Funktionelle Charakterisierung von Typ-III Effektorproteinen in Pflanzen

Transkript

1 Funktionelle Charakterisierung von Typ-III Effektorproteinen in Pflanzen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Şuayıb Üstün aus Krefeld

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth Gutachter: Prof. Dr. Frederik Börnke Prof. Dr. Andreas Burkovski

3 Söylediklerine dikkat et; düşüncelere dönüşür. Düşüncelerine dikkat et; duygularına dönüşür. Duygularına dikkat et; davranışlarına dönüşür. Davranışlarına dikkat et; alışkanlıklarına dönüşür. Alışkanlıklarına dikkat et; değerlerine dönüşür. Değerlerine dikkat et; karakterine dönüşür. Karakterine dikkat et; kaderine dönüşür Achte auf Deine Worte, denn sie werden zu Gedanken. Achte auf Deine Gedanken, denn sie werden zu Gefühlen. Achte auf Deine Gefühle, denn sie werden Handlungen. Achte auf Deine Handlungen, denn sie werden Gewohnheiten. Achte auf Deine Gewohnheiten, denn sie werden Dein Charakter. Achte auf Deinen Charakter, denn er wird dein Schicksal. Mahatma Gandhi

4 Teile dieser Arbeit sind in folgenden Publikationen enthalten: Üstün S, Bartetzko V, Börnke F (2013) The Xanthomonas campestris Type III Effector XopJ Targets the Host Cell Proteasome to Suppress Salicylic-Acid Mediated Plant Defence. PLoS Pathog 9: e Üstün S, Müller P, Palmisano R, Hensel M, Börnke F (2012) SseF, a type III effector protein from the mammalian pathogen Salmonella enterica, requires resistance-gene-mediated signalling to activate cell death in the model plant Nicotiana benthamiana. New Phytol 194:

5 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung... 1 Summary Einleitung Das pflanzliche Immunsystem Die basale Abwehr - PAMP-vermittelte Immunität (PTI) PRRs Ereignisse während PTI Regulation der PTI Pathogene währen sich: Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren Gram-negativer Bakterien Das Typ-III-Sekretionssystem Typ-III Effektorproteine und ihre Funktion Effektoren die Plasmamembran Komponenten zum Ziel haben MAPK Signalweg Transkription Vesikeltransport R-Protein-vermittelte Abwehr von Pflanzen Effektor-vermittelte Abwehr Rolle der R-Proteine in der ETI R-Protein Stabilität und genetische Voraussetzung für die ETI Gemeinsamkeiten der ETI und PTI Rolle der Salizylsäure in der Pathogenabwehr Das Pflanzenpathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria YopJ-Familie XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Zielsetzung dieser Arbeit Material und Methoden Material Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien Antikörper Oligonukleotide und Sequenzierungen Vektoren Bakterienstämme Hefestämme Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen Methoden Pflanzentransformation Transiente Transformation von Nicotiana benthamiana Virus-induziertes gene silencing (VIGS) in N. benthamiana und Paprika Mikrobiologische Methoden Bakterienanzucht Anzucht und Transformation von Hefe Infektion von Paprika oder N. benthamiana Pflanzen mit Xcv Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standardmethoden Ortsgerichtete Mutagenese Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen... 36

6 DNAse Verdau und cdna Synthese Quantitative Real-time PCR (qrt-pcr) Triparentale Konjugation Biochemische und physiologische Methoden Induktion und Aufreinigung von affinitätsmarkierten Proteinen aus E. coli GFP-Trap aus N. benthamiana für Koimmunpräzipitation In vitro Ko-Immunopräzipitation Proteingelelektrophorese und Western Blot Western Blot-Stripping Bestimmung der Proteasom-und Cystein-Proteaseaktivität Bestimmung des Xcv Wachstum in planta Messung der Ionen-Leckage Bestimmung der Gehalte an Salizylsäure Mikroskopische Methoden und histologische Färbungen Anilin-Blau Färbung von Arabidopsis thaliana-blättern Trypanblau Färbung Konfokale Laserscanning Mikroskopie (KLSM) Ergebnisse XopJ In planta Interaktion von XopJ und Mutanten mit RPT In vitro Interaktion von XopJ und RPT Spezifische Inhibition des Proteasoms durch XopJ Rekombinantes XopJ inhibiert Proteasomaktivität in Pflanzenextrakten Virulenzfunktion des Xcv Effektors XopJ in einer kompatiblen Interaktion Einfluss des Effektorproteins XopJ auf die Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Paprika (Capsicum annuum ECW) Interaktion Erhöhte Proteasomaktivität während der Xcv-Paprika Interaktion Verlust von XopJ löst Nekrosen in Paprika aus Phänotypische Veränderungen in Paprikablätter nach Xcv Infektion Inhibition des Proteasoms vermindert die Zelltod-Reaktion in Paprika Funktion von RPT6 während der kompatiblen Interaktion XopJ supprimiert SA-abhängige Abwehrantworten in einer kompatiblen Interaktion Messung der SA Gehalte in Xcv infizierten Paprika Pflanzen Exogene SA Behandlung imitiert den von Xcv ΔxopJ-ausgelösten Phänotyp in Paprika Expressionsanalyse von SA- und Seneszenz-abhängigen Markergenen Besteht ein Zusammenhang zwischen dem Proteasom und der SA-vermittelten Antwort? SA stimuliert die Proteasomaktivität und RPT6 Genexpression Die Inhibition des Proteasoms durch XopJ führt zur Akkumulation von NPR Verminderung der NPR1 und ICS mrna-menge in N. benthamiana und Paprika Einfluss des Proteasoms auf basale Abwehrantworten Modifikation von Rpt6 durch XopJ Identifizierung von XopJ-ähnlichen Typ-III Effektoren PopJ ist ein XopJ-Homolog mit hoher Sequenzidentität PopJ interagiert mit RPT6 in Hefe Lokalisierung von PopJ in N. benthamiana In planta Interaktionsnachweis zwischen PopJ und RPT Analysen zum Einfluss von PopJ auf die Proteasomaktivität in N. benthamiana... 88

7 3.3 Analyse der SseF-abhängigen HR in N. benthamiana Beeinflussung der SseF-induzierten HR in N. benthamiana Pflanzen mit verminderter endogenen NDR1 und EDS1 Tranksriptmengen Translokation des Salmonella Effektorproteins SseF über das Xanthomonas T3SS Erstellung des chimären AvrRpt2-SseF Konstrukts und Test auf Funktionalität Die Translokation der AvrRpt2-SseF Fusion über das T3SS von Xcv löst HRähnliche Antworten in N. benthamiana aus Einfluss der Sekretion des AvrRpt2-SseF Proteins während der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika Mutationsanalyse von SseF Die Interaktion von Salmonella mit N. benthamiana Diskussion Xcv Typ-III Effektorprotein XopJ XopJ interagiert mit der Proteasomuntereinheit RPT6 in vivo und in vitro zur Beeinträchtigung der Proteasomaktivität Verzögerung der Nekrose-Bildung durch die XopJ-abhängige Inhibition des Proteasoms in der kompatiblen Interaktion von Xcv mit Paprika Beeinträchtigung der SA- und Seneszenz-abhängigen Antworten durch XopJ Destabilisierung von RPT6 durch XopJ PopJ ist ein XopJ-Homolog aus Pseudomonas syringae pv. lachrymans Hohe Sequenzidentität von XopJ und PopJ PopJ lokalisiert an der Plasmamembran Inhibition des Proteasoms durch die in planta Interaktion von PopJ und RPT Das Typ-III Effektorprotein SseF aus dem Tierpathogen Salmonella löst Immunreaktionen in Pflanzen aus Die SseF-induzierte HR ist abhängig von NDR Deletionen in der Transmembran-Domäne 2 führen zum Verlust der Erkennung von SseF in planta Salmonella löst keine HR-ähnlichen Symptome auf N. benthamiana aus Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis

8 ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Viele Gram-negative, für Pflanzen oder Tiere pathogene Bakterien verwenden ein Typ-III- Sekretionssystem (T3SS) um sog. Typ-III Effektorproteine (T3E) in das Zytoplasma ihrer eukaryotischen Wirtszelle zu translozieren. Diese Effektorproteine können als Virulenz- Faktoren wirken indem sie im Wirtsorganismus Veränderungen zum Vorteil des Pathogens hervorrufen. Prozesse und Zielstrukturen, die Effektoren sowohl in Pflanzen als auch in tierischen Zellen angreifen beinhalten z.b. das Zytoskelett, Abwehr- und Hormonantworten, die Ubiquitinierung, Transkription und den Vesikeltransport. Um sich gegen Pathogene zu schützen besitzen Pflanzen wie auch Tiere ein komplexes Immunsystem, das konservierte Moleküle der Pathogene erkennt, die als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogenassociated molecular patterns; PAMPs) bezeichnet werden. Die hierdurch ausgelöste Abwehrform wird in Pflanzen als PAMP-vermittelte Immunität (PAMP-triggered immunity; PTI) bezeichnet und bildet die erste Abwehrebene. Jedoch sind Pflanzenpathogene in der Lage die PTI durch die Translokation von Effektorproteinen zu unterdrücken. Als Antwort auf diese Effektoren entwickelten Pflanzen Resistenz-(R)-Proteine, die T3E spezifisch erkennen können und damit die sogenannte Effektor-vermittelte Immunität (effector-triggered immunity; ETI) aktivieren, die in Form von einem lokalisierten Zelltod, der Hypersensitiven Reaktion (HR), bakterielles Wachstum unterbinden kann. Für die Mehrzahl der bekannten T3E sind die Zielmoleküle innerhalb der Wirtszelle bisher nicht identifiziert. Die funktionelle Analyse von Effektorproteinen stellt daher einen wichtigen Baustein zum Verständnis von Virulenzstrategien bzw. von Abwehrmechanismen in eukaryontischen Wirtszellen da, wobei sich durch systemübergreifende Ansätze Gemeinsamkeiten in beiden Prozessen zwischen den Organismenreichen identifizieren lassen sollten.ein Typ-III Effektor, der pflanzliche Abwehrprozesse unterdrücken kann, ist XopJ aus dem phytopathogenen Bakterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte ermittelt werden welchen Einfluss die Interaktion von XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6 und der damit einhegenden Inhibition der Proteasomaktivität während einer Infektion von Paprika Pflanzen mit Xanthomonas campestris pv. vesicatoria besitzt. In planta und in vitro Interaktionsanalysen von XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6 bestätigten eine spezifische Interaktion beider Proteine. Die Wechselwirkung beider Proteine an der Plasmamembran führte zu einer spezifischen Inhibition der Proteasomaktivität, die neben der Chymotrypsin-Aktivität auch die Caspase-ähnliche, d.h. zelltod-regulierende Aktivität des Proteasoms miteinschließt. In der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas mit Paprika agiert XopJ als ein Virluenz-Faktor, der das bakterielle Wachstum begünstigt und die Ausbildung von Nekrosen verzögert. Daher sind Xcv ΔxopJ Mutanten im Wachstum beeinträchtigt und führten zu einer schnelleren Symptom-Entwicklung, die mit einer Nekrose 1

9 ZUSAMMENFASSUNG in suszeptiblen Paprika Blätter einherging. Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 stellte die Fähigkeit von Xcv ΔxopJ wieder her, die Symptom-Entwicklung zu verzögern und deutet darauf hin, dass die Inhibition des Proteasoms durch XopJ eine Reduzierung der Symptomentwicklung zur Folge hat. Demnach korrelierte die XopJabhängige Verzögerung der Wirts-Zelltod-Reaktion mit einem verminderten Salizylsäure (SA)-Gehalt, einschließlich veränderter SA- und Seneszenz-assoziierter Genexpression, und abgeschwächter Proteasomaktivität während einer Infektion. Die Inhibition des Proteasoms unterdrückt auch basale Abwehr-Antworten wie die Sekretion von Proteinen oder Callose- Ablagerung und ist eine weitere Erklärung dafür wie XopJ Zellwand-basierte Abwehrreaktion supprimiert. Darüberhinaus konnte ein Zusammenhang zwischen der Proteasom-Aktivität und der SA-vermittelten Abwehrantwort erstellt werden, da die Herunterregulierung der Genexpression von NPR1, einem zentralen Regulator der SA Signalantwort, die Nekrose- Bildung nach Infektion mit Xcv ΔxopJ ausblieb. Die Infektion dieser Pflanzen löste keine Induktion der Proteasomaktivität auf und festigt die Annahme, dass die SA- Signalweiterleitung für die Aktivität des Proteasoms von essentieller Bedeutung ist. Der Mechanismus wie die Interaktion von XopJ und RPT6 die Proteasomaktivität beeinflusst ist noch nicht klar, dennoch gibt es Anzeichen, dass XopJ RPT6 an die Plasmamembran rekrutiert um eine Proteasom-unabhängige Degradierung von RPT6 zu fördern. Die anschließende Inhibition des Proteasmoms beeinträchtigt daraufhin SA-abhängige Abwehrantworten um die Wirts-Zelltod-Reaktion zu unterdrücken. Neben XopJ sollten im Rahmen dieser Arbeit auch andere Effektoren der YopJ-Familie identifiziert werden, die das Proteasom als Zielstruktur besitzen. Dabei konnte durch eine komparative Analyse ein XopJ-Homolog, der T3E PopJ aus Pseudomonas syringae pv. lachrymans entdeckt werden, der auch mit RPT6 in planta und Hefe interagiert. Wie XopJ besitzt PopJ eine charakteristische katalytische Triade und gehört damit zur YopJ- Superfamilie der Effektoren und ist durch sein Myristoylierungsmotiv an der Plasmamembran verankert. Die Interaktion mit RPT6 konnte mittels Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) auch an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Neben der strukturellen Konservierung scheint auch die Funktion beider Effektoren konserviert zu sein, da auch PopJ abhängig von dessen katalytischen Triade und Myristoylierung, die Proteasomaktivität reduzieren kann. Damit stellt die Manipulation des Proteasoms möglicherweise eine generelle Virulenz-Strategie unterschiedlich adaptierter Pathogene dar. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit sollte durch einen system-übergreifenden Ansatz Typ-III Effektorproteine aus Tierpathogenen gefunden werden, die Immunreaktion in Pflanzen auslösen und möglicherweise konservierte Funktionen besitzen. Hierbei wurde SseF, ein T3E aus Salmonella enterica, identifiziert, der aktiv durch das pflanzliche Immunsystem wahrgenommen wird. Dabei löste SseF eine HR-ähnliche Antwort in N. benthamiana aus, 2

10 ZUSAMMENFASSUNG sowohl nach transienter Expression durch Agrobakterien-vermittelte Transformation, als auch nach Translokation über das T3SS von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Die beobachtete HR-ähnliche Reaktion war möglicherweise von einem R-Protein der Klasse CC- NB-LRR abhängig. Die Translokation der AvrRpt2-SseF Fusion über das T3SS von Xcv führte zu einem reduzierten Wachstum dieser Bakterien in N. benthamiana, die aber in einer kompatiblen Interaktion mit Paprika Pflanzen zu einer beschleunigten Symptomentwicklung und erhöhten Virulenz beitrugen. Eine Mutationsanalyse ergab, dass die Region die für die Virulenz-Funktion in menschlichen Zellen erforderlich, für die Avirulenz-Funktion in pflanzlichen Zellen verantwortlich ist, was darauf hindeutet, dass die Funktion bzw. das Zielprotein system-übergreifend konserviert sein könnte. 3

11 SUMMARY Summary Many Gram-negative pathogenic bacteria of plants and animals use a type III secretion system (T3SS) to translocate type III effector proteins (T3Es) into the cytoplasm of their eukaryotic host cell. Type III effectors (T3Es) are able to act as virulence factors that effect changes in host cells to promote pathogen survival. Common effector target processes and structures in both animal and plant host cells include the cytoskeleton, defence and hormonal signalling, ubiquitination, gene expression, and vesicle trafficking. To protect themselves from pathogens, plant and animals possess a complex immune system that perceives conserved molecules of pathogens, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). This form of basal defence is termed PAMP-triggered immunity (PTI), which represents the first layer of defence. However, T3Es of phytopathogens are able to suppress the PTI. In turn, plants have evolved resistance (R) proteins that can recognize specific T3Es to induce an effector triggered immunity (ETI) that is often accompanied by rapid, localized cell death, termed the hypersensitive response (HR), which eventually restricts bacterial spread. Target proteins of many T3E remain mostly unknown. Thus, the functional analysis of effector proteins represents an essential tool to understand virulence strategies and defence mechanisms of eukaryotic host cells, while commonalities across kingdoms should be expected. One of the T3Es suppressing defense mechanisms is XopJ from the plant pathogenic bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). The focus of the first part of this study was, how the interaction of XopJ and the proteasome subunit RPT6 influence the compatible interaction of Xcv and pepper plants. In planta and in vitro interaction studies confirmed a specific interaction of both proteins. The interaction of XopJ and RPT6 at the plasmamembrane resulted in a specific inhibition of the chymotrypsin- and caspase-like activity of the proteasome. During the compatible interaction of Xcv with pepper XopJ acts as a virulence factor promoting bacterial growth and delaying the onset of necrosis. Thus, Xcv ΔxopJ mutants are impaired in growth and display accelerated symptom development including tissue necrosis on susceptible pepper leaves. Application of the proteasome inhibitor MG132 restored the ability of Xcv ΔxopJ to attenuate the development of leaf necrosis. The XopJ dependent delay of tissue degeneration correlates with decreased levels of salicylic acid (SA), including changes in SA- and senescence associated gene expression, and attenuated proteasome activity during Xcv infection. The inhibition of the proteasome by MG132 prevents basal defence responses such as callose deposition and protein secretion explaining how XopJ is able to suppress cell wall-associated defence responses. Moreover, necrosis upon infection with Xcv ΔxopJ was greatly reduced in pepper plants silenced fpr NPR1, a central regulator of SA responses, demonstrating the involvement of SA-signalling in the development of XopJ dependent phenotypes. Despite the fact that the 4

12 SUMMARY mechanism of how the interaction of XopJ and RPT6 inhibits the proteasome activity remains unclear, there is growing evidence that XopJ recruits RPT6 to the plasmamembrane to trigger its proteasome-independent degradation. This results in an inactivation of the proteasome to interfere with SA-dependent defence reactions to suppress host cell death reactions. Another aim of this study was to identify other YopJ-like effectors that are able to target the proteasome. Thereby, a comparative approach revealed a novel XopJ-like protein, the T3E PopJ from Pseudomonas syringae pv. lachrymans, interacting with RPT6 in planta and yeast. PopJ also contains a catalytic triade and hence belongs to the YopJ superfamily of effector proteins. PopJ is localised to the plasmamembrane in a myristoylation-dependent manner. Furthermore, BiFC analysis revealed a clear interaction of PopJ and RPT6 at the plasmamembran similar to the XopJ-RPT6 interaction. PopJ is also able to inhibit the proteasome activity dependent on its catalytic triade and correct localization indicating that alongside with the structural conservation there is a functional conservation of XopJ and PopJ. Therefore, the manipulation of the proteasome seems to be a convenient virulence strategy for pathogens that are adapted to different host plants. The focus of the last part of this thesis was to identify T3E from animal pathogens that trigger immune responses across kingdoms, in particular in plants, and hence probably exhibit conserved functions. This approach revealed that T3E SseF from Salmonella enterica is actively recognized by the plant immune system. SseF induced HR-like responses in N. benthamiana, either when transiently expressed in leaves of N. benthamiana by Agrobacterium tumefaciens infiltration or when delivered by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) through the type III secretion system. The observed HR-like reaction was probably medieated by a yet unknown CC-NB-LRR resistance protein. Xcv translocating an AvrRpt2 SseF fusion protein was restricted in multiplication within leaves of N. benthamiana. Bacterial growth was not impaired but symptom development was rather accelerated in a compatible interaction with susceptible pepper plants. Furthermore, functional dissection of SseF revealed, that the region being essential for the virulence function in human cells, seems to be responsible for the avirulence function in plant cells, indicating a cross-kingdom conservation of SseF function. 5

13 EINLEITUNG 1 Einleitung 1.1 Das pflanzliche Immunsystem Pflanzen sind die wichtigste Lebens- und Energiegrundlage für zahlreiche heterotrophe Lebewesen. Durch die Photosynthese können Pflanzen anorganischen Kohlenstoff assimilieren und diesen in Form von Kohlehydraten als eine Energiequelle für andere Organismen nutzbar machen. Dabei benötigen Pflanzen Licht, Wasser und Mineralien. Aufgrund ihrer sessilen Lebensweise besteht für Pflanzen jedoch ständig die Notwendigkeit sich an variierende Umweltbedingungen mit ihren abiotischen als auch biotischen Stressfaktoren anzupassen. Unter biotischem Stress sind Pflanzen vor allem Phytopathogenen wie Bakterien, Pilzen, Viren, Oomyceten oder auch Insekten bzw. Herbivoren ausgesetzt und müssen sich gegen diese Schadorganismen zur Wehr setzten. Doch wie schon Charles Darwin feststelle, sind nur Individuen, die besser an ihre Umwelt angepasst sind, in der Lage zu überleben und ihre vorteilhaften Eigenschaften an ihre Nachkommen zu vererben (Darwin, 1859). Auch Pflanzen und deren Pathogene stehen in einem permanenten Wettstreit. Jede Seite konkurriert darum effektive molekulare Waffen zu entwickeln um seinen Feind zu besiegen. Deshalb hat die Fähigkeit pathogene Mikroorganismen zu detektieren und Abwehrantworten einzuleiten während der Evolution von Pflanzen zu einem Selektionsvorteil geführt. Interessanterweise erfolgte die Etablierung erster Landpflanzen durch die Interaktion mit symbiotischen Pilzen, was vermutlich auf eine Koevolution von Mikroben und Pflanzen seit deren Besiedlung von Landmassen hindeutet (Gehrig et al., 1996). Seit jeher sind Pflanzen ständig pathogenen Organismen ausgesetzt und evolvierten ein raffiniertes, mehrschichtiges Immunsystem zur Erkennung eindringender Schadorganismen. Da Pflanzen, im Gegensatz zu Vertebraten kein adaptives und erworbenes Immunsystem besitzen müssen sie sich stattdessen auf ihre angeborene Immunität verlassen (Jones & Dangl, 2006). Dabei stützen sie sich auf ein großes Repertoire an bereits existierenden Immunrezeptoren, die lokale und systemische Immunantworten nach einer Infektion auslösen können (Chisholm et al., 2006). Normalerweise, ist die Abwehr von pathogenen Mikroorganismen sehr effektiv, da die Mehrzahl von Pathogenen durch eine dauerhafte Nicht-Wirts-Resistenz abgewehrt wird (Nürnberger et al., 2004). Weiterhin kann diese Form der Resistenz in zwei Typen unterteilt werden. Bei der Nicht-Wirts-Resistenz des Typ I sind nach Pathogenbefall keine sichtbaren Symptome an der Pflanze zu beobachten. 6

14 EINLEITUNG Hier können die Mikroorganismen, physikalische Barrieren nicht durchdringen oder induzieren in Pflanzen mehrere Abwehrprozesse, die das Pathogen wirksam bekämpfen (Mysore & Ryu, 2004). Zum Typ II der Nicht-Wirts-Resistenz zählt man Abwehrantworten, welche immer mit einer Nekrose am Infektionsort eingeleitet werden (Alfano & Collmer, 2004; Mysore & Ryu, 2004)(Abbildung 1.1). Zur Nicht-Wirts- Resistenz kann man das bereits vorhandene angeborene Immunsystem zählen, welches in verschiedene Abwehrstufen unterteilt werden kann. Hier ist neben der präformierten, konstitutiven Abwehr an der Zelloberfläche auch die induzierte Abwehr involviert. Die präformierte Abwehr beinhaltet neben mechanischen und strukturellen Barrieren (Kutikula, Trichome und Zellwände), auch toxisch wirkende Sekundärmetabolite wie Saponine oder Glukosinolate (Fu & Dong, 2013). Wird diese konstitutive Abwehr überwunden ist das Pathogen induzierten Abwehrmechanismen ausgesetzt. Dabei handelt es sich um die Fähigkeit der Pflanze Moleküle pathogener Mikroorganismen als fremdartig zu erkennen und die induzierte Immunabwehr einzuleiten (Boller & Felix, 2009). Diese induzierte Abwehr kann wiederum in zwei Ebenen aufgeteilt werden: auf der ersten Ebene werden mikrobielle Eindringlinge über konservierte Merkmale perzipiert (Basale Abwehr). Die Suppression der basalen Abwehr durch ein Pythopathogen resultiert in einem Befall der Pflanzen und wird auch als kompatible Interaktion bezeichnet, bei dem der Wirt suszeptibel ist und das Pathogen virulent (O'Connell & Panstruga, 2006) (Abbildung 1.1). Dahingegen werden auf der zweiten Abwehrebene einzelne pathogene Stämme spezifisch erkannt (Wirts-Resistenz). Diese Resistenz beruht auf der Anwesenheit eines bestimmten Resistenzgens (R-Gen), dessen Genprodukt die Erkennung eines bestimmten Avirulenz-Faktors des eindringenden Pathogens vermittelt. Damit ist diese Form der Resistenz Genotyp-abhängig, wobei auf Seiten der Pflanze das R-Gen und auf Seiten des Pathogens der entsprechende Avirulenz- Faktor vorhanden sein muss (Flor, 1971). Die Interaktion ist inkompatibel und das Pathogen damit avirulent (Abbildung 1.1). Abbildung 1.1: Überblick über die verschiedenen Formen der pflanzlichen Immunabwehr. Bei der Nicht- Wirts-Resistenz (Typ I) kommt es zu keinen sichtbaren Symptomen, wohingegen bei der Typ II Nicht-Wirts- Resistenz Nekrosen auftreten. Ist das Pathogen virulent auf der Wirtspflanze, so spricht man von einer kompatiblen Interaktion, in der die Wirtspflanze suszeptibel ist und Krankheitssymptome entwickelt. Eine spezifische Erkennung des Pathogens führt zu einer inkompatiblen Interaktion und führt zu der Wirts-Resistenz. (Abbildung verändert nach Nürnberger et al., 2004) 7

