Aus der Abteilung Virologie des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br.

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1 Aus der Abteilung Virologie des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Rationale und rationelle EBV-Diagnostik im Leistungssport: Evaluation von serologischen Quer- und Längsschnittdaten bei Ausdauerathleten und Kontrollpersonen I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vorgelegt 2004 von geboren in Torben Pottgießer Hattingen (Ruhr)

2 Dekan Prof. Dr. Christoph Peters 1. Gutachter Prof. Dr. Georg Bauer 2. Gutachter Prof. Dr. Hans-Hermann Dickhuth Jahr der Promotion 2006

3 Meinen Eltern und meinem Bruder

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Das Epstein-Barr Virus Epidemiologie und Übertragung Epstein-Barr Virus Lebenszyklus Klinisches Bild Differentialdiagnostik Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik Bedeutung der EBV-Infektion im Sport Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Material Seren Testkit Lineassay Immunfluoreszenzverfahren Geräte Methoden EBV-IgG-Lineassay Aviditätsbestimmung im Lineassay Scantechnik, quantitative Bestimmung der Bandenintensität Immunfluoreszenztechnik Longitudinalstudie Statistik und EDV Ergebnisse Querschnittstudie Probanden-Charakteristika EBV-IgG-Line-Assay Immunfluoreszenztechnikverfahren (IFT) Einzelfallbeschreibung und Scanmethodik Longitudinalstudie Probanden-Charakteristika... 72

5 3.2.2 EBV-IgG-Lineassay Aviditätsbestimmung Vergleich der beiden Gruppen Diskussion Methoden Vergleich Quantitative Scanmethodik Vergleich Athleten und Normalpersonen Longitudinalstudie Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf

6 1 Einleitung 1.1 Das Epstein-Barr Virus Epidemiologie und Übertragung Das Epstein-Barr Virus hat sich neben dem Mensch über Millionen von Jahren co-entwickelt und sich während dieser Zeit äußerst an den menschlichen Organismus angepasst, so dass es heute einen der effektivsten Parasiten darstellt (82). Durch M. Epstein, B.G. Achong und Y. Barr wurden 1964 in kultivierten Burkitt-Lymphom-Zelllinien virusähnliche Partikel elektronenmikroskopisch nachgewiesen (22), die von dem Ehepaar Henle als neues Virus erkannt und nach ihren Entdeckern als Epstein-Barr Virus bezeichnet wurden. Im Laufe der Zeit wurde eine Serokonversion von spezifischen Antikörpern gegen das Epstein-Barr Virus bei solchen Personen festgestellt, die an dem Krankheitsbild Infektiöse Mononukleose erkrankt waren. Damit wurde der Zusammenhang zwischen EBV-Infektionen und Infektiöser Mononukleose hergestellt. Außerdem wurde herausgefunden, dass über 90% der Erwachsenen Bevölkerung seropositiv sind (53;90), also spezifische Antikörper gegen das Epstein-Barr Virus besitzen. Das Virus gehört zu der Gruppe der Herpesviren (HHV-4) und hat, wie andere Herpesviren, latente und produktive (lytische) Phasen im Lebenszyklus, die zum einen das Virus lebenslang im menschlichen Organismus bestehen lassen und zum anderen die Virus-Produktion und Weiterverteilung beeinflussen. So kommt es zu einer latenten Infektion von B-Lymphozyten (4;116) und Virusproduktion in den Speichel (91;125). Das Epstein-Barr Virus verursacht das klinische Bild der Infektiösen Mononukleose und wird auch mit malignen Tumoren assoziiert. Die Primärinfektion erfolgt in den meisten Fällen asymptomatisch im Kindesalter (28), das Virus wird häufig zwischen Familienmitgliedern durch Speichel übertragen (30;44). Einen zweiten Erkrankungsgipfel klinisch manifester Infektionen erfolgt im jungen Erwachsenenalter (6). In dem Alter der Adoleszenz entwickelt sich eine manifeste Infektiöse Mononukleose in 50-74% der Fälle (47;90;104). Man geht im Allgemeinen davon aus, dass sich solche Personen, die in ihrer Kindheit nicht mit dem Virus in Berührung gekommen sind, durch Küssen infizieren. Daher wird die Infektiöse Mononukleose im englischen auch als kissing disease bezeichnet. Grundsätzlich ist eine Neuinfektion in jedem Alter möglich, doch im

7 1 Einleitung - Das Epstein-Barr Virus 2 lebenszeitlichen Verlauf immer unwahrscheinlicher. Bei einer Neuinfektion im höheren Lebensalter werden häufig schwerere Verläufe des klinischen Bildes beobachtet. In manchen Studien wird neben dem klassischen Übertragungsweg, auch eine Infektion durch sexuellen Kontakt diskutiert, da EBV in männlichen und weiblichen genitalen Sekreten festgestellt wurde (19;59;109). Ebenso wurden Infektionen nach Transfusion von größeren Frischblutvolumina beschrieben (1;36) Epstein-Barr Virus Lebenszyklus Der für das Epstein-Barr Virus bekannte Tropismus für B-Zellen und Epithelien spielt im Lebenszyklus eine wichtige Rolle. Im Allgemeinen sind die Konzentrationen von EBV im Speichel gering, so dass bei einer Neuinfektion eine Amplifikation des Virus erst erfolgen muss, um Persistenz in den B-Zellen zu erreichen. Bei einer primären Infektion könnte also initial eine lytische Phase mit Replikation in Tonsillarepithelien mit nachfolgender Infektion der benachbarten B-Zellen erfolgen (12;26). Andererseits könnte auch eine direkte Infektion von B- Zellen in Lymphepithelien des Waldeyer`schen Rachenrings stattfinden, wo Kryptenstrukturen direkten Zugang zu lymphatischen Gewebe und B-Zellen erlauben könnten (27;97). Durch Expression der viralen Gene könnte es so zu einer Amplifikation der virusinfizierten Zellen bis zur Latenz kommen, noch bevor Immunabwehrmechanismen greifen (82). In der lytischen (produktiven) Phase kommt es zunächst zu einer Aktivierung der immediate early-proteine, die als Transaktivatoren den Ablauf der lytischen Phase regulieren, indem sie die Expression der delayed early- und späten Proteine aktivieren. Diese auch kurz als early antigens (EAs) bezeichneten Proteine katalysieren verschiedene Schritte des Nukleinsäurestoffwechsels und sind bei DNA-Synthese und Genomvermehrung aktiv. Die Genprodukte der späten Gene sind Strukturproteine und werden auch als viral capsid antigens (VCA) bezeichnet. Die Latenz des Virus scheint durch physiologische B-Zell Antigen-Aktivierungsabläufe erreicht und aufrecht gehalten zu werden (5). In einfachen B-Zellen werden zunächst unter dem Einfluss von EBV nuclear antigen 2 (EBNA-2) alle viralen Gene exprimiert und die Zellen proliferieren. Nach anschließend verminderter EBNA-2-Aktivität umgehen neu infizierte B- Zellen Apoptose durch Expression der EBV latenten Membranproteine (LMP) 1 und 2a, da LMP1 ein CD40-Homolog ist und LMP2a B-Zellrezeptorbindung vortäuscht, so dass nur nichtinfizierte B-Zellen über die Moleküle CD40 und den B-Zellrezeptor Apoptose unterlaufen (13;37;65;117;127). Über zytotoxische T-Zellen, T-Supressorzellen und natürliche Killerzellen werden die infizierten B-Zellen effizient auf 1/ B-Zellen zurückgedrängt, welche lebenslang persistieren (23;68;102).

