NAT für die Diagnostik von Mykobakteriosen

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1 NAT für die Diagnostik von Mykobakteriosen Andreas Roth Institut für Mikrobiologie Lungenklinik Heckeshorn, Berlin

2 ???? 1999/2001 MIQ NAT 1995 Amplicor/ TMA 1993 Telenti: rpob Gen 1993 Telenti: RFLP hsp Gen 1990 Böttger: 16S RNA Gen 1990 Eisenach: PCR IS6110

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4 Weshalb noch Mikroskopie? preiswert (er) einfach (er) schnell (er) semiquantitativ Infektionsgefährdung Kombination mit PCR 100 % Spezifität

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6 RINGVERSUCHE MYKOBAKTERIEN PCR-NAT Sollwertlaboratorien 2/2002 Sputumproben TB-NAT Neg Neg Neg Pos ++ Pos (+) Pos (+) Mikroskopie Neg Neg Neg (+) Neg Neg Richtig- Ergebnisse der Referenzlaboratorien (Methode): keitsquote 3x In-house PCR Neg Neg Neg Pos Pos Pos 100 % 4x Amplicor Neg Neg Neg Pos Pos Pos 100 % 1x GenProbe Neg Neg Neg Pos Pos Pos 100 % 1x ProbeTec Neg Neg Neg Pos Pos Pos 100 %

7 RINGVERSUCHE MYKOBAKTERIEN NAT - PCR Methoden Methode Feb/2003 Nov/2002 n (%) Mittelwert RQ Einfache vs alle Proben Amplicor 54 46,6% 99 % 89 % (- 10) 57 58,8% 97 % 91 % (- 5) GenProbe 10 8,6% 100 % 94 % (- 6) 9 8,5% 98 % 94 % (- 4) In-house 28 24,1% 96 % 93 % (- 3) 21 19,8% 96 % 92 % (- 4) ProbeTec 20 17,2% 97 % 97 % (- 0) 14 13,2% 99 % 97 % (- 2) Andere 4 3,4% 100 % 82 % (- 18) 5 4,7% 88 % 83 % (- 5)

8 Ringversuch TB-NAT Feb (n 119) TB-NAT positiv (Einzelbestimmung) TB-NAT positiv (Zweifachbestimmung) TB-NAT negativ Sputumprobe Neg Pos 5 KBE Pos 50 KBE Pos 500 KBE Neg Neg Nicht beurteilbar, weil nicht reproduzierbar positiv Nicht beurteilbar wegen Inhibitoren % mit voller Punktzahl 98,3 7,6 19,3 61,3 96,6 98,3 Ergebnisse aller Teilnehmer Ergebnisse n % Alles richtig > 90 % richtig 51 42, % richtig 43 36,1 Nicht bestanden 4 3,4 Richtigkeitsquoten paucibacilläre Proben Methode n Probe 2 Probe 3 Probe 4 Amplicor 57 5,8 % 8,2 % 47,4 % LightCycler 8 12,5 % 12,5 % 37,5 % Inhouse 22 18,2 % 50 % 86,4 % ProbeTec 19 10,5 % 36.8 % 94,7 %

9 RINGVERSUCHE MYKOBAKTERIEN PCR-NAT Feb Falsch-positiv: 1-2% Mitgeteilte Ergebnisse: Sputumproben Neg Pos Neg Pos Neg Neg TB-NAT positiv TB-NAT negativ Nicht beurteilbar, weil nicht reproduzierbar positiv Nicht beurteilbar wegen Inhibition % mit voller Punktzahl 98,2 93,9 96,5 93,9 94,7 97,4

10 RINGVERSUCHE MYKOBAKTERIEN PCR-NAT Feb (10 4 Genome) Rate falsch-positiver: Mitgeteilte Ergebnisse: Sputumproben Neg Pos Pos Neg Neg Neg TB-NAT positiv (Einzelbest.) TB-NAT positiv (reproduz.) TB-NAT negativ Nicht beurteilbar (nicht reprodz.) 2 Inhibition % mit voller Punktzahl 98,2 99,29 98, ,3

11 Externe Qualitätssicherung PCR Mykobakteriologie Didaktik Grenzen bei der Sensitivität Reproduzierbarkeit => pos. Befund Firmenkits

12 Indikationen PCR/ NAT Mykobakteriologie Gesicherte Indikationen (Routinelabor) Sekrete des Respirationstraktes (Tuberkulose) 1) Mikroskopie positiv 2) Mikroskopie negativ und klinisch begründeter Verdacht Liquor 3) Meningitis tuberculosa Spezielle Indikationen (Referenzlaboratorien) Extrapulmonale Tuberkulose Atypische Mykobakterien