15 EINLEITUNG Die basale Abwehr - PAMP-vermittelte Immunität (PTI) Die Immunantwort und Erkennung von Pathogenen ist eine Hauptvoraussetzung für die Aktivierung der induzierbaren Wirts-Abwehr. Diese Erkennung basiert auf der Perzeption von molekularen Strukturen bzw. Mustern, die charakteristisch und spezifisch für Mikroorganismen sind. Dabei wurde ein Konzept aus der angeborenen Immunität aus verschiedenen Tiersystemen übernommen, welches besagt, dass die Hauptaufgabe des angeborenen Immunsystems die Unterscheidung zwischen fremden Molekülen und den Eigenen ist (Medzhitov & Janeway, 1997). Die Differenzierung erfolgt über PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), hochkonservierte Moleküle mit essentieller Funktion, die sowohl in Phyto- als auch Tierpathogenen vorkommen, aber im Wirt nicht vorhanden sind. PAMPs die Immunreaktionen in Vertebraten und Nicht-Vertebraten auslösen sind Lipopolysaccharide aus gram-negativen Bakterien, Flagellin, der bakterielle Elongationsfaktor EF-Tu, sowie Glukane aus Pilzen (Felix et al., 1999; Klarzynski et al., 2000; Meyer et al., 2001; Kunze et al., 2004) PRRs Die molekulare Basis für die PAMP-vermittelte Immunität (PAMP-triggered immunity; PTI) ist die Erkennung der PAMPs durch Transmembranrezeptoren, die als sogenannte PRRs (pattern recognition receptors) bezeichnet werden (Zipfel, 2008). Meistens sind PRRs aus einer extrazellulären Leucin-reichen Domäne (leucin-rich repeats; LRR), welche für die Wahrnehmung der PAMPs erforderlich sind, aufgebaut. Die Rezeptoren sind über ihre Transmembrandomäne in der Plasmamembran verankert und besitzen außerdem eine cytosolische intrazelluläre Kinase-Domäne, die für die Signaltransduktion nach PAMP Erkennung notwendig ist (Monaghan & Zipfel, 2012). Im Jahre 2000 gelang es Gomez- Gomez und Boller den Arabidopsis Flagellin Rezeptor FLS2 zu klonieren und zu charakterisieren (Gomez-Gomez & Boller, 2000). Dieser gehört zur Klasse der LRR-RLKs (leucin-rich repeat receptor-like kinase) und erkennt ein konserviertes 22 Aminosäuren großes Peptid des bakteriellen Flagellinproteins (flg22) über seine LRR-Domäne (Chinchilla et al., 2006). Interessanterweise werden in tierischen Systemen PAMPs, wie z.b. bakterielles Flagellin, durch TLRs (Toll-like receptors) erkannt, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu den PRRs der Pflanzen aufweisen (Hayashi et al., 2001). Das bedeutet, dass die Wahrnehmung von Flagellin zwischen Pflanzen und Tieren evolutionär konserviert ist. Jedoch suggerieren Unterschiede in der zytoplasmatischen Domäne beider Rezeptoren, dass diese Flagellin- Erkennungssysteme durch eine konvergente Evolution entstanden sind (Ausubel, 2005). Weitere Studien zeigen, dass die Flagellin-induzierte Immunantwort das Bakterienwachstum eines adaptierten (virulenten) Bakteriums Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) limitiert, wohingegen fls2 Mutanten suszeptibler gegenüber Pst DC3000 sind (Zipfel 8

16 EINLEITUNG et al., 2004). Deshalb ist die Erkennung bakterieller Muster durch PRRs wie FLS2 ein wichtiger Bestandteil der PTI und ermöglicht eine wirksame basale Abwehr gegen adaptierte, aber auch nicht-adaptierte pathogene Mikroorganismen. Doch FLS2 allein ist für die effiziente flg22-induzierte PTI nicht verantwortlich. Nach Bindung des flg22-peptids an FLS2 kommt es zu einer Heterodimerisierung mit der Rezeptor-ähnlichen Kinase BAK1 (Chinchilla et al., 2007). Diese Assoziierung ist für die Phosphorylierung und Aktivierung des Rezeptor- Komplexes sowie Weiterleitung der Signale notwendig (Schulze et al., 2010). Neuere Studien deuten darauf hin, dass weitere Rezeptor-ähnliche Kinasen, z.b. BIK, mit nichtstimulierten FLS2 assoziieren. Die Dimerisierung von FLS2-BAK1 erlaubt die Dissoziation von BIK1 und damit die Phosphorylierung von weiteren nachfolgenden Komponenten (Lu et al., 2010; Zhang et al., 2010) Ereignisse während PTI Nur wenige Sekunden bis Minuten nach PAMP Erkennung und darauffolgender Phosphorylierungsereignisse an den Rezeptorkinasen erfolgt eine Depolarisierung der Membran gefolgt von einer Ansäuerung des Zytoplasmas und damit der Alkalinisierung des Apoplasten (Nürnberger et al., 2004). Daraufhin führen verschiedene Ionen-Flüsse zu einem Anstieg in der cytosolischen Calcium-Konzentration, die wahrscheinlich für die Aktivierung von mehreren Calcium-abhängigen Proteinkinasen verantwortlich ist (Boudsocq et al., 2010). Diese können eine schnelle Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species; ROS) initiieren (Boudsocq et al., 2010). Neben der Bildung von ROS hat der Calcium-Influx auch einen zusätzlichen Einfluss auf die Mitogen-aktivierte Protein Kinase (MAPK) Kaskade, die sowohl in Pflanzen als auch in Vertebraten eine wichtige Komponente in verschiedenen zellulären Signalwegen darstellt (Asai et al., 2002; Segonzac & Zipfel, 2011; Tena et al., 2011). Hierbei sind MAP Kinasen hierarchisch angeordnet und werden durch Phosphorylierung der stromaufwärts-liegenden MAP Kinase transient phosphoryliert und aktiviert. Schlussendlich führt diese Signalkaskade zu einer Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren, welche die Genexpression von Abwehr-assoziierten Genen beeinflussen (Asai et al., 2002; Lee et al., 2004). Eine vorangegangene Arbeit postulierte, dass die FLS2 Stimulierung die MAP Kinase Kaskade aus den Arabidopsis MAPKs MEKK1- MKK4/5-MPK3/6 aktiviert und damit die Weiterleitung des Signals an die Transkriptionsfaktoren WRKY22/29 bewerkstelligt (Asai et al., 2002). Jedoch konnte demonstriert werden, dass AtMEKK1 für die Aktivierung von AtMPK3 und 6 nicht notwendig 9

17 EINLEITUNG Abbildung 1.2: Die basale Abwehr-PTI. Phytopathogene Bakterien vermehren sich im extrazellulären Bereich, dem Apoplast, und können durch die Freisetzung von PAMPs über PRRs wahrgenommen werden. Dabei kann z.b. flg22 durch FLS2 detektiert werden und führt zu einer Komplexbildung mit BAK1. Neben der Erhöhung der Calciumkonzentration und der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wird die MAPK Kaskade eingeleitet, die in einer Aktivierung von Transkriptionsfaktoren resultiert. Die Genexpression von Abwehr-assoziierten Genen (PR-Gene) wird stimuliert und führt auch zu einer gesteigerten Sekretion von PR Proteinen (meisten mit einer antimikrobiellen Wirkung). Zur mechanischen Verstärkung der Zellwand wird in der späten Phase der PTI Callose eingelagert. Daraus resultiert eine eingeschränkte Vermehrung des Pathogens. ist, aber essentiell für die Signalweiterleitung an AtMPK4 (Ichimura et al., 2006; Nakagami et al., 2006; Suarez-Rodriguez et al., 2007). Die MAP Kinase (MPKKK) die stromaufwärts von AtMKK4 und 5 agiert ist derzeit unbekannt. Dennoch ist bekannt, dass aktivierte MAPKs zur Phosphorylierung Transkriptionsfaktoren von führen, die für die pflanzliche Immunantwort essentiell sind (Bethke et al., 2009; Mao et al., 2011). Nur wenige Substrate, die durch MAP Kinasen spezifisch phosphoryliert werden, wurden charakterisiert. Beispielsweise konnte eine Verbindung zwischen der MAPK Aktivierung und der Expression von PR- Genen (pathogenesis-related genes) sowie der Induktion des programmierten Zelltods erstellt werden (Zhang & Klessig, 2001; Jonak et al., 2002; Ren et al., 2002; Nürnberger et al., 2004). Neben den frühen Antworten während der Flagellin-induzierten PTI, wie der Produktion von ROS, der Aktivierung von MAPKs oder der veränderten Genexpression, stellen auch späte Abwehrantworten wirksame Mittel gegen eindringende Pathogene dar. Dabei nimmt die Zellwand-basierte Abwehr von Pflanzen eine zentrale Rolle ein. Während der Infektion kommt es zu einer Reorganisation des Zytoskeletts, das dadurch an der Bildung von Zellwandauflagerungen (Papillen) oder an dem Transport von PR Proteinen, beteiligt ist (Day et al., 2011). Papillen bestehen hauptsächlich aus ß-1,3-Glukan Callose, quervernetzt mit phenolischen und Hydroxyprolinreichen Gylcoproteinen, welche eine Verstärkung der Zellwand zur Folge haben, um das Bakterienwachstum zu limitieren (Abramovitch & Martin, 2004). Die Ereignisse während der PTI sind in Abbildung 1.2 vereinfacht dargestellt. 10

18 EINLEITUNG Regulation der PTI Die Schwächung der PRR-Funktion bzw. die Abschaltung der PTI ist von großer Bedeutung und wird durch verschiedene negative Regulatoren gewährleistet. Neben der KAPP(Kinaseassoziierte Protein Phosphatase)-vermittelten Inaktivierung von FLS2 konnte auch eine Proteasom-abhängige Endozytose des FLS2 Rezeptors nach Flagellin-Perzeption demonstriert werden und stellt damit auch ein Möglichkeit dar, die PRR-Aktivität in Pflanzen auszuschalten (Gomez-Gomez et al., 2001; Robatzek et al., 2006). Dabei wird die Proteasom-abhängige Degradierung von FLS2 durch zwei U-box E3 Ubiquitin Ligasen vollführt, die FLS2 nach Flagellin-Bindung ubiquitinieren und damit dieses zum Abbau über das 26S Proteasom bereitstellen (Lu et al., 2011). Weitere E3 Ligasen, die zur U-box Familie gehören, regulieren die basale Abwehr auf eine negative Art und Weise, indem sie mit Exo70B2, einer Untereinheit des Exozyst-Komplexes, das an der Vesikelanbindung während der Exozytose beteiligt ist, interagieren (Stegmann et al., 2012). Eine weitere negative Regulation erfolgt über die Inaktivierung von MAP Kinasen durch Phosphatasen (Bartels et al., 2010). 1.2 Pathogene währen sich: Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren Gram-negativer Bakterien Erfolgreiche Pathogene müssen in der Lage sein die Immunantwort in ihrem Wirt zu unterdrücken. Deshalb haben Gram-negative Bakterien ähnliche Strategien entwickelt, um in Pflanzen- bzw. Säugetierzellen das Immunsystem zu manipulieren (Galan, 2009). Dabei haben Phytopathogene im Laufe der Evolution eine Reihe von Virulenzfaktoren erworben, die eine Kolonisierung der Pflanze ermöglichen oder auch vereinfachen. Zu diesen Virulenzfaktoren gehören die sogenannten Typ III Effektorproteine (T3E), die vor allem eingesetzt werden um die pflanzliche Abwehr zu unterbinden. Einige Phytopathogene kodieren für 20 bis 30 Effektoren, deren Expression strikt reguliert wird und die über eine nadelartige Struktur, das Typ III Sekretionssystem (T3SS), in das Wirts-Zytosol injiziert werden (Cunnac et al., 2009) Das Typ-III-Sekretionssystem Das T3SS nimmt eine zentrale Rolle während der Wirts-Pathogen Interaktion ein und ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor, der unter pflanzen- und tierpathogenen gram-negativen Bakterien stark konserviert ist (Ghosh, 2004). Die Verwendung eines T3SS wurde unter anderem sowohl für die Pflanzenpathogene Pseudomonas syringae, Erwinia und Xanthomonas spp., als auch für die Tierpathogene Salmonella, Yersinia und Shigella spp. 11

19 EINLEITUNG demonstriert (Büttner & Bonas, 2003). Evolutionär ist das TTSS wahrscheinlich aus dem Flagellum, dem Fortbewegungsapparat der Bakterien, hervorgegangen (McCann & Guttman, 2008). Das T3SS wurde ursprünglich durch die Analyse nicht-pathogener P. syringae Mutanten entdeckt. Die isolierten Mutanten wurden zunächst als hrp (hypersensitive response and pathogenicity; hypersensitive Reaktion und Pathogenität) Mutanten bezeichnet, da sie neben der Fähigkeit Zelltod-Reaktionen auszulösen auch ihre Pathogenität auf suszeptiblen Pflanzen verloren hatten (Lindgren et al., 1986). Es stellte sich heraus, dass diese mutierten Bakterienstämme, Mutationen in Genen enthielten, die für das T3SS kodieren, weshalb der entsprechende genomische Bereich hrp-gen-cluster genannt wurde. Unter den ca. 20 Hrp-Proteinen befinden sich elf Proteine, die in Pflanzen- und Tierpathogenen hoch konserviert sind und daher als Hrc-Proteine (hrp-conserved) bezeichnet werden. Diese Gene kodieren für Proteine der äußeren und inneren Membran sowie für zwei cytosolische Proteine und bilden möglicherweise den Basalapparat des T3SS (Bogdanove et al., 1996). Die Basis des T3SS besteht aus einem Proteinkomplex, der die innere Bakterienmembran, den periplasmatischen Raum, die Peptidoglykanschicht und die äußere Membran durchspannt (Abbildung 1.3). An diesem Basalkörper ist ein Hrp-Pilus, ein Nadelkomplex, angeschlossen, durch die Proteine transportiert werden (Koebnik, 2001; He et al., 2004). Diese Proteine gelangen über eine Translokationspore, die in der Wirtsmembran gebildet wird, ins Zytoplasma der Wirtszelle (Büttner & Bonas, 2002). Durch das T3SS werden Typ III Effektorproteine direkt ins Zytoplasma der pflanzlichen Wirtszelle injiziert um dort ihre Wirkung zu entfalten (Alfano & Collmer, 2004). Abbildung 1.3: Modell des T3SS von phytopathogenen Bakterien. Der Sekretionsapparat durchspannt sowohl bakterielle als auch pflanzliche Membranen. Der Hrp-Pilus ist mit einer Translokationspore verbunden und ermöglicht dadurch den Transport von Typ-III- Effektorproteinen in das pflanzliche Zytoplasma. IM: innere Bakterienmembran; OM: äußere Membran (outer membrane); PM: Plasmamembran; ZW: Zellwand. (Abbildung vereinfacht nach He et al., 2004) Da bakterielle Typ-III Effektorproteine in pflanzlichen aber auch in tierischen Zellen agieren, besitzen sie ungewöhnliche Eigenschaften, die sie von anderen Proteinen unterscheiden. Sie haben multiple Domänen die für die Sekretion und Funktion in eukaryotischen Zellen erforderlich sind (Galan, 2009). Dazu gehören T3SS-Sekretionssignal-Sequenzen, Motive die für die subzelluläre Lokalisierung im Wirt gebraucht werden sowie Domänen die für die 12

20 EINLEITUNG Assoziation und Modifikation von eukaryotischen Zielproteinen notwendig sind. Normalerweise befindet sich das Sekretionssignal der Typ-III Effektoren in der aminoterminalen Region der Proteine, typischerweise innerhalb der ersten Aminosäureresten (Mudgett et al., 2000; He et al., 2004). Diese Sequenzen weisen kein erkennbares konserviertes Motiv auf, aber nichtsdestotrotz teilen sie einzigartige Eigenschaften, die z.b. für in silico Vorhersagen von Effektorproteinen in sequenzierten Bakteriengenomen benutzt werden können (He et al., 2004; Samudrala et al., 2009). Für die Sekretion vieler Typ-III Effektorproteine sind jedoch Hilfsproteine notwendig, die dabei als Chaperone fungieren. Typ-III Chaperone sorgen möglicherweise für die Entfaltung und Stabilisierung der Effektoren und sind auch an der Assemblierung des T3SS beteiligt (He et al., 2004) Typ-III Effektorproteine und ihre Funktion Zur Identifizierung von Effektorproteinen wurden Verschiedene Ansätze wurden eingesetzt um T3SS Effektorproteine zu entdecken. Schließlich konnten die ersten Effektoren über ihre Funktion als Avirulenz-Determinanten (Avr) identifiziert werden (Staskawicz et al., 1984). Hierbei handelt es sich um Effektoren die während der Wirst-Resistenz durch Resistenzproteine erkannt werden und Zelltod-Reaktionen auslösen. In suszeptiblen Pflanzen hingegen agieren diese Avr-Proteine als Effektoren mit Virulenzfunktion. Zusätzliche Effektorgene konnten anhand ihrer Ko-Regulation mit dem T3SS identifiziert werden. Während in P. syringae alle bekannten Effektorgene mit dem T3SS ko-reguliert werden (Xiao & Hutcheson, 1994; Chang et al., 2005) ist dies für Xanthomonas nicht der Fall, da beispielsweise die Effektoren AvrBs1, AvrBsT, AvrRxv und AvrBs3 konstitutiv exprimiert werden (Knoop et al., 1991; Ciesiolka et al., 1999; Escolar et al., 2001). Anhand verschiedenster Methoden konnten damit hunderte T3SS-assoziierte Gene bestimmt werden, was daraufhin deutet, dass bestimmte Pathogene bis zu 50 Typ-III Effektoren während einer Infektion zum Einsatz bringen können (Mudgett, 2005). Doch was ist die Funktion dieser Effektorproteine? Schon in den frühen 90ern gab es erste Anzeichen, dass T3E möglicherweise die pflanzliche Immunantwort unterdrücken: Jakobek et al. (1993) zeigten z.b., dass ein virulentes P. syringae Pathovar in der Lage war die Induktion von Abwehrgenen zu supprimieren. Diese frühen Studien suggerierten, dass das bakterielle T3SS an der Inhibition der PTI beteiligt sein muss. Besonders wirksame Ziele in der basalen Abwehr stellen die Signalweiterleitung nach PAMP-Erkennung, die Expression von Abwehrgenen oder die Sekretion von antimikrobiellen Proteinen in den Apoplasten dar (Deslandes & Rivas, 2012). Ein wichtiger und neuentdeckter Angriffspunkt von Pflanzenpathogenen scheint auch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) zu sein, da 13

21 EINLEITUNG Komponenten der UPS entweder ausgeschaltet oder ausgenutzt werden, um zelluläre Antworten im Wirt umzuprogrammieren (zusammengefasst in Marino et al., 2012) Effektoren die Plasmamembran Komponenten zum Ziel haben Ein Hauptzielort bakterieller Effektorproteine stellt die Plasmamembran der Pflanzenzelle dar, die mit den PRRs, essentielle Proteine der PTI beherbergt. Unter den Effektoren die an der Plasmamembran agieren ist AvrPto aus Pseudomonas syringae pv. tomato ein gut untersuchtes Beispiel. Die funktionelle Charakterisierung von AvrPto liefert ein exzellentes Beispiel für die Koevolution von Pflanzen und Mikroben. Anfänglich konnte gezeigt werden, dass AvrPto frühe PTI Signalweiterleitungen blockiert und damit die PTI unterdrückt (He et al., 2006). In resistenten Pflanzen interagiert AvrPto normalerweise mit der Proteinkinase Pto, welche wiederum mit einem Resistenzprotein assoziiert ist und somit die Wirtsspezifische Resistenz auslösen kann (Pedley & Martin, 2003). Spätere Studien berichteten, dass AvrPto mit FLS2 und EFR sowie deren Ko-Rezeptor BAK1 interagiert und die Komplexformation von FLS2-BAK1 stört (Shan et al., 2008; Xiang et al., 2008). Jedoch zeigten Xiang et al. (2011), dass nicht BAK1 sondern FLS2 das Zielprotein von AvrPto ist und dass diese Interaktion eine Komplexbildung der beiden Rezeptoren nicht beeinträchtigt. Weiterhin kann erwähnt werden, dass AvrPto die Kinaseaktivität von Pto, FLS2 und EFR inhibiert und damit die PTI zu stören scheint (Xing et al., 2007; Xiang et al., 2008). Basierend auf diesen Daten scheint Pto während der Evolution als eine Art Köder entstanden zu sein, um AvrPto von seinen eigentlichen Zielproteinen fern zu halten und dessen Erkennung zu ermöglichen (van der Hoorn & Kamoun, 2008). Ein anderer Effektor der an der pflanzlichen Plasmamembran wirkt ist das erst kürzlich charakterisierte AvrAC aus Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). AvrAC ist eine Uridylyltransferase, die mit der Rezeptor-ähnlichen Kinase BIK1 interagiert. Hierbei fügt AvrAC an einem konservierten Serin- und Threonin-Rest in BIK1 ein Uridin 5 -Monophosphat an und verhindert damit dessen Phosphorylierung (Feng et al., 2012). Neben BIK1 werden auch RIPK und PBL1 durch AvrAC modifiziert, wohingegen FLS2 und BAK1 keine Zielproteine dieses Effektors sind. Auch Xanthomonas campestris pv. vesicatoria besitzt mit XopN einen Effektor der Rezeptorähnliche Kinasen als Ziel hat. Hier interagiert XopN mit TARK1 und inhibiert die PR- Genexpression sowie die Callose-Ablagerung, was auf eine Unterdrückung der PTI hindeutet (Kim et al., 2009). Neuere Studien belegen, dass XopN als ein Gerüstprotein für die Interaktion mit TARK1 und dem Protein TFT1, einem positiven Regulator der PTI, fungiert (Taylor et al., 2012). Jedoch konnte eine biologische Funktion und biochemische Aktivität von XopN noch nicht ermittelt werden. 14