8 1 Einleitung - Das Epstein-Barr Virus 3 Nach der Primärinfektion werden nur wenige Gene exprimiert, darunter LMP2a und die Gruppe der EBNA-Gene. Besonders EBNA-1 ist für die Aufrechterhaltung des immortalisierten Zustands wichtig, da es z.b. die Bindung von viraler DNA an zelluläre Chromosomen vermittelt, und so die gleichmäßige Verteilung der DNA in Tochterzellen erreicht (126). Schließlich muss das Virus aus der Latenz reaktivieren und in den lytischen Zyklus treten, um andere Personen zu infizieren. Wenn diese Reaktivierung stattfindet, werden verschiedene lytische Proteine exprimiert, die aktiv Immunabwehrmechanismen hemmen können, z.b. ein Interleukin-10-Homolog (88) und andere Proteine, die die Ausschüttung von Zytokinen und Interferon beeinträchtigen (17;89). Auch ein Bcl2-Homolog (BHRF1) kann das Überleben der Zellen durch Hemmung der Apoptose verlängern (51). Besonders das BZLF-1-Protein ist ein Schlüsselprotein bei dem Umschalten vom latenten in den produktiven Infektionszyklus (18;64;87). Jedoch wird bei gesunden infizierten Personen ein Gleichgewicht zwischen Virus und Mensch erreicht, so dass das Virus persistiert und sich nur in geringem Maße vermehrt Klinisches Bild Bei Infektionen in jungem Alter kommt es selten zu symptomatischen Infektionen, in der Adoleszenz und jungem Erwachsenenalter in etwa 50-74% der Fälle (47;90;104). Das klinische Bild einer akuten EBV-Infektion ist dabei sehr variabel und zeigt überlappende Symptome mit anderen Erkrankungen (14;16). Bei dem als Infektiöse Mononukleose und Pfeiffer sches Drüsenfieber bekannten Krankheitsbild kommt es nach einer Inkubationszeit von 4 bis 7 Wochen (57) zu klassischen Symptomen wie fieberhafte Angina tonsillaris, Pharyngitis, Lymphadenopathie und Splenomegalie (bis 50% der Fälle (106)). Bei Kindern kann eine respiratorische Symptomatik im Vordergrund stehen. Seltene neurologische Symptome stellen eine besondere diagnostische Herausforderung dar. Als Folge der polyklonalen B- Zellstimulation können Autoantikörper auftreten, die die Grundlage für hämolytische Anämie, Neutropenie und Thrombozytopenie bilden. Während der EBV-Primärinfektion kommt es zu einer vorübergehenden Suppression der zellulären Immunantwort (84;96) und dadurch gelegentlich zu einer Reaktivierung anderer persistierender Herpesviren wie dem Varizella- Zoster-Virus (63). Im Blutbild zeigt sich häufig eine mäßige Leukozytose mit mononukleären Zellen (Monozytose). Dies kann als eine absolute Lymphozytose (73) und atypische Lymphozytose (atypische Lymphozyten >10% der Gesamtleukozyten) (15) beobachtet werden. Auch eine milde Hepatitis mit Erhöhung der Transaminasen ist möglich. Ebenso können Hauterscheinungen wie Erytheme und Urtikaria imponieren, Exantheme werden besonders in Zusammenhang mit der Gabe von Ampicillin und Amoxicillin gesehen (98).

9 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 4 Als Komplikationen sind Milzruptur (2;25;83;103), Atemwegsobstruktion (15;83) und selten chronische Verlaufsformen (66;111) beobachtet worden. Eine besondere Rolle spielt die EBV- Infektion bei immuninkompetenten Patienten, bei denen im allgemeinen ein komplizierter, schwerwiegender Verlauf beobachtet wird und Reaktivierungen auftreten können (102). Neben dem klassischen und vermeintlich harmlosen Krankheitsbild der Infektiösen Mononukleose kann das Virus auch mit verschiedenen Malignomen assoziiert werden. Zu den klassischen Tumoren zählen dabei das Burkitt-Lymphom und das Nasopharynxcarcinom (69;128). Außerdem soll das Virus bei der Entstehung des Hodgkin-Lymphom (56;122), Leimyosarkomen (70;86) sowie Tumoren anderer Organe (82) beteiligt sein Differentialdiagnostik Gerade wegen dieser Variabilität des klinischen Bildes kommt der Differentialdiagnostik eine große Bedeutung zu. Da sich die Symptome zudem mit denen anderer Krankheitsbilder überlappen, sind vor allem folgende Krankheiten auszuschließen. Die Lymphadenopathie ist in ihrer Genese von einer Infektion mit Röteln-, Mumps- und Zytomegalieviren, einer HIV- Infektion, Toxoplasmose, Brucellose, Leptospirose und Hodgkin-Lymphomen abzugrenzen. In Hinblick auf die erhöhten Transaminasen müssen Infektionen mit Hepatitisviren abgegrenzt werden. Gewöhnliche Streptokokkenangina und andere respiratorische Erreger können für die respiratorische Symptomatik ursächlich sein, es ergeben sich Verwechslungsmöglichkeiten durch im Sport nicht seltene, durch Rhino-, Adeno- oder RS-Viren ausgelöste obere Atemwegserkrankungen (URTI). Schließlich kann das auffällige Blutbild bei der Infektiösen Mononukleose an eine Leukämie denken lassen. 1.2 Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik Aufgrund der variablen und sich überlappenden Symptome einer EBV-Infektion kommt der adäquaten und aussagekräftigen Serologie eine große Bedeutung zu. Grundsätzlich soll durch die Serologie eine eindeutige Zuordnung eines Falles zu einer der Kategorien seronegativ, akute Infektion, oder länger zurückliegende Infektion erfolgen. In der Vergangenheit wurde eine akute Infektion durch den Nachweis von heterophilen IgM- Antikörpern bestätigt. Diese Antikörper richten sich nicht gegen virale Epitope, sondern entstehen vielmehr durch das immunologische Chaos, das durch eine akute EBV-Infektion der B-Lymphozyten ausgelöst wird. Der ursprünglich verwendete Paul-Bunnell-Davidsohn Test wurde durch Monospot Tests ersetzt. Sie basieren als Schnelltests auf der Agglutination von Latex-Partikeln mit den eventuell vorhandenen heterophilen Antikörpern im Serum des

