Signaltransduktion. T-Zell Rezeptor-Komplex: Signalauslösung und Regulation

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1 Signaltransduktion Möglichkeiten der interzellulären Kommunikation Signalweiterleitung in die Zelle ( Transduktion ) Rezeptoren als Signalumwandler T-Zell Rezeptor-Komplex: Signalauslösung und Regulation - Aufbau des TZR - Aktivierung des TZR (proximale Ereignisse) - Regulation der proximalen Ereignisse am TZR (Csk, CD45, Lipid Rafts, Immunologische Synapse) Vom T-Zell Rezeptor ausgehende Signalwege - Ausbildung des Signalosoms zur Initiation distaler Signalwege - Calcium-Signal und assoziierte Signalwege (PL-C, PKC, NF-kB, NFAT) - MAP-Kinase Signalwege

2 Lodish et al. Molecular Cell Biology, W.H. Freeman and Comp.

3 Lodish et al. Molecular Cell Biology, W.H. Freeman and Comp.

4 Einteilung membranständiger Rezeptoren: 1. G-Protein gekoppelte Rezeptoren 2. Ionen Kanäle 3. Rezeptoren mit intrinsischer Enzymaktivität (S/T-Kinasen, Y-Kinasen, Phosphatasen) 4. Rezeptoren ohne intrinsische Enzymaktivität; sind mit Protein Tyr-Kinasen assoziiert (Cytokinrezeptor-Superfamilie) Lodish et al. Molecular Cell Biology, W.H. Freeman and Comp.

5 Phosphorylierung / Dephosphorylierung als wichtiges Mittel der Signalweitergabe Etwa 1/3 aller Proteine in Säugerzellen sind phosphoryliert Phosphorylierung ist häufigste posttranslationale Modifikation Verhältnis P-Ser : P-Thr : P-Tyr = 1800 : 200 : 1 Etwa 200 Kinasen (2-3% des Genoms) und 100 Phosphatasen sind bekannt

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8 Figure 6-9 Geladene Aminosäuren ITAM: Immunoreceptor tyrosine-based activation motive Tyr-X-X-Leu/Val-X Tyr-X-X-Leu/Val

9 Call & Wucherpfennig, Annu. Rev. Immunol ITAM

10 Call & Wucherpfennig, Annu. Rev. Immunol. 2005

11 Signaltransduktion Möglichkeiten der interzellulären Kommunikation Signalweiterleitung in die Zelle ( Transduktion ) Rezeptoren als Signalumwandler T-Zell Rezeptor-Komplex: Signalauslösung und Regulation - Aufbau des TZR - Aktivierung des TZR (proximale Ereignisse) - Regulation der proximalen Ereignisse am TZR (Csk, CD45, Lipid Rafts, Immunologische Synapse) Vom T-Zell Rezeptor ausgehende Signalwege - Ausbildung des Signalosoms zur Initiation distaler Signalwege - Calcium-Signal und assoziierte Signalwege (PL-C, PKC, NF-kB, NFAT) - MAP-Kinase Signalwege

12 Lck, Fyn, ZAP-70: Rezeptor-assoziierte Tyrosin-Kinasen (RTKs)

13 Wie wird Auslösung der proximalen TZR Signale reguliert? 1. Regulation der src-kinase Lck (Leukocyte-specific protein tyrosine kinase) Exkurs: Protein-Protein Wechselwirkungen durch SH2-und SH3-Domänen

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15 Regulation von lck durch csk (c-terminal src kinase) und CD45 Domänenstruktur von lck Aktive lck Inaktive lck

16 Regulation von lck durch csk (c-terminal src kinase) und CD45 (Autokatalytisches Y) (Inhibitorisches Y) Hermiston et al. Annu. Rev. Immunol auto-transphosphorylation

17 Holmes, Immunology, 2005

18 Tchilian & Beverley, TRENDS in Immunology, 2006

19 Was reguliert die Regulatoren? Naive T-Zelle Mehrere Tage Effektor-/Gedächtniszelle Hermiston et al. Annu. Rev. Immunol. 2003

20 Aktivierung des T-Zell Rezeptors führt zur Aggregation von Lipid Rafts und zur Ausbildung der Immunologischen Synapse Huppa & Davies, Nature Reviews Immunology, 2006

21 Lipid rafts ( Flöße ): reich an Cholesterol, Glykolipiden, gesättigten Fettsäuren Bilden dynamische Strukturen Extraktion von Cholesterol inhibiert T-Zell Rezeptor Signal

22 Integrin-vermittelter Kontakt zwischen T-Zelle und APC LFA-1: Lymphocyte function-associated antigen (ein Integrin) ICAM-1: Intercellular adhesion molecule (ein Adhesionsmolekül)

23 SMAC = Supramolecular Activation Cluster

24 Aktivierung des T-Zell Rezeptors führt zur Aggregation von Lipid Rafts und zur Ausbildung der Immunologischen Synapse (SMAC = Supramolecular Activation Clusters) CD45 wird ausgeschlossen

25 Huppa & Davies, Nature Reviews Immunology, 2006

26 Zusammenfassung der proximalen Ereignisse am T-Zell Rezeptor Expression und Dimerisierung kleiner CD45 Isoformen in aktivierten T-Zellen (enzymatisch inaktiv) Hemmung Aktivierung CD45 CD45 Monomer enzymatisch aktiv große Isoformen auf naiven T-Zellen Lck (Leukocyte-specific protein tyrosine kinase) Csk (c-terminal src kinase) Regulation durch Subzelluläre Lokalisation, Phosphatasen Trennung vom TZR bei Bildung der immunologischen Synapse Auto-trans-Phosphorylierung Phosphorylierung ITAMs Rekrutierung von ZAP-70 Phosphorylierung ZAP-70 (Zeta-assoziiertes Protein 70)