22 EINLEITUNG MAPK Signalweg Neben der Beeinträchtigung membranständiger Rezeptorkinasen sind zwei Effektoren in der Lage mit der PAMP-induzierten MAP Kinase Aktivierung flussabwärts der PRRs zu interferieren. HopF2, eine ADP-Ribosyltransferase, blockiert die PAMP-induzierte Phosphorylierung von MPK4 nach transienter Überexpression in Arabidopsis Protoplasten (Wang et al., 2010). Ein weiterer Pseudomonas Effektor HopAI1 interagiert mit MAP Kinasen und blockiert diese spezifisch. Hierbei agiert HopAI1 als eine Phosphothreonin-Lyase, die in einer irreversiblen Dephosphorylierung der MAP Kinasen MPK3 und 6 resultiert (Zhang et al., 2007). Die HopAI1-vermittelte Inaktivierung der MAPK Proteine führt zu einer Suppression der PAMP-induzierten Transkription und Zellwand-basierten Abwehrmechanismen (Zhang et al., 2007) Transkription Ein weiteres wichtiges Virulenz-Ziel für bakterielle Effektoren stellt die Manipulation der transkriptionellen Aktivität dar. Hierbei ist die TAL (Transcription-Activator-Like)/ AvrBs3/PthA Effektor-Familie die wahrscheinlich außergewöhnlichste Erfindung der Bakterien die Transkription in der Wirtszelle zu steuern. Ursprünglich wurde AvrBs3 als ein Avirulenzprotein von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) identifiziert (Bonas et al., 1989; Bonas et al., 1993). Neben der Kernlokalisierungssequenz (NLS) und der Aktivierungsdomäne besitzt AvrBs3 eine variable Anzahl an Wiederholungen mit je 34 Aminosäuren. Entsprechend dieser Struktur ahmt AvrBs3 einen eukaryotischen Transkriptionsfaktor nach und ist damit in der Lage die Transkription im Zellkern der Wirtspflanze zu modulieren (Kay et al., 2007; Römer et al., 2007). Die Aminosäuren 12 und 13 jeder Wiederholung sind hypervariabel und bestimmen dadurch die Sequenz an die der Effektor schlussendlich binden kann (Boch et al., 2009). Viele TAL-Effektoren sind essentielle Virulenzfaktoren in der Interaktion mit suszeptiblen Pflanzen. Beispielsweise bindet AvrBs3 in suszeptiblen Paprikapflanzen an die Promotorregion des Upa20 Gens und induziert dessen Genexpression, die zu einer Hypertrophie in Mesophyllzellen führt (Kay et al., 2007). Dahingegen aktiviert der Effektor in resistenten Paprika Kultivaren die Transkription des korrespondierenden Resistenzgens, Bs3, und begünstigt damit die Ausbildung der Resistenz gegen Xcv (Römer et al., 2007). Das Xcv Effektorprotein XopD bewirkt neben AvrBs3 eine Veränderung der Wirts- Transkription während der Infektion von suszeptiblen Pflanzen. Jedoch handelt es sich bei XopD nicht um ein weiteres Effektorprotein der TAL-Familie sondern um eine SUMO Cystein-Protease (Hotson et al., 2003). XopD ist ein Virulenzfaktor, der das Bakterienwachstum von Xcv in Tomaten begünstigt und zu einer Verzögerung der 15

23 EINLEITUNG Symptom-und Seneszenz-Entwicklung führt (Hotson et al., 2003; Kim et al., 2008). XopD kann über seine NLS in den Zellkern gelangen, dort an DNA binden und seine SUMO- Protease Funktion ausführen (Hotson et al., 2003). Hier reprimiert XopD die Transkription von Seneszenz- und Abwehrgenen und verlangsamt dadurch die Salizylsäure(SA)- abhängige Seneszenz in Tomaten (Kim et al., 2008). Weiterhin konnten Kim und Kollegen demonstrieren, dass XopD den Transkriptionsfaktor SlERF4 desumoyliert und damit die Ethylen-Antwort supprimiert, um schließlich das bakterielle Wachstum zu begünstigen (Kim et al., 2013) Vesikeltransport Als einer der späteren Schritte während der basalen Abwehr nimmt die Sekretion bzw. der Vesikeltransport eine enorme Rolle in der befallenen Wirtspflanze ein. Da Phytopathogene anders als Tierpathogene außerhalb der Zelle, im extrazellularen Raum, überleben müssen, stellt die Grenze, also die Plasmamembran, zwischen Zellwand und Apoplast eine Art Front dar, an der die Pathogene aktiv durch die Pflanze bekämpft werden müssen. Daher muss während der Pathogenabwehr ein funktionaler Vesikeltransport an die Plasmamembran gewährleistet werden, da hier z.b. Abwehr-abhängige Proteine oder Sekundärmetabolite (Phytoalexine) sekretiert werden. Ist die Exozytose bzw. Sekretion gestört kann das Pathogen nicht wirksam bekämpft werden. Der erste identifizierte Effektor der hier an dieser Stelle eingreift ist HopM1 aus P. syringae. Dieser Effektor akkumuliert im Trans-Golgi- Netzwerk der Wirtszelle und interagiert mit AtMIN7, um dieses Protein anschließend über das 26S Proteasom zu degradieren (Nomura et al., 2006; Nomura et al., 2011). AtMIN7 gehört zur einer Protein-Familie, dessen Mitglieder ein wichtiger Bestandteil des Vesikeltransports sind und wahrscheinlich eine Rolle in der basalen Abwehr einnehmen, indem sie die Callose-Deposition vermitteln (Nomura et al., 2006). 1.3 R-Protein-vermittelte Abwehr von Pflanzen Effektorvermittelte Abwehr Im Wettstreit um das Überleben zwischen Pflanzen und Bakterien haben auch Pflanzen ausgeklügelte Abwehrmechanismen entwickelt um bakterielle Eindringlinge und deren Effektor-Repertoires zu erkennen. Dabei haben resistente Pflanzen im Laufe der Evolution spezifische Proteine sogenannte Resistenz (R)-Proteine erworben. Diese Proteine repräsentieren die Schlüsselkomponente in der zweiten Ebene der induzierten Immunität in Pflanzen (Jones & Dangl, 2006). Nach einer R-Protein-vermittelten Effektor-Erkennung werden verschiedene Abwehrmechanismen in Gang gesetzt und enden schlussendlich in 16

24 EINLEITUNG einer Hypersensitiven Antwort/Reaktion (hypersensitive response; HR), einer Form des programmierten Zelltods, bei der das Bakterienwachstum inhibiert wird und somit zur Resistenz der Wirtspflanze führt (Hofius et al., 2007). Diese zweite Form der induzierten Abwehr wird auch als Effektor-vermittelte Immunität (effector-triggered immunity; ETI) und die Effektoren als Avirulenzproteine bezeichnet (Jones & Dangl, 2006). Das Phänomen der spezifischen Erkennung wurde erstmals in der Gen-für-Gen Hypothese von Harald Flor beschrieben (Flor, 1971). Nach diesem Modell der Pathogen-Wirt-Interaktion existiert für jedes R-Gen ein passendes Avirulenzgen im Pathogen. Demzufolge wurde zunächst eine direkte Interaktion zwischen dem R-Protein und dem Effektor postuliert. Doch die Erkennung von bakteriellen Effektoren über R-Protein verläuft größtenteils indirekt und nur in seltenen Fällen kommt es zu einer direkten Interaktion beider Proteine (Jia et al., 2000; Deslandes et al., 2003). Daher wurde darüber spekuliert, ob R-Proteine mögliche Zielstrukturen überwachen (Dangl & Jones, 2001). Nach der Guard-Hypothese hat die Pflanze eine Möglichkeit geschaffen, nicht die Effektorproteine direkt wahrzunehmen, sondern deren Zielproteine (guardee) auf mögliche Modifikationen hin über R-Proteine (guard) überwachen zu lassen (Van der Biezen & Jones, 1998; Chisholm et al., 2006). Die R-Protein-vermittelte Wahrnehmung einer Bindung oder posttranslationalen Modifikation des Zielproteins durch bakterielle Effektoren führt folglich zur Einleitung der HR. Ein bekanntes Beispiel hierfür ist die Hyperphosphorylierung des Zielproteins RIN4 durch zwei verschiedene P. syringae Effektoren AvrB und AvrRpm1 und anschließende Aktivierung der RPM1-abhängigen HR (Mackey et al., 2002). Das gleiche Zielprotein wird durch einen anderen Effektor AvrRpt2 aus Pseudomonas gespaltet. Diese Modifikation aktiviert das R-Protein RPS2 und löst wiederum die ETI aus (Axtell & Staskawicz, 2003; Mackey et al., 2003). Diese Befunde deuten daraufhin, dass RIN4 durch mindestens zwei R-Proteine überwacht wird und verdeutlichen, dass dadurch die Pflanze in der Lage ist unterschiedliche Effektoren aber auch unterschiedlich Pathogene, die das gleiche zelluläre Zielprotein angreifen, mit Hilfe weniger R-Proteine zu detektieren Rolle der R-Proteine in der ETI In Pflanzen existieren zwei Klassen von R-Proteinen: die NB-LRRs (Nukleotid-bindende Leucin-reiche Wiederholungen, nucleotide binding leucine-rich repeats) und die elrr (extrazelluläre Leucin-reiche Wiederholungen, extracellular leucin-rich repeats). Es sind über 149 NB-LRR Proteine in Arabidopsis thaliana bekannt die eine Resistenz gegenüber diversen Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilze oder Oomyceten vermitteln können (Meyers et al., 2003). NB-LRR R-Proteine kommen häufiger vor und weisen diverse Strukturen am aminoterminalen Ende auf. Deshalb werden sie nochmal in zwei Unterklassen geteilt: Coiled- Coil-NB-LRR (CC-NB-LRR) und Toll/Interleukin 1-Rezeptor-ähnliche NB-LRR (TIR-NB-LRR) 17

25 EINLEITUNG (Takken & Tameling, 2009). NB-LRRs zeigen auch Sequenzähnlichkeiten mit den NB- Domänen von Apoptose Faktoren, wie z.b. APAF4 und CED1 aus dem Menschen auf (Ting et al., 2008). Auch Säugetiere besitzen Leucin-reiche Immunrezeptoren, zum einen Tollähnliche Membranrezeptoren (Toll-like membrane receptors (TLR)) und zum anderen Nodähnliche Rezeptoren (Nod-like receptors (NLR)). Mit diesen Immunrezeptoren sind Säugetiere in der Lage PAMPs wahrzunehmen und Abwehrreaktionen zu aktivieren können aber keine Typ-III Effektoren detektieren (Latz, 2010). Des Weiteren scheinen NLR Proteine, wie z.b. NLRP3 auch eine ähnliche Funktion wie NB-LRRs der Pflanzen zu bekleiden, da auch sie Nekrosen einleiten können (Li et al., 2009). Neben den Effektorproteinen teilen auch die Komponenten der pflanzlichen Abwehrmechanismen mit den tierischen Immunrezeptoren kombinierte strukturelle Motive. Dies deutet wiederum auf eine systemübergreifende, funktionelle Konservierung einzelner Proteindomänen hin. Weiterhin kann spekuliert werden, dass pflanzliche R-Proteine auch zu einer Art adaptivem Immunsystem gehören, da sie erst als Antwort gegen bestimmte bakterielle Effektorproteine entstanden sind R-Protein Stabilität und genetische Voraussetzung für die ETI Da R-Proteine der Pflanzen programmierten Zelltod im Wirt auslösen, müssen sie strikt reguliert sein. Erst wenn ein eindringendes Pathogen nicht durch die PTI bekämpft werden kann darf eine Aktivierung erfolgen, während sie bei Abwesenheit von Phytopathogenen ausgeschaltet sein sollten. Eine unnötige Aktivierung wird wahrscheinlich durch Autoinhibition verhindert, die womöglich durch intramolekulare Interaktionen zwischen den einzelnen Domänen stattfindet. Demnach wäre im Adenosindiphosphat (ADP)-gebundenen Zustand das R-Protein inaktiv und in einer geschlossenen Konformation (Lukasik & Takken, 2009). Eine zusätzliche Möglichkeit zur Regulierung der R-Protein-Aktivität ist die Kontrolle der Stabilität der R-Proteine. Dabei machen sich NB-LRRs einen konservierten Chaperon- Komplex zu Nutze, der die Faltung, Stabilität und Aktivierung von R-Proteinen beeinflusst. Die Schlüsselkomponenten in diesem Komplex enthalten das Hitze-Schock-Protein 90 (Heat Shock Protein 90; HSP90), SGT1 (benannt nach seinem Homolog aus Hefe dem suppressor of G-two allele of skip1) und RAR1 (required for MLA12 resistance). Sowohl HSP90 als auch SGT1 sind an der Regulation und Aktivierung von NB-LRR in Pflanzen und Tieren impliziert (Shirasu, 2009). HSP90 ist ein konserviertes Chaperon mit einer N-terminalen ATP Bindedomäne und einer C-terminalen Dimerisierungsdomäne. HSP90 interagiert paarweise mit SGT1 und RAR1, wobei RAR1 und SGT1 auch miteinander wechselwirken können (Azevedo et al., 2002; Takahashi et al., 2003). HSP90 und RAR1 fungieren als positive Regulatoren der R-Protein Akkumulation wohingegen SGT1 auch als negativer Regulator charakterisiert wurde (Holt et al., 2005). Möglicherweise führt die Assoziierung von SGT1 mit 18

26 EINLEITUNG RAR1 und HSP90 zu einer Stabilisierung der R-Proteine (Abbildung 1.4). Die zwei Unterklassen der R-Proteine, CC- und TIR-NB-LRRs, benötigen aufgrund ihrer unterschiedlichen N-termini unterschiedliche stromabwärts-gelegene Komponenten für die Signalweiterleitung (Feys & Parker, 2000). Genetische Analysen habe verschiedene Gene identifiziert, die für die CC- oder TIR-NB-LRR-vermittelte Resistenz gebraucht werden. Dabei ist EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility-1) für die Signalantwort durch TIR-NB-LRR erforderlich (Parker et al., 1996), wohingegen NDR1 (Non-Race Specific Disease Resistance-1) für die CC-NB-LRR-vermittelte Signalweiterleitung notwendig ist (Century et al., 1995; Abbildung 1.4). NDR1 scheint eine Funktion in der Vermittlung der Plasmamembran-Zellwand Signalweiterleitung während der Infektion zu besitzen (Knepper et al., 2011). Die ETI die durch TIR-NB-LRR induziert wird, wird durch EDS1 gelenkt. Hierbei interagiert EDS1 mit PAD4 (Phytoalexin Deficient 4) und führt zu einer Stimulierung der Produktion des Phytohormons Salizylsäure (SA), um das Pathogen-Wachstum während der basalen Abwehr zu unterbinden (Zhou et al., 1998). Abbildung 1.4: Genetische Voraussetzungen für die Ausbildung einer HR. Bakterielle Typ-III Effektoren können durch verschiedene Gruppen von R-Proteinen perzipiert werden. Dabei benötigen die meisten CC-NB-LRR R-Proteine NDR1, wohingegen viele TIR-NB-LRR R-Proteine von EDS1 abhängig sind. Für die Stabilisierung und Faltung dieser R-Proteine ist der Chaperonkomplex aus SGT1, HSP90 und RAR1 zuständig. Die Wahrnehmung von Effektorproteinen über verschiedene R-Proteine führt letztendlich zur Einleitung der HR und damit zur Resistenz gegen Pathogene. PM: Plasmamembran; ZW: Zellwand; HR: Hypersensitive Reaktion Gemeinsamkeiten der ETI und PTI Die ETI und PTI teilen viele Gemeinsamkeiten und unterscheiden sich eigentlich nur in ein paar Aspekten. Die Effektor-vermittelte Abwehr ist eine schnellere und stärkere Form der basalen Abwehr, die in den meisten Fällen zu einem programmierten Zelltod (HR) resultiert (Jones & Dangl, 2006). Nachdem die PTI oder ETI eingeleitet wird treten in beiden Fällen Signaltransduktionskaskaden auf, die zu einer transkriptionellen Umprogrammierung der Pflanze führen. Dabei verwenden sowohl die PTI als auch die ETI die MAP Kinase Kaskade um die Genexpression zu induzieren (Asai et al., 2002; Jin et al., 2002; Rodriguez et al., 19

27 EINLEITUNG 2010). Weiterhin deuten Microarray-Analysen darauf hin, dass es eine große Überlappung in den Genexpressions-Profilen zwischen PTI und ETI gibt, wobei viele Gene in der ETI drastischer induziert sind als in der PTI (Tao et al., 2003; Navarro et al., 2004; Zipfel et al., 2004). SA nimmt eine Zentrale Rolle während der ETI an, wird jedoch auch in der basalen Abwehr benötigt, da der SA Gehalt nach PAMP Behandlung steigt und SA Biosynthese Mutanten in der PTI Induktion gestört sind (Tsuda et al., 2008). Weitere Abwehrantworten wie die Callose-Einlagerung oder Phytoalexin-Bildung treten in beiden Abwehr-Ebenen auf. Der einzige sichtbare Unterschied zwischen beiden Abwehrformen ist, dass es während einer PAMP-induzierten Abwehr zu keinem schnellen lokalen Zelltod in Form einer HR kommt. Das Unvermögen der PTI eine HR zu induzieren könnte dadurch zu erklären sein, dass während der PTI die Schwelle um eine HR auszulösen nicht erreicht wird. Dabei ist zu beachten, dass die ETI sich in ihrer Kinetik verglichen zur PTI durch eine verlängerte Aktivität unterscheidet (Underwood et al., 2007). Zusammengenommen bedient sich die ETI mit einer spezifischen Pathogen-Erkennung wahrscheinlich ähnlicher bzw. gleicher Signalwege wie die PTI. 1.4 Rolle der Salizylsäure in der Pathogenabwehr Obwohl bekannt ist, dass viele Phytohormone Abwehrantworten induzieren können, treten die Pflanzenhormone Salizylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) sowie Ethylen (ET) als Schlüsseldeterminanten in der Regulation der Signalwege während induzierter Abwehrreaktionen hervor (Durrant & Dong, 2004; Pieterse et al., 2012). Sie besitzen hierbei eine zentrale Rolle pflanzliche Immun-Signalnetzwerke zu steuern (Pieterse et al., 2009). SA und JA werden als wichtigste Abwehrhormone wahrgenommen (Browse, 2009; Vlot et al., 2009). Jedoch modulieren auch Phytohormone wie Ethylen das pflanzliche Immunnetzwerk (van Loon et al., 2006). Abhängig vom Pathogen können diese Hormone spezifische Signalwege anschalten, welche individuell, synergistisch oder auch antagonistisch agieren können (Robert-Seilaniantz et al., 2011) Die Synthese von SA wird hauptsächlich bei der Abwehr von biotrophen oder hemibiotrophen Pathogenen in der PTI oder ETI eingeleitet und scheint eine essentielle Rolle in der Bildung der systemisch erworbenen Resistenz (SAR; systemic acquired resistance) zu besitzen (Glazebrook, 2005). Bei der SAR handelt es sich um die Fähigkeit der Pflanze auch in nicht-infiziertem Gewebe eine erhöhte Bereitschaft zur Abwehr von potentiellen Eindringlingen zu aktivieren und kann nach Erkennung eines Pathogens über die PTI oder ETI ausgelöst werden (Pieterse et al., 2012). Weiterhin benötigt SA eine wichtige Signalkomponente, NPR1 (non-expressor of PR1), die nach Aktivierung durch SA als ein transkriptioneller Ko-Aktivator agiert und eine Vielzahl von PR (Pathogenesis-related) -Genen induziert (Dong, 2004; Moore et al., 2011). Eine Mutation 20

28 EINLEITUNG in NPR1 verhindert die SA-vermittelte Induktion der PR-Gene und suggeriert damit, dass NPR1 auch ein positiver Regulator des SA-Weges ist (Cao et al., 1994; Cao et al., 1997). PR-Gene kodieren meistens für Proteine mit antimikrobieller Funktion (Van Loon et al., 2006). Unter diesen Genen befindet sich PR-1, das bereits in verschiedenen Pflanzenspezies als ein robuster Marker für die SA-responsive Genexpression beschrieben wurde. Außerdem können auch WRKY Transkriptionsfaktoren durch SA induziert werden, die wiederum SA-Antworten begünstigen oder unterdrücken können (Wang et al., 2006; Rushton et al., 2010). Neben der Regulation von PR-Genen oder WRKY Transkriptionsfaktoren kann NPR1 auch die Transkription von Genen, die an der Sekretion beteiligt sind, aktivieren. Die Expression dieser Gene ist von großer Bedeutung, da nur dadurch eine korrekte Prozessierung und Sekretion der PR-Proteine sichergestellt werden kann (Wang et al., 2005). Die Translokation von NPR1 in den Zellkern ist ein wichtiger regulatorischer Prozess während der SA Signalweiterleitung und hängt von vielen Faktoren ab. In nicht-infizierten Pflanzen akkumuliert NPR1 als Oligomer im Zytoplasma. Die geringen Mengen an NPR1, die in den Zellkern gelangen, werden dort ubiquitiniert und über das Proteasom abgebaut um eine verfrühte Aktivierung der NPR1 Zielgene zu verhindern (Spoel et al., 2009). Nach Pathogenbefall steigt die intrazelluläre SA-Konzentration an und führt zu einer Monomerisierung von NPR1, das in diesem Zustand über das nukleäre Porenprotein MOS in den Zellkern transloziert wird (Tada et al., 2008; Cheng et al., 2009). Hier kann nun NPR1 mit Mitgliedern der TGA-Transkriptionsfaktoren interagieren und die Aktivierung von SAresponsiven Genexpression vorantreiben (Despres et al., 2000; Fan & Dong, 2002). Anschließend wird NPR1 phosphoryliert und dadurch ubiquitiniert um einen Abbau über das 26S Proteasom zu gewährleisten (Abbildung 1.5). Dabei spielen die NPR1 Paraloge NPR3 und 4 eine zentrale Rolle und wurden kürzlich als SA-Rezeptoren beschrieben (Fu et al., 2012). Beide Proteine sind Adaptoren für die E3 Ligase, die NPR1 ubiquitiniert und zum Abbau bereitstellt. Bei geringen basalen SA Konzentrationen führt die NPR4-NPR1 Interaktion zur Degradierung von NPR1. Steigt die SA Konzentration während der basalen Abwehr an, bindet SA an NPR4, stört damit die Interaktion mit NPR1, welches nun die Aktivierung von Abwehrgenen durchführen kann. Bei sehr hohen SA Mengen während einer ETI bindet SA an NPR3 und fördert damit dessen Interaktion mit NPR1, was schlussendlich zum Proteasom-abhängigen Abbau von NPR1 führt (Fu et al., 2012). Diese konstitutive Beseitigung des phosphorylierten NPR1 vom Zielgen-Promotor ist für eine vollständige Induktion der SA-responsiven Gene erforderlich, da wahrscheinlich nur neues NPR1 eine Re-Initiation des Transkriptions-Zyklus erlaubt. Dieser ständige Auf- und Abbau von NPR1 ist für die Etablierung der SAR essentiell (Spoel et al., 2009). 21

29 EINLEITUNG Abbildung 1.5: Schematische Übersicht über den Salizylsäure-Signalweg. Der Befall einer Pflanze durch ein biotrophes Pathogen führt zu einer Akkumulierung von SA und damit zur Monomerisierung von NPR1, dem zentralen Regulator im SA-Signalweg. NPR1 wird über die Kernpore MOS in den Zellkern transloziert und fungiert hier als Transkriptions-Ko-Aktivator, in dem es mit TGA Transkriptionsfaktoren interagiert. Somit wird die Genexpression von WRKYs oder PR-1 sichergestellt. Die Phosphorylierung von NPR1 stellt ein Signal für das konstitutive Recycling von NPR1 über das 26S Proteasom dar und ist essentiell für die Etablierung der SAR. (Abbildung vereinfacht nach Pieterse et al., 2012) 22

30 EINLEITUNG 1.5 Das Pflanzenpathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit (bacterial spot disease) auf Paprika (Capsicum spp.) und Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum) und besonders ertragsschädigend in feuchtwarmen Gebieten (Jones et al., 2004). In der Natur kann sich Xcv über Aerosole und Regen ausbreiten und wachsen zunächst epiphytisch auf der Blattoberfläche. Danach können sie über natürliche Öffnungen wie Stomata, Hydatoden oder Verwundungsstellen in die Pflanze eindringen (Ryan et al., 2011). Krankheitssymptome äußern sich in lokalen, wässrigen Läsionen, die im Laufe der Infektion chlorotisch und anschließend nekrotisch werden (Abbildung 1.6B-D). In Paprika-Früchten entwickeln sich diese wässrigen Läsionen zu nekrotischen Flecken (Abbildung 1.6A). Damit gehört Xcv zu den hemibiotrophen Bakterien, die sich in der Anfangsphase der Infektion auf lebendes Wirtsgewebe angewiesen sind, aber im späteren Infektionsverlauf das Absterben des befallenen Gewebes verursachen (Büttner & Bonas, 2010). Dagegen lösen Pflanzengenotypen, die Resistenz-Gene tragen um Effektorproteine zu erkennen, bei einem hohen bakteriellen Titer eine HR aus (Abbildung 1.6E). Essentiell für die Ausprägung der Krankheitssymptome sowie für die Induktion der HR ist ein durch die Xanthomonas hrp-gene kodiertes T3SS, welches T3E in die Wirtszelle transloziert und damit die zelluläre Umsteuerung pflanzlicher Stoffwechselwege verursacht (Büttner & Bonas, 2006). Hrp-Gene sind in einem Gen-Cluster im Chromosom von Xcv angelegt und enthalten die 6 Transkriptionseinheiten hrpa bis hrpf (Bonas, 1994). Abbildung 1.6: Phänotypen der Xanthomonas-Paprika Interaktion. A: Bakterielle Fleckenkrankheit auf Paprika-Früchten (Howard F. Schwartz, Colorado State University, Bugwood.org). B: Wässrige Läsionen auf Paprika Blättern nach Infektion mit Xcv. C: Chlorosen während der Xcv-Paprika Interaktion. D: Nekrotische Läsionen auf Paprika Blättern ausgelöst durch Xcv. E: HR Symptome auf Paprika Bs2 Pflanzen nach Infektion mit Xcv. (B bis E: eigene Infektionen- Labor-Phänotyp ) Derzeit sind etwa 40 Typ-III Effektoren der Xanthomonas Gattung bekannt, die anhand von Sequenzidentitäten in verschiedene Gruppen eingeteilt werden können (White et al., 2009). Dabei wird klar, dass die meisten sequenzierten Xanthomonas spp. Genome ein Kernrepertoir aus 9 Typ-III Effektorproteinen besitzen, welches in allen Xanthomonaden vorkommen. Zu diesen Kerneffektoren gehören XopR, AvrBs2, XopK, XopL, XopN, XopP, 23