10 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 5 Patienten. Diese neueren Tests haben nach Linderholm et al. Sensitivitäten von 70-92% und Spezifitäten von % (76). In einer anderen Studie wurden falsch-positive Raten von 0-4% respektive 10% gefunden (118). Die Bildung dieser heterophilen Antikörper kann verzögert sein, dann muss der Test im Verlauf wiederholt werden. Außerdem liefern diese Tests nicht immer eindeutige Ergebnisse, da 10-15% der Erwachsenen mit Infektiöser Mononukleose keine heterophilen Antikörper bilden (24;29;106), und diese bei Kindern sogar ganz fehlen können (112). Auch andere Krankheiten und Viren, wie HIV, Lymphome, Lupus erythematodes, Röteln, Parvovirus, die dazu teilweise Mononukleose-ähnliche Symptome auslösen, können manchmal die Bildung von heterophilen Antikörpern verursachen (52;58;120). Auch heute werden diese Tests dennoch benutzt. Neben den beschriebenen Problemen verweigern sie auch eine Aussage über die Existenz von spezifischen Antikörpern gegen EBV. Schon früh wurden Tests auf spezifische Antikörper gegen EBV-Antigene entwickelt. Als klassische Methode gilt die Immunfluoreszenztechnik, mit der die meisten Erfahrungen gewonnen und wesentliche serologische Reaktionsmuster erarbeitet wurden (55). Die Sensitivität und Spezifität wurde durch Anwendung der spezifischen Tests verbessert, doch brachten auch diese Verfahren keine gänzlich eindeutigen Ergebnisse. Diese klassische EBV Serologie basiert auf der Detektion der IgG- und IgM- Antworten mithilfe der indirekten Immunfluoreszenz (IFT) gegen VCA (viral capsid antigen), EA (early antigens) und Antikörper gegen EBNA-1 und EBNA-2 (Epstein-Barr virus nuclear antigens) (74;105). Dabei ist VCA-IgG der klassische Marker für Seropositivität und bleibt lebenslang nachweisbar. VCA-IgM ist bei akuter EBV-Infektion in etwa 80 % der Fälle gleichzeitig mit VCA-IgG nachweisbar, selten eilt es VCA-IgG voraus oder tritt verspätet auf (8;105). Durch Rheumafaktor kann es zu falsch positiven VCA-IgM Ergebnissen kommen (54). VCA-IgM ist bei 20 % der akuten Infektionen nicht nachweisbar. Andererseits kann dieser Marker in einigen Fällen lange persistieren oder infolge von Wiederaufnahme des Virus in den lytischen Zyklus auftreten. Damit erlaubt weder der positive Nachweis noch das Fehlen von VCA-IgM eine eindeutige Diagnose. Da Anti-EBNA2-Antikörper auch bei frischen Infektionen nachgewiesen werden können, ist es wichtig, dass ein serologischer Test zwischen Antikörpern gegen EBNA-1 und EBNA-2 diskriminieren kann (105). Anti-EBNA-1 fehlt regelmäßig in den ersten Wochen nach Krankheitsbeginn und stellt somit den sichersten Marker für eine abgelaufene Infektionen dar (75). Allerdings wird Anti-EBNA-1 von 5-10% der gesunden Personen nicht gebildet (8), oder kann unter massiver Immunsuppression sekundär negativ werden (119). Negatives Anti-EBNA- 1 bedingt durch Nichtbildung oder sekundären Verlust kann bei gleichzeitig positivem Anti-

11 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 6 VCA-IgG eine akute Infektion vortäuschen. Diese mögliche falsch-positive Diagnose einer akuten EBV-Infektion stellt das größte Problem der EBV-Serologie dar. Dies gilt für Athleten genauso wie für die Allgemeinbevölkerung. Zusätzlich wird die Immunfluoreszenztechnik durch das mögliche Auftreten von antizellulären Bestandteilen der Seren erschwert, die keine Auswertung und Diagnose erlauben. Die für die Immunfluoreszenztechnik aufgezeigten Probleme (fehlendes Anti-EBNA-1; Anti- EBNA-1-Verlust; untypische IgM-Antwort) treten auch bei der heute häufigen Verwendung von Enzymimmunoassays auf, die auf denselben Teststrategien beruhen. Neuartige serologische Tests mit dem Immunoblot-Verfahren haben den bisherigen Goldstandard der EBV-Serologie abgelöst (8), da sie die oben beschriebenen Schwierigkeiten der bisherigen Diagnostik lösen konnten. Besonders die Entdeckung eines zweiten späten Markers, dem p-18-igg, konnte die Probleme der Anti-EBNA-1-Diagnostik im wesentlichen kompensieren (8), (Hansen C, Bauer G, 2000, unveröffentlicht). Dieser Marker geht nicht wie Anti-EBNA-1 unter Immunsuppression verloren und ist auch bei fehlender Anti-EBNA-1- Bildung in 98% der seropositiven Personen vorhanden. Außerdem erwies sich die Anti-EBNA- 1 Erkennung im Blot fach sensitiver als in der antikomplementären Immunfluoreszenz (Maier A, Bauer G, 2000, unveröffentlicht). Eine Weiterentwicklung des Immunoblots stellt die Lineassay-Technik mit rekombinanten, hochgereinigten Antigenen dar. Sie erlaubt eine beliebige Anordnung der Antigene auf dem Teststreifen, die z.b. nach Verlauf der Serokonversion geordnet werden können und deren Banden immer eine exakt definierte Größe besitzen. Durch Verwendung der rekombinanten Antigene können auch solche Fälle mit antizellularer Aktivität gelöst werden, da es zu keinen Hintergrundreaktionen kommt. Nach Bauer (8) kann der EBV-IgG-Lineassay aufgrund der Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenztechnik als neuer Goldstandard in der EBV-Serologie bezeichnet werden. Die EBV-Diagnostik wurde schon früh durch die Aviditätsbestimmung der vorhandenen Antikörper ergänzt. Bei der Aviditätsbestimmung handelt es sich um zusätzliches diagnostisches Verfahren zur Unterscheidung von frischen und abgelaufenen Infektionen, sowie zur eindeutigen Diagnosestellung von selteneren aberranten serologischen Konstellationen. Die Avidität ist als Teilbereich der Affinität zu betrachten, der sich nur auf die Stabilität der Antigen-Antikörper-Komplexe bezieht und auch als funktionelle Affinität beschrieben wurde (7). Für eine Vielzahl von viralen Erregern wurde ein standardisiertes Testsystem der Avidität etabliert (z.b. für Rubella Virus, CMV, HHV-6, HIV, VZV) (10;48-50;62;71;72;108;114;115;121).

