigt, da UGGT eine geringere Affinität zu nicht-nativen demannosylierten Substraten zeigt. (2) Man 8 GlcNAc 2 ist ein potentielles Degradationssignal, das durch EDEM erkannt wird. Es gibt weitere Features der Glykoprotein-Erkennung während ERAD: - Anzahl und Position der Glykane in Glykoproteinen können für den Eintritt oder Austritt vom Calnexin/Calretikulin Zyklus optimiert werden. - Crosstalk zwischen BIP und Calnexin/Calretikulin: (1) synergistische Inhibition der Aggregation nicht-glykosylierter Proteine (2) BIP kompensiert Abwesenheit von Calnexin/Calretikulin durch Bindung glykosylierter Substrate, mit denen es normal nicht interagiert, um ihre Substratlöslichkeit aufrecht zu eralten. Disulfidbrücken-Bildung Im ER herrscht ein im Vergleich zum Zytosol oxidierendes Milieu, was die Bildung von Disulfidbrücken erleichtert. Die Bildung von Disulfidbrücken, sowie die Isomerisierung nicht-nativer Disulfidbrücken, wodurch die Bildung des nativen Zustands begünstigt ist, wird durch Protein- Disulfid-Isomerasen (PDIs) katalysiert, welche eine Thiol-Oxidoreduktase Aktivität aufweisen. Im humanen ER existierten 19 homologe PDIs (Annahme: unterschiedliche Substratspezifitäten, Oxidationspotentiale und/oder Expressionsregulation). PDIs sind am ERAD verschiedener Substrate beteiligt. - PDIs ermöglichen Retrotranslokation viraler Proteine (z.b. cholera toxin) von Viren, welche den endozytotischen Pathway zur Invasierung nutzen. - ERP57 (PDI-Säugerhomolog) assoziiert mit Calnexin und Calretikulin und ist in der Qualitätskontrolle von Glykoproteinen involviert. - ERDJ5 (PDI-Säugerhomolog) enthält 4 Thioredoxin-ähnliche aktive Zentren (Cys-X-X-Cys Motive) und ist ein BIP-Cofaktor. Es bewirkt retrotranslokation des SV40 Virions und reguliert Degradation einer defekten α1-antitrypsin Variante (NHK), indem die Bildung Degradations-kompetetenter NHK Monomere aus Disulfid-verknüpften Dimeren geförerdert wird. Assemblierung oligomerer Komplexe Die Faltung der Untereinheiten multimerer Komplexe kann vor oder nach der Ausbildung der Quartiärstruktur erfolgen. Die Assemblierung kann die Konformationsstabilität erhöhen oder einen Transport-kompetenten Zustand schaffen. Die Assemblierung kann Peptidsignale verdecken, welche die ER-Retention oder Degradation determinieren. ERAD könnte durch einen Faltungsdefekt oder durch einen verlängerten Aufenthalt des Proteins im ER induziert werden.

132 - Influenza virus hämagglutinin Protein: Zuerst erfolgt die cotranslationale Faltung der Monomere. Hier erhöht eine Disulfidbrücke die Stabilität im Monomer. Anschließend erfolgt die Homotrimerisierung und zuletzt der Export aus dem ER. - TCR Komplex: Assemblierung der Monomere im heptameren TCR Komplex erhöht die Stabilität der einzelnen Untereinheiten. Ohne Assemblierung würden diese schnell über ERAD abgebaut, da sie basische Reste in der ER-Membran exponieren. - Immunoglobulin: Assemblierung benötigt Disulfidbrücken zwischen schweren und leichten Ketten. In Plasmazellen, welche keine leichten Ketten codieren, gelangen die schweren Ketten durch Bindung an BIP in einen partiell gefalteten, Assemblierungs-kompetenten Zustand oder werden über ERAD degradiert. Die schweren Ketten enthalten auch ein C-terminales Cystein, das im nicht-assemblierten Zustand exponiert wid und als Degradations-Signal fungieren könnte. Degradation schützt vor Ig-Aggregation durch falsche Disulfidbrücken-Bildung. Erkennung integraler Membranproteine ER-assoziierte, cytoplasmatisches Hsp70/Hsp40 erhöht die Löslichkeit von großen cytoplasmatischen Loops in einigen ERAD-Substraten und vermitteln gleichzeitig die Interaktion mit E3 Ub-Ligasen. Hsp90 scheint ausschließlich in die Faltung von fehlgefalteten cytoplasmatischen Domänen involviert zu sein, da Hsp90-Defekte zur vermehrten Degradation von Membranproteinen führen. Das cytoplasmatische Faltungsnetzwerk kann damit zur Faltung und/oder zur Degradation führen. Membranproteine nutzen meist den ERAD-C Pathway. Ausschließlich Membranproteine, welche keine löslichen Domänen aufweisen gehen den ERAD-M Weg, der sehr wenig studiert wurde. Es ist möglich, dass solche Substrate direkt über E3-Ub-Ligasen erkannt werden. Die meisten in ERAD- Substrat-Ubiquitinierung involvierten E3s haben mehrere Transmembran-Domänen, welche die Intramembran-Substrat-Erkennung ermöglichen könnte. Die Transmembrandomänen könnten aber auch Komponente des Retrotranslokationskanals sein. Substrat Targeting Lösliche ERAD Substrate müssen vom ER-Lumen ins Cytosol transportiert werden (Retrotranslokation), da sich die für die Ub-Markierung notwendigen Enzyme im Zytoplasma befinden. ERAD-Substrate, welche in der ER Membran lokalisiert sind, können gleichzeitig oder sogar vor der Retrotranslokation ubiquitiniert werden. Verschiedene ERAD-Pathways in Hefe

133 Die Lokalisation eines fehlgefalteten Proteins bestimmt, welche Faktoren für das ERAD-Targeting notwendig sind (Zytoplasma: ERAD-C, Lumen: ERAD-L, Membran: ERAD-M). - ERAD-C Substrate nutzen einen Komplex, der Doa10 als E3-Ligase Ubiquitin enthält. - ERAD-L Substrate (lösliche oder integrale Membranproteine mit luminalem Faltungsdefekt) interagieren mit der Hrd1 als E3-Ubiquitin Ligase. - ERAD-M Substrate scheinen auch mit Hrd1 Ub-Ligase zu interagieren (wenig bekannt). In Säugern existiert ein größeres Repertoir an ERAD-Komponenten, weshalb die Unterscheidung in verschiedenen Pathways unscharf wird. Schon in Hefe existieren Membran-Substrate, die Doa10 und Hrd1 Ub-Ligasen benötigen; ERAD-C und ERAD-L können überlappen. Dies dient der Erhöhung der Degradations-Effizienz und verhindert, dass ein Pathway mit einem Substrat überladen ist. Kopplung von Erkennung und Targeting Erkennung und Targeting sind schwer zu unterscheiden, da ERAD-Substrate nicht zwischen Erkennungs- und Targeting-Komplexen hin und her gereicht werden. Für die Erkennung verantwortliche Faktoren befinden sich in Multiprotein-Komplexen, die ebenso für das Targeting essentiell sind. - In Hefe wird BiP an einen Membran-ständigen Proteinkomplex über die Interaktion mit der Untereinheit Sec63 gebunden. Die Untereinheit Sec61 ist ein Kandidat für den Retrotranslokations-Kanal. Ein Komplex aus BiP und zwei assoziierten Hsp40-Molekülen im ER könnten ERAD-Substrate erkennen und über die Sec63-Bindung zum Retrotranslokon Sec61 dirigieren. - In Säugern fungiert HERP (homocys-responsive ER-resident protein) als Rezeptor für nichtglykosylierte BIP-Substrate. HERP ist ein Transmembranprotein mit UBL-Domäne. HERP copräzipitiert mit Derlin-1, einem weiteren Kandidaten für das Retrotranslokon, mit ubiquitinierten Proteinen und dem 26S-Proteasom, weshalb HERP als Brücke zwischen der ER-residenten Erkennungsmaschinerie und der zytoplasmatischen Ubiquitin-Proteasom- System fungieren könnte. Es erkennt ausschließlich nicht-glykosylierte BiP-Substrate, deren