31 EINLEITUNG XopQ, XopX und XopZ. Der Verlust eines der Gene die für diese Haupteffektoren kodieren führt generell zu einer reduzierten Virulenz des Pathogens (zusammengefasst in Ryan et al., 2011). Eine weitere prominente Effektor-Gruppe in Xanthomonas stellt die XopJ-Gruppe dar, zu der neben XopJ (Xanthomonas outer protein J) auch AvrRxv, AvrBsT und AvrXv4 gehören. Im folgenden Abschnitt soll nun näher auf die XopJ-Gruppe und damit auf die YopJ-Familie eingegangen werden. 1.6 YopJ-Familie Die YopJ-Familie der Typ III Effektoren ist einer der größten und am weitesten verbreiteten bakteriellen Effektor-Familien. Mitglieder dieser großen Familie können sowohl in Tier- als auch Pflanzenpathogenen gefunden werden, was daraufhin deutet, dass diese Effektorproteine möglicherweise konservierte Ziele besitzen oder sich breit funktionell spezifizieren lassen (Ma et al., 2006). Namensgeber dieser wichtigen Effektor-Familie ist YopJ (Yersinia outer protein J) aus Yersinia pestis, dem Erreger der Schwarzen Pest. Orth und Kollegen entdeckten im Jahre 2000, dass die YopJ Effektor-Familie strukturelle Ähnlichkeiten zu Cystein Proteasen des Adenovirus aufweist, weshalb YopJ anfänglich zur Familie der CE C55-Proteasen gezählt wurde (Orth et al., 2000). Proteasen in dieser Familie zeichnen sich durch eine katalytische Triade aus, die aus den Aminosäureresten Histidin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure und Cystein (H/E/C oder H/D/C) besteht (Abbildung 1.7). Die gezielte Mutation des katalytischen Kerns bei Mitgliedern dieser Effektor-Gruppe führt zu einer gestörten Funktion dieser Effektoren in ihren jeweiligen Wirtszellen (Hotson & Mudgett, 2004). Außerdem besitzt YopJ weitere strukturelle Ähnlichkeit zu Ulp1 aus Hefe (ubiquitin-like protease), einer Cystein Protease der C48 Familie, und reduziert damit die Akkumulation von SUMO-Proteinkonjugaten (Orth et al., 2000). Abbildung 1.7: Strukturelle Eigenschaften einiger Mitglieder der YopJ-Familie. In grün ist die für die YopJ- Familie der Effektoren typische katalytische Triade hervorgehoben. Die Aminosäurereste, die die katalytische Triade formen, sind in der Proteinsequenz in grün hinterlegt. 24

32 EINLEITUNG Vertreter der YopJ-Familie in Tierpathogenen sind AvrA (Salmonella typhimurium), VopJ (Vibrio parahaemolyticus) und AopP (Aeromonas salmonicida). In phytopathogenen Bakterien oder Symbionten können YopJ-Homologe in Pseudomonas (HopZ-Familie), Xanthomonas (AvrRxv, AvrXv4, AvrBsT und XopJ), Erwinia (ORFB), Ralstonia (PopP1 und PopP2) und Rhizobium (Y4LO) gefunden werden (Ma et al., 2006). Die meisten dieser Effektoren besitzen die Fähigkeit Immunantworten in ihren jeweiligen Wirtsorganismen abhängig von ihrer katalytischen Funktion zu unterdrücken, indem sie eukaryotische enzymatische Aktivitäten nachahmen (Orth et al., 2000; Roden et al., 2004; Zhou et al., 2005; Mukherjee et al., 2006; Tasset et al., 2010; Zheng et al., 2011; Lee et al., 2012). Dabei fällt auf dass einige Mitglieder der YopJ-Familie eine Acetyltransferase-Aktivität besitzen (YopJ, PopP2 und HopZ1a). Beispielsweise kann YopJ die MAPK Kinase MKK6 oder IκB acetylieren und verhindert dadurch die Phosphorylierung beider Proteine, was zu einer Störung im MAP Kinaseweg in Säugetieren führt (Mukherjee et al., 2006). Des Weiteren zeigen neuere Studien, dass der Effektor HopZ1a aus dem Phytopathogen Pseudomonas durch eine Acetylierung von Tubulin die Sekretion und damit basale Abwehrmechanismen beeinflussen kann (Lee et al., 2012) XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria XopJ ist ein Typ-III Effektor aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, der auch zur YopJ- Superfamilie gehört und damit zur Familie der CE C55-Cystein Proteasen (Orth et al., 2000). Ursprünglich wurde dieser Effektor als ein HrpG-induziertes und reguliertes Gen identifiziert (Noël et al., 2001). HrpG, ein Mitglied der OmpR-Familie der 2-Komponenten Regulatoren, kontrolliert dabei die Expression der hrp Gene, die für die Pathogenität von Xanthomonas von essentieller Bedeutung sind (Schulte & Bonas, 1992; Wengelnik & Bonas, 1996). Deshalb wurde angenommen das XopJ möglicherweise eine Funktion als Virulenzfaktor besitzt. Noël et al. (2003) wiesen die Translokation von XopJ in Pflanzenzellen nach, konnten aber keinen signifikanten Beitrag zur Virulenz feststellen (Noël et al., 2003). Die in silico Analyse des N-Terminus von XopJ ergab, dass das Protein ein mögliches N- Myristoylierungsmotiv beinhaltet, welches ein typisches eukaryotisches Motiv darstellt (Thieme et al., 2007). Lokalisierungsstudien nach transienter Expression einer XopJ-GFP Fusion verdeutlichten, dass XopJ, abhängig von der Myristoylierung des Glycins an Position 2 der Aminosäuresequenz, an die Plasmamembran gebunden wird (Thieme et al., 2007). Die Plasmamembran Lokalisierung des Effektors steht auch im Zusammenhang mit dessen Funktion, da die Expression von XopJ in Pflanzenzellen die Proteinsekretion an der Plasmamembran inhibiert und damit auch mit Zellwand-basierten Abwehrantworten interferiert (Bartetzko et al., 2009). In vorangegangen Arbeiten wurde mit Hilfe einer Hefe- Zwei-Hybrid Durchmusterung RPT6 als ein möglicher Interaktionspartner von XopJ in 25

33 EINLEITUNG Pflanzen identifiziert (Bartetzko, 2012; Börnke unveröffentlicht). RPT6 ist Bestandteil der regulatorischen 19S Untereinheit des 26S Proteasoms in Eukaryoten und stellt damit ein attraktives Ziel für Phytopathogene dar. Die Interaktion beider Proteine in planta führt zu einer möglichen Verminderung der Proteasomaktivität, abhängig von der katalytischen Aktivität und Lokalisierung des Effektors, sowie zu einer Akkumulation ubiquitinierter Proteine in N. benthamiana (Bartetzko, 2012). 1.7 Zielsetzung dieser Arbeit Pflanzen verfügen über ein komplexes Immunsystem um schädliche mikrobielle Eindringlinge erfolgreich abzuwehren. Dabei ist das pflanzliche Immunsystem aus einem Überwachungssystem zusammengesetzt, das auch Gemeinsamkeiten zu Komponenten aus dem tierischen Immunsystem aufweist. Sowohl in der Pflanzen- als auch in der Tierwelt können jedoch eine Reihe bakterieller Pathogene über ihr Typ-III Sekretionssystem spezialisierte Typ-III Effektoren in die Wirtszelle einschleusen um diverse zelluläre Prozesse in der Wirtszelle zu ihrem Vorteil umzuprogrammieren. Dabei werden Zielproteine in den Wirtszellen modifiziert oder eliminiert, um die Virulenz des jeweiligen Pathogens zu begünstigen. Da die Analyse bakterieller Typ-III Effektoren von essentieller Bedeutung ist und nicht nur zu einem besseren Verständnis der bakteriellen Pathogenese führt, sondern auch ein einzigartiges molekulares Hilfsmittel ist um die pflanzliche Abwehr zu untersuchen, war es Ziel dieser Arbeit, die Funktionen von Typ-III Effektoren während der kompatiblen und inkompatiblen Interaktion in Pflanzen funktionell zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten verschiedene Fragestellungen bearbeitet und beantwortet werden: 1. Wie wirkt sich die Interaktion von XopJ und RPT6 auf das Proteasom aus und welchen Beitrag hat diese Interaktion auf die Virulenz von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in einer kompatiblen Interaktion mit Paprika? 2. Gibt es auch andere YopJ-ähnliche Effektoren in Phytopathogenen, die eine XopJähnliche Funktion auf das Proteasom besitzen? 3. Existieren Effektoren aus Tierpathogenen die Immunreaktionen in Pflanzen auslösen und damit möglicherweise konservierte Zielproteine haben? 26

34 MATERIAL UND METHODEN 2 Material und Methoden 2.1 Material Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien Wenn nicht anders angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien von den Firmen Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Applichem GmbH (Darmstadt), Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Invitrogen (Karlsruhe), New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main) und VWR International GmbH (Darmstadt) bezogen. Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien, die Aufreinigung von PCR-Produkten und für die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden Kits von der Firma Qiagen GmbH (Hilden) verwendet Antikörper Für die Immundetektion, rekombinanter Proteine finden die im Folgenden aufgelisteten Antikörper Verwendung. Antikörper Verdünnung Hersteller/Referenz anti-gfp Antikörper aus Maus, monoklonal 1:1000 Roche, Mannheim anti-c-myc-meerrettichperoxidase-antikörper aus 1:1000 Roche, Mannheim Maus (Klon 9E10) anti-ha-meerrettichperoxidase-antikörper aus 1:500 Roche, Mannheim Maus, monoklonal (Klon 12CA5) anti-mbp Antikörper aus Maus, monoklonal 1:10000 New England BioLabs, Frankfurt am Main anti-gst Antikörper aus Kaninchen 1:2000 Sigma-Aldrich, St.Louis, USA ImmunoPure Ziege-anti-Kaninchen- Meerrettichperoxidase- Antikörper 1:10000 Thermo Fischer Scientific, Bonn ImmunoPure Ziege-anti-Maus- Meerrettichperoxidase- Antikörper 1:10000 Thermo Fischer Scientific, Bonn anti-npr1 Antikörper aus Kaninchen 1:1000 zur Verfügung gestellt von Ursula Pfitzner, Universität Hohenheim

35 MATERIAL UND METHODEN Oligonukleotide und Sequenzierungen Oligonukleotide wurden von Metabion International AG (Martinsried) und Eurofins MWG Operon (Ebersberg) bezogen und Sequenzierungen von GATC (Konstanz) durchgeführt. Primer Sequenz Verwendung SUE50 ATGTCAGACTATGGATCCAATAATAC SUE51 CTGTATAATTACCTATAGGAAAACTT NDR1 für VIGS SUE60 CACCAACAATGAAAATTGCTCCAGTTG SUE61 GGTGGAATCGGAAGCCACGCTCGAACT AvrRpt SUE68 CCTCCAAGTTTGAGCTCGGATAGT SUE69 CCAAGAAATTCTCCATGCACTCTGTC NbPti5 für qrt-pcr SUE70 AATTCGGCCATCGTGATCTTGGTC SUE71 GAGAAACTGGGATTGCCTGAAGGA NbACRE31 für qrt-pcr SUE72 TACCTAGCACCAAGCAGATGCAGA SUE73 TCATGAGGCGTTACTCGGAGCATT NbGRAS2 für qrt-pcr SUE74 CTCGAGAGGAGGATGGGAAATGTA TGCGTCGGCGGATCTCGAATGTCG HopZ1a SUE75 GAATTCTCAAGCGTAGTCTGGGACG TCGTATGGGTAGCGCTGCTCTTCGGC HopZ1a mit HA-tag SUE164 GGCATCTCGAGCACAAAACT SUE165 GCGCCAGACCACTTGAGTAT CaSENU4 für qrt-pcr SUE166 CCAGGAAAGTTGCCAAGAAC SUE167 GCCTCCACTAATGTGGCAAT CaSGR für qrt-pcr SUE168 TCAAGTTTGGTGAGGCTGTG SUE169 GGGATAGAGTGGGTCGACAA CaCab-1b für qrt-pcr CaBPR1_F CAGGATGCAACACTCTGGTGG CaBPR1_R ATCAAAGGCCGGTTGGTC CaBPR1 für qrt-pcr SUE174 CAGATTGTTGCCAGGGAGAT SUE175 ACAACGGCCATGACAAGTTT CaSAR82A für qrt-pcr SUE176 GGAAGACGAAGCTGGAACTG SUE177 TGCGTACAAAACCTGAACCA CaNPR1 für qrt-pcr AktinFW GCCAACAGAGAGAAGATGACCCAGA AktinRev ACACCATCACCAGAGTCCAACACAAT Aktin für qrt-pcr SUE178 CACCAACAATGGGCTGTATTGTTAGCA PopJ SUE179 TGATTGACTATCAGAGATGGCTGTTTC PopJ ohne Stopp SUE180 GAATTCAAAGTTGACCTTTCTCGTAGCG XopJ N-terminale Deletion SUE181 GTCGACCTATGACTGGCGATCAGAGATA XopJ mit Stopp SUE184 GAATTCATGGGTCTATGCGTTTCAAAG XopJ mit EcoRI für pgbt9- Klonierung 28

36 MATERIAL UND METHODEN SUE185 GTCGACCTATGACTGGCGATCAGAGAT XopJ mit SalI und Stopp für pgbt9-klonierung SUE186 GAATTCATGGCGTCAGCTGATGTGGAG NbRPT6 mit EcoRI für pgad424-klonierung SUE187 GTCGACCTACTTCCACAGCTTTCGCAG NbRPT6 mit SalI für pgad424-klonierung SUE188 TGCCATATCCGACTTGGTTAAGTCCG SUE189 GTGGTGGCTGTTGCATCAAATCGGAT CaICS für VIGS SUE191 TTGGAGGCTGTGTGTTCAAG SUE192 TAAAAGCCCGTGCATCTTCT CaICS für qrt-pcr PopJFw GAATTCATGGGCTGTATTGTTAGCAAATC PopJ mit EcoRI für pgbt9- Klonierung PopJRev GTCGACCTATGATTGACTATCAGAGATGGC PopJ mit SalI und Stopp für pgbt9-klonierung SUE193 CACCAACAATGGCCTGTATTGTTAGCA PopJ G2A SUE196 AAGTCTGCCGCAGATGCCGTAATATTCGATTTG PopJ C194A SUE197 CAAATCGAATATTACGGCATCTGCGGCAGACTT PopJ C194A ohne Stopp SUE208 TAACAACACCGATGCTGAGG SUE209 ACTTACCTCGGAAGCTGCAA CaTD für qrt-pcr SUE210 CGACCTAGCAAAGGAGGTTG SUE211 CATCCATTGGACCTTCTCGT CaLAP für qrt-pcr SUE218 ATACAGCTCTGCCGTTTCCA CaEREBP-C3 für qrt- SUE219 CGTGTGTTGGATTGAGGATG PCR SUE220 GTACCCGTGAAGCCTGTTGT CaEREBP-C4 für qrt- SUE221 AAGTTTAAACGCCGCCCTAT PCR VB106 TGCAGCATATCCACGATCTC VB107 CAGGCTCCTGAAGCAACTGT CaRPT6 für qrt-pcr VB114 AGGGAGTGGCAATGGTGATA VB115 AATCAATCCCTCGCATCAAG NbRPT6 für qrt-pcr SS275 AGAGCCTCGAAATCGTCAAA SS276 TGATGAACTCAGCCAAGCAC CaAcre31 für qrt-pcr SS301 AGGGCTTCTACACTTACGATGC SS302 TCCTTCTTACGGGCACTATCAT CaPRQ für qrt-pcr Pti5_5' ATTCGCGATTCGGCTAGACATGGT Pti5_3' AGTAGTGCCTTAGCACCTCGCATT CaPTI5 für qrt-pcr 29

37 MATERIAL UND METHODEN Vektoren Vektor Resistenz Verwenung Hersteller/Referenz pentr /D-TOPO Kan R Entry -Vektor für Gateway - Klonierung Invitrogen,Karlsruhe pcrblunt Kan R Klonierungsvektor Invitrogen,Karlsruhe puc19 Amp R Klonierungsvektor pmal-c2 Amp R N-terminaler MBP-tag; Proteinaufreinigung pdest15 Amp R N-terminaler GST-tag; Proteinaufreinigung prb-35s-gw-3xmyc Spec R, Strep R fach myc-tag, konstitutive binärer Vektor, C-terminaler 3- Expression in Pflanzen pgwb614 Spec R fach HA-tag, konstitutive binärer Vektor, C-terminaler 3- Expression in Pflanzen pk7fwg2 Spec R, Strep R GFP-tag, konstitutive binärer Vektor, C-terminaler Expression in Pflanzen pk7wgf2 Spec R, Strep R GFP-tag, konstitutive binärer Vektor, N-terminaler Expression in Pflanzen pyl279 Kan R binärer Vektor, VIGS- Konstrukt ptrv2a Amp R binärer Vektor, VIGS- Konstrukt ptrv1 Kan R binärer Vektor, VIGS- Helferplasmid prb-35s-gw Bimolekulare Fluoreszenz- Spec R, Strep R VENUS N173 komplementation prb-35s-gw Bimolekulare Fluoreszenz- Spec R, Strep R VENUS C155 komplementation prb-35s-gwmcherry Spec R, Strep R binärer Vektor, C-terminaler mcherry-tag, konstitutive Expression in Pflanzen New England BioLabs, Frankfurt am Main Invitrogen,Karlsruhe Invitrogen,Karlsruhe Bartetzko et al. (2009) Nakamura et al. (2010) Karimi et al. (2002) Karimi et al. (2002) Liu et al. (2002) zur Verfügung gestellt von Thomas Lahaye, LMU München; Szczesny et al. (2010) Liu et al. (2002) Liu et al. (2002) diese Arbeit diese Arbeit Üstün et al. (2013) 30

38 MATERIAL UND METHODEN Hybrid-System pbbr1-mcs-5 Gm R Expressionsvektor für Komplementation von Xcv Clontech, Mountain View, USA Kovach et al. (1995) Bakterienstämme Es wurden folgende Bakterienstämme verwendet: Stamm Genotyp Herkunft/Referenz E. coli Top10 E. coli DH5α E. coli M15/pREP4 E. coli K12 HB101 F-(tetr) mcra D(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80laczdm15 DlacX74 deor reca1 arad139 D(ara-leu)7697 galu galk rspl (StrR) enda1 nupg F80lacZM15.(lacZYA-argF) U169 reca1 enda1 hs- dr17 (rk,mk + ) phoa supe44 thi-1 gyra96 rela1 NalSStrSRifSThiLacAra+Gal+MtlFRecA+Uvr+Lon+(Kan R ) F reca; Helfer prk 2013 (Kan R ) Invitrogen, Karlsruhe Invitrogen Villarejo & Zabin (1974) Bonas et al. (1989) Xcv Wildtyp (Rif R ) Bonas et al. (1989) Xcv ΔxopJ xopj-verlustmutante (Rif R ) Bartetzko (2012) Xcv ΔhrpB1 hrpb1-verlustmutante (Rif R ) Rossier et al. (2000) Xcv ΔhrpF hrpf-verlustmutante (Rif R ) Rossier et al. (2000) Xcv pgbt9 Amp R Köder-Plasmid für Hefe-Zwei- N-terminale Bindedomäne; (pbbr1-mcs- 5) Wildtyp mit pbbr1-mcs-5 (Rif R ; Gm R ) Üstün et al. (2012) Xcv ΔxopJ (pbbr1- MCS-5) xopj-verlustmutante mit pbbr1-mcs-5 (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2013) Xcv ΔxopJ (pbbr1- xopj-verlustmutante mit pbbr1-mcs-5-xopj-ha (Rif R ; Diese Arbeit Üstün et al. (2013) 31

39 MATERIAL UND METHODEN MCS-5-XopJ- HA) Gm R ) Xcv ΔxopJ (pbbr1- MCS-5-XopJ G2A-HA) xopj-verlustmutante mit pbbr1-mcs-5-xopj G2A-HA (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2013) xopj-verlustmutante mit pbbr1-mcs-5-xopj C235A-HA (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2013) Wildtyp mit pbbr1-mcs-5- AvrRpt SseF HA (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2012) Xcv HopZ1a-HA) Wildtyp mit pbbr1-mcs-5- HopZ1a-HA (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2012) Xcv ΔxopJ (pbbr1- MCS-5-XopJ C235A-HA) Xcv (pbbr1-mcs- 5-AvrRpt SseF HA) (pbbr1-mcs- Xcv ΔhrpB1 (pbbr1-mcs- 5-AvrRpt SseF HA) hrpf-verlustmutante mit pbbr1-mcs-5- AvrRpt SseF HA (Rif R ; Gm R ) Diese Arbeit Üstün et al. (2012) Pst DC3000 Wildtyp (Rif R ) Salmonella Typhimurium Wildtyp NCTC Zur Verfügung gestellt von Mary Beth Mudgett, Stanford University, USA ATCC 14028s A. tumefaciens C58C1 Rif R mit Helferplasmid pgv2260 (Amp R ) Van Larebeke et al. (1974); Deblaere et al. (1985) 32

40 MATERIAL UND METHODEN Hefestämme Für die Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente wurden folgende Stämme verwendet: Stamm Genotyp Referenz Y190 MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4, gal80, cyhr 2, LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3, URA3::GAL1uas- GAL1TATA -lacz Flick & Johnston, (1990); Harper et al., (1993) Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen Nicotiana benthamiana N. benthamiana Pflanzen wurden bei 25 C tags und 20 C nachts bei einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 40 % gezüchtet. Eine Zusatzbeleuchtung garantierte auch tagsüber eine konstante Lichtmenge. Capsicum annuum Paprikapflanzen des Kultivars Early Cal Wonder (ECW) wurden unter Gewächshausbedingungen bei einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 60 % und zusätzlicher Beleuchtung angezogen. Tagsüber wurde das Gewächshaus auf 26 C und nachts auf 22 C beheizt. Arabidopsis thaliana A. thaliana Pflanzen wurden im Percival-Klimaschrank (CU-36L; CLF PlantClimatics GmbH, Wertingen) unter Kurztagbedingungen (8 Stunden Licht) bei konstanten 22 C am Tag und 19 C in der Nacht angezogen. 2.2 Methoden Pflanzentransformation Transiente Transformation von Nicotiana benthamiana Um Proteine in Pflanzen transient zu exprimieren, wurde die Agrobakterien-vermittelte Transformation von N. benthamiana durchgeführt. Dazu wurden Agrobakterien (Stamm C58C1 mit dem Helferplasmid pgv2260 (Deblaere et al., 1985; Hofgen & Willmitzer, 1988), die das entsprechende Plasmid mit dem gewünschten Gen enthielten, in 50 ml YEB-Medium mit Antibiotika angeimpft und ü/n bei 28 C wachsen gelassen. Anschließend wurde die Kultur für 20 Minuten bei 4500Upm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 25 ml Wasser 33