12 1 Einleitung - Bedeutung der EBV-Infektion im Sport 7 Historisch hat sich die Aviditätsbestimmung aus der Beobachtung von inkonsistenten IgM- Antworten entwickelt, als man ein zusätzliches Verfahren zur sicheren Unterscheidung von frischen und abgelaufenen Infektionen gesucht hat. Eine Anwendung findet sowohl in ELISA- Testsystemen als auch in der Immunfluoreszenztechnik statt. Das Prinzip stützt sich in der EBV-Serologie auf die positive Selektion von B-Zell Klonen, die höher affine IgG-Moleküle gegen das Antigen bilden und gegenüber niedrig affinen IgG-Antikörpern überlegen sind (77). Diese Reifungskinetik findet während jeder humoralen Immunantwort statt, variiert aber beispielsweise leicht von Patient zu Patient (34). Eine hohe Avidität spricht demnach für eine länger zurückliegende, eine geringe Avidität dagegen für eine frische oder sehr kürzliche Infektion. Auch für die EBV-Diagnostik wurde die Aviditätsbestimmung etabliert und kann für das Lineassay-Verfahren als diagnostisches Hilfsmittel herangezogen werden (3;8;119;123). 1.3 Bedeutung der EBV-Infektion im Sport Bisher hat gerade im Sport die unterschiedliche EBV-Diagnostik für Verunsicherung bei Athleten, Trainern und betreuenden Ärzten gesorgt, da gängige serologische Methoden nicht in jedem Fall ein eindeutiges Ergebnis liefern, weil sie nur den klassischen, nicht aber den aberranten serologischen Konstellationen Rechnung tragen. Das nicht seltene Fehlen der späten Anti-EBNA-1-Antikörper (5-10% der Fälle (8)) hat zur Diagnose von frischen oder persistierenden klinischen Infektionen geführt, auch wenn die Infektion länger zurückliegend ist. Gerade dieser Umstand hat für Athleten eine besondere Relevanz, da nachfolgend häufig Trainingsunterbrechung und Verzicht auf Wettkämpfe gefordert wird. Deswegen ist die sichere Unterscheidung von frischen und länger zurückliegenden Infektion für Athleten so wichtig. Besteht wirklich eine sich klinisch manifestierende frische Infektion, ist der Athlet im Vergleich zur Normalbevölkerung besonders betroffen, da der als eher langwierig beschriebene Krankheitsverlauf und der Wiederbeginn von leichtem Training nach frühestens 21 Tagen (46;83) die sportliche Laufbahn stark einschränken können. Für den behandelnden Sportarzt ist bei akuter EBV-Infektion vor allem die Frage interessant, wann das Training und Wettkämpfe ohne erhöhtes Risiko wieder aufgenommen werden können. Diese Entscheidungen setzen aber immer die gesicherte Diagnose einer akuten EBV-Infektion voraus, da bei anderen Krankheitsbildern verschiedene Therapieoptionen möglich sind, andere Komplikationen erwartet werden und ein Wiederbeginn meistens früher möglich ist. In Einzelfällen soll bei schweren Symptomen und Komplikationen viel länger ausgesetzt werden, von 3 Monaten (2) bis sogar 6 Monaten, die 1978 von Rutkow gefordert wurden (103). Heute wird dagegen in Abhängigkeit der Symptome, des Blutbildes und der Milzgröße eine Wiederaufnahme der sportlichen Aktivität nach 3-4 Wochen empfohlen (46;83). Besonders in Kontaktsportarten ist

13 1 Einleitung - Zielsetzung der Arbeit 8 die zwar seltene, aber mögliche Komplikation von Milzrissen (2;25;83;103) die vorherrschende Gefahr, die genauso atraumatisch und spontan auftreten kann. Es existieren anekdotenhafte Berichte über gehäufte EBV-Infektionen bei Athleten (67;107), die wie von Klassen et al. beschrieben auch als klinische Reaktivierungen imponiert haben (67). Aufgrund der sportlichen Aktivität wurde ebenfalls die Gefahr einer klinischen Reaktivierung oder verlängerter Dauer der akuten Erkrankung beschrieben, besonders wenn vorschnell nach akuter Infektion die sportliche Aktivität wieder aufgenommen wird (81). Gleeson et al. stellen fest, dass es bei intensiv trainierenden Athleten zu einer signifikanten Ausscheidung von EBV- DNA im Speichel kommt und sehen einen signifikanten Zusammenhang von positivem EBV- Serologiestatus und dem Auftreten von oberen Atemwegssymptomen (URTI) (43). Zudem erscheinen auch in der nicht-fachlichen Literatur immer wieder anekdotenhafte Berichte über EBV und Pfeiffer sches Drüsenfieber, was als Erklärung für alle möglichen Geschehnisse herangezogen wird, wie z.b. hoher Blutdruck und jegliche unerklärliche Leistungsschwäche, selbst bei solchen Patienten, bei denen aufgrund des Alters über 30 Jahren eine frische Infektion sehr selten ist. In einem Fall soll die durch das EBV verursachte, andauernde Leistungsschwäche Grund gewesen sein, EPO-Doping anzuwenden, um wieder einen Leistungszuwachs zu bekommen ( ). Greenslade beschreibt einen typischen Fall einer fälschlich angenommenen EBV-Infektion, die aufgrund von EBV- Serologie als länger zurückliegende EBV-Infektion identifiziert wurde und als herkömmliche virale Infektion keine besondere Nachsorge oder Pause erfordert hat (45). In einem weiteren Fall wurde einem Athleten die Wiederaufnahme von Training untersagt, weil sich nach einer akuten Infektion keine Anti-EBNA-1-Antikörper nachweisen ließen ( ). Erst ein Test mit dem IgG-Lineassay bestätigte aufgrund des positiven Markers Antip18 eine länger zurückliegende Infektion. Nach all diesen Berichten würde man für ein Athletenkollektiv auch in irgendeiner Form besondere Ergebnisse erwarten. Es sind bisher keine großen Studien vorhanden, die Daten präsentieren, dass stark trainierte Athleten mehr oder weniger anfällig für EBV-Infektionen sind. Unklar bleibt auch, ob die bei Athleten bekannte transiente Immunsuppression (9;33;43;92-94;100;101;110) zu einer Änderung des EBV-Serologiestatus führen kann. 1.4 Zielsetzung der Arbeit Mit dieser Arbeit soll vor allem das Ziel verfolgt werden, die Prävalenz der möglichen Antikörperkonstellationen bei Athleten zu bestimmen und so einen Eindruck über das Ausmaß von EBV-Infektionen einer großen Athletenpopulation zu erhalten. Eventuelle Unterschiede zu

14 1 Einleitung - Zielsetzung der Arbeit 9 altersgematchten Normalpersonen sollen gleichzeitig festgestellt werden. Die serologischen Tests sollen anhand der klassischen Immunfluoreszenztechnik und dem Lineassay durchgeführt werden, um parallel die zuverlässigere Methode zu definieren und auf ihre Anwendbarkeit bei Athleten zu testen. Die Diagnostik soll bei unklaren Fällen oder aberranten Konstellationen durch die Aviditätsbestimmung ergänzt werden, um dieses zusätzliche diagnostische Verfahren auch für die Athletenpopulation zu etablieren. Durch die Verwendung einer neuen Scanmethodik zur quantitativen Auswertung des Lineassays soll herausgefunden werden, ob sich diese an einem großen Kollektiv gut anwenden lässt und Vorteile gegenüber der herkömmlichen semiquantitativen Auswertung bestehen. Mit der Durchführung der Longitudinalstudie soll das Ziel verfolgt werden, die Verläufe von Antikörperkonzentrationen bei höchst belasteten Ausdauerathleten zu studieren. Dabei soll wie in der Querschnittstudie und der Analyse der EBV-Prävalenz das Athletenkollektiv mit Normalpersonen verglichen werden und beobachtet werden, ob Konstellationen auftreten, die die Diagnostik besonders erschweren und ob ein Unterschied im Antikörperverlauf zwischen beiden Gruppen besteht. Durch die Beobachtung der Aviditätskinetik soll ein Eindruck über die Reifung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Verlauf erlangt werden. In Hinblick auf die bei Athleten gefundenen EBV-Reaktivierungen soll mit dieser Studie untersucht werden, ob eine solche Reaktivierung auch serologisch nachweisbar ist oder besondere serologische Antikörperkonstellationen nach sich zieht. Beide Studienteile haben zusammenfassend das Ziel herauszufinden, ob EBV-Infektionen bei Athleten eine besondere Rolle zukommt und die Verunsicherung bei betreuendem Personal und Athleten gerechtfertigt ist. Abschließend wäre es für zukünftige EBV-Serologie im Leistungssport sinnvoll, ein eindeutiges Testprocedere zur sicheren Diagnostik festzulegen, das als allgemeine Empfehlung helfen soll, Fehldiagnosen zu vermeiden.