134 Degradation nicht von der Calnexin-Funktion abhängig ist. Somit gibt es einen klaren Unterschied im ERAD-Targeting zwischen glykosylsierten und nicht-glykosylierten Proteinen. - HERP-ähnliche Funktion hat auch der Hrd1-Komplex, welcher ER-luminale Chaperone und andere Targeting-Komponenten mit Membran-ständigen E3 Ub-Ligasen und zytoplasmatischen Substrat-Extraktions-Faktoren verbinden. Glykoprotein-erkennende Targeting-Faktoren ER-residente Glykoprotein-erkennende Targeting-Faktoren sind EDEMs (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like lectins) und Lektine, welche Mannose-6-phosphat-Rezeptor-ähnliche Domänen aufweisen (z.b. Yos9 in Hefe und OS9 und XTP3-B in Säugern). Diese Faktoren könnten ERAD-Substrate zum Retrotranslokon transportieren. EDEMs erkennen Glykoproteine mit verkürzten Mannose-Resten und zeigen Chaperon-Aktivität. EDEM1 könnte Substrate aufgrund der Interaktion mit Calnexin vom Calnexin-Zyklus erhalten. Es beschleunigt z.b. die Degradation von NHK α1-antitrypsin. Die zwei homologen Proteine EDEM2 und EDEM3 agieren wahrscheinlich auf ähnliche Weise. EDEM1 ermöglicht Substrat-Targeting durch Assoziation mit Derlin-2 und Derlin-3 (Kandidaten für Retrotranslokons). Ein EDEM-Homolog aus der Hefe ist am Umsatz der ERAD-L Substrate beteiligt. Yos9, ein 61 kda schweres ER-luminales Lektin, ist im ERAD von löslichen und Membran-gebundenen Glykoproteinen beteiligt, die luminale Fehlfaltungen aufweisen. Yos9 ist Teil des Gate-Keeping Komplexes, den alle ERAD-Substrate vor der Retrotranslokation passieren müssen. Es bindet an fehlgefaltete Proteine (Chaperon-Aktivität), sowie an BiP und Hrd3, dem Bindepartner der Hrd1 Ub-Ligase, wodurch es im ERAD-L HRD1-Komplex lokalisiert ist. In diesem reguliert es möglicherweise die Selektivität von Hrd1 für fehlgefaltete Substrate. Da BiP und Hrd3 fehlgefaltete Proteine auch unabhängig von Yos9 erkennen, wird ein multiple-step Erkennungs-Mechanismus vermutet, welcher der finalen Entscheidung, ob das ERAD-Substrat zwecks Degradation zum Retrotranslokon dirigiert wird oder nicht, vorangeht. Yos9 interagiert außerdem mit dem Hsp70 Chaperon Kar2, wodurch es ebenso an den HRD1 Komplex rekrutiert wird. OS9 und XTP3-B sind Säuger-Homologe zu Yos9. Beide binden analog zu Yos9 an fehlegefaltete Proteine, sowie SEL1L (Hrd3-homolog), sodass sie ERAD-Substrate zur Membran-assoziierten Ubiquitinierungs-Maschinerie bringen. OS9 interagiert zusätzlich mit GRP94 (94 kda glucoseregulated protein; ER-luminales Hsp90 Homolog), das zur Degradation fehlgefalteter Proteine erforderlich ist. Grp94 könnte in Substrat-Erkennung oder Assemblierung/Deassemblierung des OS- 9-SEL1L-Hrd Komplexes invovliert sein. Os9 detektiert NHK α1-antitrypsin für den Transport zum HRD1-Komplex. Knockdown von OS9 oder GRP94 verlangsamt die Degradation von NHK α1-antitrypsin. XTP3-B könnte vor Aggregation von NHK α1-antitrypsin schützen und die BIP Erkennungs-Maschinerie mit dem HRD1 Komplex verknüpfen; es hat vermutlich aber eine weniger wichtigere Rolle. ER-residente Faktoren spielen für das ERAD-Targeting von Membran-Proteinen, deren fehlgefaltete Domänen im Zytoplasma lokalisiert sind keine Rolle. Hier vermitteln zytoplasmatische Hsp70 und Hsp40 die Interaktion zwischen Membransubstraten und Doa10 Ubiquitin-Ligase in Hefe. Retrotranslokation

135 Da die aktiven Zentren der E1/E2/E3 Enzyme im Zytoplasma vorliegen und die Ub-Markierung für die proteasomale Degradation notwendig ist, müssen ER-resistente fehlgefaltete Proteine retrotranslokiert werden. Es gibt mehrere Kandidaten für das Retrotranslokon. Zur Retrotranslokation ist eine bestimmte minimale Peptid-Länge erforderlich. Es wurde gezeigt, dass Ub-markierte und unmarkierte ERAD-Substrate auf der cytosolischen Seite der ER-Membran liegen, während das Proteasom inhibiert ist. Sec61 Translokations-Kanal Sec61 ist die Hauptkomponente des Polypeptid-importierenden Translokationskanals im ER. Durch Bindung verschiedener Faktoren an Sec61 könnte zwischen Translokation und Retrotranslokation gewechselt werden. Größtes Indiz hierfür liefert die Degradation von Apoliporptein B (apob) in Säugern. Im Lipid-defizienten Zustand, wird die apob-translokation ins ER blockiert, während das Protein cotranslational über das Proteasom degradiert wird. Es wird angenommen, dass die regulierte Degradation von apob das ER- und zugleich Sec61-assoziierte Chaperon p58 benötigt, das die Funktion von Sec61 zwischen Translokon und Retrotranslokon wechselt. Folgende Beobachtungen stützen, dass Sec61 zumindest eine sekundäre Rolle als Retrotranslokon aufweist (für einen kleinen Teil der ERAD-Substrate). - Humaner Sec61 Komplex interagiert mit MHC1 Molekülen während ihres Transports zum Proteasom (Prozess, der durch virales HCMV-Genprodukt induziert wird). - Untereinheiten des Sec61 Komplexes binden verschiedene ERAD-Substrate en route zur Degradation. - Die Bindung naszierender Polypeptidketten durch Sec61 blockiert die Retrotranslokation von cholera toxin. - Mutationen in Sec61 verlangsamen ERAD von löslichen und Membran-ständigen Substraten. - Sec61 interagiert mit dem 19S RP des Proteasoms, was den Mechanismus der 19Sabhängigen Extraktion stützt. Sec61 ist jedoch sehr sicher nicht das Retrotranslokon für alle ERAD-Substrate, da Komplexe, welche die ERAD-spezifischen E3s nutzen (HRD1 und DOA10), kein Sec61 aufweisen. Im Gegensatz dazu enthält HRD1 den Retrotranslokon-Kandidat Der1. Außerdem wird die Retrotranslokation des ERAD-Substrats pαf nicht von einer Behandlung mit anti-sec61 Antikörpern beeinflusst, jedoch von anti-der1 Antikörpern. Proteine der Derlin-Familie

136 Der1 (211 AS, 24 kda, 4 TM-Helices, zytoplasmatische Termini) könnte ebenso das Retrotranslokon bilden oder Teil davon sein. Der1 ist in Hefe ausschließlich für die Degradation ER-luminaler Proteine verantwortlich. Es ist eine Komponente des HRD1 ERAD-L Komplexes. Es bindet über das UBL-Domänen Protein Usa1 (U1 SNP-associating protein 1), einem HERP-Homolog, an diesen Komplex. Der HRD1-Komplex verknüpft damit Erkennung und Retrotranslokation (frühe und späte ERAD-Ereignisse). In Säugern fungiert Derlin1 jedoch als kritische Komponente, welche luminale und cytoplasmatische ERAD-Komponeten miteinander verknüpft. Es ist hier Teil eines Komplexes mit Faktoren in der Membran, im Cytoplasma, sowie mit ERAD-Substraten. Derlin1 interagiert mit Komponenten der Ubiquitinierungs- und Targeting-Maschinerie und ist am HCMV-katalysierten Umsatz des MHC1, dem Export des SV40 Virions und der Retrotranslokation von speziellen ERAD-Substraten (cholera toxin, pαf) beteiligt. E3-Ubiquitin-Ligasen Hrd1 und Doa10 als Retrotranslokons Der effizienteste ERAD-Weg wäre Retrotranslokation und Ubiquitinierung in einem Proteinkomplex zu vereinen, sodass beide Funktionen gekoppelt sind. Es wird angenommen, dass Hrd1 und Doa10 entweder das Retrotranslokon bilden oder integrale Komponenten des Retrotranslokons darstellen. Die TD-Domäne von Doa10 hat 3 TM-Helices und ist im Gegensatz zu anderen TM-Segmenten hochkonserviert, sodass diese Domäne den Kern des Translokons bilden könnte. Außerdem werden weder Sec61, noch Der1 für die Degradation zweier gut studierter Doa10 Substrate benötigt (Ubc6, Ste6-166). Erklärungsmöglichkeiten der Retrotranslokon-Vielfalt Retrotranslokons könnten sich nur transient bilden und/oder sind Verbände verschiedener Kandidaten. In anderen Organellen, wie dem Peroxisom, wurde das Modell einer transienten Pore postuliert, wodurch gefaltete, sogar oligomere Proteine importiert werden können. Es könnte sein, dass mehrere Retrotranslokons parallel agieren. Alle genannten Faktoren haben eine Substratspezifität, weshalb die Suche nach DEM Retrotranslokon unter Umständen nicht erforderlich ist. Es ist auch möglich, dass kein Retrotranslokon existiert, da der ER-Export über die Bildung von Lipid-Tröpfchen geschehen könnte. Bei Membranproteinen könnte das Proteasom cytoplasmatische Domänen abschneiden. Intramembrane und luminale Domänen können zu verschiedenen Degradations-Kompartimenten transportiert oder Substrate für andere Proteasen werden. Keines der genannten potentiellen Retrotranslokons ist für ERAD absolut essentiell! Ubiquitinierung und die Komplexe HRD1 und DOA10