41 MATERIAL UND METHODEN gewaschen und erneut für 20 Minuten bei 4500Upm zentrifugiert. Zum Schluss wurde das Pellet in 25 ml MilliQ-Wasser aufgenommen, die od600 bestimmt und auf 1,0 eingestellt. Anschließend wurden die N. benthamiana-blätter mit einer nadellosen Spritze auf der Blattunterseite mit der Bakteriensuspension infiltriert Virus-induziertes gene silencing (VIGS) in N. benthamiana und Paprika Die in dieser Arbeit verwendete VIGS Methode wurde verändert nach Üstün et al. (2012) und beruht auf einer Gateway-kompatiblen Version eines Hybrid-Vektors aus dem Tabak- Mauchevirus ([engl.] tobacco rattle virus, (TRV)), einem RNA-Virus (Liu et al., 2002). Dieser Vektor dient als Zielvektor (ptrv2) für beliebige cdnas. Diese werden in Agrobakterien transformiert und der cdna-klon zusammen mit dem Agrobacterium-Klon, der ein Heflerplasmid (ptrv1) besitzt durch Agro-Infiltration in N. benthamiana ko-exprimiert. Wenn Pflanzenzellen mit beiden Konstrukten transformiert wurden, kann sich der Virus replizieren, assemblieren und somit in der Pflanze ausbreiten. Die Pflanze reagiert über PTGS ( Post Transkriptionelles Gene Silencing ) auf den Virus und startet eine Abwehrreaktion. Deshalb wird die endogene mrna des Zielgens degradiert und abgebaut. Das korrespondierende Protein kann somit nicht mehr gebildet werden. Agrobakterien-Stämme mit dem ptvr1-vektor und den ptrv2-gfpsil, PYL279-RPT6, ptvr2a-ics und ptrv2-npr1 (Üstün et al., 2013; Liu et al., 2002) wurden mit einer od 600 von 1,0 in einem Verhältnis von 1 zu 1 vermischt und in die Kotyledonen 2-Wochen alter Paprika oder N. benthamiana Pflanzen mit einer nadelfreien Spitze auf der Blattunterseite infiltriert. Inokulierte Paprika Pflanzen wurden für 56 Stunden bei 20 C/16 C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 45% im Dunkeln gehalten. Anschließend wurden sie dann zusammen mit N. benthamiana VIGS-Pflanzen bei 25 C tags und 20 C nachts und einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 40 % gezüchtet Mikrobiologische Methoden Bakterienanzucht Die Kultivierung von E. Coli erfolgte bei 37 C in LB Medium (10 g/l Bacto-Trypton, 10 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt), die von A. tumefaciens bei 28 C in YEB Medium (5 g/l Rinderextrakt, 1 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Saccharose, 2 mm MgSO 4 ). Die Anzucht von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria erfolgte auf NYG-Medium (5 g/l Pepton, 3 g/l Hefeextrakt, 20 ml Glycerin) bei 28 C oder 30 C. Antibiotika wurden mit Ausnahme von Rifampicin in Wasser gelöst und sterilfiltriert. Rifampicin wurde in DMSO gelöst und nicht sterilfiltriert. 34

42 MATERIAL UND METHODEN Zur Selektion wurden folgende Antibiotika in gegebenen Konzentrationen eingesetzt: Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration Ampicillin 100 mg/ml 200 µg/ml Kanamycin 50 mg/ml 50 µg/ml Rifampicin 50 mg/ml 50 µg/ml (für Xcv 100 µg/ml) Spectinomycin 50 mg/ml 50 µg/ml Streptomycin 10 mg/ml 20 µg/ml Gentamycin 15 mg/ml 15 µg/ml Anzucht und Transformation von Hefe Der Hefestamm Y190 wurde auf YPAD- (Vollmedium: 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Glukose, 100 mg/ml Adenin) bzw. SCAD-Medium (Selektionsmedium: 20 g/l Glukose, 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base, 0,67 g/l Aminosäure-Mix, 100 mg/ml Adeninhemisulfat, ph=5,8) angezogen. Die Transformation von Hefe erfolgte nach (Schiestl & Gietz, 1989; Gietz et al., 1992). Zur Analyse der direkten Interaktion von zwei bekannten Proteine wurden zunächst die entsprechenden Plasmide in den Reporterstamm Y190 transformiert und die Transformanden für 3-4 Tage bei 30 C auf SCAD Trp - /Leu - selektiert. Danach wurden die Zellen auf SCAD Trp - /Leu - /His mm 3-Aminotriazol (3-AT) überimpft und auf HIS3- und lacz-expression getestet. Dabei fungiert das HIS3-Genprodukt als Reporterprotein und 3-AT als kompetetiver Inhibitor um das Wachstum von falsch-positiven Klonen zu verhindern. Die Expression des lacz-reportergens erfolgte nach der Filterlift-Assay-Methode nach von (Breeden & Nasmyth, 1985) Infektion von Paprika oder N. benthamiana Pflanzen mit Xcv Für Infektionsexperimente wurden ca. 5-6 Wochen alte Pflanzen verwendet. Xcv Bakterienkulturen wurden über Nacht in NYG Medium bei 28 C kultiviert, bei 4500rpm für 15 min bei 4 C zentrifugiert und mit sterilem 1 mm MgCl 2 gewaschen. Die Zellen wurden in 1 mm sterilem MgCl 2 resuspendiert und die Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 2x10 8 colony forming units(cfu) ml -1 eingestellt. Für Bestimmung des Bakterienwachstums wurde eine Bakteriendichte von 1x10 6 oder 1x10 5 cfu/ml verwendet. Anschließend wurden die Bakterien von der Blattunterseite über das stumpfe Ende von Einwegspritzen injiziert. Für biochemische und molekularbiologische Analysen wurden Blattproben zu angegeben Zeiten nach Infektion genommen und sofort in flüssigem Stickstoff gefroren. Zur Bestimmung des bakteriellen Wachstums in planta wurden Blattscheiben in 500 µl sterilem Wasser aufgenommen. 35

43 MATERIAL UND METHODEN Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standardmethoden Grundlegende Techniken der Nukleinäuremanipulation wie z.b. Amplifikation von DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen, Verknüpfen von DNA mit Hilfe von Ligasen, Reinigung von DNA-Fragmenten, Agarose- Gelelektrophorese von Nukleinsäurem, Anzucht von E. coli, Transformation von E. coli, Präparation von Plasmiden, wurden nach Sambrook et al. (2001) durchgeführt. Bakterien-Plasmid-DNA wurde mit dem QiaPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. Für die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) verwendet und die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel erfolgte durch das QiaQuick Gel Extraction Kit. Einige Konstrukte in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der pentr/d-topo -Klonierung (Invitrogen ) angefertigt. Dabei wurde nach Protokoll des Herstellers vorgegangen Ortsgerichtete Mutagenese Die Herstellung der PopJ-Varianten C194A und G2A erfolgte nach Protokoll des QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kits von Agilent Technologies (Waldbronn) Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen Die Extraktion von RNA wurde für den Nachweis von Vollängen-mRNA in verschiedenen PCR Methoden die Methode nach (Logemann et al., 1987) verwendet. Die RNA Konzentration wurde an einem ND-1000 Spectrophotometer (NanoDropTechnologies) bestimmt DNAse Verdau und cdna Synthese Um RNA von möglichen DNA-Kontaminationen zu befreien, wurde die Gesamt-RNA den Herstellerangaben entsprechend mit DNaseI (Fermentas) behandelt. Die cdna wurde mit Hilfe der RevertAidTM H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase (Fermentas) laut Herstellerangaben synthetisiert. Falls nicht anders erwähnt, wurden Oligo(dT) Oligonukleotide als Primer für die cdna Synthese eingesetzt. 36

44 MATERIAL UND METHODEN Quantitative Real-time PCR (qrt-pcr) Die cdna wurde mit Hilfe des Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent) in einem MX3000P real-time PCR Gerät nach Herstellerangaben amplifiziert. Als Matrize wurde unverdünnte oder 1:10 verdünnte cdna eingesetzt. Die cdna-amplifizierung von 18S rrna (für N. benthamiana) und Aktin (für C. annuum) wird zur Standardisierung des Transkript- Levels verwendet und dient als Referenz. Die Berechnung der relativen Genexpression erfolgte mithilfe der MxPro v4.10 Software von Agilent. Statistische Analysen erfolgen durch den student s t-test. Ansatz für qrt-pcr 1 µl cdna 1 µl Primer 1 (1 µm) 1 µl Primer 2 (1 µm) 7 µl SYBR Green Mix 10 µl Wasser PCR-Programm 95 C 10 min 95 C 30 sec 60 C 30 sec 72 C 30 sec 95 C 1 min 55 C 30 sec Zyklen C 30 sec Triparentale Konjugation Für die Komplementation von der Xcv ΔxopJ Verlustmutant wurden die bereits vorhandenen pbbr1-mcs-5-xopj-ha, -XopJ 235A-HA und XopJ-G2A-HA Konstrukte mittels triparentaler Konjugation wiedereingebracht. Die Methode wurde auch für die Transformation der pbbr1-mcs-5-(avrrpt SseF ) und -HopZ1a Konstrukte in Xcv Wildtyp oder in Xcv ΔhrpB1 verwendet. Für eine erfolgreiche triparentale Konjugation sind drei Bakterienstämme benötigt. Der Rezipient ist die zu komplementierende Deletionsmutante. Der Donor ist der E. coli DH5α-Stamm mit dem entsprechenden pbbr1mcs-5 Expressionsplasmid. Als dritte Komponente wird ein E. coli Helfer Stamm benötigt, der das für den Transfer genetischen Materials notwendige F-Plasmid trägt. Durch Konjugation kann dieses auf den Donor übertragen werden, der seinerseits damit in der Lage ist, Sex-Pili zum Rezipienten aufzubauen und das Deletionsplasmid aufzunehmen. Der Rezipient wurde 2 Tage bei 28 C auf NYG Medium angezogen, die E.coli Stämme über Nacht bei 37 C auf LB Medium. Anschließend wurde von jedem Stamm ca. 5 10mm Bakterienrasen von der Platte abgenommen, in 500 µl NYG Medium resuspendiert und wie folgt gemischt: 50 µl Rezipient, 10 µl Donor und 10 µl Helfer. Der gesamte Mix wurde auf eine NYG Platte aufgetropft und unter der Sterilbank leicht getrocknet. Die Platte wurde über Nacht bei 28 C inkubiert und die gewachsenen Bakterien am nächsten Tag von der Platte abgenommen und in 500 µl NYG Medium (+Rif, +Gm) resuspendiert. Anschließend wurde die Bakteriensupension 30 sec bei 37

45 MATERIAL UND METHODEN Upm abzentrifugiert und das Pellet in 100 µl NYG (+Rif, +Gm) resuspendiert. Jeweils 50 µl und 100 µl einer 1:10 Verdünnung wurden auf selektivem NYG Medium (+Rif/ +Gm) ausplattiert und 2 bis 3 Tage bei 28 C kultiviert. Die gewachsenen Klone wurden in 3 ml flüssiges NYG Medium (+Rif, +Gm) überführt und bei 28 C über Nacht inkubiert. Von dieser Kultur wurde am nächsten Tag wieder ein Aliquot in 3 ml frisches NYG Medium (+Rif, +Gm) überimpft und ebenfalls bei 28 C über Nacht inkubiert. Um zu überprüfen, ob die Plasmide aufgenommen wurden, wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wurden je 500 µl der Übernachtkulturen für 8 Minuten bei 13000Upm abzentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden in je 500 µl 1 mm Magnesiumchlorid resuspendiert. Die Suspensionen wurden für 8 Minuten bei 95 C gekocht und für weitere 8 Minuten bei Upm pelletiert. Die Überstände wurden in neue Eppendorfgefäße überführt und dienten als Matrizen für die PCR. Von positiven Klonen wurden jeweils 2 Gefrierstocks angelegt. Dazu wurden 930 µl einer Übernachtkultur mit 70µl sterilem DMSO versetzt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Anschließend wurden die Stämme bei -80 C aufbewahrt Biochemische und physiologische Methoden Induktion und Aufreinigung von affinitätsmarkierten Proteinen aus E. coli Für die Aufreinigung von markierten Proteinen, wurden die entsprechenden Vektoren in E. coli- Zellen transformiert. Mit diesen Bakterien wurde zunächst eine Vorkultur in LB- Medium mit adäquaten Antibiotika mit einem Volumen von 5 ml angesetzt. Diese wurde über Nacht bei 37 C inkubiert. 3 ml dieser Vorkultur wurden in 100 ml frisches Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft. Die Hauptkultur wurde ebenfalls bei 37 C geschüttelt. Bei Erreichen einer od600 von 0,5 wurde 1 mm IPTG hinzugegeben und somit die Proteinexpression induziert. Daraufhin wurde die Kultur für 24 Stunden bei 18 C oder 37 C (für GST-RPT6) weiter geschüttelt. Die Ernte der Zellen erfolgte für 20 Minuten bei 4000 Upm. Die anschließende Aufreinigung GST- und MBP-markierter Proteine erfolgte nach Herstellerangaben (GE Healthcare und New England Biolabs) GFP-Trap aus N. benthamiana für Koimmunpräzipitation Die GFP-Trap wurde nach (Schwessinger et al., 2011) und Herstellerangaben (GFP- Trap _M, Chromotek GmbH, Planegg-Martinsried) durchgeführt. 38

46 MATERIAL UND METHODEN In vitro Ko-Immunopräzipitation Hierzu wurden die rekombinanten Proteine nach induziert. Dabei wurden die Bakterienzellen durch sonifizieren aufgeschlossen und GST-RPT6 über die Glutathion- Sepharose Matrix nach Herstellerangaben (GE Healthcare) aufgereinigt und eluiert. Währenddessen wurde MBP-XopJ an die Amylose-Matrix für 1 Stunde bei 4 C auf einem Überkopfroller (10 Upm) gebunden. Nach mehrmaligem Waschen wurde dann das GST- RPT6 Eluat vollständig auf das Amylose-Harz gegeben und wiederum für 1 Stunde bei 4 C auf einem Überkopfroller (10 Upm) inkubiert. Danach wurde MBP-XopJ nach Herstellerangaben von der Amylose-Matrix eluiert (New England Biolabs). Die Proben wurden auf ein Proteingel aufgetragen und Western Blots mit MBP- Antikörper bzw. GST- Antikörper (Detektion des Interaktionspartners) durchgeführt Proteingelelektrophorese und Western Blot Für die Western Blots in dieser Arbeit wurden BisTris- oder SDS-Polyacrylamidgele (Laemmli, 1970) verwendet. BisTris-Gele Trenngel Sammelgel 1,43 ml 3,5x Bis Tris Puffer 0,71 ml 3,5x Bis Tris Puffer 2 ml Acyrlamid 0,35 ml Acrylamid 1,57 ml Wasser 1,44 ml Wasser 20 µl 10% APS (v/v) 25 µl 10% APS (v/v) 2 µl TEMED 4 µl TEMED Enticklerlösungen: Lösung 1 Lösung 2 5 ml 100 mm Tris-HCl, ph 100 mm Tris-HCl, ph 5 ml 8,5 8,5 72 µl Culu (250 mm Luminol, 90 mm Cumarinsäure) 3 µl H 2 O 2 Für die Analyse von Gesamtproteinextrakten aus Pflanzen wurden Blattscheiben mit Hilfe des Rotor-Stator-Homogenisators (Heidolph, Schwabach) aufgeschlossen und mit Lämmli- Puffer (200 mm Tris-HCl, ph 6,8; 18% ß-Mercaptoethanol (v/v); 40% Glycerin (v/v); 0,01 % 39

47 MATERIAL UND METHODEN Bromphenolblau (w/v); 8 % SDS (w/v) versetzt. Nach Abkochen für 10 Minuten bei 95 C wurden die Zelltrümmer kurz pelletiert und der Überstand wurde auf ein Gel aufgetragen. Nach dem Gellauf wurden die der Größe nach aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose- Membran (Porablot, Macherey-Nagel, Düren) transferiert. Dazu wurde die Membran in Transferpuffer [39 mm Glycin, 48 mm Tris, 0,0375 % SDS, 20 % Methanol, ph 8,2 (HCl)] äquilibriert. Die Proteine im Gel wurden dann auf die Nitrozellulosemembran bei 1 ma / cm2 für 1,5 Stunden ge- blottet. Anschließend wurde die Membran in Blockierlösung (TBS-T [20 mm Tris, 500 mm NaCl, 0,1 % Tween-20] mit 5 % Magermilchpulver (w/v)) für mindestens eine Stunde inkubiert. Nach der Blockierung wurde die Membran für 1 Stunde in Antikörper-Lösung geschüttelt. Dabei wurde der Antikörper in 1 % Magermilch-TBS-T verdünnt. Danach wurde die Membran dreimal für 5 Minuten in TBS-T gewaschen. Im Anschluss daran erfolgte die Inkubation mit dem zweiten Antikörper, an dem die Meerrettichperoxidase gekoppelt war. Der zweite Antikörper wurde ebenfalls vor Gebrauch in 1 % Magermilch-TBS-T verdünnt. Vor der Entwicklung mit Cumarinsäure, Luminol und H 2 O 2 wurde der Blot wieder dreimal für je 5 bis 10 Minuten in TBS-T gewaschen. Die Inkubation in den Entwicklerlösungen 1 und 2 erfolgte für 1 Minute unter ständigem Schwenken. Antikörper-spezifische Signale wurden auf Röntgenfilmen detektiert Western Blot-Stripping Um die Antikörper von der Nitrozellulosemembran zu entfernen, wurde die Membran in 50 ml 50 C warmem Puffer [25 mm Tris-HCl, ph 6,8, 2 % SDS] für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 500 µl ß-Mercaptoethanol dazu pipettiert und für 15 Minuten inkubiert. Nach dreimal 10-minütigem Waschen der Membran in MilliQ-Wasser, konnte diese wieder blockiert und mit neuen Antikörpern dekoriert werden Bestimmung der Proteasom-und Cystein-Proteaseaktivität Die im Folgenden beschriebene Methode wurde verändert nach (Reinheckel et al., 2000; Jacob-Wilk et al., 2006). Von infiltrierten oder SA-besprühten N. benthamiana oder C. annuum Blättern wurden jeweils vier Blattscheiben mit dem Korkbohrer #5 geerntet. Diese wurden mit dem Rotor-Stator-Homogenisator (Heidolph, Schwabach) in je 200 µl Extraktionspuffer [50 mm HEPES-KOH, ph 7,2, 2 mm ATP, 2 mm DTT, 250 mm Saccharose] aufgeschlossen. Danach wurden die Proben bei Upm und 4 C zentrifugiert. Vom Überstand wurde die Proteinkonzentration mit Hilfe der Bradford-Methode bestimmt (Bradford, 1976). Alle Proben wurden mit Extraktionspuffer auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. Je 50µg-Aliquots bei Nicotiana benthamiana und Capsicum annuum wurden auf je 270 µl mit Proteolyse-Puffer [100 mm HEPES- KOH, ph 7,8, 5 mm MgCl 2, 10 40

48 MATERIAL UND METHODEN mm KCl, 2 mm ATP] aufgefüllt und für 5 Minuten bei 30 C inkubiert. Bei Inhibitor- Behandlung mit MG132 oder E64 wurden diese in der entsprechenden Konzentration zum Pflanzenextrakt hinzugegeben und mit dem Proteolyse-Puffer für 15 min bei 30 C inkubiert. Um die Reaktion zu starten, wurden 0,2 mm des Substrates Succinyl-LLVY- Amidomethylcumarin (Suc-LLVY-NH-AMC) oder Z-LLE-Aminomethylcumarin (Z-LLE-AMC) zugegeben. Zur Bestimmung der Cystein-Protease-Aktivität wurde das fluorogene Substrat Z-Phe-Arg-AMC verwendet. Die Messkinetik wurde 2 bis 3 Stunden durchgeführt. Dabei wurden die Proben mit Licht der Wellenlänge / - 40 nm angeregt und die Emission bei / - 40 nm gemessen. Die Sensitivität wurde bei Suc-LLVY-NH-AMC auf 85 und bei Z- LLE-AMC auf 60 eingestellt. Jede Probe wurde einmal pro Minute angeregt. Die Proteasomaktivität wurde anhand des linearen Anstiegs der Emissionskurve bestimmt und wird als Fluoreszenz Einheiten pro Minute (RFU min -1 ) oder in Prozent ausgedrückt Bestimmung des Xcv Wachstums in planta Zur Bestimmung der Bakteriendichte wurden Xcv-infizierte N. benthamiana oder C. annuum Blattscheiben (Korkbohrer 4) in sterilem H 2 O homogenisiert und serielle Verdünnungen angefertigt. Ein Aliquot wurde auf selektivem NYG Medium (+Rif bzw. +Rif/+Gm) ausplattiert. Nach zwei bis drei- tägiger Kultivierung bei 28 C erfolgte die Auszählung gewachsener Kolonien Messung der Ionen-Leckage Die Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit erfolgte nach (Stall et al., 1974). Um die maximal mögliche Leitfähigkeit der Probe zu messen, wurden die Proben für 1 Stunden aufgekocht. Die Leitfähigkeit wird als prozentualer Anteil von der maximal möglichen Leitfähigkeit nach Aufkochen ausgewertet oder in Zeitkinetik-Experimenten in µs/cm angegeben Bestimmung der Gehalte an Salizylsäure Freie Salicylsäure (SA) und SA-Glucoside wurde modifiziert nach (Nawrath & Metraux, 1999) extrahiert. Blattmaterial mit einer Fläche von 2 cm 2 wurde mit 250 ng Ortho-Anissäure (o- ANI) als internem Standard versetzt und je einmal mit 600 µl 70% MeOH bzw. 600 µl 90% MeOH bei 65 C für 1 h extrahiert. Das Lösungsmittel der vereinigten Extrakte wurde in einem Vakuumkonzentrator (Bachofer, Reutlingen) eingeengt. Nach einer Proteinfällung mit 500 µl 5% (w/v) Trichloressigsäure wurden freie Phenole zweimal in 600 µl Cyclohexan/Ethylacetat (1:1) ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen wurden 41

49 MATERIAL UND METHODEN wiederum im Vakuumkonzentrator eingeengt und in 400 µl 20% Acetonitril/80% 25 mm KH 2 PO 4 (ph 2.6), der mobilen Startphase der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), resuspendiert. Freie SA wurden per HPLC quantifiziert. Für die Quantifizierung von gebundener SA wurde die verbleibende wässrige Phase mit einem Volumenanteil 8 M HCl versetzt und für 1 h bei 80 C inkubiert. Nach dieser sauren Hydrolyse wurde freigesetzte SA zweimal in 600 µl Cyclohexan/Ethylacetat (1:1) ausgeschüttelt, mit 20 µl H 2 O versetzt, um die Sublimation von SA zu vermeiden und das Lösungsmittel im Vakuumkonzentrator eingeengt. Nach dem Resuspendieren in 400 µl 20% Acetonitril/80% 25 mm KH 2 PO 4 (ph 2,6), wurden SA, o-ani über eine Phenomenex Luna Security Guard C18 Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250 x 4,6 mm) (Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 30 C und einer Flussrate von 1 ml/min in einer Dionex Summit HPLC (P680, ASI-100, TCC-100, RF-2000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt. Nach einer isokratischen Elution mit der mobilen Startphase für 5 min wurde der Acetonitril- Anteil innerhalb von 23 min auf 50% und in 2 min auf 70% erhöht. Nach 2 min isokratischer Elution wurde der Anteil wieder auf 20% reduziert und die Säulen für 4 min reäquilibriert. Die Einstellungen des Fluoreszenzdetektors wurden dabei jeweils an die Messung von o-ani (0-14 min, Anregung 305 nm, Emission 365 nm), SA (14-22 min, Anregung 305 nm, Emission 407 nm) angepasst. Zur Quantifizierung von SA wurden Standardreihen der Reinsubstanzen verwendet Mikroskopische Methoden und histologische Färbungen Anilin-Blau Färbung von Arabidopsis thaliana-blättern Um Callose-Ablagerung nach flg22-infiltration in A. thaliana zu detektieren wurden die Blätter, wie bereits beschrieben, mit Anilin-Blau gefärbt (Lu et al., 2011) Trypanblau Färbung Die Färbung nach (Koch & Slusarenko, 1990) wurde für die mikroskopische Beobachtung von Zelltodreaktionen angewandt. Das infizierte Blattgewebe wurde in einem Reaktionsgefäß mit der Trypanblau-Färbelösung (10 mg Trypanblau, 10 g Phenol, 10 ml H 2 O, 10 ml Milchsäure, 10 ml Glycerin) bedeckt, für 1 min bei 99 C inkubiert und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gefärbt. Am folgenden Tag wurde das Blattmaterial in gesättigte Chloralhydratlösung (250% (w/v)) überführt, mindestens einen Tag entfärbt und in derselben Lösung gelagert. Mit Trypanblau gefärbte Präparate wurden mit einem Leica DMR- Fluoreszenzmikroskop fotografiert. Dazu wurde die UV-Filter-Anordnung, bestehend aus einem 340 nm Bandpass-Filter und einem 425 nm Langpass-Filter, von Leica verwendet. 42