15 2 Material und Methoden 2.1 Material Seren Im Rahmen der jährlichen sportmedizinischen Routineuntersuchung wurde bei Athleten der aktuell in Freiburg betreuten Disziplingruppen Biathlon, Skilanglauf, Nordische Kombination, Rad Straße, Rad Bahn und Mountainbike jeweils eine zusätzliche Blutprobe entnommen. Alle Athleten waren zum Zeitpunkt ihrer körperlichen Untersuchung und der Blutentnahme gesund und Mitglied im Landes- oder Bundeskader des zuständigen Sportfachverbandes. Um anschließend aus der Blutprobe das Serum zu erhalten, wurde die Probe für 15 min bei 4200 rpm zentrifugiert (Beckman CL-GPR Centrifuge). Die so gewonnenen 202 Seren der Gruppe Athleten der Querschnitt-Studie wurden bis zu ihrer Verwendung bei 20 C eingefroren. Die Seren der Kontrollgruppe stammen von Medizinstudenten des 5. und 6. Semesters, deren obligatorische Eingangsblutabnahmen für das virologische Praktikum im Sommersemester 2001 in gleicher Weise wie die Proben oben genannter Athleten verarbeitet wurden. Aus dem Kollektiv aller Studenten (n=270) wurden nach Befragung Probanden ausgeschlossen, die mehr als 8 Stunden Sport pro Woche treiben, rauchen oder die Einwilligung zur zusätzlichen Untersuchung ihrer Seren verweigerten, so dass danach die Kontrollgruppe 200 Probanden umfasste. Für das Athleten-Kollektiv der Longitudinal-Studie wurden bei 15 Bundeskader-Athleten der Disziplin Biathlon zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Saison insgesamt je 4-6 Seren gewonnen. Diese wurden ebenfalls zentrifugiert und bis zum Zeitpunkt der serologischen Untersuchung eingefroren. Die Kontrollgruppe der Longitudinal-Studie setzt sich aus 12 Studenten zusammen, die zu den im Intervall circa 4-6wöchigen Blutabnahmen in die Klinik bestellt wurden. Die Blutproben konnten so direkt weiter verarbeitet werden und wurden ebenfalls bis zum Zeitpunkt ihrer Verwendung bei 20 C eingefroren.

16 2 Material und Methoden - Material Testkit Lineassay In den Untersuchungen wurde der recomline-igg-assay der Firma Mikrogen GmbH, Martinsried verwendet. Dieser Lineassay wird in Packungen geliefert, deren Reagenzien für 50 Bestimmungen reichen. Jeder Reagenziensatz enthält: Zwei Röhrchen mit insgesamt 50 durchnummerierten Teststreifen, die mit Testantigenen beschichtet sind Wasch- / Verdünnungspuffer Konzentrat (100ml, zehnfach konzentriert, enthält Phosphat-Puffer, NaCl, KCl, Tween-20, 0,1% MIT, 0,2% Oxypyrion) Magermilchpulver (1x5g) Anti-human-IgG-Konjugat (12ml, zehnfach konzentriert) TMB Substratlösung, enthält 0,008% Kathon (2x 45ml) Gebrauchsinformation Auswertungsbögen Zusätzlich benötigt werden: Deionisiertes Wasser zum Verdünnen des Waschpuffers Absaugesystem mit Auffanggefäß für infektiöse Lösungen Schüttler (mit Longitudinal-Ausrichtung, 8-15 Bewegungen pro Minute) Pipetten, Mikropipetten für 2-10µl, 20µl und 2ml Messzylinder für 100 und 500ml Plastikpinzette zum Hantieren der Streifen Evtl. Hubpipette mit Glasflasche zum schnellen Aliquotieren des Waschpuffers Inkubationsschalen Optional kann die Abarbeitung des Lineassays auch maschinell erfolgen: Blot Automat Matec Apollo, Tecan ProfiBlot II N Immunfluoreszenzverfahren Zur Verwendung kamen hauseigene Burkitt-Lymphom-Zelllinien (Abteilung Virologie, Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg), welche das EBV-Genom

17 2 Material und Methoden - Methoden 12 tragen. Bei dem verwendeten Testkit handelt es sich um Objektträger, auf welche eine P3HR-1- Zellsuspension aufgebracht wurde. Die Zellen auf den Objektträgern wurden mit kaltem Aceton fixiert und permeabilisiert. Notwendige Seren: Negativkontrolle (1:40 vorverdünntes Serum eines EBV-negativen Blutspenders) Positivkontrolle (1:40 vorverdünntes Serum eines EBV-positiven Blutspenders) Zu testendes Serum (1:40 verdünnen) Folgende weitere Reagenzien werden benötigt: Pufferlösung zur Verdünnung des zu testenden Serums Waschlösung vorverdünnter Fluorescein-markierter Zweitantikörper: Ziege-anti-human-IgG Einbettmedium Elvanol Geräte Zur Abarbeitung der Proben wurden zwei Geräte verwendet: Matec Apollo Automat mit integriertem Scansystem zur quantitativen Erfassung der Antikörperkonzentrationen und Tecan ProfiBlot II N Automat zur reinen Abarbeitung der Proben ohne Scanmöglichkeit. Die Scanauswertung der mit dem Tecan bestimmten Lineassay-Streifen erfolgte mit einem herkömmlichen Scanner in München und einer speziell von der Firma Mikrogen entwickelten Software. 2.2 Methoden EBV-IgG-Lineassay Zur Verwendung kam der recomline EBV IgG der Mikrogen GmbH, Martinsried. Dieser Immunoassay verwendet rekombinant in E. coli produzierte Antigene gegen IgG Antikörper, die nach Aufreinigung auf die Teststreifen in gewünschter Reihenfolge aufgesprüht und fixiert werden. Er gilt als neuer Goldstandard in der EBV-Serologie (8). Als Testantigene dienen zwei Komponenten der Early Antigens (EAs: p54; p138) und des Viruskapsid Komplexes (VCAs: p23; p18), sowie ein nukleäres Antigen (EBNA-1 (p72)) und Immediate Early Antigen (BZLF-1). BZLF-1 wurde speziell für diese Studie aufgetragen und befindet sich nicht auf kommerziell erhältlichen Teststreifen.