137 Protein Ubiquitinierung benötigt E1, E2 und E3. In manchen Fällen beschleunigen auch E4 Ubiquitin- Ketten-Verlängerungs Enzyme den ERAD-Pathway, da die Ubiquitin-Kette eine kritische Länge erreichen muss, bevor ein Substrat retrotranslokiert werden kann. Die für ERAD in Hefe benötigten E3 Ub-Ligasen sind sehr große Membranproteine und Teil großer Proteinkomplexe (DOA10 bzw. HRD1), welche Substrat-Erkennungs-, Targeting- und Retrotranslokations-Komponenten aus dem ER-Lumen, der Membran und dem Zytosol enthalten. Die Unterschiede in diesen Komplexen sind durch die Notwendigkeit verschiedene ERAD-Substrate zu erkennen bedingt. In einem speziellen Fall benötigt ein ERAD-Substrat das HECT Domänen E3 Protein Rsp5 (reverses SPT-phenotype protein 5), das im Cytoplasma lokalisiert ist. Die Säuger-Homologe sind NEDD4-2. Der HRD1 Komplex besteht aus den folgenden Kern-Komponenten (1) E3 Ub-Ligase Hrd1/Der3 und sein Bindepartner Hrd3 (2) Zytoplasmatisches Ub-Konjugationsenzym Ubc7, gebunden an Cue1 sowie Ubc6 (3) Transmembran-Protein Der1 und sein Rekrutierungsfaktor Usa1

138 Zusätzlich existieren weitere HRD1-assoziierte Proteine (1) Zytosolischer Cdc48 Komplex und sein Membrananker Ubx2 (2) Lektin Yos9 und gebundenes ER-luminales Hsp70-Chaperon Kar2 Der DOA10 Komplex ist wesentlich unkomplizierter. Er besteht aus (1) Doa10 (2) Ubc6, Ubc7 und Cue1 (3) Ubx2 und Cdc48 Komplex Doa10 (Degradation of alpha2; 14 TM-Helices; N- und C-Terminus im Zytosol; 1319 AS, 151 kda) ist am ERAD-C Pathway beteiligt und für die Ubiquitinierung eines großen Spektrums von Target- Proteinen verantwortlich (ER- und Kern-ständige lösliche sowie Membran-gebundene und zytoplasmatische Proteine). Der Großteil der Sequenz ist zytosolisch. Die Homologie zu Säuger- Proteinen konzentriert sich auf die N-terminale Region, welche die RING-CH Finger Domäne und eine interne 130 AS Sequenz enthält, die als TD (TEB4-DOA10) Domäne bezeichnet wird. Diese ist in allen Doa10 homologen Proteinen, wie auch im Säuger-Homolog TEB4, hochkonserivert. Zusätzlich hat Doa10 eine WW Domäne (ca. 30 AS), welche ein Protein-Interaktionsmotiv darstellt und in HECT- Domänen E3s der Hefe, Rsp5 und den Säuger-Orthologen gefunden wird (Funktion unklar). Hrd1/Der3 (HmgCoA reductase degradation/degradation in the ER; 6 TM-Helices, N- und C-Terminus im Zytosol; 551 AS, 64 kda) ist dagegen am ERAD-L Pathway beteiligt und an der Ubiquitinierung von ER-luminalen und Membran-ständige Proteinen beteiligt. Zellen ohne Hrd1 und Doa10 zeigen eine starke UPR, während die UPR in Zellen, in denen nur eines der beiden Ub-Ligasen fehlt wesentlich geringer ausfällt. Hrd1 und Doa10 enthalten katalytische RING Domänen auf der cytoplasmatischen Oberfläche der ER-Membran und gehören damit zur RING-Finger Klasse der E3s. Die beiden E3-Ub-Ligasen zeigen unterschiedliche E2-Spezifitäten: Doa10-abhängige Ubiquitinierung benötigt Ubc6 und Ubc7 Hrd1- abhängige Ubiquitinierung benötigt Ubc7 und Ubc1, kann aber auch Ubc6 nutzen. Diese E2s sind Membran-assoziiert, wobei Ubc6 über seinen C-terminalen hydrophoben Schwanz an die ER-Membran verankert und Ubc7 über die Interaktion mit dem ER-Membran-ständigen Protein Cue1 (203 AS großes Typ 1 Membranprotein) an das ER gebunden ist. Ubc7 und Ubc1 interagieren mit Hrd1/Der3 über die RING-Finger Domäne. Sowohl HRD1 als auch DOA10 assoziierten an den zytosolischen CDC48 Komplex (siehe unten). Weitere Komponenten des HRD1-Komplexes Hrd1/Der3 liegt im Komplex mit Hrd3, einem 95 kda (833 AS) schweren Membranprotein mit einer einzigen TM-Helix, einer großen ER-luminalen Domäne, fünf Glykosylierungsstellen und einem kurzen C-terminalen Schwanz (40 AS). Die Interaktion erfolgt mit der N-terminalen TM-Domäne von Hrd1. In Abwesenheit von Hrd3 ist Hrd1/Der3 instabil und wird schnell proteasomal abgebaut. Diese Degradation wird vermutlich durch Auto-Ubiqutininierung induziert, da hierfür Ubc7, Cue1 und eine intakte Hrd1-RING-Finger Domäne benötigt werden.

139 Hrd3 interagiert mit Yos9, wodurch das Lektin zum HRD1 Komplex rekrutiert wird. Yos9 interagiert seinerseits mit Kar2, einem ER-luminalen Hsp70 Chaperon. Dadurch werden Substrate zum HRD1 Komplex rekrutiert. Es scheint zwei HRD1-Populationen zu geben, eine mit Yos9/Kar2 und eine ohne. Es wird angenommen, dass exponierte hydrophpobe Bereiche und der Glykosylierungsstatus eines Proteins ein zweiteiliges Signal für die Erkennung durch HRD1 darstellt. Dabei geschieht die initiale Erkennung des fehlgefalteten Proteins über die Rekrutierung zur luminalen Domäne von Hrd3, welche dann die Präsentation des Substrats an Hrd1 übernimmt. Hrd3 und Yos9 regulieren dabei zusammen den Zugang der Substrate zu Hrd1/Der3 (Gating-Mechanismus): Hrd3 ist Substrat- Rezeptor in HRD1 und Yos9 agiert als Gate-Keeper, um vor uneingeschränkter Zerstörung von Proteinen zu schützen. Hrd1/Der3 und Hrd3 interagieren unabhängig voneinander mit dem ER-Membran-Protein Der1. Es ist für die Degrdation einer Unterklasse fehlgefalter Proteine notwendig. Seine Funktion ist jedoch großteils unverstanden. Der1 könnte einen Teil des Retrotranslokons ausmachen. Die Interaktion zwischen Der1 und Hrd1/Der3 wird durch das Protein Usa1 vermittelt. Es handelt sich dabei um ein Membranprotein (97 kda, 2 TM-Helices, zytosolische Termini) mit N-terminaler UBL-Domäne. Usa1 ist notwendig zur Degradation von HRD1 Substraten mit fehlgefalteten luminalen Domänen. Doa10 lokalisiert im ER und der inneren Kernmembran Die Substrat-Spezifität für die Ubiquitinierung wird durch verschiedene E2s und E3s gewährleistet. Beide sind oft an spezifischen Regionen der Zelle lokalisiert. Diese Kompartimentierung ist ein Regulator der Spezifität. Doa10 ist sowohl in der ER-Membran als auch in der inneren Kernmembran lokalisiert, um dort Kern-ständige Proteine zu ubiquitinieren und der Degradation zuzuführen. Doa10 hat kein Kern-Lokalisations-Signal und erreicht die innere Kernmembran vermutlich über laterale Kanäle im NPC. Diese Fähigkeit wird vor allem durch die geringe Größe der zytoplasmatischen Loops begünstigt (24 kda und geringer). Säugerhomologe von HRD1- und DOA10-Komponenten Es existieren viele Säugerhomologe von Hrd1 und Doa10, da wesentlich mehr E3s in den ERAD- Pathway höherer Organismen involviert sind. Einige dieser Enzyme haben eine Rolle in der Qualitätskontrolle von Proteinen, die mit Krankheiten assoziiert sind. ERAD-Substrate haben oft verschiedene E3-Partner. Es existieren auch E3 Komplexe, deren Funktionen sich kompensieren können. Die E2-Proteine Ubc6 und Ubc7 aus der Hefe haben jeweils zwei Säuger-Homologe (Ube2j1 und Ube2j2 bzw. Ube2g1 und Ube2g2). Die Ubc6-Homologen E2s haben hydrophobe Sequenzen am C-Terminus, welche die posttranslationale Insertion in die ER-Membran vermitteln. Die Ubc7- Homologen E2s sind zytosolische Proteine. Die erste identifizierte E3 Ub-Ligase in Säugern, welche in der ER-Membran lokalisiert ist und in ERAD eine Rolle spielt ist gp78. Es ist für die Degradation verschiedener ERAD-Substrate essentiell. Gp78 ist ein integrales Membranprotein mit multiplen TM-Helices und einer Hrd1/Der3-ähnlichen Topologie. Die einzige N-Glykosylierungsstelle (N599) befindet sich in der zytosolischen Domäne einer Region, die in Ube2g2 Rekrutierung involviert ist, sodass es sich nicht unbedingt um ein Glykoprotein handeln muss. Der C-Terminus von gp78 enthält neben der RING-Finger Domäne einen Bereich, der homolog zu Cue1 aus Hefe ist. Ein Teil dieses Bereichs wird als CUE-Domäne bezeichnet. Diese besteht aus ca.