50 MATERIAL UND METHODEN Konfokale Laserscanning Mikroskopie (KLSM) Für konfokale Analysen wurde ein Leica TCS SP5 II (AOBS) Laserscanning Mikroskop (KLSM; Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar) eingesetzt. Dabei erfolgte die Anregung von GFP und YFP mit einem 65 mw Argon-Laser bei 488 nm bzw. 514 nm und von mcherry mit einem 20 mw DPSS-Laser bei 561 nm. GFP wurde in einem Detektionsbereich von 497 bis 526 nm aufgenommen, YFP bei 527 bis 561nm, mcherry bei 587nm bis 610nm. Zusätzlich konnte noch die Autofluoreszenz des Chlorophylls - nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 488 nm bei 680 bis 730 nm detektiert werden. Die erhaltenen Datensätze wurden mit der Leica-Software LAS_AF und Adobe Photoshop CS3 bearbeitet. 43

51 ERGEBNISSE: XopJ 3 Ergebnisse 3.1 XopJ Phytopathogene Bakterien sind in einer kompatiblen Interaktion mit ihrer Wirtspflanze in der Lage, deren Immunabwehr wirksam zu unterdrücken und eine Krankheit auszulösen. Dabei nehmen die über das Typ III Sekretionssystem (T3SS) translozierten Typ-III Effektorproteine (T3E) eine zentrale Rolle ein, da diese bakteriellen Proteine auf unterschiedlichen Wegen die pflanzliche Immunabwehr supprimieren können. Die Analyse und Charakterisierung der Funktion von T3E ist von essentieller Bedeutung, führt daher oft zu einer Aufklärung der Virulenz-Strategien bakterieller Pathogene und hilft auch Abwehrmechanismen der Pflanze besser zu verstehen oder neue Mechanismen zu entdecken. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Interaktion des Typ-III Effektorproteins XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) mit der Proteasomuntereinheit RPT6 detailliert untersucht werden. Frühere Arbeiten belegen, dass die Interaktion beider Proteine anscheinend zu einer Reduzierung der Proteasomaktivität führt (Bartetzko, 2012). Jedoch ist nicht klar, wie sich diese Interaktion genau auf das Proteasom auswirkt und welchen Beitrag diese Interaktion auf die Virulenz von Xcv in der kompatiblen Interaktion mit Paprika hat. Deshalb wurde der Einfluss von XopJ auf verschiedene Proteasomaktivitäten sowie auf die kompatible Xcv-Paprika Interaktion näher analysiert. Hierbei sollte aufgeklärt werden, ob XopJ als ein Virulenzfaktor während der Infektion fungieren kann und wie die Inhibition der Proteasomaktivität mit der Unterdrückung von basalen Abwehrmechanismen zusammenhängt In planta Interaktion von XopJ und Mutanten mit RPT6 In vorangegangenen Interaktionsstudien konnte durch eine Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse die Proteasomuntereinheit RPT6 (Regulatory Particle Triple-A ATPase protein 6) als mögliche Wirtszielstruktur des Xanthomonas Effektorproteins XopJ identifiziert werden (Bartetzko, 2012). Weiterführende Analysen, wie die GFP-Koimmunpräzipitation (Ko-IP), bestätigten eine Wechselwirkung beider Proteine in Pflanzenzellen. Des Weiteren konnten in planta bimolekulare Fluoreszenzkomplementations (BiFC) Analysen bereits zeigen, dass neben der XopJ Wildtypform sowohl die katalytische Mutante XopJ C235A als auch die Myristoylierungsmutante XopJ G2A mit RPT6 interagieren können (Bartetzko, 2012). Um 44

52 ERGEBNISSE: XopJ diese Beobachtung zu stützen wurde eine GFP-Ko-IP mit allen XopJ Varianten durchgeführt. Dazu wurde RPT6, fusioniert mit einem carboxyterminalen GFP, zusammen mit XopJ-, XopJ (C235A)- und XopJ (G2A)-myc mittels Agrobakterieninfiltration transient in Blättern von Nicotiana benthamiana exprimiert. Zwei Tage nach Infiltration wurde RPT6 über dessen GFP-Markierung mittels einer mit GFP-Einzeldomänenantikörpern beschichteten magnetischen Matrix aufgereinigt. Proteine, die mit dem GFP-gekoppelten RPT6 wechselwirken, können damit ko-präzipitiert und in einem Western Blot nachgewiesen werden. Hier in diesem Fall konnten alle drei XopJ Varianten in den Eluaten mit einem antimyc-antikörper detektiert werden (Abbildung 3.1A). Eine unspezifische Affinität der myc- Markierung mit der anti-gfp-matrix kann ausgeschlossen werden, da XopJ-myc und dessen Varianten ohne RPT6-GFP nicht in der Lage waren an die GFP-Matrix zu binden (Abbildung 3.1B). Dies deutet darauf hin, dass neben dem Wildtyp XopJ Protein, die katalytische und die Myristoylierungsmutante, mit RPT6-GFP in planta interagieren können. Dieses Resultat ist damit im Einklang mit den vorherigen BiFC-Studien. Um auszuschließen, dass die Interaktion mit RPT6 eine generelle Eigenschaft von Typ-III Effektoren ist, wurden Ko-IPs von RPT6 mit anderen Xanthomonas Effektoren in die Interaktionsanalyse miteinbezogen. Sowohl XopD-myc als auch XopB-myc konnten nicht an RPT6-GFP binden (Abbildung 3.1C). Abbildung 3.1: Ko- Immunopräzipitation von RPT6-GFP mit XopJ-myc, XopJ G2A-myc und XopJ C235A-myc. A: RPT6-GFP wurde mit XopJ-myc und Varianten in N. benthamiana über Agrobakterienvermittelte Transformation transient koexprimiert. 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde ein Rohextrakt gewonnen (Input) und RPT6-GFP wurde über dessen GFP-Markierung mittels magnetischer Nanopartikel, an die ein GFP-Bindeprotein gekoppelt ist, aufgereinigt (Eluat). Die Western Blot Analyse erfolgte mit anti-gfp- und antimyc-antikörpern. B: Als Negativkontrolle wurden XopJ-myc und Mutanten in N. benthamiana exprimiert, anschließend über die GFP-Matrix aufgereinigt. und mit einem anti-myc Western Blot analysiert. C: XopD- und XopB-myc wurden mit RPT6-GFP ko-exprimiert und einer GFP- Ko-Immunopräzipitation unterzogen. Die gewonnen Fraktion wurden mittels Western Blots mit anti-gfp- und anti-myc Antikörpern untersucht. 45

53 ERGEBNISSE: XopJ In vitro Interaktion von XopJ und RPT6 Die bisherigen experimentellen Ansätze schließen nicht aus, dass die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 auch durch ein drittes eukaryotisches Protein vermittelt werden könnte. Daher wurde eine in vitro Koimmunopräzipitation mit rekombinanten, gereinigten Proteinen durchgeführt. Hierzu wurde das Maltose-Bindeprotein (MBP) sowie die Fusionsproteine MBP-XopJ und GST (Glutathione S-Transferase)-NtRPT6 in E. coli M15 Zellen exprimiert und anschließend über eine entsprechende Affinitätsmatrix aufgereinigt (Abb. 3.2). Abbildung 3.2: Proteinaufreinigung von GST-markiertem RPT6 aus E. coli. Das Bakterien-Pellet aus einer 100 ml induzierten E. coli-kultur wurde über Ultraschall aufgeschlossen. Die anschließende Aufreinigung von GST- RPT6 erfolgte mit Hilfe von Glutathion-Sepharose. Nach der Elution mit reduziertem Glutathion wurden die gewonnen Porteinextrakte auf einem Bis-Tris-Proteingel analysiert. Die an die Amylose-Matrix gebunden MBP-markierten Proteine wurden mit dem bereits aufgereinigten rekombinanten GST-NtRPT6 für eine Stunde bei 4 C inkubiert. Gebundene Proteinkomplexe wurden durch Zugabe von Maltose eluiert. Ein darauffolgender Western Blot lässt eine Präzipitation von GST-NtRPT6 mit MBP-XopJ erkennen (Abbildung 3.3). Das Maltose-Bindeprotein allein war nicht in der Lage mit dem Fusionsprotein aus RPT6 und GST zu interagieren und auch GST-RPT6 allein konnte nicht an die Amylose binden (Abbildung 3.3). Die Resultate deuten auf eine direkte Interaktion von XopJ und RPT6 hin. Abbildung 3.3: In vitro Ko-Immunopräzipitation von XopJ mit RPT6. MBP-XopJ und GST-RPT6 wurden in E. coli exprimiert. MBP-XopJ wurde an die Amylose Matrix gebunden und mit GST-RPT6 inkubiert. MBP und GST-RPT6 dienten als Negativkontrolle, ebenso wie GST-RPT6 alleine. Die Elution erfolgte mit Maltose. Die Western Blot Analyse erfolgte mit anti-gst-und anti-mbp Antikörpern 46

54 ERGEBNISSE: XopJ Spezifische Inhibition des Proteasoms durch XopJ Nachdem durch verschiedenste Methoden die Interaktion von XopJ und der Proteasomuntereinheit RPT6 bestätigt werden konnte, wurde der Einfluss von XopJ auf die Proteasomaktivität genauer charakterisiert. Vorangegangene Experimente deuteten darauf hin, dass XopJ durch die Wechselwirkung mit RPT6 die Chymotrypsin-ähnliche 20S Proteasomaktivität herunterreguliert. Die Verminderung der Funktion des Proteasoms durch XopJ war auch von der katalytischen Aktivität und Lokalisierung des Effektors abhängig, da eine Punktmutation in der katalytischen Triade (C235A) und im Myristoylierungsmotiv (G2A), zum Verlust der Inhibition der Proteasomaktivität führt (Bartetzko, 2012). Im Folgenden sollte analysiert werden, ob die durch XopJ vermittelte Reduzierung der Proteasomaktivität ein spezifischer Effekt ist. Die Überexpression von bakteriellen Effektorproteinen in Pflanzen führt oft zu unspezifischen, toxischen Reaktionen, die die Funktion des Proteasoms im Generellen beeinflussen könnten. Deshalb wurde mit XopB ein weiteres Effektorprotein aus Xanthomonas, das keinerlei Ähnlichkeit zu XopJ aufweist, in Nicotiana benthamiana überexprimiert und anschließend die Proteasomaktivität überprüft. Bei XopB handelt es sich auch um einen Virulenzfaktor aus Xanthomonas, der die basale Abwehr möglicherweise über andere Mechanismen als XopJ unterdrücken kann (Schulze et al., 2012). Des Weiteren wurde in die Analyse mit dem viralen Faktor HcPro ein weiteres Protein mit einbezogen. Hierbei handelt es sich um ein multifunktionales Protein aus dem Kartoffel-Virus Y(PVY), das essentiell für den viralen Entwicklungszyklus ist und neben der Funktion die RNA Stilllegung zu supprimieren auch das Proteasom durch die Interaktion mit der α1 Untereinheit inhibiert (Sahana et al., 2012). Wie in Abbildung 3.4 zu sehen ist, geht mit der transienten Expression von XopJ in N. benthamiana eine signifikante Verminderung der Proteasomaktivität um über 40% relativ zur Leervektor-Kontrolle, einher. Die Suppression der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität in Blättern die das virale Protein HcPro exprimieren, die in dieser Messung als Positivkontrolle für die Inhibition des Proteasoms fungierte, war mit der von XopJ vergleichbar. Die Expression von XopB hingegen verursachte keine Beeinflussung der Proteasomfunktion und verhält sich damit genauso wie die Leervektor-Kontrolle (Abbildung 3.4A). In einem anschließenden anti-myc Westernblot konnten sowohl XopJ- als auch XopB-myc nachgewiesen werden (Abbildung 3.4B). Folglich stellt die Suppression der Proteasomfunktion keine generelle Eigenschaft von Typ III Effektoren aus Xanthomonas dar, sondern ist spezifisch für XopJ. 47

55 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.4: Messung der Proteasomaktivität nach transienter Expression von XopJ-myc, XopB-myc und Hc-Pro in N. benthamiana. XopJ-myc wurde neben der Leevektor-Kontrolle (LV) sowie XopB-myc und Hc- Pro in N. benthamiana transient exprimiert. A: 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms in den jeweiligen Blattextrakten bestimmt, in dem der Abbau des fluorogenen Peptids Suc-LLVY- NH-AMC bei 30 C in einem Fluoreszenz-Spektrophotometer beobachtet wurde. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. B: Zur Überprüfung der Expression von myc-markierten Effektorproteinen wurde ein Western Blot mit anti-myc-antikörper durchgeführt. Frühere Studien belegen, dass das fluorogene Substrat Suc-LLVY-AMC neben der ß5 Untereinheit des Proteasoms auch unspezifisch durch Cystein-Proteasen proteolytisch gespalten wird (Groll et al., 2008). Könnte XopJ möglicherweise die Proteasomaktivität auch dadurch reduzieren, indem es Cystein-Proteasen inhibiert? Um dies auszuschließen, wurde die Proteasomaktivität in An- und Abwesenheit von dem Cystein-Protease Inhibitor E64 vermessen. Durch Zugabe von E64 wurde die Suc-LLVY-AMC-Spaltung sowohl in Extrakten die mit dem Leervektor infiltriert wurden als auch von XopJ-exprimierenden Blättern aus N. benthamiana um etwa 10% reduziert (Abbildung 3.5). Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass in beiden Fällen nur etwa 10% des Substrates durch Cystein-Proteasen umgesetzt werden kann. Infolgedessen kann die Inhibition von Cystein-Proteasen durch XopJ ausgeschlossen werden und die direkte Suppression der Proteasomaktivität bestätigt werden. Abbildung 3.5: Proteasomaktivität in der Anwesenheit des Cystein-Protease-Inhibitors E64. XopJ-myc und der Leervektor wurden mittels Agroinfiltration in N. benthamiana transient exprimiert. 48 Stunden nach Expression wurde die Proteasomaktivität mit dem Substrat Suc-LLVY-NH-AMC gemessen. Pflanzenextrakte wurden vor der Messung mit Wasser oder 100 µm E64 für 15 min bei 30 C inkubiert. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch ** P < 0,01 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 4) an. 48

56 ERGEBNISSE: XopJ Zusätzlich zur Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität (hier erfolgt die Spaltung nach einem hydrophoben Rest) des Proteasoms, die die ß5 Untereinheit besitzt, ist die ß1 Untereinheit des 20S Proteasoms für die Caspase-ähnliche Aktivität (Spaltung nach einem sauren Rest) verantwortlich (Borissenko & Groll, 2007). Deshalb wurde die Caspase-ähnliche Proteasomaktivität nach transienter Expression von XopJ in Nicotiana benthamiana gemessen. Hierzu wurde die Caspase-ähnliche Aktivität durch die Verwendung eines fluorogenen Substrates Z-LLE-AMC beobachtet. Die Expression von XopJ-myc führte zu einer ca. 40%-igen, signifikanten Herabregulierung der Caspase-ähnlichen Aktivität in N. benthamiana, verglichen zur Leervektor-Kontrolle (Abbildung 3.6). Die Inhibition der Caspase-ähnlichen Aktivität ist auch von der katalytischen Aktivität und Lokalisierung von XopJ abhängig (Abbildung 3.6). Somit kann XopJ neben der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität auch die Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms supprimieren. Abbildung 3.6: XopJ inhibiert Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms. XopJ-myc sowie Varianten und der Leervektor wurden mittels Agroinfiltration in N. benthamiana transient exprimiert. 48 Stunden nach Expression wurde die Caspaseähnliche Aktivität des Proteasoms über den Abbau des fluorogenen Substrats Z-LLE-AMC bestimmt. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t- Test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an Rekombinantes XopJ inhibiert Proteasomaktivität in Pflanzenextrakten Nach Etablierung der in vivo Inhibition der Proteasomaktivität in XopJ-exprimierenden Pflanzenzellen, kam die Fragestellung auf, ob in E. coli synthetisiertes, rekombinantes XopJ, die Proteasomaktivität in vitro beeinflussen kann. Zu diesem Zweck, wurde MBP-markiertes XopJ und MBP in E. coli produziert und über eine Amylose-Matrix aufgereinigt (Abbildung 3.7A). Anschließend wurden Pflanzenrohextrakte mit 1 µg aufgereinigtem Protein oder dem Proteasominhibitor MG132 inkubiert und vermessen. Die Bestimmung der Proteasomaktivität zeigte, dass in MBP-XopJ behandelten Pflanzenextrakten die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität um ca. 40% geringer war als in Extrakten die mit MBP inkubiert wurden (Abbildung 3.7B). Die Suppression der Proteasomaktivität ist vergleichbar zu der in vivo Inhibition in N. benthamiana Blättern durch XopJ. Eine Inkubation mit MG132 führte zu einer über 80% geringeren Proteasomaktivität und damit zu einer ca. doppelt so starken Suppression der Proteasomaktivität (Abbildung 3.7B). 49

57 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.7: MBP-XopJ inhibiert Proteasomaktivität. A: MBP und MBP-XopJ wurden in E. coli überexprimiert und anschließend über eine Amlyose-Matrix aufgereinigt. Die mit Maltose eluierten Fraktionen wurden auf ein Bis-Tris-Proteingeil aufgetragen. B: Pflanzenextrakte aus N. benthamiana wurden mit jeweils 1 µg MBP-XopJ oder MBP und mit 100 µm MG132 für 30 min bei 30 C inkubiert. Die Proteasomaktivität wurde danach mit Hilfe des Substrates Suc-LLVY-AMC gemessen. Die MBP-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Signifikante Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch ** P < 0,01 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Als nächstes sollte untersucht werden, ob die in vitro Verminderung der Proteasomaktivität genauso wie die in vivo Inhibition, abhängig von der katalytischen Funktion von XopJ ist. Hierzu wurde das über das Amylose-Harz aufgereinigte MBP-XopJ (C235A), neben MBP und MBP-XopJ, in die Analyse miteinbezogen. Messungen ergaben, dass MBP-XopJ wiederum die Proteasomaktivität um etwa 40% vermindert (Abbildung 3.8). Außerdem war die katalytische Mutante von XopJ nicht in der Lage die Aktivität des Proteasoms zu beeinflussen und verhielt sich wie das MBP Protein (Abbildung 3.8). Demzufolge beeinträchtigt das in E. coli synthetisierte XopJ die Proteasomaktivität, in Abhängigkeit von der katalytischen Aktivität von XopJ. Abbildung 3.8: MBP-XopJ inhibiert Proteasomaktivität, abhängig von dessen katalytischer Aktivität. Pflanzenextrakte aus N. benthamiana wurden mit jeweils 1 µg MBP-XopJ, MBP-XopJ C235A oder MBP für 30 min bei 30 C inkubiert. Die Proteasomaktivität wurde mit Hilfe des Substrates Suc-LLVY-AMC gemessen. Die MBP-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Signifikante Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 50

58 ERGEBNISSE: XopJ Virulenzfunktion des Xcv Effektors XopJ in einer kompatiblen Interaktion Einfluss des Effektorproteins XopJ auf die Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Paprika (Capsicum annuum ECW) Interaktion Die bisherigen erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6 in Hefe, in vitro sowie in planta interagiert. Diese Wechselwirkung führt zu einer Reduktion der Proteasomaktivität und scheint dadurch auch die Degradierung von ubiquitinierten Proteinen in Pflanzenzellen zu stören (Üstün et al., 2013). Doch welchen Nutzen hat Xanthomonas das Wirtszellproteasom anzugreifen und kann eine verminderte Proteasomaktivität die Virulenz von Xanthomonas in seiner Wirtspflanze Paprika fördern? Um diese essentiellen Fragen zu beantworten und um einen Zusammenhang zwischen der Funktion des Proteasoms und der Virulenz von Xanthomonas herzustellen, wurde die Virulenzfunktion von XopJ in der kompatiblen Xcv-Paprika Interaktion detailliert untersucht. Frühere Arbeiten zeigen, dass eine Mutation von XopJ in Xcv, keinen Einfluss auf das bakterielle Wachstum und die Symptomentwicklung in suszeptiblen Paprika Pflanzen hat (Noël et al., 2003). Jedoch handelte es sich bei dieser Mutation lediglich um eine Rastermutation, die zu einer Verschiebung des Leserahmens führte. Weiterführende Analysen sollten mit einer neuen xopj Verlustmutante (Xcv ΔxopJ) fortgeführt werden (Bartetzko, 2012). Der Beitrag von XopJ an der bakteriellen Vermehrung wurde mit Hilfe dieses Stammes neubeurteilt. Hierzu wurden suszeptible Paprika Pflanzen mit Xcv ΔxopJ (Vektor) oder Wildtyp (WT)-Xcv (Vektor) mit einem geringen Bakterientiter von 10 5 cfu pro Milliliter infiltriert. Verglichen zum Xcv (Vektor)-Stamm, war das Wachstum von Xcv ΔxopJ (Vektor) sechs und 8 Tage nach Infektion (dpi: days post infection) signifikant reduziert (Abbildung 3.9A). Xcv ΔxopJ Bakterien, die das Komplementations-Konstrukt pbbr1 MCS-5 XopJ-HA [Xcv ΔxopJ (xopj-ha)] über triparentale Konjugation erworben haben, verhalten sich 6 und 8 Tage nach Infektion wie der Xcv-Wildtyp Stamm und komplementieren den Wachstumseffekt (Abbildung 3.9A). Ein ähnliches Ergebnis konnte erzielt werden, wenn Paprika Pflanzen mit den Xanthomonas-Stämmen ohne den Leervektor infiziert wurden (Abbildung 3.9B). Dies weist darauf hin, dass XopJ erst in späteren Stadien der Infektion am Wachstum von Xanthomonas in suszeptiblen Paprika Pflanzen beteiligt ist. 51

59 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.9: XopJ fördert das Wachstum von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Paprika. A: Wachstum von Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor), Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) in Paprika ECW. Die Paprika Blätter wurden mit einer nadellosen Spritze mit einer Bakteriendichte von 10 5 cfu/ml infiltriert. Die Anzahl der Bakterien wurde zu den Zeitpunkten 0, 4, 6 und 8 dpi (days post infection) quantifiziert. Signifikante Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 und ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. B: Die Bakteriendichten des Xcv Stammes und der Xcv ΔxopJ Mutante im Vergleich zueinander. Die Infektion erfolgte wie in A. Signifikante Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an Erhöhte Proteasomaktivität während der Xcv-Paprika Interaktion Da XopJ nach Überexpression in der Modellpflanze N. benthamiana die Proteasomaktivität vermindert, stellt sich die Frage ob XopJ einen ähnlichen Effekt besitzt, wenn es während einer kompatiblen Interaktion über das Xanthomonas Typ III Sekretionssystem transloziert wird. Deshalb wurde die Proteasomaktivität nach Infektion von verschiedenen Xanthomonas Stämmen bestimmt. Die Messung ergab, dass drei Tage nach Infektion, der Wildtyp Xcv Stamm im Vergleich zur MgCl 2 -Kontrolle einen signifikanten Anstieg in der Proteasomaktivität verursachte (Abbildung 3.10). Die Infektion mit Xcv ΔxopJ (Vektor) führte zu einer noch stärkeren Induktion der Proteasomaktivität verglichen mit Xcv WT-infizierten Pflanzen. Dieser Effekt ist XopJ-spezifisch, da die erhöhte Proteasomaktivität durch die Komplementante Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) wieder aufgehoben und auf Xcv WT-Niveau vermindert wurde (Abbildung 3.10). Auch die korrekte Lokalisierung und katalytische Aktivität des Effektorproteins scheint für die Drosselung der Proteasomfunktion von Bedeutung zu sein: Xcv ΔxopJ Stämme die entweder die Myristoylierungsmutante Xcv ΔxopJ (XopJ G2A- HA) oder die katalytische Mutante Xcv ΔxopJ (XopJ C235A-HA) exprimieren und damit translozieren, weisen höhere Aktivitätswerte auf als Xcv WT oder Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) infizierte Pflanzen (Abbildung 3.10). Damit ist XopJ in Abhängigkeit seiner Lokalisierung und katalytischen Aktivität in der Lage die Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion, in vivo, zu dämpfen. 52