18 2 Material und Methoden - Methoden 13 Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, hier wurde das durch 15minütige Zentrifugation (4200 rpm) gewonnene Serum verwendet. Die Verwendung von lipämischen, hämolysierten oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrund auf den Teststreifen ergeben. Diese Proben können zu verfälschten Ergebnissen führen und sollten daher nicht verwendet werden. Hitzeinaktivierte Proben können ebenso zu erhöhten Hintergrund- Reaktionen führen. Eine mikrobielle Kontamination der Proben ist unbedingt zu vermeiden, genauso wie wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben. A. Testvorbereitung Vor Testbeginn sind alle Bestandteile für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden bei 2-8 C gelagert. Für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte wird Waschpuffer benötigt. Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers in Abhängigkeit der Anzahl der gewünschten Teststreifen zu bestimmen. Bei 50 Ansätzen werden 1000ml gebrauchsfertiger Waschpuffer benötigt. Das Waschpufferkonzentrat wird mit Magermilchpulver (1g auf 20ml Konzentrat) versetzt und im Anschluss mit deionisiertem Wasser 1:10 verdünnt. Nicht benötigter Waschpuffer kann bis zu 4 Wochen bei 4 C aufbewahrt werden. Die IgG- Konjugatlösung ist unmittelbar vor dem Test herzustellen. Dazu wird ein Teil des IgG- Konjugat-Konzentrats mit 9 Teilen des Waschpuffers verdünnt (1+9). Die Substratlösung ist bereits gebrauchsfertig. B. Testdurchführung In jeder Vertiefung der Inkubationsschale findet ein Test statt, dazu werden 2ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers in jede Wanne pipettiert. Jeweils ein Teststreifen wird anschließend mit nach oben zeigender Streifennummerierung mit Hilfe einer Pinzette in die Vertiefungen gelegt, so dass der gesamte Streifen mit Flüssigkeit benetzt ist. Nun werden je Inkubationsansatz 20µl der unverdünnten Probe in die Vertiefung pipettiert. Die abgedeckte Inkubationsschale wird unter leichtem Schütteln für 1 Stunde inkubiert. Die in der Probe vorhandenen Antikörper können in dieser Zeit an die auf dem Streifen fixierten Antigene binden. Die Inkubationslösung wird nun aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt und im Anschluss werden diese insgesamt drei Mal mit 2ml Waschpuffer je Vertiefung im je 5minütigen Waschschritt gewaschen. Nun werden in jede Inkubationswanne 2ml der vorbereiteten IgG-Konjugatlösung gegeben und unter erneuter Abdeckung und Schütteln für 45 min inkubiert. So kann die Konjugatlösung (2.

19 2 Material und Methoden - Methoden 14 Antikörper, Anti-human-IgG) an die IgG Antigen-Antikörper Komplexe der ersten Inkubation binden (siehe Abbildung 1). Die Konjugatlösungen werden nach der Inkubation wieder abgesaugt. Die Teststreifen werden dann nach obigem Schema dreimal mit 2ml Waschpuffer gewaschen. Bei der nun folgenden dritten Inkubation werden je Vertiefung 1,5 ml der fertigen Substratlösung pipettiert und unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Substratlösung macht die Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem 2. Antikörper sichtbar (siehe Abbildung 1). Sobald die Cutoff-Kontrollbande zu sehen ist (standardisiert nach 10min) wird die Inkubationslösung abgesaugt und drei Mal mit deionisiertem Wasser nachgespült. Die Streifen werden nun mit einer Pinzette aus den Vertiefungen genommen und zum Trocknen für ca. 2 Stunden auf saugfähiges Papier gelegt. Alternativ können die Streifen auch in den Inkubationswannen belassen und zum Trocknen in einen Wärmeraum gelegt werden. Es ist darauf zu achten, dass die vor dem Test für die zu testenden Serumproben festgelegten Streifennummern eindeutig bleiben. Nach dem Trocknen können die Streifen auf die Auswertungsbögen aufgeklebt und protokolliert werden. Abbildung 1: Schematischer Aufbau des EBV-Lineassay: Im Serum vorhandene Antikörper binden an die auf dem Teststreifen fixierten EBV-Antigene und werden durch die Substratmarkierung eines sekundären Antikörpers als Banden sichtbar gemacht (hier ist exemplarisch eine länger zurückliegende Infektion abgebildet). C. Testauswertung Die Identifizierung der Banden erfolgt über die den Testkits beigelegten spezifischen Kontrollstreifen. Eine Auswertung der Streifen ist dann möglich, wenn folgende Kriterien

20 2 Material und Methoden - Methoden 15 erfüllt sind. Neben der Reaktionskontrollbande sollte die Konjugat-Kontrollbande (z.b. für das IgG Konjugat) eine deutliche dunkle Färbung zeigen. Außerdem sollte die Cutoff-Bande eine schwache, aber sichtbare Färbung aufweisen. Die Bewertung der Bandenintensität erfolgt in Relation zur Cutoff-Bande anhand Tabelle 1 und ist exemplarisch in Abbildung 2 dargestellt: Tabelle 1: Bewertung der Bandenintensität in Relation zur Cutoff-Bande Banden in Relation zur Cutoff Bande Intensität Negativ - schwächere Intensität (+) gleiche Intensität + leicht stärkere Intensität ++ stärkere Intensität +++ sehr starke Intensität ++++ Sobald auf den Streifen mindestens eine Bande der Intensität + zu sehen ist, kann ein Serum als EBV-reaktiv bezeichnet werden. Ein negatives Ergebnis liegt vor, falls keine Banden oder isolierte Banden der Intensität (+) sichtbar sind. Abbildung 2: exemplarische Bewertung der Bandenintensität in Relation zur Cutoff-Bande D. Testinterpretation Der EBV-Status ist meist durch Antikörper-Reaktivitäten gegen verschiedene Schlüsselantigene und das Auftreten von typischen Antigen-Bandenkonstellationen gekennzeichnet. Diese EBV

21 2 Material und Methoden - Methoden 16 Antigene und ihre Bedeutung bei der Bestimmung des EBV-Status sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Bedeutung der EBV-Antigene Antigen Name Klassifizierung Beurteilung des EBV-Status EBNA-1 (p72) Epstein-Barr nukleäres Antigen IgG-Titer fehlt regelmäßig bei Frischinfektionen, Marker für abgelaufene Infektionen p18 Virus Capsid Antigen IgG-Titer fehlt regelmäßig bei Frischinfektionen, Marker für abgelaufene Infektionen, auch bei Fehlen von EBNA-1 sehr häufig positiv p23 Virus Capsid Antigen Oft schon zu Beginn einer Infektion nachweisbar, bei abgelaufenen Infektionen sehr oft positiv p138 EA: Early Antigen IgG-Titer bei frischen Infektionen sehr häufig nachweisbar, schwache Titer bei abgelaufenen Infektionen möglich p54 EA: Early Antigen IgG-Titer bei frischen Infektionen sehr häufig nachweisbar, schwache Titer bei abgelaufenen Infektionen möglich BZLF-1 Immediate Early Antigen Bei Frischinfektionen nachweisbar, bei Immunsuppression stark erhöht vorhanden, sonst unspez. Seropositivitätsmarker Die Interpretation der serologischen Konstellationen der verschiedenen Antigene erlaubt dann eine Kategorisierung des EBV-Status. Grundsätzlich lässt sich der Serostatus in negativ, frisch (akut) und abgelaufen (länger zurückliegend) einteilen. Negativ: Seren werden als negativ bewertet, die keine oder deutlich schwächere Antikörperbanden als die Cutoff Bande bieten. Frisch: Bei Erstinfektionen (akut) sind die späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Antip18 noch negativ, Anti-p23, Anti-BZLF-1 und frühe Antikörper (Anti-p138, Anti-p54) sind einzeln oder in jeder möglichen Kombination nachweisbar. Abgelaufen (länger zurückliegend): Bei abgelaufenen, länger zurückliegenden Infektionen (ca. ab 3 Wochen nach Erstinfektion) bietet sich das Bild der positiven späten Marker Anti-EBNA-1 und Anti-p18 in Kombination mit positiver p23 Bande. Frühe Antikörper sind in einigen Fällen noch nachweisbar.