140 40 AS, die in einem 3-Helix-Bündel gefaltet sind und mit Ubiquitin interagiert (Cue1 zeigt kontroverserweise keine Interaktion mit Ubiquitin). Der Cue1-Homologe Bereich enthält außerdem eine Ube2g2 Binde-Region (G2BR), welche das E2 rekrutiert. Eine mögliche Rolle der CUE Domäne in gp78 ist die Rekrutierung von bereits (durch andere E3s) ubiquitinierten Substraten, sodass gp78 als E4 agieren könnte. Es ist auch denkbar, dass gp78 die Assemblierung von Polyubiquitin-Ketten direkt am Substrat oder einem E2 beschleunigt, um diese assemblierten Ub-Ketten später auf das Substrat zu übertragen. Die C-terminale p97/vcp-binde-region (Säuger-Homologe zu Cdc48) in gp78 ist nicht für ERAD essentiell. Das Cdc48-Homolog bindet wahrscheinlich direkt an polyubiquitinierte Substrate oder an Proteine, die an gp78 rekrutiert wurden. Gp78 interagiert mit Derlin-1 und UbxD2. UbxD2 enthält eine UBX-Domäne, über die es mit p97 wechselwirkt. Ein weiteres E3 Enzym des ER ist das humane Hrd1-Homolog Synoviolin/HsHrd1. Es zeigt in seinen TM-Regionen 50% Homologie zu Gp78. Es ist ebenso für einige ERAD-Substrate essentiell für die Degradation. Außerdem ist das Enzym in die Ubiquitinierung von zytosolischem p53 involviert. TEB4 ist ein Säuger-Homolog zu Doa10 und hat eine ähnliche Membrantopologie. Es katalysiert seine Autoubiquitinierung mit K48-verknüpften Polyubiquitin Ketten in Anwesenheit von Ube2g2 und fördert damit seine eigene Degradation. Daher könnte es als ERAD E3 fungieren, obwohl bisher keine Substrate identifiziert worden sind. Neben diesen ER-residenten Ub-Ligasen gibt es auch zytosolische E3 Ligasen, die am Säuger ERAD beteiligt sind. Die E3 Ub-Ligase Parkin hat zwei RING-finger Domänen und eine IBR Region (cysteine-rich In- Between-RING) und erkennt sowohl ER-residente (bisher nur Pael-R identifiziert) als auch nicht- ER Substrate. Es ubiquitiniert einen Aggregations-anfälligen GPCR, der sonst Zelltod induzieren würde. CHIP (C-terminus of Hsc70-interacting protein) ist eine zytosolische E3 Ub-Ligase mit U-box Domäne, die in Zusammenarbeit mit zytosolischen Chaperonen eine Rolle in der Qualitätskontrolle von Proteinen spielt. Parkin und CHIP agieren vermutlich zusammen in einem Komplex, der auch Hsp70 enthält. Die Degradation von CFTR benötigt die sequentielle Aktivität von zwei E3 Ub-Ligasen. RMA1 (RING-finger protein with membrane anchor-1) ist Membran-assoziiert und agiert cotranslational. CHIP ist cytoplasmatisch und agiert posttranslational. F-box only protein 2 ist die Substraterkennungs-Komponente eines zytosolischen SCF E3 Komplexes und bindet verschiedene glykosylierte Substrate. Es beeinflusst die Stabilität der α-untereinheit von TCRα. Cytosolische Extraktion und proteasomales Targeting

141 Cdc48-Komplex und Cofaktoren Polyubiquitinierte Proteine müssen vor oder während des Proteasom-Targetings aus der ER- Membran extrahiert werden. In den meisten Fällen in Säugern und Hefen ist der Cdc48 (celldivision-cycle-48) Komplex für die Extraktion ubiquitinierter Substrate essentiell. Cdc48 ist eine hexamere AAA + -ATPase, welche ATP-Hydrolyse wahrscheinlich mit Polypeptid-Retrotranslokation verknüpft. Cdc48 assoziiert die Cofaktoren Ufd1 und Npl4. In Säugern ist das Cdc48-homologe Protein p97, das ebenso mit konservierten UFD1 und NPL4 Homologen assoziiert. Rekrutierung von Cdc48 an die ER-Membran Der Cdc48-Komplex könnte aufgrund der Interaktion mit dem Membranprotein Ubx2 in Hefe (67 kda ER-Membranprotein, 2 TM-Helices, zytoplasmatische Termini) oder über VIMP (valosin-containing protein-interacting membrane protein) in Säugern an die ER-Membran rekrutiert werden. Ubx2 ist für die Degradation verschiedener ERAD-Substrate essentiell. Ubx2 enthält eine N-terminale UBA-Domäne, die für ERAD essentiell ist, und eine C-terminale Ubiquitin-ähnliche UBX (ubiquitinregulatory X; 80 AS) Domäne, welche als Cdc48 Bindestelle fungiert und gewöhnlich am C-Terminus von Ubiqutin-regulatorischen Proteinen gefunden wird. Der Cdc48 Komplex wird damit einerseits über die Interaktion mit Ubiquitin (polyubiquitinierte Substrate), andererseits über die Interaktion mit alternativen Bindestellen, die strukturelle Ähnlichkeit zu Ubiquitin haben, zur ERAD-Maschinerie rekrutiert. Die Interaktion mit HRD1: Cdc48 bindet effizient sowohl an Hrd1/Der3 als auch an Hrd3. Die Interaktion zwischen HRD1 und Cdc48 benötigt aktives Hrd1/Der3 und Ubc7, sodass eine funktionelle Ub-Ligase essentiell für die Rekrutierung des Cdc48 Komplexes ist. Die Interaktion mit DOA10: Cdc48 bindet über Ubx2 an den Komplex, wobei auch in Abwesenheit von Ubx2 die Interaktion zwischen den Komponenten des Cdc48 Komplexes und den DOA10-Komponenten nicht gestört sind. Der Cdc48 Komplex bindet zusätzlich an die ER-residenten Komponenten GP78 und Der1. Cdc48-Extraktionsmechanismus und Wechselwirkung mit ERAD-Substraten Die Erkennung von ERAD-Substraten durch Cdc48 ist unbekannt, vor allem von solchen im ER Lumen, die zunächst die cytosolische Seite des ERs erreichen müssen. Zwei Möglichkeiten existieren: (1) Cdc48 Komplex kapselt sich transient in das Retrotranslokon ein, erkennt und zieht Substrate aktiv ins Cytoplasma

142 (2) Polyubiquitin Rest fungiert als Erkennungs- und Bindestelle für den Komplex, um eine ATPabhängige Extraktion zu initiieren. (3) Es ist auch möglich, dass Cdc48 ERAD-Substrate erst nach ihrer Retrotranslokation bindet und zum Proteasom dirigiert. Cdc48-abhängiger Transport der ERAD-Substrate zum Proteasom Cdc48 transportiert/dirigiert das ERAD-Substrat nach der Retrotranslokation zum Proteasom. Es assoziiert mit dem 19S RP des Proteasoms, wodurch Membranständige ERAD-Substrate direkt von der Membran-assoziierten Cdc48-enthaltenen Maschinerie zum Proteasom weitergereicht werden könnten. Es scheinen jedoch verschiedene PIPs (Proteasom-interacting proteins) mit UBA und UBL Domänen vor der Substrat-Degradation mit dem Proteasom, sowie mit Ub-markierten Proteinen im Cdc48 Komplex zu interagieren. Die Faktoren Rad23 und Dsk2 erhöhen die ERAD-Effizienz. Weitere interagierende UBA/UBL Domänen Proteine sind Ufd2 (E4), Ufd3 (unbekannte Funktion) und Otu1 (Deubiqutinierendes Enzym). Ein Cdc48 und Rad23 assoziiertes Protein (in Hefe Png1, in Säugern Peptid-N-Glykanase) ist für die Deglykosylierung verantwortlich, damit das Protein vor dem Eintritt in das 20S CP nicht sterisch gehindert wird. Solche Proteine sind entweder statisch im Cdc48 Komplex gebunden oder agieren als mobile Eskort-Faktoren. Im 19S RP residente Ub-Rezeptoren sind Rpn13, Rpn10 und Rpt5 (siehe Proteasom). Ein beachtlicher Anteil Proteasome sind an der Oberfläche der ER-Membran lokalisiert und sind daher ideal für den Empfang von ERAD-Substraten positioniert (ERAD-zugeordenete Proteasom- Population). Cdc48-unabhängiges Proteasom-Targeting Eine Gruppe von ERAD-Substraten wird unabhängig von der Ubiqutinierung retrotranslokiert. Sie nutzen auch einen anderen Energie-lieferenden Komplex, den 19S RP. Dessen Base-Komplex besteht ebenso aus AAA-ATPasen, welche die Funktion von Cdc48 übernehmen. Cholera Toxin und pαf werden z.b. nicht polyubiquitiniert, weshalb sie unabhängig von Cdc48 über ERAD abgebaut werden. Cdc48/p97 ist jedoch auch nicht für die Degradation aller Ub-markierten ERAD-Substrate notwendig. Es wird vermutet, dass das Ausmaß mit dem ein Membranprotein in der Lipid-Doppelschicht eingekapselt ist (oder der Grad der Hydrophobizität) den Grad der Cdc48-Notwendigkeit bestimmt. Damit zeigen Membranproteine mit multiplen Transmembran-Segmenten eine stärkere Abhängigkeit von der Cdc48-Funktion als Membranproteine mit weniger Transmembran- Segmenten oder solche mit geladenen Resten. ERAD-M Pathway