60 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.10: XopJ reduziert die Proteasomaktivität während der Xcv-Paprika Interaktion. Paprika Blätter wurden mit den Stämmen die in der Abbildung angegeben sind infiltriert. Null und drei Tage nach Infiltration wurde die Proteasomaktivität mit Hilfe des fluorogenen Substrates Suc-LLVY-NH-AMC bestimmt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 und ** P < 0,01 gekennzeichnet. Hierbei wurde die MgCl 2-Kontrolle gegen Xcv, Xcv gegen Xcv ΔxopJ und Xcv ΔxopJ gegen Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) verglichen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Der beobachtete Anstieg der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion deutet möglicherweise auf eine Rolle des Proteasoms und dessen Aktivität während der basalen Abwehr hin. Um dies näher zu untersuchen, wurde neben Xcv WT, ΔxopJ und der Komplementante, ein Xanthomonas Stamm infiltriert, der im hrpf Gen eine Deletion trug (Xcv ΔhrpF). Normalerweise agiert HrpF als ein bakterielles Translocon, um Effektormoleküle in die Pflanzenzelle einzuschleusen (Büttner et al., 2002). Eine Deletion dieses Gens führt dazu, dass Xanthomonas nicht mehr in der Lage ist Effektoren in die Wirtszelle einzubringen um die PAMP (pathogen-associated molecular patterns)-triggered immunity, PTI, zu supprimieren, weshalb das Bakterium durch die basale Abwehr der Wirtszelle erfolgreich bekämpft werden kann. Infektionen mit diesem Stamm lösen schnelle, charakteristische Abwehrantworten aus, die Teil der PTI sind (Taylor et al., 2012). Paprika Pflanzen die mit Xcv ΔhrpF infiziert wurden, zeichneten sich durch eine verstärkte Proteasomaktivität aus, die auch vergleichbar mit der durch Xcv ΔxopJ verursachten Erhöhung ist (Abbildung 3.11). Diese Daten verdeutlichen, dass das Proteasom eine wichtige Rolle während der basalen Abwehr einnimmt. 53

61 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.11: Proteasomaktivität wird während der basalen Abwehr induziert. Paprika Blätter wurden mit den Stämmen die in der Abbildung angegeben sind infiltriert. Null und drei Tage nach Infiltration wurde die Proteasomaktivität bestimmt, indem der Abbau des fluorogenen Substrates Suc-LLVY-NH-AMC beobachtet wurde. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 und ** P < 0,01 gekennzeichnet. Hierbei wurde Xcv gegen Xcv ΔxopJ, Xcv ΔxopJ gegen Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) und Xcv gegen Xcv ΔhrpF verglichen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 4) an Verlust von XopJ löst Nekrosen in Paprika aus Angesichts der Tatsache, dass XopJ zu späten Zeitpunkten während einer kompatiblen Interaktion von Xanthomonas mit Paprika, einen signifikanten Beitrag zum in planta Wachstums von Xanthomonas leistet, wurde nach einem XopJ-abhängigen Phänotyp gesucht. Dadurch sollte es möglich sein, eine Verbindung zwischen Effektor-Funktion und Virulenz-Aktivität herzustellen. Hierzu wurde die Phänotyp- und Symptom-Entwicklung nach Infektion mit Xcv ΔxopJ im Vergleich zum Wildtyp-Xcv Stamm beobachtet. Damit Wirtsantworten robust ausgelöst und schnell sichtbar werden, wurde dazu mit 10 8 cfu/ml ein hoher Bakterientiter verwendet. Blätter, die mit dem Xcv ΔxopJ Stamm infiziert wurden, entwickelten nach 3 Tagen nekrotische Läsionen, während Wildtyp-Xcv-infizierte Blätter zu diesem Zeitpunkt nur milde Krankheitssymptome in Form von leichten Chlorosen aufwiesen (Abbildung 3.12A). Jedoch konnte 5 Tage nach Infektion nekrotisches Absterben des Pflanzengewebes in beiden Fällen beobachtet werden (Abbildung 3.12C). Folglich kann angenommen werden, dass eine Deletion von XopJ, lediglich die Kinetik der Symptom- Entwicklung während einer kompatiblen Interaktion beeinträchtigt, indem es den Beginn der Nekrose verzögert bzw. inhibiert. Der Xcv ΔxopJ Stamm, in dem das XopJ-HA Konstrukt wiedereingeführt wurde, verhielt sich wie der Wildtyp-Xcv Stamm, während die Xcv ΔxopJ (XopJ G2A-HA) und (XopJ C235A-HA) Stämme nicht in der Lage waren die Entwicklung von nekrotischen Bereichen zu beseitigen (Abbildung 3.12A). Die Expression der Effektorprotein, 54

62 ERGEBNISSE: XopJ die auf einem externen Plasmid über triparentale Konjugation in Xcv ΔxopJ wieder eingeführt wurden, wurde drei Tage nach Infektion mit einem anti-ha Westernblot nachgewiesen. Hierbei ist zu erkennen, dass die Expressionsstärke zwischen den verschiedenen XopJ Varianten kaum variiert und die im vorherigen Experiment beobachteten phänotypischen Unterschiede kein Resultat von verschiedenen Expressionslevels sind (Abbildung 3.12B). Zusammengenommen kann festgestellt werden, dass ein funktionales und richtig lokalisierendes XopJ notwendig ist, um Nekrosen während des Krankheitsverlaufs in suszeptiblen Paprika Pflanzen zu supprimieren. Abbildung XopJ unterdrückt die Ausbildung von Nekrosen in der kompatiblen Interaktion von Xcv mit Paprika. A: Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor), Xcv ΔxopJ (XopJ-HA), XopJ (G2A-HA) und (C235A-HA) wurden mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu pro ml in Paprika Blätter infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurden der Phänotyp der infiltrierten Blätter dokumentiert. B: Die Expression von XopJ-HA und Varianten in den Komplementationsstämmen wurde 3 Tage nach Infektion von Paprika Blättern mit Hilfe eines Western Blots mit anti-ha-antikörpern analysiert. C: Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor), Xcv ΔxopJ (XopJ-HA), XopJ (G2A-HA) und (C235A-HA) wurden mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu pro ml in Paprika Blätter infiltriert. 5 Tage nach Infektion wurden der Phänotyp der infiltrierten Blätter dokumentiert. Um die Annahme, dass XopJ den Beginn der Nekrose inhibiert, zu verstärken, wurde eine gemischte Infektion ( mixed-inoculum ) in planta durchgeführt. Hierzu, wurde zuerst der Xcv ΔxopJ (XopJ-HA)-Stamm in Paprika Blätter infiltriert. Nach einer etwa drei stündigen 55

63 ERGEBNISSE: XopJ Verzögerung wurde daraufhin der Xcv ΔxopJ-Stamm in den mit Xcv ΔxopJ (XopJ-HA)- infizierten Bereich infiltriert. Wie aus Abbildung 3.13 hervorgeht, konnte in dieser gemischten Infektion keine Zelltod-Reaktion induziert werden, da XopJ in den Pflanzenzelle schon bereits vorhanden war. Abbildung XopJ unterdrückt die Ausbildung von Nekrosen in einer gemischten Infektion. Xcv ΔxopJ (Vektor), Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) wurden mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu pro ml in Paprika Blätter infiltriert. Bei der gemischten Infektion wurden die Blätter zunächst mit Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) und danach mit Xcv ΔxopJ (Vektor) infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurden der Phänotyp der infiltrierten Blätter dokumentiert. Im Folgenden wurde eine detailliertere Charakterisierung der Suppression des Zelltods durch XopJ durchgeführt um die bisherigen erzielten Ergebnisse zu stützen und zusätzlich zu quantifizieren. Dafür wurden Blattscheiben, die mit unterschiedlichen Xanthomonas Bakterien infiziert waren, mit Trypanblau angefärbt. Trypanblau ist ein anionischer Diazofarbstoff, der nur durch abgestorbene und perforierte Zellen aufgenommen werden kann, wohingegen Zellen deren Plasmamembran intakt ist, diesen Farbstoff nicht absorbieren (Szczesny et al., 2010). Xcv (Vektor), ΔxopJ (Vektor) und die mit den unterschiedlichen XopJ-Varianten komplementierten Stämme wurden in Paprika Blätter infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurden die Proben entnommen, mit Trypanblau gefärbt und anschließend unter einem Lichtmikroskop untersucht. Im Gegensatz zu nicht infiziertem Blattmaterial (MgCl 2 ), das nicht gefärbt wurde, wies Xcv ΔxopJ-infiziertes Gewebe eine starke Färbung auf (Abbildung 3.14A). Eine schwache Färbung war zu beobachten, wenn Pflanzenmaterial, mit Xcv (Vektor) oder mit der Xcv ΔxopJ (XopJ-HA)-Komplementante infiziert wurden, während die Xcv ΔxopJ (XopJ G2A-HA) und (XopJ C235A-HA) Stämme eine verstärke Trypanblau-Färbung aufzeigten (Abbildung 3.14A). Jedoch stellen sowohl die Trypanblau-Färbung als auch die makroskopisch sichtbaren Symptome kein quantitatives Maß für Nekrosen dar. Um Zelltod-Reaktionen in Pflanzenzellen zu quantifizieren, ist die Bestimmung der Ionen Leckage erforderlich. Zelltod erfolgt oft nach einem starken Ionenausstrom, da die Membranintegrität in sterbenden Zellen gestört ist. Deshalb stellt die Ionen Leckage ein quantitatives Maß für Zelltod-assoziierte Phänotypen dar. Wie zu erwarten war und auch übereinstimmend mit den vorherigen Resultaten, führte die Infektion mit den Nekrosen-induzierenden Stämmen Xcv ΔxopJ, Xcv ΔxopJ (XopJ G2A-HA) und 56

64 ERGEBNISSE: XopJ (XopJ C235A-HA) zu einem signifikanten Anstieg in der Leitfähigkeit, verglichen mit Wildtyp- Xcv (Vektor) oder Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) (Abbildung 3.14B). Zusammenfassend sind diese Daten im Einklang mit den makroskopisch sichtbaren Symptomen, die durch die verschiedenen Xcv Stämme ausgelöst werden. Abbildung 3.14: XopJ supprimiert Zelltod-assoziierte Antworten in Paprika. A: Trypanblau-Färbung von infizierten ECW-Paprika Pflanzen. Die Blätter wurden den Stämmen die in der Abbildung angegeben sind mit einer Bakteriendicht von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurden Blattscheiben geerntet und mit Trypanblau angefärbt, wobei tote Zellen sich blau färbten. B: Die Translokation von XopJ reduziert die Ionen- Leckage in Paprika. Die elektrische Leitfähigkeit von Paprika Pflanzen die mit den angegeben Bakterienstämmen infiltriert wurden, wurde ein, zwei und drei Tage nach Infektion bestimmt. Hierzu wurde Blattscheiben für 24 Stunden inkubiert und anschließend die Leitfähigkeit des Wassers ermittelt. Um das Verhältnis der durch die Infektion verursachten Ionen-Leckage zur maximal möglichen Ionen-Leckage zu berechnen, wurden die Blattproben für eine Stunde bei 95 C aufgekocht und dann erneut vermessen. Die Leckage wird als prozentualer Anteil von der maximal möglichen Leckage nach Aufkochen ausgewertet. Die Signifikanz wurde mittels student s t-test analysiert und ist mit * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Die durch die unterschiedlichen Xcv Stämme ausgelösten Symptome wurde in einer Phänotyp-Verteilung zusammengefasst. Dazu wurden 20 individuelle Paprika ECW Pflanzen mit den jeweiligen Xcv-Stämmen infiltriert und die erzielten Symptome in drei Kategorien unterteilt: Rot steht für starke Nekrosen, Gelb für beginnende Nekrosen bzw. Chlorosen und Grün steht für eine fehlende Nekrose-Bildung (Abbildung 3.15). Hier wird deutlich, dass der Xanthomonas Stamm, der im xopj Gen deletiert ist, in 90% aller Infektionen zu einem Absterben des Gewebes führt, d.h. zu starken Nekrosen (Abbildung 3.15). Xcv ΔxopJ (XopJ G2A-HA) und (XopJ C235A-HA) verursachten zu 60 oder zu 65% starke Nekrosen. Demgegenüber wiesen Blätter, die mit dem Wildtyp-Xcv Stamm oder mit Xcv ΔxopJ (XopJ- HA) infiltriert wurden, nur zu 10-15% starke nekrotische Bereiche auf und zeigten größtenteils keine oder nur beginnende Nekrosen (Abbildung 3.15). Folglich demonstriert die phänotypische Verteilung, dass die XopJ-abhängigen Phänotypen in einer Population von 20 Paprika Pflanzen konsistent auftreten. 57

65 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.15: Zusammenfassung der beobachteten Phänotypen. 20 Paprika Pflanzen wurden mit den verschiedenen Xcv Stämmen mit einem Bakterientiter von 2 x 10 8 cfu/ml infiziert. Die auftretenden Symptome wurden in drei Kategorien unterteilt: Rot für eine starke Nekrose, Gelb für beginnende Nekrosen und Grün für Blätter die noch keine nekrotischen Läsionen entwickelt hatten. Anhand dieser Kategorisierung wurde die Phänotyp-Verteilung ermittelt Phänotypische Veränderungen in Paprikablätter nach Xcv Infektion Da XopJ nekrotische Läsionen im Krankheitsverlauf verzögert und der Xcv ΔxopJ-Stamm bei einer Infektion mit einem hohen Bakterientiter von 10 8 cfu/ml zu einer beschleunigten Zelltod- Reaktion führt, wurde die Symptomentwicklung bei Infektion mit einer niedrigen Bakteriendichte von 10 5 cfu/ml systematisch untersucht. Eine geringere Bakterienkonzentration wurde gewählt, um einer natürlichen Infektionssituation möglichst nahezukommen. Paprika Pflanzen wurden mit Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor) sowie dem Komplementations-Stamm Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) infiziert. Pflanzen, die mit Xcv ΔxopJ infiziert waren, zeigten 10 Tage nach Infektionsbeginn erste chlorotische Bereiche auf, welche sich nach 12 Tagen über das ganze Blatt ausgebreitet hatten (Abbildung 3.16). Nach 13 Tagen konnten erste Nekrosen beobachtet werden, die am 14. Tag der Infektion nahezu das komplette Blatt bedeckten (Abbildung 3.16). Im Vergleich hierzu traten in Xcv (Vektor)- oder Xcv ΔxopJ (XopJ-HA)-infizierten Blättern, erste Chlorosen nach ca. 12 Tagen auf (Abbildung 3.16). Nekrotische Bereiche bildeten sich hier erst 13 Tage nach Infektion, waren jedoch im Vergleich zu Xcv ΔxopJ-infizierten Blättern kleiner (Abbildung 3.16). Wiederum wurden die beobachteten phänotypischen Veränderungen mittels bewertet. Dabei wurden unterschiedlich ausgeprägte Symptome in vier Kategorien unterteilt (Abbildung 3.16). Aus dem Diagramm wird ersichtlich, dass eine Deletion von XopJ, in 60% aller Fälle, zu einer Ausbildung von starken Symptomen führt (Abbildung 3.16). Dahingegen verursachte eine Infektion mit Xcv (Vektor) oder Xcv ΔxopJ (XopJ-HA), lediglich abgemilderte Symptome (zwischen 40 und 80%) oder im Falle von Xcv eine normale Symptomentwicklung die zu 60% eintrat. Keiner der beiden Stämme war in der Lage starke Symptome in Paprika 58

66 ERGEBNISSE: XopJ Pflanzen hervorzurufen (Abbildung 3.16). Alles zusammengenommen scheint XopJ für die Verzögerung von Krankheits-Symptomen, wie Chlorosen und Nekrosen, während der kompatiblen Interaktion notwendig zu sein. Abbildung 3.16: Phänotypische Veränderung in Paprika Blättern nach Xcv-Infektion mit einem niedrigen Bakterientiter. A: Paprika Blätter wurden mit Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor) und Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) mit 5 einer Bakteriendichte von 10 cfu/ml infiltriert. 10 bis 14 Tage nach Infektion (dpi) wurden die Phänotypen der infizierten Blätter makroskopisch beobachtet und fotografiert. B: Zusammenfassung der auftretenden Phänotypen bei einer Infektion mit einem niedrigen Bakterientiter. Anhand von drei Kategorien (Rot für Starke Symptome, Gelb für eine normale Symptomentwicklung und Grün für milde Symptome) wurde Phänotyp-Verleitung in % ermittelt (n=5) Inhibition des Proteasoms vermindert die Zelltod-Reaktion in Paprika Angesichts der Tatsache, dass XopJ das Absterben des Pflanzengewebes nach Xanthomonas Infektion verhindern kann und darüber hinaus die Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion vermindert, sollte im nächsten Abschnitt analysiert werden ob beide Ereignisse miteinander verknüpft sind. Um den Einfluss der Proteasomaktivität auf die Zelltod-Entwicklung zu untersuchen, wurde ein pharmakologischer Ansatz ausgewählt. Die Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG132 (100 µm in 1% Ethanol), zwei Tage nach Infektion mit Xcv ΔxopJ, führte, verglichen mit der Kontrollbehandlung (1% Ethanol), zu einer geringeren Ausbildung von Nekrosen (Abbildung 3.17A). Die Messung der Ionen Leckage 59

67 ERGEBNISSE: XopJ war ebenfalls konsistent mit dem beobachteten Phänotyp nach MG132 Behandlung, da Blätter, die 2 Tage nach Xcv ΔxopJ-Infektion mit MG132 ko-infiltriert wurden, eine signifikant reduzierte Leitfähigkeit aufwiesen, die vergleichbar mit der durch Xcv WT ausgelösten Ionen Leckage war (Abbildung 3.17B). Deshalb kann geschlussfolgert werden, dass MG132 die XopJ Funktion übernehmen kann und damit zu einer Suppression des Zelltodes führt. Dieser Befund bestätigt eine Verbindung der Inhibition des Proteasoms durch XopJ und dessen Fähigkeit Zelltod-Reaktion in einer kompatiblen Interaktion zu verhindern. Abbildung 3.17: Der Proteasom-Inhibitor MG132 verhindert die Ausbildung von Nekrosen in Xcv ΔxopJ-infizierten Blättern. A: Zwei Tage nach Infektion von Paprika Blättern mit Xcv ΔxopJ wurde in das gleiche Blatt 100 µm MG132 oder 1% Ethanol (Kontrolle) infiltriert. Nach 24 Stunden wurde der Phänotyp dokumentiert. B: MG132 führt zu einer Reduzierung der Ionen-Leckage in Abwesenheit von XopJ. Die elektrische Leitfähigkeit wurde in Blättern, die mit Xcv oder Xcv ΔxopJ (mit oder ohne MG132 Behandlung) infiziert waren, bestimmt. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an Funktion von RPT6 während der kompatiblen Interaktion Ein erster wichtiger Hinweis, dass das Proteasom ein wichtiger Bestandteil der basalen Abwehr ist, ergaben Messungen der Proteasomaktivität nach Infektion mit einem T3SSdefizienten Xcv Stamm (Xcv ΔhrpF) (Abbildung 3.11). Des Weiteren verdeutlichen kürzlich veröffentlichte Studien, dass einzelne Proteasomuntereinheiten einen wichtigen Beitrag zur basalen Abwehr leisten können (Yao et al., 2012). Da RPT6 ein Zielprotein von XopJ ist, könnte auch diese Untereinheit des Proteasoms eine essentielle Rolle während der PTI einnehmen. Um nun den Einfluss von RPT6 auf XopJ-abhängige Effekte näher zu charakterisieren, wurde die Herunterregulierung der Expression von RPT6 genutzt. Jedoch konnten Vorarbeiten bereits zeigen, dass die Reduzierung der Transkriptmenge von RPT6 in N. benthamiana, über Agrobakterien-vermitteltes Virus-induzierte Genstilllegung (virus- 60

68 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.18: Virus-induzierte Herunterregulierung von RPT6 in ECW Paprika Pflanzen. A: qrt-pcr Analyse der RPT6 Transkriptmenge 21dpi nach VIGS. Der Wert -3,32 auf der Y-Achse entspricht einer 10-fachen Herunter-regulierung. Die Standardabweichung bezieht sich auf 3 technische Replikate. B: Phänotyp der RPT6-VIGS Pflanzen (Replikat 6 und 10) im Vergleich zur ptrv2-gfpsil Kontrollpflanze 21 Tage nach VIGS. induced gene silencing; VIGS), für die Pflanzen letal ist (Bartetzko, 2012). Da Agrobakterien-vermittelte Transformation und die Virusinduzierte Genstilllegung in Paprika Pflanzen eine geringere Effizienz als in N. benthamiana besitzt (Brummell & Pathirana, 2007), und deshalb womöglich mit einem abgemilderten Phänotyp einhergeht, wurde VIGS von RPT6 in Paprika ECW Pflanzen durchgeführt. Allerdings war 2 bis 3 Wochen nach Infektion mit den VIGS Konstrukten deutlich zu erkennen, dass eine Verminderung der RPT6 Transkriptmenge zu einer Wachstumsretardation der Paprika Pflanzen führte, die schließlich nach kurzer Zeit starben (Abbildung 3.18A). Dieser Phänotyp war auf die Verminderung der RPT6 Genexpression zurückzuführen und nicht Ergebnis der Virus-Ausbreitung, da ptrv2-gfpsil infizierte Kontrollpflanzen ein normales Wachstum aufwiesen. (Abbildung 3.18A). Quantitative Real-time-PCR (qrt-pcr) zeigte, dass die RPT6 mrna-menge in den RPT6-VIGS Pflanzen, im Vergleich zu den ptrv2-gfpsil, ca. 7-fach herunterreguliert war (Abbildung 3.18B). Der letale Phänotyp der RPT6-VIGS Pflanzen schließt demnach eine weitere genetische Analyse der RPT6 Funktion in Paprika während der PTI aus. Eine weitere Möglichkeit die Rolle von RPT6 während der pflanzlichen Abwehr zu verstehen ist die Überprüfung der Genexpression von RPT6 während der kompatiblen Interaktion von Xcv und Paprika. Um die Genexpression während der basalen Abwehr detaillierter und systematischer zu analysieren, wurden Paprika Pflanzen mit MgCl 2, Wildtyp-Xcv, Xcv ΔxopJ und mit Xcv ΔhrpF infiltriert. Sechs Stunden nach Infektion erfolgte die RNA-Probennahme, da hier die gängigsten PTI-Markergene am stärksten induziert sind (Nguyen et al., 2010). Quantitative RT-PCR ergab, dass RPT6 nicht durch PAMPs induziert wird, da die Transkriptmenge nach Infektion mit dem T3SS-defizienten Xcv ΔhrpF-Stamm mit MgCl 2 - Negativkontrolle vergleichbar ist (Abbildung 3.19A). Wiederum war zu beobachten, dass 61

69 ERGEBNISSE: XopJ sowohl Xcv als auch Xcv ΔxopJ die Genexpression von RPT6 positiv beeinflussten (Abbildung 3.19A). Zudem zeigte die Analyse der Genexpression der PTI Markergene CaPTI5 und CaAcre31 einen signifikanten und erheblichen Anstieg in der mrna-menge beider Gene, nach Infektion mit Xcv ΔhrpF (Abbildung 3.19B). Damit kann von einer erfolgreichen Induktion der basalen Abwehr ausgegangen werden. Zusammenfassend konnte verdeutlicht werden, dass RPT6 kein PAMP-induzierbares Gen ist, jedoch möglicherweise durch andere Mechanismen nach Xcv WT oder Xcv ΔxopJ Infektion aktiviert wird. Dieses Phänomen wird in nachfolgenden Teilen der Arbeit weiter charakterisiert. Abbildung 3.19: Analyse der Genexpression von RPT6 während der basalen Abwehr. A und B: Paprika Pflanzen wurden mit MgCl 2, Xcv, Xcv ΔxopJ und ΔhrpF mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Die RNA wurde 6 Stunden nach Infektion extrahiert. Anschließend wurde eine qrt-pcr durchgeführt um RPT6-Transkriptmengen (A) oder die Genexpression der PTI Marker CaAcre31 und CaPTI5 zu bestimmen (B). Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. In A wurde MgCl 2 als Kalibrator festgelegt und in B Xcv WT. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit * P < 0,05 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an XopJ supprimiert SA-abhängige Abwehrantworten in einer kompatiblen Interaktion Messung der SA Gehalte in Xcv infizierten Paprika Pflanzen O'Donnell et al. konnten bereits 2001 zeigen, dass Xcv-induzierte Nekrosen in suszeptiblen Tomatenpflanzen abhängig vom Phytohormon Salicylsäure (SA) sind. Weitere Experimente weisen darauf hin, dass ein anderer Xanthomonas Typ III Effektor, XopD, in der Lage ist SA Gehalte in Tomatenpflanzen zu vermindern, um damit die Pflanzenabwehr zu unterdrücken (Kim et al., 2008). Es besteht die Möglichkeit, dass XopJ eine ähnliche Funktion besitzt und 62