22 2 Material und Methoden - Methoden 17 Abbildung 3: exemplarische Beispiele der Lineassay Ergebnisse: Bandenkonstellation der häufigsten Serotypen (inklusive der aberrant zurückliegenden Infektion ohne Anti-p72-IgG (Anti-EBNA- 1-IgG) In Abbildung 3 sind die häufigsten Lineassay Ergebnisse mit den entsprechenden Bandenkonstellationen exemplarisch illustriert. In der Realität existiert eine hohe Variabilität der Antikörperbandenintensität und die dargestellten Fälle können in anderer Konstellation imponieren. Zur genaueren Analyse lassen sich weitere serologische Gruppen und Subgruppen voneinander abgrenzen, die aber in der Routinediagnostik teilweise nicht als besonderer Serostatus hervorgehoben werden und entsprechend selten vorkommen. Für diese Studie wurde diese Einteilung jedoch ergänzend verwendet: Unklar: Es erscheinen mehrere sehr schwache Banden der Intensität (+) oder parallel eine isolierte Bande der Intensität + und andere Banden sind negativ. Es könnte sich um eine Kontamination des Serums oder des Testansatzes handeln, eine gleichzeitige Wiederholung mit demselben Serum und ein Test eines Folgeserums nach ein bis zwei Wochen sollte durchgeführt werden.

23 2 Material und Methoden - Methoden 18 Kürzlich abgelaufen: Der späte Antikörper Anti-p18 kann neben den frühen Antikörpern schon vorhanden sein, Anti-EBNA-1 ist meist negativ, selten sehr schwach positiv. Kürzlich schließt etwa einen Zeitraum von mehreren Monaten ein. Auch hier ist eine Kontrolleinsendung nach 2-4 Wochen empfohlen. Länger zurückliegende Infektionen mit aberranter Antikörperkonstellation: Abgelaufen ohne Anti-EBNA-1-Bildung: Der späte Antikörper Anti-EBNA-1 (p72) ist nicht vorhanden, aber Anti-p18 ist nachweisbar, häufig in Kombination mit einer Anti-p23 Bande. Frühe Antikörper sind in einigen Fällen noch nachweisbar. Abgelaufen mit schwacher Anti-EBNA-1-Bildung: Der späte Antikörper Anti- EBNA-1 ist vorhanden, aber nur sehr schwach ((+)) nachweisbar. Die Banden Anti-p18 und Anti-p23 sind nachweisbar, frühe Antikörper in einigen Fällen noch vorhanden. Abgelaufen ohne Anti-p18: Anti-EBNA-1 ist positiv, Anti-p18 fehlt oder ist sehr schwach bei dieser Antikörper Konstellation. Die Anti-p23 Bande ist häufig positiv, frühe Antikörper können in einigen Fällen nachweisbar sein. Weitere abgelaufene Konstellationen: Sehr selten sind entweder Anti-EBNA-1 und Anti-p18 gemeinsam nicht nachweisbar (1/1000), oder Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 gemeinsam nicht vorhanden (1/5000), obwohl es sich um abgelaufene, länger zurückliegende EBV-Infektionen handelt. Ein negatives Ergebnis des Lineassay schließt die Möglichkeit einer EBV-Infektion nicht aus. Wenn die Serumprobe sehr früh nach erfolgter Infektion gewonnen wurde, sind evtl. noch keine nachweisbaren Antikörper gegen EBV-Antigene gebildet worden Aviditätsbestimmung im Lineassay Zur eindeutigen Diagnosestellung von seltenen aberranten serologischen Konstellationen und bei der Abgrenzung von akuten, kürzlich zurückliegenden und länger zurückliegenden Fällen wird die für die EBV-Diagnostik etablierte Methode (3;8;119;123) der Aviditätsbestimmung durchgeführt. Dazu wird parallel ein zweiter Testansatz des Lineassay je Serum benötigt und zunächst so verfahren, wie unter 2.2.1B beschrieben. Nach der ersten Inkubation werden die Seren für drei Minuten mit 2 ml einer 7 molaren Harnstofflösung inkubiert (Waschpuffer mit Harnstoff), wodurch sich niedrig-avide Antikörper durch die denaturierenden Eigenschaften aus ihren Bindungen lösen und nachfolgend durch die Waschschritte und das Absaugen entfernt werden. Hoch-avide Antikörper lassen sich dagegen nicht mehr aus ihren Bindungen verdrängen. Nach

24 2 Material und Methoden - Methoden 19 diesem Inkubationsschritt mit 7M Harnstoff wird die normale Abfolge des Lineassays fortgesetzt. Das Verhältnis zwischen der Intensität der Antikörper des normalen Ansatzes und der Antikörper des Aviditätsansatzes (Harnstoff) wird als Aviditätsindex bezeichnet. Um zwischen geringer und hoher Avidität zu unterscheiden, muss ein Aviditäts-Cutoff festgelegt werden. Für die in dieser Studie verwendete Scantechnik wurde für die IgG-Antikörper gegen EBNA-1 und p18 ein Index von 0,4, für p23-igg von 0,5 als Cutoff zwischen gering- und hochavide festgelegt. Diese Indices wurden durch arbeitsgruppeninterne Vorexperimente festgelegt und sind in Abbildung 4 abgebildet. Abbildung 4: Festlegung der Aviditätsindices durch arbeitsgruppeninterne Vorexperimente mit Seren von länger zurückliegenden und akuten Infektionen (für Anti-EBNA-1 und Anti-p18 wurde ein Index von 0,4, für Anti-p23 ein Index von 0,5 als Cutoff zwischen gering- und hoch-avide festgelegt) Die verschiedenen Serodiagnosen des Lineassays sind mit den typischen Aviditätsbefunden in Abbildung 5 exemplarisch dargestellt. In dieser Studie wurde die Aviditätsbestimmung besonders für die Unterscheidung von kürzlich zurückliegenden und länger zurückliegenden Infektionen bei negativer Anti-EBNA-1-Antwort herangezogen. Dabei gelten solche Infektionen als kürzlich zurückliegend, die eine geringe Avidität des Anti-p18-IgG aufweisen, wenn Anti-p18-IgG überhaupt schon positiv ist. Demgegenüber wird bei den länger zurückliegenden Infektionen ein positives hoch-avides Anti-p18-IgG gefordert. Außerdem werden zusätzlich selbst solche Fälle noch als kürzlich befundet, die zwar schon den späten Antikörper Anti-EBNA-1-IgG aufweisen, für den aber eine geringe Avidität gefunden wird. Der Antikörper Anti-p23-IgG ist bei den kürzlich zurückliegenden Infektionen meist niedrigavide, kann aber auch schon stärker gereift und damit hoch-avide sein (Index größer 0,5). Die

25 2 Material und Methoden - Methoden 20 Avidität von Anti-p23-IgG wurde nicht als Unterscheidungsmerkmal von kürzlich und länger zurückliegenden Infektionen herangezogen. Ein frische EBV-Infektion zeichnet sich durch eine geringe Avidität der nachweisbaren Antikörper aus, einzelne Antikörper wie die des EA-Komplexes können im Einzelfall schon stärker gereift und hoch-avide sein. Abbildung 5: exemplarische Beispiele der Lineassay Bandenkonstellation bei Aviditätsmessung der häufigsten Serotypen, besonders eignet sich die Aviditätsbestimmung zur Unterscheidung von akut frischen, kürzlichen und länger zurückliegenden EBV-Infektionen Die Aviditätsbestimmung der als unklar definierten Fälle war aufgrund der schwachen Antikörper Intensitäten nur eingeschränkt möglich und wurde nicht als diagnoseweisend verwendet. Nicht für alle primär im Lineassay getesteten Seren wurde auch ein Aviditätstest durchgeführt. Sowohl bei dem Kollektiv der Athleten als auch bei dem der Normalpersonen wurden alle Fälle nach dem ersten Durchgang analysiert und dann einige Fälle ausgewählt, die entweder uneindeutig frisch oder zurückliegend waren, oder so selten, dass eine Aviditätsbestimmung zusätzlichen Aufschluss über den Serostatus geben sollte. Für einige klassisch zurückliegende Fälle wurde die Avidität ebenfalls bestimmt, um methodische Fehler auszuschließen und die Theorie von hoch-aviden Antikörpern bei länger zurückliegenden Infektionen zu bestätigen.