143 Integrale Membranproteine haben cytoplasmatisch exponierte Bereiche, die vor der Retrotranslokation ubiquitiniert werden könnten. Die anschließende Degradation könnte auf mehrere Arten erfolgen. (1) Das Substrat wird noch während es in der Membran eingebettet ist, beginnend vom N- oder C- Terminus durch das Proteasom degradiert. In diesem Modell sind Degradation und Retrotranslokation direkt an der ER-Membran gekoppelt. (2) Degradation beginnt von einer internen Stelle eines cytoplasmatisch exponierten loops nach endoproteolytischem Schnitt durch das Proteasom. Dislokation und Degradation sind eng gekoppelt. (3) Das Substrat wird über das Retrotranslokon exportiert und anschließend von dem Ende der Polypeptidkette beginnend degradiert. Einige integrale Membranproteine, die extrahiert wurden, verbleiben im Cytoplasma, wenn die Proteasom-Funktion inhibiert ist. Die Membransegmente dieser Proteine müssen damit zwischen Membranextraktion und Degradation solubilisiert werden. Diese Aufgabe könnte der Cdc48 Komplex, 19S RP oder andere Chaperon-Komponenten erfüllen. (4) Es erfolgt zunächst eine endoproteolytische Spaltung und die anschließende Retrotranslokation. Die einzelnen retrotranslokierten Segmente werden dann durch das Proteasom abgebaut. Deubiquitinierung vor oder während der Degradation Deubiquitinierung wird durch Proteasom-assoziierte Enzyme sowie Proteasom-Untereinheiten vermittelt. Die Entfernung von Ub kann proximal (en bloc) oder distal (trimming) erfolgen. Wie die Entfernung der Glykan-Kette ist auch die Deubiqutinierung essentiell vor der Degradation im 20S CP. Polyubiquitin-Trmming könnte Proteasom-Substraten eine zweite Chance geben der Degradation zu entkommen. Das humane Deubiquitinierungs-Enzym Ataxin-3 bindet an den Derlin-VIMP Komplex und dem humanen Rad23 Homolog. Es bindet auch an p97 und agiert Downstream des Cdc48 Komplexes während der Degradation. Eine dominant-negative Ataxin-3 Mutante induziert UPR und verlangsamt ERAD von TCRα. Mutationen in Ataxin-3 bewirkt spinocerebellar ataxia. Andere in ERAD involvierte De-Ub Enzyme sind unbekannt. Solche sollten die ERAD beschleunigen. Crosstalk zwischen ERAD und anderen Pathways Uneffiziente Abgabe oder Überproduktion abnormaler Proteine im ER können die Homeostase im ER und der gesamten Zelle gefährden, weshalb ERAD reguliert werden muss. ERAD und UPR Die Transkription vieler ERAD-Faktoren wird durch UPR induziert. Andere über UPR induzierte Faktoren reduzieren den ER-Stress durch kompliziertere Mechanismen. o ER-Volumen expandiert nach Hochregulation der Lipid-Synthese.

144 o o o Chaperon-Konzentration und Menge an Enzymen, die für posttranslationale Modifikationen benötigt werden steigen. Protein-Translation und ER-Translokation sinkt. Protein-Transport über den sekretorischen Pathway steigt, wodurch das Kompartiment, das potentiell toxische Peptide enthält, geleert wird. Individuelle Deletion von Genen, die entweder für UPR oder für ERAD essentiell sind haben keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Hefe. Simultane Deletion von UPR- und ERAD-spezifischen Genen resultiert jedoch zu Defekten im Wachstum. Damit haben ERAD und UPR komplementäre Rollen im ERQC. ERAD und Autophagie Autophagie reduziert ebenfalls ER-Stress. Wenn ERAD-Effizienz gefährdet ist, akkumulieren Substrate, die aggregieren können. In einigen Fällen wird diese Bedrohung durch die Autophagievermittelte Zerstörung behoben. Während der ER-Stress-induzierten Autophagie werden Bereiche des ERs mit seinen Proteinen und Proteinaggregaten von einem Autophagosom umschlossen und zum Lysosom bzw. zur Vakuole zwecks Degradation transportiert. Autophagie dient damit als Backup für ERAD, zumindest für Aggregations-anfällige Substrate. Die Z-Variante von α1-antitrypsin (NHK-Mutante) fällt in diese Katgorie. Dieses Protein wird gewöhnlich durch ERAD degradiert. Es könnte im ER akkumulieren und polymerisieren, bevor das Targeting zum Autophagie Pathway beginnt und die Autophagosomen spezifische ER-Fragmente, welche diese aggregierten Proteine enthalten, umschließen. Kopplung zwischen ER-Stress und Zytoplasmatischen Stress Der ERAD-Pathway wird durch andere Pathways beeinflusst und beeinflusst selbst andere Pathways, wobei die Mechanismen des Crosstalks nicht verstanden sind. Faktoren, die durch cytoplasmatischen Stress induziert werden, könnten ebenso die physiologischen Konsequenzen des ER-Stress und somit die Akkumulation fehlgefalteter Proteine im ER reduzieren. In Säugerzellen bewirkt cytoplasmatischer Stress eine Verringerung der ERAD-Effizienz. In Hefe kann die Induktion der Heat-Shock Response ER-Stress kompensieren, der durch Überexpression von Cpy* in Ire1-defizienten Zellen entsteht. ERAD und Apoptose Wenn ER-Stress nicht erfolgreich bekämpft werden kann, wird Apoptose eingeleitet. Es existieren verschiedene Modelle, wie ER-Stress mit Apoptose verbunden ist. Caspase12 ist in der ER-Membran lokalisiert. Sie könnte durch Assoziation mit TRAF2 (TNFreceptor-associated facotr 2) aktiviert werden. TRAF2 wird durch den cytoplasmatischen Schwanz von IRE1 an die ER-Membran rekrutiert. Der IRE1-TRAF2 Komplex rekrutiert und aktiviert infolge dessen die apoptose-signal-regulating kinase1, der downstream liegende Effektoren (p28 und c-jun N-terminal kinase) aktiviert. Die ER-Kinase PERK, ein weiterer UPR-Transducer in Säugern, reguliert die CHOP- (C/EBPhomologous protein) Expression hoch. CHOP ist ein Transkriptions-Repressor, der die Expression von pro-survival BCL2-Proteinen inhibiert und möglicherweise die

145 mitochondriale Todes-Signalkaskase induziert. CHOP-Überexpression bewirkt Zellzyklus- Arrest und induziert Apoptose. Kopplung zwischen Faltung, ERAD und ER-Exit Das Prinzip der ERQC ist, dass nur korrekt gefaltete Proteine ihre Zielorte im sekretorischen Pathway erreichen. Die ERAD-Erkennungs- und Targeting-Maschinerie muss damit den Faltungszustand eines Proteins erkennen. Wenn nun das Protein den ERQC-Checkpoint bestanden hat, wie wird es dann aus dem ER exportiert? Es existiert eine Konkurrenz zwischen den Protein-Transport- und den ERAD-Maschinerien. Daher sollte die Entscheidung, ob Transport oder Degradation, von anderen Variablen (Zelltyp, Stress, Protein-Beladung, Signal-Prozesse) abhängig sein. Das Schicksal eines Proteins wird mehr von einem Netzwerk interagierender Faktoren und Parameter bestimmt, als von der Anwesenheit eines einzelnen Ereignisses oder Interaktionspartners. Medizinische Relevanz von ERAD-Substraten UPR (unfolded protein response)

146 Akkumulation fehlgefalteter Proteine im ER kann zur Induktion der UPR führen, welche die Beladung der ERs mit Proteinen reduziert (verschiedene Mechanismen). In Hefe fungiert die transmembrane Ser/Thr-Kinase und site-spezifische Endoribonuklease Ire1 (inositol-requiring protein 1) als UPR-Transducer. Unter normalen ungestressten Bedingungen ist BiP an Ire1 im ER-Lumen gebunden und hält das Enzym im inaktiven Zustand. Im gestressten Zustand dissoziiert BiP von Ire1 ab, um an fehlgefaltete Proteine zu binden, wodurch Ire1 aktiviert wird. Ire1 kann auch dimerisieren, wodurch sich eine Peptid-Bindetasche in der ERluminalen Domäne bildet und Ire1 damit fähig wird selbst ungefaltete Proteine zu binden. Dies resultiert ebenso in der Aktivierung von Ire1. Ire1 Aktivierung involviert die Trans-Phosphorylierung seiner zytoplasmatischen Domäne, was die Endoribonuklease-Aktivität induziert. Diese ist für das Spleißen des Introns in der für Hac1 (homologous to ATG6/CREB = UPR-Transkriptionsaktivator) codierenden mrna verantwortlich. Die prozessierte mrna wird mittels der trna-ligase Trl1 re-ligiert und anschließend translatiert. Hac1 translokiert dann in den Zellkern und bindet an UPR-Elemente (UPREs) und andere Sequenzen in der Promoter-Region der Zielgene, deren Expression hochreguliert wird. In höheren Eukaryonten beinhaltet die UPR drei Transducer (IRE1, PERK, ATF6). In allen drei Fällen wird BIP zusätzlich für die Transducer-Aktivierung benötigt. - IRE1 fungiert in einer Weise wie auch das beschriebene Hefe-Homolog. - ER-Stress aktiviertes PERK ist eine Transmembran-Kinase, welche die α-untereinheit von elf2α (eukaryotic translation initiation factor-2) phosphoryliert und damit die Translation inhibiert. - ATF6 (activating transcription factor-6) wandert bei ER-Stress zum Golgi, wo es mithilfe der Intermembran-Proteasen S1P und S2P proteolytisch prozessiert wird, sodass der ATF6- Fragment Transkriptionsfaktor freigesetzt wird. Dieser translokiert in den Zellkern und reguliert Zielgene hoch. Der Calnexin-Calretikulin-Zyklus