13 Akuterkrankung Hoher Verdacht Ausschluß Mikroskopie + Kultur SFS positiv negativ Tb- Nukleinsäure- Amplifikation (NAT) Klinik Verdacht kein Verdacht Negativ nicht reprod. NTM? Tb positiv Klinische Diagnose Keine NAT Entscheidung Kultur Tuberkulose Kultur

14 Sequenzanalyse rrna Operon 16S rdna ITS 23S rdna 1,5 kb 3 kb Helix 10

15 Harmsen et al. Nov BMC Infectious Disease RIDOM: comprehensive and public datadbase for identification of Mycobacterium species

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17 Kultur Empfindlichkeit LightCycler LIPA - Arrays in house Amplicor Hain TB PCR Genus PCR Chiptechnologie Differenzierung Identifizierung Genotypisierung Rifampicinresistenz LightCycler LIPA -Arrays Mikroskopie

18 ZN AFB Lung lesion Infiltrate/Cavitation Carcinoma Abscess specimen Gram Branched gram+rods culture isolate Aerobic Actinomycetes Mycobacterium, Nocardia Tsukamurella, Gordonia, Streptomyces

19 Chip: DNA-Microarray ATAGGCTGAGTCGATAGGCTGTGCCGAATA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I A 30-mer AATAGGCTGAGTCGATAGGCTGTGCCGAATA PCR product SNP Oligo 20-mer A

20 LCD Array (Low Cost & Density)

21 LCD Array BacBasic Gramneg. Stäbchen Blutkultur Pseudomonas Bacteroides Proteus Citrobacter aeruginosa fragilis mirabilis koseri

22 LCD Array Mycobacteria Application Identification colony positive MGIT mixed culture Bacteria 15m DNA Direct detection positive microscopy (AFB, branched GPR) Specimen 1h scan stain label 5m 1m 5m 1-2h PCR multiple single Hybbuffer Hybridization 30m

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25 Actinomycetales [1917] Corynebacterineae Corynebacteriaceae. ;. ;. Dietziaceae. Gordoniaceae. Mycobacteriaceae Mycobacterium (>100) Nocardiaceae Nocardia (35) ;. Tsukamurellaceae Tsukamurella Propionibacterineae Streptomycineae Medizinische ca. 18 Bedeutung:

26 Actinomycetales [1917] Corynebacterineae Corynebacteriaceae. ;. ;. Dietziaceae. Gordoniaceae. Mycobacteriaceae Mycobacterium (>100) Nocardiaceae Nocardia (35) ;. Tsukamurellaceae Tsukamurella Propionibacterineae Streptomycineae Medizinische Bedeutung: 9 sicher 3 selten

27 Myco Type Specificities 6 Mycobacterium Nocardia Tsukamurella Gordonia Streptomyces Rhodococcus 4 N. cyriacigeorgica N. farcinica N. nova N. paucivorans 4 M. fortuitum complex M. marinum-ulcerans M. scrofulaceum complex M. tuberculosis complex positive control internal standard M. abscessus 16 M. avium M. celatum M. chelonae M. gordonae M. haemophilum M. heckeshornense M. intracellulare M. kansasii M. malmoense M. peregrinum M. phlei M. simiae M. smegmatis M. szulgai M. xenopi

28 LCD Array Mycobacteria Identification of culture isolates Mixed culture N. farcinica M. smegmatis Nocardiosis N. nova Rare isolates Streptomyces Opportunist Tsukamurella

29 Myco Type Specificity - Sensitivity 6 Mycobacterium Nocardia Tsukamurella Gordonia Streptomyces Rhodococcus 4 N. cyriacigeorgica N. farcinica N. nova N. paucivorans 4 M. fortuitum complex M. marinum-ulcerans M. scrofulaceum complex M. tuberculosis complex positive control internal standard Evaluation Strains 150 Mycobacteria 41 Nocardia 21 other aer. Actinomy. Specimens 52 AFB + 3 GPR + Sensitivity 98% M. abscessus 16 M. avium M. celatum M. chelonae M. gordonae M. haemophilum M. heckeshornense M. intracellulare M. kansasii M. malmoense M. peregrinum M. phlei M. simiae M. smegmatis M. szulgai M. xenopi

30 LCD Array Myco-Res Array Design

31 LCD Array Myco-Res Capture probe WT amino acids Capture probe WT amino acids Capture probe for mutant 516-Tyr positive global: 3.9 % Capture probe for mutant 531-Leu positive global: 43.2 %

32 LCD Array Myco Res Direct detection Sputum (AFB +)

33 ZN AFB Lung lesion Infiltrate/Cavitation Carcinoma Abscess MTB MOTT Noc RIF/INH 70% specimen Gram Branched gram+rods culture isolate Aerobic Actinomycetes Mycobacterium, Nocardia Tsukamurella, Gordonia, Streptomyces

34 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!!!