26 2 Material und Methoden - Methoden 21 Für solche Athleten, die auch zum Kollektiv der Longitudinalstudie gehören, wurde für die Querschnittstudie der in der Longitudinalstudie erhobene Aviditätsbefund des ersten Serums verwendet Scantechnik, quantitative Bestimmung der Bandenintensität Durch die Scantechnik lassen sich die auf den Teststreifen vorhandenen Antikörper-Banden quantitativ erfassen. Zwei unterschiedliche Methoden wurden zur Datenerhebung angewendet. Die größte Anzahl der Lineassays wurde mit dem Gerät Apollo gescannt, welches in einem ersten Schritt die automatische Abarbeitung der Proben übernimmt, und in einem zweiten Schritt die entwickelten Banden mit einer integrierten Kamera fotografiert. Mit einem Windows-kompatiblen Betriebsprogramm des Apollo-Automaten werden die Amplitude und das Integral der optischen Dichte der Antikörper-Banden erfasst und gespeichert. Bei der anderen verwendeten Methode handelt es sich um einen herkömmlichen kommerziell erhältlichen Scanner, der die auf einem Papierbogen aufgeklebten entwickelten Teststreifen scannt. Die so erhaltenen Bilder werden mit einer eigens der Firma Mikrogen programmierten Software ausgewertet und ebenfalls werden Amplitude und Integral der optischen Dichte der Antikörper-Banden aufgezeichnet. A. Vergleich und Validierung der Scanmethodik Apollo vs. München In Abbildung 6 ist ersichtlich, dass zwischen den beiden Verfahren ein linearer Zusammenhang besteht, aber offensichtlich andere Werte gemessen werden. Der Unterschied zwischen beiden Methoden scheint durch einen Skalierungsfaktor korrigierbar. Insbesondere dann, wenn Banden im intensiveren Bereich lagen, wurde die Amplitude der Bande mit dem Scansystem München höher bewertet. Der Vergleich der beiden Methoden mit dem Bland-Altman Test (11) hat bestätigt, dass beide Methoden nicht die gleichen Werte messen, besonders dann nicht, wenn die vorhandenen Banden sehr intensiv sind. Die Werte sind so zwar nicht direkt vergleichbar, dennoch erlaubt jede Methode durch den Scan ein realistisches Abbild der Bandenintensität, eben mit unterschiedlicher Skalierung der gemessenen Amplitude. Es wurde bewusst darauf geachtet, dass für Vergleiche, beispielsweise der Kollektive, immer nur eine Scanmethode verwendet wurde. Ebenso wurden beide für die Aviditätsbestimmung notwendigen Scans eines Serums jeweils nur mit einem Scansystem durchgeführt.

27 2 Material und Methoden - Methoden 22 Abbildung 6: Korrelation der Scansysteme Apollo versus München für Antikörper-Amplituden von Anti- EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 (je 50 Fälle): die Messsysteme liefern unterschiedliche Werte der Amplituden, scheinen aber durch einen Skalierungsfakor korrelierend beschreibbar. Zur Verdeutlichung der gerade im intensiven Bereich höher erfassten Banden im Scan München ist zusätzlich die folgende Abbildung 7 aufgeführt. Abbildung 7: Beziehung zwischen Amplitudenwert Apollo und Amplitudenwert München für die Antikörper gegen EBNA-1, p18 und p23 (je 50 Fälle wurden als Referenz mit beiden Scanmethoden erfasst)

28 2 Material und Methoden - Methoden 23 Mit der Scantechnik in München wurden Bandenamplituden bis 400 ermittelt, mit dem Apollo Gerät bis 180. In solchen Abbildungen, die Scanergebnisse darstellen, findet sich dadurch eine unterschiedliche Skalierung der Ordinate, abhängig davon, mit welchem Scansystem der Teststreifen erfasst wurde. Bei der München-Methode mussten einige Scan-Werte korrigiert werden, da sie nicht den auf den Teststreifen abgebildeten Antikörper-Banden entsprachen, und entweder viel zu hohe oder zu niedrige Werte anzeigten. Es war nicht rekonstruierbar, ob es sich um einen Scanfehler oder eine Fehldokumentation gehandelt hat. Diese Fehlbestimmungen wurden dann anhand des Originalbefundes und in Abhängigkeit der Intensität der anderen gescannten Banden desselben Antikörpers angepasst, z.b. durch Mittelwertbildung aus dem vorangehenden und nachfolgenden Antikörper, je nachdem, welche Intensität mit dem Auge gefunden wurde. Außerdem wurden die Werte <10 mancher Testreihen nicht als positiv erfasst und als Null bezeichnet, da diese Werte als Hintergrundrauschen imponierten und auf dem Teststreifen nicht als korrelierende Bande gefunden wurden. B. Anwendung in Querschnittstudie Im Querschnitt-Teil wurden alle Fälle beider Kollektive mit dem Apollo Blotautomaten sowohl abgearbeitet als auch im Anschluss direkt gescannt. So wurde gewährleistet, dass die bei der statistischen Analyse (Vergleich der beiden Gruppen mit dem Mann-Whitney Test) betrachteten Scanwerte alle mit derselben Methode gewonnen wurden und vergleichbar waren. Die jeweils ersten Durchgänge der Aviditätsbestimmung wurden ebenfalls mit Apollo durchgeführt. Nur die zusätzlich im zweiten Durchgang bestimmten Aviditäten wurden mit dem Tecan Blotautomaten abgearbeitet und manuell in München gescannt. Diese Werte wurden nicht gemeinsam analysiert. C. Anwendung in Longitudinalstudie Die Methodik des Scanverfahrens bietet gerade für die Auswertung der Antikörper-Verläufe in der Longitudinalstudie neue Möglichkeiten zur genauen Beobachtung. Durch den Scan der Bandenintensität können auch geringe Unterschiede erfasst und quantifiziert werden. Die herkömmliche Beurteilung der Bandenintensität wie in Tabelle 1 dargestellt erlaubt nur eine kategorisierende Auswertung. Deshalb wurden alle Antikörpertiterverläufe durch die Scanmethodik quantifiziert und auch die Aviditätsbestimmungen anhand des Scans durchgeführt. Alle vorhandenen Lineassays der Longitudinal Studie wurden ausschließlich mit dem Blot Automaten Tecan abgearbeitet und in München gescannt und waren somit auch statistisch auswertbar.