147 Der Calnexin-Zyklus ist ein N-Glykan abhängiger Mechanismus der ERAQ für die Glykoproteinfaltung. Die meisten ins ER translokierten Proteine werden cotranslational mit dem N-verknüpften Oligosaccharid GlcNAc 2 -Man 9 -Glc 3 modifiziert. Dieses Glykan wird von einem Dolichol-P-P Derivat auf den Asn-Rest des Konsensusmotivs Asn-X-Ser/Thr im naszierenden Substrat-Protein übertragen. Die zwei terminalen Glucose-Reste werden durch Glucosidase I und II (GI und GII) abgespalten. Die monoglykosylierte Spezies ist Substrat für die Lektine Calnexin (CNX) und Calretikulin (CRT), welche die Polypeptidfaltung katalysieren und Aggregation verhindern. Die Dissoziation des Glykoproteins von CNX/CRT erfolgt wahrscheinlich aufgrund der relativ schwachen Affinität zur Bindestelle (KD=1-2µM), wonach GII das Glykoprotein deglykolysiert. Es ist jedoch auch möglich, dass Glucosidase II aktiv am Dissoziationsprozess beteiligt ist und den dritten Glucose-Rest vom Glykoprotein noch in der Bindung zu CNX/CRT abspaltet, wodurch das Substrat von den Lektinen freigesetzt wird. Ist das Proteinsubstrat immernoch fehlgefaltet, so werden hydrophobe Bereiche in molten globule -ähnlichen Konformeren durch das lösliche ER-Enzym UGGT erkannt und das Proteinsubstrat reglycosyliert, wodurch die erneute Bindung an die CNX/CRT induziert und der Austritt des Substrat aus dem ER verhindert wird. GT ist damit die einzige Komponente, die als Konformationssensor im CNX/CRT Zyklus fungiert. GT kann ebenso Glykoproteine in unvollständig assemblierten oligomeren Komplexen glykosylieren, da es auch hydrophobe Bereiche erkennt, die aufgrund von der Abwesenheit anderer Untereinheiten exponiert werden. Die Zyklen von CNX/CRT Glykoprotein-Bindung und Freisetzung, katalysiert durch GT und GII (gegensätzliche Aktivitäten), werden solange fortgesetzt, bis das Glykoprotein aus dem ER transportiert wird. Glucose-freie Glykoproteine können dann ihren Weg im sekretorischen Pathway fortsetzen, während irreversibel fehlgefaltete Glykoproteine zwecks Degradation ins Zytosol transportiert werden (ERAD).

148 Die Lektin-Glykoprotein-Assoziation verhindert einerseits den ER-Exit von Faltungs-Intermediaten und irreperabel fehlgefalteten Glykoproteinen in Richtung Golgi-Apparat und beschleunigt andererseits die Faltungseffizienz durch Verhinderung von Protein-Aggregation und Unterstützung korrekter Disulfidbrücken-Bildung. Letzteres wird durch die Oxidoreduktase ERp57 vermittelt, welche zur Protein-Disulfid-Isomerase Familie gehört und ausschließlich mit CNX/CRT assoziierten Glykoproteinen interagiert. Struktur und Bindestellen von CNX/CRT CNX ist ein 90 kda schweres Typ 1 ER-Membranprotein, dessen größter Bereich im ER-Lumen lokalisiert ist. CRT ist ein 60 kda lösliches CNX-paralog, das im ER-Lumen- wegen einer C-terminalen KDEL Sequenz lokalisiert ist. Beide Proteine binden präferenziell Glykoproteine mit einem einzelnen terminalen Glucose-Rest. Sie binden ebenso ATP, Calcium, Zink und eine der vielen Thiol- Oxidoreduktasen des ERs (ERp57; eine von 17 PDIs im ER). Außerdem können sie mit Polypeptid- Segmenten assoziieren, die nicht native Konformationen aufweisen. Die Struktur des ER-luminalen Abschnitts von CNX gliedert sich in zwei Domänen (linke Abbildung). Die globuläre β-sandwich-domäne enthält die Oligosaccharid-Bindestelle mit u.a. sechs AS, welche den terminalen Glucose-Rest erkennen und koordinieren (rot dargestellt; Mutation einer dieser AS resultiert in vollständigem Verlust der Lektin-Funktion). Außerdem ist hier das Ca 2+ -Ion (schwarzer Punkt) über die cyan dargestellten AS mit hoher Affinität (KD=10µM) gebunden und eine Disulfid- Brücke lokalisiert. Das Calcium-Ion ist weit entfernt von der Lektin-Bindestelle, aber spielt eine essentielle strukturelle Rolle für das Protein und ist damit für die Lektin-Bindung notwendig. Außerdem weist CRT mehrere Calcium-Bindestellen mit geringerer Affinität (KD=2mM) auf, um den ER-Calcium-Speicher zu puffern. Zink wird ebenso über die globuläre Domäne gebunden. Die 14 nm lange, extendierte Arm-Domäne besteht aus zwei β-strängen, die in einer Hairpin Konfiguration gefaltet sind. Jeder β-strang besteht aus vier Prolin-reichen Tandem-Repeats (Arm- Domäne = P-Domäne). Der eine Strang hat Repeats des Sequenz-Motivs 1, der andere Repeats des Motivs 2. Jeder Motiv1-Repeat ist mit einem Motiv2-Repeat auf dem gegenüberliegenden Strang gepaart. Die Abbildung zeigt die vier Motiv-Paare.

149 CRT weist im Gegensatz zu CNX nur drei Tandem-Repeats auf und ist damit etwas kürzer. Aufgrund der Sequenz-Identität zwischen CNX und CRT von 39% sind die globulären Domänen sehr ähnlich und weisen identische Lektin-Bindespezifitäten auf. Rechts ist das Modell für die Interaktion zwischen CNX/CRT und einem Glykoprotein gezeigt. CNX ist in grün dargestellt. Ein faltendes Glykoprotein (hellblau) tritt in die Kavität zwischen Arm und globulärer Domäne. Es interagiert einerseits mit der Lektin-Bindestelle, die sich in einem Spalt auf der globulären Domäne befindet und den terminalen Glucose-Rest sowie darunter liegende Mannose-Reste erkennt, und andererseits mit der Polypeptid-Bindestelle, die ebenso in der globulären Domäne lokalisiert ist (nicht charakterisiert). Die zwei CGHC-haltigen aktiven Zentren in ERp57 (rot) sind gut platziert, um Disulfid-Brücken-Bildung, Reduktion oder Isomerisierung zu katalysieren. Es existiert außerdem eine ATP-Bindestelle, deren Position unbekannt ist, wobei keine ATPase- Aktivität detektiert wurde. ATP könnte Konformationsänderungen in CNX/CRT regulieren. ATP, aber nicht ADP und AMP machen CRT resistenter gegen Protease-Verdau und erhöht die Fähigkeit Protein-Aggregation zu inhibieren. Die Thiol-Oxidoreduktase ERp57 CNX und CRT assoziieren mit der Thiol-Oxidoreduktase ERp57 (blau) über die Spitze ihrer Arm- Domänen. Es handelt sich um ein Mitglied der PDI-Familie, das vier Thioredoxin-ähnliche Domänen aufweist. Die a und a Domänen enthalten das aktive Zentrum mit dem CXXC Motiv. Der N-Terminale Cys-Rest des Motivs bildet eine gemischte Disulfidbrücke mit dem Substratprotein während Oxidations- und Isomerisierungsreaktionen. Die WW mit CNX/CRT erfolgt über die b Domäne und in geringerem Ausmaß über den positiv-geladenen C-Terminus. ERp57 wird durch CNX/CRT rekrutiert und unterstützt hauptsächlich im Komplex mit CNX/CRT die Faltung von Glykoproteinen. ERp57 agiert als Thiol-Oxidase, -Reductase, und Isomerase in vitro. Im Komplex mit CRT assoziiert ERp57 mit der SERCA2b Calcium-Pumpe und inhibiert ihre Funktion, die von Cysteinen in einem intraluminalen Loop abhängig ist. ERp57 bildet gemischte Disulfidbrücken (Intermediate in Oxidations- und Isomerisierungsreaktionen) mit viralen Glykoproteinen. MHC Klasse I Biogenese Die Assemblierung von MHC Klasse I Molekülen, wie sie in fast allen Säugerzellen stattfindet, beginnt mit der Bindung einer CNX- und ERp57-assozioierten Klasse I schweren Kette (heavy chain = hc) an die lösliche untereinheit β 2 -Microglobulin (β 2 m). Der hc-β 2 m-heterodimer tritt nun in den Peptid- Lade-Komplex ein, der aus CRT, ERp57, TAP (ABC-Peptiid-Transporter) und Tapasin (bildet Brücke zwischen TAP und hc) besteht. Es folgt die Beladung eines Peptid-Antigens auf MHC I und die