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28 Modulärer Aufbau von ZAP-70

29 Die Bildung des Signalosoms am T-Zell Rezeptor Signalosom ZAP-70: Zeta-assoziiertes Protein 70; Aktivierung durch src-vermittelte Phosphorylierung LAT (linker of activation in T cells), SLP67, GADS: Adaptermoleküle SLP-76: SH2 domain containing leukocyte phosphoprotein of 76 kda. Itk (Familie der Tec-Kinasen): Phosphoryliert PLC-γ

30 Aktive Phospholipase C erzeugt 2 wichtige Signalmoleküle: Inositol-tris-phosphat und Diacylglycerin

31 Zellulärer Calcium-Flux Calcium-release-activated calcium channel (CRAC) SERCA: Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca-ATPase pump PMCA: Plasma membrane Ca-ATPase pump NCX: Na-Ca exchanger

32 Das cytoplasmatische Calcium-Signal spiegelt den Aktivierungszustand der T-Zelle wider!

33 Koppelung des Ca-Signals zwischen ER und Plasmamembran: STIM1 and Orai1 STIM1 Orai1

34 Koppelung des Ca-Signals zwischen ER und Plasmamembran: STIM1 and Orai1

35 Aktivierung des Nuclear Factor of Activated T Cells durch das Calcium-Signal

36 Aktivierung des Nuclear Factor Kappa B durch das Calcium/DAG-Signal Proteasom

37 Die Bildung des Signalosoms am T-Zell Rezeptor ZAP-70: Zeta-assoziiertes Protein 70; Aktivierung durch src-vermittelte Phosphorylierung LAT (linker of activation in T cells), SLP67, GADS: Adaptermoleküle Itk (Familie der Tec-Kinasen): Phosphoryliert PLC-γ

38 Kleine GTP-bindende Proteine (G-Proteine) als Schalter der MAP-Kinase Kaskade GEF: Guanosine exchange factor GAP: GTPase activating protein MAP-Kinase Kaskade

39 Figure 6-17

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42 Das TCR Signal reicht nicht aus zur Aktivierung naiver T-Zellen

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45 CD28 liefert das 2. Signal durch Bindung von CD80 und CD86 auf professionellen APC

46 Signal 2 alleine: Kein Effekt auf T-Zelle TCR Signal alleine: ANERGIE (funktionelle Inaktivierung)

47 CD28 Signale verstärken TCR Signale quantitativ

48 CTLA-4 (CD152) generiert hemmendes Signal in der T-Zelle

49 Phorbolester Cytoplasma Peptid-MHC-Komplex TCR-CD3- Komplex PIP2: Phosphatidyl-Inositol-Bisphosphat IP3: Inositol-Trisphosphat DAG: Diacyl-Glycerin GEF: Guanine exchange factor K: Kinase PKC: Protein KinaseC MAP-K: Mitogen activated protein kinase DAG PIP2 PKC ZAP-70 P P IκB-NF-κB IP3 Phospholipase C P Cyclosporin A GEF P Proteasom IκB + NF-κB Ca 2+ Cyclosporin A - Immunophilin Ca 2+ -Calmodulin P Calcineurin - NFAT G-Protein MAP-KKK MAP-KK P NFAT MAP-K P NF-κB Zellkern NFAT P AP-1 AP-1 Genaktivierung Cytokinproduktion/Zellteilung

50 Übungsfragen zu Gentransfer und Signaltransduktion SS 2011 (Michael Stassen) Wie könnte man gezielt ein Gen nur in den T-Zellen einer Maus zerstören? Skizzieren Sie eine Strategie, die es erlaubt, Dendritische Zellen der Maus mit Hilfe des gene targeting zu markieren und zu eliminieren. Nutzen Sie die Tatsache, daß Dendritische Zellen das Integrin CD11c exprimieren. Nach Aktivierung von T-Zellen über den T-Zell Rezeptor-Komplex spielt Ca2+ eine wichtige Rolle als Signalmolekül. Skizzieren Sie: a) Die Auslösung des initialen Ca2+-Stromes durch das T-Zell Rezeptor Signal b) Die einzelnen Ströme, aus denen sich der Gesamtstrom von Ca2+ in das Cytoplasma zusammensetzt. Geben Sie auch die Konzentrationen und Gradienten für Ca2+-Ionen in den entscheidenden zellulären Kompartimenten und der extrazellulären Flüssigkeit an. c) Wichtige Signalmoleküle / Transkriptionsfaktoren, die durch Ca2+ aktiviert werden Skizzieren Sie die wichtigsten proximalen Ereignisse am T-Zell Rezeptor, die zur Aktivierung von ZAP-70 führen. Welche Rolle spielen hierbei lck, csk und CD45 und wie kann CD45 selbst reguliert werden? Phorbolester sind Substanzen, die Diacylglycerin in seiner Wirkungsweise ersetzen können. Oft werden sie mit Substanzen kombiniert ( Calcium-Ionophore ), die zu einem Einstrom von Calcium- Ionen in die Zelle führen. Skizzieren Sie die Signalwege (bis in den Zellkern), die in T-Zellen bei gleichzeitiger Behandlung mit Phorbolestern und Calcium-Ionophoren aktiviert werden. Das cyclische Polypeptid Cyclosporin A wird wegen seiner immunsuppressiven Wirkung zur Verhinderung von Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen eingesetzt. Erklären Sie die Wirkungsweise von Cyclosporin A. An dem Prozeß der Aktivierung von T-Zellen ist das Zeta-assoziierte Protein 70 (ZAP-70) entscheidend beteiligt. Skizzieren Sie die wichtigsten Signalwege, die von aktiviertem ZAP-70 angeschaltet werden.