150 anschließende Deassemblierung des Peptidlade-Komplexes. Das beladene MHC Klasse I Molekül wird nun zur Zelloberfläche transportiert. Eine sehr häufig vorkommende Disulfid-Brücke verknüpft ERp57 kovalent mit Tapasin. Weder Chaperon-Defizienz noch Inhibition haben einen Einfluss auf die Häufigkeit dieses Komplexes, weshalb die Chaperone CNX/CRT die Oxidaoreduktase ERp57 nicht zum Peptidlade-Komplex rekrutieren. ERp57 bestimmt die Rate der Disulfidbrücken-Bildung in hc und darüberhinaus die hc- Faltungseffizienz. Eintritt in den CNX/CRT Zyklus Die durch GI katalysierte Entfernung des äußersten Glucose-Restes geschieht fast simultan mit dem Glykan-Transfer. Daher wird angenommen, dass die Oligosaccharyl- Transferase GI und Dolichol-PP einen Superkomplex bilden. Die Rolle von GII geht über das Entfernen der zwei folgenden Glucose-Reste hinaus, da es auch regulatorische Aufgaben erfüllt. GII ist ein löslicher Dimer. Die α-untereinheit enthält die katalytische Aktivität und keine ER-retaining/retrieval Sequenz. Die β-untereinheit hat eine KDELähnliche Sequenz am C-Terminus, sowie einen Sequenz-Bereich mit hoher Homologie zur Mannose- Binde-Domäne des Man-6-Rezeptors. Die β-untereinheit ist nicht für die Aktivität von GII notwendig, sondern bestimmt seine Lokalisation (von S.pombe bis Säuger). Einzige Ausnahme ist die β-untereinheit von S.cerevisae, welche keine KDEL Sequenz enthält und somit weder Einfluss auf die enzymatische Aktivität, noch auf die ER-Lokalisation der katalytischen Komponente hat. Entfernung dieser β-untereinheit resultiert jedoch in der Produktion von monoglykosylierten Protein-verknüpften N-Glykanen, sodass sie für das vollständige Entfernen von Glucose in der Bäckerhefe notwendig ist. Im Falle des Säuger-Enzyms sind zwei N-Glykane im selben Glykoprotein erforderlich, um monoglykosylierte N-Glykane zu produzieren, jedoch nicht um den dritten Glucose Rest abzuspalten. Für diese GII-Spezifitäten im Säuger (β-untereinheit nur für Spaltung des ersten Glucose-Resten erforderlich) und in S-cerevisae (β-untereinheit nur für Spaltung des zweiten Glucose-Restes erforderlich) ist höchstwahrscheinlich die Interaktion der Man-6-P Rezeptor-ähnlichen Domäne der β-untereinheit mit den N-Glykanen verantwortlich. Im Falle des Säuger-Enzyms wird angenommen, dass die Bindungen zwischen Glucose m und l, sowie zwischen Glucose l und Mannose g nach der ersten erfolgreichen Glucose-Abspaltung räumlich anders orientiert sind, sodass das N-Glykan und die katalytische Stelle von GII transient voneinander entfernt werden. Diese Separation erlaubt auch die Erkennung von monoglykosylierten Epitopen durch CNX/CRT. Glykoproteine im CNX/CRT Zyklus Notwendigkeit von GT für den Zyklus

151 Die meisten Glykoproteine interagieren mit den Lektinen, jedoch werden nicht alle durch GT reglykosyliert, da einige den Faltungsprozess schon nach einmaliger Bindung an CNX/CRT erfolgreich abschließen. GT ist nicht Lebensnotwendig für S.cereviase oder Säugerzellen, die unter normalen Bedingungen wachsen. Nur bestimmte Glykoproteine benötigen GT für eine korrekte Faltung mit akzeptabler Effizienz. Außerdem wird GT unter ER-Stress Bedingungen vermehrt benötigt (ER-Stress in GT-defizienten Zellen kann letal sein). Dauer der CNX/CRT-Glykoprotein-Assoziation Man unterscheidet drei Klassen von Glykoproteinen, aufgrund ihrer Release-Rate von CNX/CRT in GT-defizienten Zellen. Klasse 1 Glykoproteine zeigen im Vergleich zu WT-Zellen eine identische Release-Rate in GTdefizienten Zellen. Sie benötigen nur einen Lektin-Assoziations-Zyklus, der durch Deglykosylierung des übertragenen Glykans induziert wird. Klasse 2 Glykoproteine zeigen eine erhöhte Release-Rate, da sie stark von der GTvermittelten Assoziation mit CNX/CRT abhängig sind. GT-Abwesenheit führt zu einer niedrigeren Faltungseffizienz. Glykoproteine der dritten Klasse zeigen eine längere Assoziation mit CNX/CRT. Dies wird entweder durch eine Protein-Protein Interaktion zwischen Lektinen und Glykoproteinen oder durch das Protein Sep15 (eine Selenocystein-haltige Oxidoreduktase), welches einen 1:1 Komplex mit GT bildet und eine Rolle in der Ausbildung der glykoproteinogenen Disulfidbrücken spielt, ermöglicht. Substratspezifität von CNX und CRT Obwohl die monoglykosylierte Form des glykoproteinogenen N-Glykans dieselbe Affinität für CNX und CRT aufweist, überlappen die Substrate von CRT und CNX nur teilweise. Die Unterschiede in der Substratspezifität wurden auf die Lokalisation der Lektine und der Substrate zurückgeführt. CNXoder CRT-defiziente Zellen zeigen jedoch eine Veränderung in der Glykoprotein-Produktion, sowie der Genauigkeit des ERQC (Die Faltungsrate wird in Abwesenheit von CRT beschleunigt; die Faltungseffizienz wurde in allen Defizienzen verringert; Die Retention unvollständig gefalteter Glykoproteine im ER wurde in gleichzeitiger Abwesenheit von CRT und CNX erhöht). CNX scheint als Faltungshelfer wichtiger als CRT zu sein, da die Folgen von CNX-Defizienz wesentlich schwerwiegender ausfallen und auch eine Erhöhung alternativer ER-residenter Chaperone induziert. Drei Varianten desselben zellulären Glykoproteins, die sich in Faltungskompetenz, Anzahl der Glykane und Löslichkeit unterscheiden, sowie in WT-Zellen CNX-Substrate waren, konnten nicht an CRT in CNX-defizienten Zellen binden. Stattdessen interagierten sie stark mit BiP. Im Gegensatz hierzu interagieren zwei virale Glykoproteine (Semliki Forest virus E1 und p62) mit beiden Lektinen unter normalen Bedingungen und in CNX-defizienten Zellen vermehrt mit CRT, wodurch ihre Reifung normal verläuft. Ein anderes virales Protein (vesicular stomatitis virus G) interagiert unter normalen Bedingungen ausschließlich mit CNX, obwohl es in CNX-defizienten Zellen auch mit CRT wechselwirken kann. Es ist aber auch denkbar, dass virale Infektionen die normale Glykoprotein- Erkennung durch CRT/CNX verändern können. Austritt aus dem CRT/CNX Zyklus

152 Korrekt gefaltete Glykoproteine werden aufgrund ihrer Konformation nicht von GT erkannt und damit nicht wieder reglykosyliert. Wie jedoch erkennt die Zelle, dass ein Glykoprotein irreperabel fehlgefaltet oder ein multimerer Komplex unfähig zur Ausbildung der vollständigen oligomeren Struktur ist? Solche müssen aus dem CNX/CRT Zyklus geschleust und dem ERAD zugeführt werden. Mannose-Analoga, welche als ER-Mannosidase I Inhibitor oder Polymannose-Lektin Inhibitor fungieren, verzögern die Degradation fehlgefalteter Glykoprteine. Es wird daher angenommen, dass die Degradation durch das Entfernen von Mannose-Reste induziert wird. Wenn die Entfernung von Mannose langsamer verläuft, als die Entfernung von Glucose durch GI und GII kann die Demannosylierung von Glykoproteinen, die lange im ER residieren (irreparabel fehlgefaltete Proteine sind im CNX/CRT Zyklus gefangen) als tag für die Degradation begriffen werden. Es gibt mindestens zwei Proteine während ERAD, die mit Polymannose-Ketten interagieren, um fehlgefaltete Glykoproteine aus dem CNX/CRT Zyklus zu holen. ER-α-Mannosidase I spaltet den i-mannose-rest ab, sodass Man 8 -GlcNAc 2 Isomer B (M8B) entsteht. Glykane, die kleiner als M8B sind, wurden in Glykoproteinen gefunden, die länger im ER residieren. Die hier zugrundeliegenden Mechanismen sind nicht bekannt. Es ist auch bekannt, dass irreparabel fehlgefaltete Glykoproteine zwischen ER und Golgi hin und her transportiert werden, bevor sie zur Degradation geschickt werden. Im Gegensatz zum S.cerevisae Golgi-Apparat, der keine Mannosidase-Aktivitäten aufweist, hat die cis-golgi Zisterne von Säugern drei α-mannosidase Aktivitäten (Golgi α-mannosidase IA, IB und IC), welche Man 9 -GlcNAc 2 zu Man 5 -GlcNAc 2 abbauen können, wobei die Reste d bis g, sowie j und k abgespalten werden. Zusätzlich befindet sich in Säuger-Zellen eine ERGIC/cis-Golgi Endomannosidase, welche die Bildung von M8A durch Abspaltung von Mannose g, sowie das Degradationsprodukt Glc-Man durch Spaltung von Glc 1 -Man 9 -GlcNAc 2 erzeugt. Das zweite Protein, das im ERAD mit Polymannose-Ketten interagiert ist EDEM (in Säugern) bzw. Htm1p oder Man1p in Hefe. Sie sind löslich und weisen eine 450 AS-große Domäne auf, welche 35% Seuqenzidentität zur ER-α-Mannosidase I hat (Homologe Proteine). Überexpression von EDEMs beschleunigt die Degradation fehlgefalteter Proteine, indem sie aus dem CNX/CRT Zyklus befreit werden. Die Abspaltung von Mannose ist nicht ausreichend für Austritt aus dem CNX/CRT Zyklus Auch Glykoproteine mit einer kürzeren Mannosekette, wie Man 5 -GlcNAc 2 sind gute GT-Substrate. Ihre Reglykosylierung resultiert in einer Interaktion mit CNX. Die Entfernung von Mannose-Resten ist damit nicht ausreichend für einen Austritt aus dem CNX/CRT Zyklus. Es ist möglich, dass EDEMs eine Lektin-Funktion aufweisen und ein breites Substratspektrum haben (müssen auch kürzere Mannoseketten erkennen). So könnten EDEMs mit deglukosylierten Glykoproteinen und CNX mit monoglucosylierten Glykoproteinen interagieren. EDEMs würden damit die Reglykosylierung mittels GT physikalisch blockieren und den Wiedereintritt in den CNX/CRT Zyklus verhindern. In S.pombe ist dies der wahrscheinlichste Mechanismus, da S.pombe keine Golgi-Mannosidasen und das EDEM-Homolog keine Mannosidase-Aktivität aufweist. Eine weitere Annahme ist, dass eine extensive Demannosylierung, insbesondere das spezifische Entfernen des Mannose-Restes g (Mannose-Rest, der von GT mit Glucose verknüpft wird), eine Reglykosylierung verhindert. Dies steht in Zusammenhang mit der Überexpression von

153 ER-α-Mannosidase I, welche die Degradation fehlgefalteter Glykoproteine beschleunigt. Nach extrem langer ER-Residenz sind die Man 9 -GlcNAc 2 haltigen fehlgefalteten Glykoproteine nur minimal degradiert worden. Man 7 -GlcNAc 2 haltige fehlgefaltete Glykoproteine sind die mit den kleinsten Glykanen, die noch vorhanden sind, wobei diese Verbindung den Mannose-Rest g aufweist. Die entsprechenden enzymatischen Aktivitäten wurden für diesen Mechanismus jedoch noch nicht identifiziert. Es gibt mehrere Indizien, wie eine extensive Demannosylierung entstehen könnte: (1) ER Mannosidase I häuft sich an spezifischen subzellulären Bereichen zusammen mit fehlgefalteten Glykoproteinen an (2) Überexpression von EDEMs resultiert in einer erhöhten Demannosylierungs-Rate fehlgefalteter Glykoproteine. Ob EDEMs als Lektine oder Enzyme agieren ist jedoch nicht sicher. (3) Zusätzliche Aktivitäten von Golgi- Mannosidasen und der ERGIC/cis-Golgi Endomannosidase, die M8A (Mannose-Rest g abgespalten) produziert. Auch die Abwesenheit von Monoglykosylierten Glykanen ist nicht unbedingt erforderlich für die Degradation, da auch Glc 1 -Man 9 -GlcNAc 2 und Glc 1 -Man 8 -GlcNAc 2 verknüpfte Glykoproteine im Cytosol durch das Proteasom degradiert werden, obwohl diese Glykane die Affinität zu CNX/CRT bestimmen. Daher kann der Austritt aus den CNX/CRT Zyklus und das Targeting zum Proteasom nicht alleine der Freisetzung aus den CNX/CRT Bindungen durch Inhibition der Bildung monoglykosylierter N-Glykane zugeschrieben werden. Ein möglicher Degradations-tag (putativ!) ist in der nebenstehenden Abbildung gezeigt. Sekretion oder Degradation? Fehlgefaltete Glykoproteine werden über ERAD degradiert. Das zuständige Ub-Konjugationssystem für Glykoproteine ist ein SFC-Komplex (siehe Ub-System). Ist geraten wegen abbildung normal macht das doch HRD1 oder DOA10 bei ERAD??

154 MLP = Mannosidase-lile proteins (z.b. EDEM) CNX und CRT als klassische Chaperone (Lektin-Bindemodell vs. Dual-Bindemodell) Da die Interaktion zwischen Glykoproteinen und CNX/CRT über zusätzliche Glykosylierung (Glucosidase-Inhibitoren) oder Oligosaccharid-Prozessierung blockiert wird, ist die Lektin-Funktion essentiell für die Wechselwrikungen und Funktionen von CNX/CRT. Daher existiert seit 1994 das Lectin-only model. Da exponierte hydrophobe Bereiche von fehlgefalteten Glykoproteinen nicht von CNX/CRT direkt verdeckt werden, ist die Frage wie sie Aggregation verhindern. Die Einkapselung des faltetenden Glykoproteins zwischen Arm-Domäne und globulärer Lektin-Domäne könnte ausreichend für eine effiziente Inhibition der Wechselwirkung mit anderen Faltungsintermediaten sein. In dem alternativen dual binding model interagieren CNX/CRT über die Lektin-Bindestelle und zugleich über die Polypeptid-Bindestelle mit dem Glykoprotein. Hier wäre die Funktion als Faltungshelfer ähnlich erklärbar wie bei klassischen Chaperonen: Bindung an hydrophoben Bereichen fehlgefalteter Proteine und Verhinderung ihrer Aggregation. Die Dissoziation des Komplexes würde hier die Freisetzung des Oligosaccharids, sowie eine Konformationsänderung in der Polypeptidstelle erfordern, die z.b. durch ATP reguliert werden könnte (ATP-Bindestelle vorhanden). UDP-Glucose könnte aber auch bei der Funktion von CNX/CRT als klassische Chaperone eine ähnliche Rolle spielen wie im CNX/CRT Zyklus (zur Lieferung der NTP-Energie, wie bei klassischen Chaperonen).In diesem Modell agieren CNX/CRT zusätzlich zu UGGT als Konformationssensoren. Die Bindung der meisten Substrate an CNX/CRT wird ausschließlich durch den Glykan-Rest vermittelt und Konformationszustände spielen dabei keine Rolle (wie z.b. bei MHC Klasse I Molekülen und RNAse B). Ein weiteres Problem ist, dass die Kristallstruktur von CNX keine bekannte

155 Bindestelle für Hydrophobe Protein-Bereiche aufzeigt. Es gibt jedoch auch Gegenargumente und Indizien, dass CNX/CRT als klassische Chaperone agieren können und das dual binding model greift. Die Kristallstruktur von CNX wurde in Abwesenheit von ATP gemacht. ATP-Bindung erhöht die Fähigkeit von CNX/CRT die Aggregation denaturierter Proteine zu verhindern und induziert Konformationsänderungen in CNX/CRT, die eine Erhöhung der Oberflächen- Hydrophobizität beinhalten. Die Kristallstruktur enthält 1mM Calcium, während im ER µm Calcium vorliegen. Diese niedrigere Konzentration bewirkt eine Veränderung in der Protease-Sensitivität von CNX/CRT und erhöht zugleich stark die Fähigkeit Aggregation bei physiologischen Temperaturen zu inhibieren. Es gibt Glykoproteine, die auch im voll-glykosylierten Zustand (Glucosidase-Inhibitoren) eine identische Affinität zu CNX/CRT aufweisen wie im monoglykosylierten Zustand. Dies ist widersprüchlich zur bisherigen Erkenntnis, dass durch solche Eingriffe meist die WW mit CNX/CRT blockiert wird. Deglykosylierung manacher Glykoproteinen resultiert nicht in einer Dissoziation aus dem CNX/CRT-Glykoprotein Komplex. CNX und CRT inhibieren die thermische Aggregation auch von nicht-glykosylierten Proteinen, was durch die globuläre Domäne vermittelt wird. CNX und CRT erkennen ausschließlich fehlgefaltete Konformere von nicht-glykosylierten Proteinen, was ihre Funktion als Konformationssensor stützt. Auch CNX/CRT Mutanten ohne Lektin-Funktion können ERp57 binden und Aggregation denaturierter nicht-glykorpteine verhindern. CRT bindet an hydrophobe Peptid-Bereiche. Infolge von Hitzeschock machen CRT und CNX Konformationsänderungen durch, welche ihre Oligomerisierung induzieren und ihre Fähigkeit nicht-glykosylierte Substrate zu binden erhöht. Greift das dual binding model, so erhöht sich auch die Avidität von CNX/CRT aufgrund der zwei vorhandenen Bindestellen. CNX/CRT könnte eine ähnliche/gleichwertige Funktion haben wie BiP. Ein Vergleich zeigt, dass beide Chaperone im selben Ausmaß die Aggregation nicht-glykosylierter Proteine verhindern, wobei CNX fähiger ist die Aggregation monoglykosylierter Proteine zu inhibieren. Deglykosylierung macht diesen Vorteil gegenüber BiP wieder zunichte. ERGIC-53 ERGIC-53 ist ein Mannose-spezifisches Lektin, das Zuckerreste von Glykoproteinen erkennt und in die Sortierung und das Recycling von Glykoproteinen involviert ist. Es handelt sich um einen spezifischen Cargo-Rezeptor für den ER-Golgi-Transport spezifischer, gefalteter Glykoproteine.

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