70 ERGEBNISSE: XopJ damit möglicherweise SA-abhängige Prozesse in infizierten Paprika Pflanzen beeinflusst. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden zwei und drei Tagen nach Infektion mit Xcv, SA Gehalte in Paprika Pflanzen bestimmt. In Xcv ΔxopJ-infizierten Paprika Pflanzen waren sowohl die freien als auch die Gesamt-SA Gehalte (freie SA und SA-Glucoside), zwei und drei Tage nach Infektion, in etwa doppelt so hoch wie in Pflanzen, die mit Xcv infizierten waren (Abbildung 3.20). Weiterhin kann der Effekt auf die Salicylsäure-Akkumulation wieder komplementiert werden, wenn XopJ in den Xcv ΔxopJ-Stamm wieder eingebracht wird [Xcv ΔxopJ (XopJ-HA)] und war damit mit dem Xcv Wildtyp Stamm vergleichbar (Abbildung 3.20). Die reduzierten SA-Gehalte deuten darauf hin, dass XopJ die Menge an SA Akkumulation während der Xcv-Infektion signifikant vermindern kann. Abbildung 3.20: XopJ reduziert freie und Gesamt-Salizylsäure-Gehalte während einer Infektion. Suszeptible Paprika ECW Blätter wurden mit 1mM MgCl 2, Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor) und Xcv ΔxopJ (XopJ) mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Feie und Gesamt-SA Mengen wurden 2 und 3 Tage nach Infektion quantifiziert. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an Exogene SA Behandlung imitiert den von Xcv ΔxopJ-ausgelösten Phänotyp in Paprika Falls XopJ die Funktion besitzt Symptome im Krankheitsverlauf von Xcv-infizierten Paprika Pflanzen durch eine Beeinträchtigung der SA Gehalte zu verringern, sollte die SA- Behandlung von Xcv-infizierten Paprikablättern den Xcv ΔxopJ-abhängigen Phänotyp imitieren. Zwei Tage nach Infektion mit Xcv, wurden Paprikablätter mit 5 mm SA besprüht. Bemerkenswerterweise, wurden die SA-behandelten und Xcv-infizierten Paprikablätter genauso nekrotisch wie die Xcv ΔxopJ-infizierten Blätter (3.21). Daher kann die 63

71 ERGEBNISSE: XopJ Schlussfolgerung gezogen werden, dass Xcv-infiziertes Gewebe, trotz XopJ, sensitiv auf eine exogene SA-Anwendung reagiert. Abbildung 3.21: SA-Behandlung induziert die Entwicklung von Nekrosen nach Xcv-WT Infektion. Xcv- WT und Xcv ΔxopJ wurden mit einer Bakteriendicht von 2 x 10 8 cfu/ml in Paprika Blätter infiziert. Zwei Tage nach Infektion wurden Xcv-infizierte Blätter mit 5 mm SA gesprüht. Als Kontrolle wurden Xcv-infizierte Blätter mit Wasser gesprüht (links). Drei Tage nach Infektion wurde der Phänotyp dokumentiert. Die Xcv ΔxopJ Infektion dient als Vergleich für die Nekrose-Bildung Expressionsanalyse von SA- und Seneszenz-abhängigen Markergenen Da XopJ für die Verminderung der SA-Gehalte im Infektionsverlauf verantwortlich ist, wurde über quantitative RT-PCR (qpcr) analysiert, ob die SA-abhängige Genexpression in Xcv ΔxopJ-infizierten Paprika Pflanzen beeinträchtigt ist. Hierfür wurden die Expressionsniveaus der SA Markergene CaPR1 (PR1 Protein), CaPR-Q (Chitinase aus C. annuum) und CaSAR82A (SAR8.2) bestimmt (Kim & Hwang, 2000; Lee & Hwang, 2003; Herbers et al., 1995). Eine Infektion von suszeptiblen Paprika Pflanzen mit Xcv ΔxopJ führte nach drei Tagen zu einer signifikanten Heraufregulierung der drei SA-Markergene im Vergleich zu Xcvinfizierten Pflanzen (Abbildung 3.22). Dies ist auch in Übereinstimmung mit der Tatsache dass XopJ die SA-Menge während einer kompatiblen Interaktion reduziert und damit die SAabhängige Genexpression beeinflusst. Abbildung 3.22: XopJ beeinflusst mrna-gehalte von SA-assoziierten Markergenen. RNA wurde aus Paprika Blättern isoliert, die mit Xcv WT und Xcv ΔxopJ mit einem Bakterientiter von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert 64

72 ERGEBNISSE: XopJ wurden. Zur Bestimmung der mrna-mengen der SA-Markergene CaPR1, CaSAR82A und CaPRQ wurde eine quantitative real-time PCR durchgeführt. Die relative Expression wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. Xcv-WT diente als Kalibrator. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Da bereits bekannt ist, dass die Signale von SA und Jasmonsäure (JA) stark antagonistisch reguliert sind, wurden JA-Markergene auf eine mögliche Repression deren Genexpression untersucht. Bei den in der qpcr eingesetzten Genen handelt es sich um die Leucin Aminopeptidase (CaLAP) und Threonin Deaminase (CaTD) aus Paprika, die durch JA induzierbar sind (Hildmann et al., 1992). Sowohl die Transkriptmengen von CaLAP als auch von CaTD wurden durch eine Infektion mit Xcv ΔxopJ reprimiert, da dieser Stamm SA- Gehalte induziert und damit möglicherweise die JA-Signalweiterleitung verhindert (Abbildung 3.23A). Weiterhin stellt auch Ethylen (ET) ein wichtiges Pflanzenhormon dar, dass vor allem im Zusammenspiel mit SA für eine erfolgreiche Abwehr benötigt wird, indem es upstream vom SA-Signalweg agiert (Robert-Seilaniantz et al., 2011). Darüber hinaus induziert Xanthomonas einen Etyhlen-abhängigen Anstieg in SA-Gehalten (O Donnell et al., 2001). Zudem konnten Kim et al. (2013) erst kürzlich demonstrieren, dass Xanthomonas Effektor XopD ET-vermittelte Abwehrantworten supprimiert und damit indirekt SA-Gehalte vermindern kann (Kim et al., 2008). Natürlich könnte auch XopJ die ET-stimulierte Abwehr beeinträchtigen und damit auch SA negativ beeinflussen. Deshalb wurden auch ETresponsive Markergene nach Infektion mit Xcv oder Xcv ΔxopJ auf transkriptionelle Veränderung analysiert. Hierzu wurden CaEREBP-C3 (Ethylen-responsives Bindeprotein) und C4 ausgewählt, wobei CaEREBP-C3 das Paprika-Homolog-zu ERF4 (Ethylenresponsiver Faktor) aus Tomate ist und letzteres Homolog zu ERF1 aus Tomate ist. Beide ERFs werden spezifisch durch ET induziert und modulieren die ET-Antwort (Tournier et al., 2003; Huang et al., 2004). In der qpcr Analyse nach Infektion mit Xcv und Xcv ΔxopJ wiesen CaEREBP-C3 und C4 keine Veränderungen in den Transkriptmengen auf (Abbildung 3.23B). Folglich scheint der ET-Signalweg nicht durch XopJ beeinflusst zu sein. 65

73 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.23: Einfluss von XopJ auf mrna-gehalte von JA- und ETassoziierten Markergenen. RNA wurde aus Paprika Blättern isoliert, die mit Xcv WT und Xcv ΔxopJ mit einem Bakterientiter von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert wurden. Zur Bestimmung der mrna-mengen der JA-Markergene CaTD, CaLAP (A) sowie der ET-Markergene CaEREBP-C3 und C4 (B) wurde eine quantitative real-time PCR durchgeführt. Die relative Expression wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. Xcv-WT diente als Kalibrator. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Neben der Ausbildung von Nekrosen und Zelltod-Reaktionen, scheint das Phytohormon Salicylsäure auch teilweise an der Seneszenz beteiligt zu sein (Morris et al., 2000; Kim et al., 2008; Guo & Gan, 2012). Da ein hoher bzw. niedriger Bakterientiter von Xcv ΔxopJ Nekrosen bzw. starke Chlorosen in Paprika ECW Pflanzen auslöst, wurde die Hypothese aufgestellt, dass XopJ neben der Suppression von Nekrosen auch für die Verzögerung von Seneszenz-assoziierten Prozessen zuständig ist. Deshalb wurden in die qpcr Analyse weitere Markergene miteinbezogen, die während der Alterungs- oder Pathogen-induzierten Seneszenz signifikant hochreguliert werden. Dabei handelt es sich zum einen, um CaSENU4, das während der Pathogenabwehr und Alterung angeschaltet wird (John et al., 1997; Block et al., 2005) und zum anderen um CaSGR (STAYGREEN) und CaCab-1b (Chlorophyll Bindeprotein), die im Laufe der Seneszenz in Tomaten Pflanzen herunterreguliert werden (Kim et al., 2008; John et al., 1997; John & Keller, 1996). Verglichen mit der Xcv-Kontrolle, waren CaSGR und CaCab-1b-Transkripte, in Xcv ΔxopJ infizierten Pflanzen, signifikant herabgesetzt (Abbildung 3.24). Außerdem wird aus Abbildung 3.24 ersichtlich, dass die Menge an CaSENU4-mRNA durch eine Infektion mit Xcv ΔxopJ, im Gegensatz zur Xcv-Infektion, signifikant erhöht war. Daher kann angenommen werden, dass eine Infektion mit Xcv ΔxopJ Seneszenz-Reaktionen beschleunigt und XopJ jene Seneszenz-assoziierten Merkmale unterbindet. 66

74 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.24: XopJ beeinflusst mrna-gehalte von Seneszenz-assoziierten Markergenen. RNA wurde aus Paprika Blättern isoliert, die mit Xcv WT und Xcv ΔxopJ mit einem Bakterientiter von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert wurden. Zur Bestimmung der mrna-mengen der Seneszenz-abhängigen Markergene wurde eine quantitative real-time PCR durchgeführt. Seneszenz-herunterregulierte Gene sind CaSGR1 und CaCab-1b und Seneszenz-induzierte ist CaSENU4. Die relative Expression wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. Xcv-WT diente als Kalibrator. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 67

75 ERGEBNISSE: XopJ Besteht ein Zusammenhang zwischen dem Proteasom und der SA-vermittelten Antwort? SA stimuliert die Proteasomaktivität und RPT6 Genexpression Da XopJ für die Suppression des Zelltodes benötigt wird, die wiederum mit einer reduzierten Proteasomaktivität und verminderten SA-Gehalten korreliert, stellte sich die Frage, ob SA einen Einfluss auf die Proteasomaktivität bzw. die Genexpression der Proteasomuntereinheit RPT6 hat. Um dies zu beantworten, wurden Paprika und N. benthamiana Blätter mit 5 mm SA besprüht und anschließend die Genexpression von RPT6 mittels qpcr analysiert. Die Behandlung der Pflanzen mit SA führte zu einer Induktion der Genexpression von CaRPT6 und NbRPT6 signifikant erhöht (Abbildung 3.25). Drei Stunden nach SA-Behanldung erreichte die transkriptionelle Aktivierung von RPT6 in Paprika ihren Höhepunkt, wohingegen N. benthamiana Pflanzen den stärksten Anstieg in der mrna Menge von RPT6, eine Stunde nach SA-Besprühung aufzeigten (Abbildung 3.25). Abbildung 3.25: Exogene SA Behandlung induziert die Genexpression von RPT6 in N. benthamiana und Paprika. Paprika und N. benthamiana Blätter wurden mit 5 mm SA besprüht und anschließend wurde zu den Zeitpunkten, die in der Abbildung angegeben sind, Gesamt-RNA aus den behandelten Blättern gewonnen. Die Analyse der Genexpression von CaRPT6 und NbRPT6 erfolgte über qrt-pcr. Die relative Expression wurde 3 Tage nach Infektion gemessen. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. Die unbehandelte Pflanze diente als Kalibrator. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit ** P < 0,01 und *** P < gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 4) an. Da die Salizylsäure-Gehalte während der Xanthomonas Infektion ansteigen, wurde eine transkriptionelle Analyse von RPT6 in der kompatiblen Xanthomonas-Paprika Interaktion durchgeführt. Nach Infiltration der Paprikapflanzen mit MgCl 2, Xcv oder Xcv ΔxopJ, wurden die RPT6 mrna-gehalten nachverfolgt. Drei Tage nach Infektion zeigte sich eine signifikante Erhöhung der RPT6 Transkriptlevels in Pflanzen die mit Xcv infiziert waren, verglichen mit der MgCl 2 -Kontrolle (Abbildung 3.26). Vergleicht man jedoch die Genexpression von RPT6 in Xcv und Xcv ΔxopJ-infizierten Paprika Pflanzen, wird deutlich, dass Xcv ΔxopJ zu einer weitaus stärkeren und signifikanten Induktion der Genexpression 68

76 ERGEBNISSE: XopJ führt als der Wildtyp-Xcv Stamm (Abbildung 3.26). Da die Infektion von Xcv ΔxopJ zu einer verstärkten SA-Akkumulation führt, steht dieses Ergebnis auch im Einklang mit den zuvor gemachten Beobachtungen, dass RPT6 ein SA-induziertes Gen ist. Abbildung 3.26: Analyse der Genexpression von RPT6 während der kompatiblen Interaktion von Xcv mit Paprika. Paprika Pflanzen wurden mit MgCl 2, Xcv und Xcv ΔxopJ mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Die RNA wurde 3 Tage nach Infektion isoliert. Anschließend wurde eine qrt-pcr durchgeführt um RPT6-Transkriptmengen zu bestimmen. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. MgCl 2 wurde als Kalibrator festgelegt. Die Signifikanz wurde über einen student s t-test ermittelt und ist mit * P < 0,05 und ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 4) an. Neben SA-abhängigen transkriptionellen Veränderungen wurde auch der Einfluss des Phytohormons SA auf die Proteasomaktivität studiert. Interessanterweise, stimulierte eine exogene Verabreichung von SA die Proteasomaktivität um bis zu 40% in Paprika und über 100% in N. benthamiana sechs Stunden nach SA Behandlung (Abbildung 3.27). Diese Daten demonstrieren, dass die erhöhte Proteasomaktivität und die Induktion der RPT6 Genexpression eine Antwort auf eine Aktivierung des SA Signalweges ist. Abbildung 3.27: SA Behandlung stimuliert die Proteasomaktivität in N. benthamiana und Paprika. Paprika und N. benthamiana Blätter wurden mit 5 mm SA besprüht und zu den angedeuteten Zeitpunkten für die Proteasomaktivität-Messung unterzogen. Die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms wurde mit Hilfe des fluorogenen Peptids Suc-LLVY-NH-AMC bei 30 C in einem Fluoreszenz-Spektrophotometer bestimmt. Die signifikanten Unterschiede wurden über einen student s t-test ermittelt und sind mit * P < 0,05 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 69

77 ERGEBNISSE: XopJ Die Inhibition des Proteasoms durch XopJ führt zur Akkumulation von NPR1 Die SA-vermittelte Aktivierung der Genexpression von RPT6 und der Proteasomaktivität geben einen ersten Hinweis darauf, dass es eine Verbindung zwischen dem Proteasom und der SA-Antwort bzw. Signalweiterleitung geben muss. Doch welche Rolle könnte das Proteasom in der SA-vermittelten Signaltransduktion einnehmen? Spoel et al. (2009) konnten bereits demonstrieren, dass ein Proteasom-abhängiger Umsatz des Transkriptions- Koaktivators NPR1 notwendig ist, um eine effektive SA-Antwort einzuleiten. Eine kontinuierliche Degradierung und darauffolgende Neusynthese von NPR1 über das 26S Proteasom ist unumgänglich für die Aktivierung von SA-responsiven Abwehrgenen (Spoel et al., 2009). Dieser Befund war Anlass für eine nähere Untersuchung der NPR1 Proteinlevels in Anwesenheit von XopJ. Dabei wurden in N. benthamiana Pflanzen, mittels Agrobakterienvermittelter Transformation, XopJ-myc sowie die katalytische Mutante C235A und die Myristoylierungsmutante G2A transient exprimiert. Interessanterweise, konnte mit Hilfe eines spezifischen anti-npr1 Western Blots eine Akkumulierung von NPR1 nachgewiesen werden, die nur bei XopJ-Expression, jedoch nicht bei Ko-Infiltration mit dem Leervektor auftrat und abhängig von der katalytischen Triade und Lokalisierung des Effektors war (Abbildung 3.28). Das bedeutet, dass nicht die Agrobakterien, sondern eine Überexpression des Proteasom-Inhibitors XopJ, für die Anreicherung von NPR1 verantwortlich ist. Weiterhin konnte nach Applikation von MG132 gezeigt werden, dass erhöhte NPR1 Proteinmengen ein Resultat der Inhibition des Proteasoms waren (Abbildung 3.28). Damit kann zusammenfassend bestätigt werden, dass eine Inhibition des Proteasoms durch XopJ zu einer Akkumulierung von NPR1 führt und damit wahrscheinlich die SA-Signaltransduktion beeinträchtigen kann. Abbildung 3.28: XopJ führt zur Akkumulation von NPR1. XopJ-myc XopJ-C235A-myc und XopJ G2A-myc wurden mittels Agrobakterienvermittelter Transformation transient in N. benthamiana ko-exprimiert. Zusätzlich wurden N. benthamiana Blätter mit 100 µm MG132 infiltriert und nach 6 Stunden beprobt. Die Expression von XopJ-myc und NPR1 Proteinmengen wurden 48 Stunden nach transienter Expression mit einem Western Blot analysiert. Zur Analyse wurde ein anti-npr1- und anti-myc-antikörper verwendet. Die Amidoblack-Färbung der Rubisco dient als Ladekontrolle. Die relative Intensität der Banden wurde mit der ImageJ Software ermittelt. 70

78 ERGEBNISSE: XopJ Verminderung der NPR1 und ICS mrna-menge in N. benthamiana und Paprika In einem direkteren Ansatz die Verbindung zwischen der XopJ-vermittelten Störung des Proteasoms und der SA-Signaltransduktion zu untersuchen, wurde Virus-induzierte Genstilllegung (VIGS) von NPR1 und ICS in Paprika und eine anschließende Infektion mit unterschiedlichen Xanthomonas Stämmen durchgeführt. Wie bereits erwähnt, ist NPR1 ein essentieller positiver Regulator SA-vermittelten Abwehrantworten, der die Aktivierung der Transkription von verschiedenen SA-responsiven Abwehrgenen stimuliert (Pieterse & Van Loon, 2004). Bei ICS handelt es sich um die Isochorismate Synthase die Chorismat in Isochorismat konvertiert, das anschließend zur Salizylsäure umgesetzt wird (Vlot et al., 2009). Dieser Syntheseweg produziert einen Großteil der Pathogen-induzierten Salizylsäure in verschiedenen Solanaceaen, wobei ICS1 aus Arabidopsis thaliana für ca. 90% der SA- Produktion nach Pathogenbefall verantwortlich ist (Uppalapati et al., 2007; Catinot et al., 2008; Garcion et al., 2008). Für das VIGS von ICS und NPR1 wurden zwei Wochen alte Paprika Setzlinge mit einer Mischung aus A. tumefaciens Stämmen infiltriert, die ptrv1 und ptrv2-npr1 bzw ptrv2a-ics oder als Kontrolle ptvr2-gfpsil, enthielten. Drei Wochen nach TRV Ausbreitung, konnte eine 50 bis 80%-Verminderung der mrna-mengen von NPR1 und ICS mittels qpcr bestätigt werden (Abbildung 3.29A). Anschließend wurden diese Pflanzen entweder mit Xcv, Xcv ΔxopJ oder Xcv ΔxopJ (XopJ-HA) infiziert. Dabei konnte überraschenderweise festgestellt werden, dass die Virus-induzierte Genstilllegung von ICS und NPR1 die Ausbildung von nekrotischen Läsionen verhinderte, während der Xcv ΔxopJ Stamm immer noch in der Lage war Zelltod-Reaktionen in den VIGS GFPsil- Kontrollpflanzen auszulösen (Abbildung 3.29B). Die Tatsache, dass die XopJ-abhängige Ausbildung von Nekrosen in NPR1- und ICS- defizienten Pflanzen ausbleibt, suggeriert einen direkten Einfluss des SA-Signalweges an der XopJ-abhängigen Phänotyp Entwicklung. 71

79 ERGEBNISSE: XopJ Abbildung 3.29: VIGS von NPR1 und ICS führen zu einem Verlust der Xcv ΔxopJ-abhängigen Nekrose- Bildung. A: Relative Expressionsniveaus wurden 21 Tage nach Agrobakterien-vermittelter Virus-Infektion ermittelt. Dabei wurde die Expression von Aktin zur Normalisierung verwendet. Als Kalibrator dienten die ptrv2- GFPsil Pflanzen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD für drei technische Replikate an. Es konnten jeweils 5 unterschiedliche Pflanzen als positiv getestet werden, die anschließend für Infektionen verwendet wurden. B: GFPsil-, NPR1-, und ICS-VIGS Pflanzen wurden mit Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor) und Xcv ΔxopJ (XopJ) mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Der makroskopische Phänotyp wurde drei Tage nach Infektion dokumentiert. Dabei deuten die Nummern unterhalb der jeweiligen Infektionen die Anzahl der Blätter an, die Nekrosen ausbildeten. Weiterhin wurden die infizierten Pflanzen einer Analyse der Proteasomaktivität unterzogen. Die Auswertung ergab, dass in ptrv2-gfpsil Pflanzen Xcv ΔxopJ wiederum zu einem signifikanten Anstieg in der Proteasomaktivität führte (Abbildung 3.30). Im Gegensatz dazu war die Proteasomaktivität in den Xcv ΔxopJ-infizierten VIGS-NPR1 Pflanzen im Vergleich zur MgCl 2 -Kontrolle nur geringfügig und nicht signifikant gesteigert (Abbildung 3.30). Xcv ΔxopJ konnte die Proteasomaktivität nicht wie in den ptrv2-gfpsil Pflanzen induzieren. Beim Blick auf die ICS-ausgeschalteten Pflanzen wird deutlich, dass Xcv ΔxopJ hier immer noch in der Lage ist die Aktivität des Proteasom zu fördern, da eine signifikante Erhöhung im Vergleich zur MgCl 2 -Kontrolle zu sehen war (Abbildung 3.30). Zusammengenommen kann von einer möglichen NPR1-vermittelten SA-abhängigen Aktivierung des Proteasoms spekuliert werden. Abbildung 3.30: Die Verminderung der NPR1 Transkript-Menge beeinträchtigt die Induktion der Proteasomaktivität. GFPsil-, NPR1- und ICS-VIGS Pflanzen wurden mit Xcv (Vektor), Xcv ΔxopJ (Vektor) und Xcv ΔxopJ (XopJ) mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurde die Proteasomaktivität anhand des Abbaus des fluoregenen Peptids Suc-LLVY-NH-AMC beobachtet. Die signifikanten Unterschiede wurden über einen student s t-test ermittelt und sind mit * P < 0,05 gekennzeichnet. Dabei wurde gegen die GFPsil- Kontrollpflanzen verglichen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 72

80 ERGEBNISSE: XopJ Einfluss des Proteasoms auf basale Abwehrantworten Obwohl eine wichtige Rolle des Ubiquitin-Proteasom Systems (UPS) während der Regulation von pflanzlichen Immunantworten postuliert wird, gibt es dennoch keine direkten Anhaltspunkte dafür, dass die Aktivität des Proteasoms essentiell für die basale Abwehr ist (Marino et al., 2012). Ein erster Hinweis für die Beteiligung des Proteasoms an der basalen Abwehr lieferte die gesteigerte Proteasomaktivität nach Infektion mit dem T3SS-defizienten Xcv ΔhrpF Stamm (siehe Abb. 3.11). Die weitere Analyse der basalen Abwehrantworten nach Ausschalten oder Herabregulierung von RPT6 war aufgrund von einem letalen Phänotyp nicht möglich. Deshalb wurde wiederum ein pharmakologischer Ansatz gewählt, indem der spezifische Proteasom Inhibitor MG132 verwendet zum Einsatz kam, um den Einfluss des Proteasoms und dessen Aktivität auf verschiedene basale Abwehrantworten zu analysieren. Frühere Studien deuten darauf hin, dass XopJ den Vesikeltransport zur Plasmamembran und zum Apoplasten inhibiert. Außerdem waren Ethanol-induzierbare XopJ Arabidopsis Pflanzen nach Infektion mit einer T3SS-defizienten P. syringae pv. tomato DC3000 hrcc Mutante nicht mehr in der Lage Kallose an der Zellwand abzulagern (Bartetzko et al., 2009). Um die Rolle des Proteasoms während der Sekretion zu verstehen, wurden N. benthamiana Pflanzen, die ein sekretierbares GFP-Protein (secgfp) transient exprimieren, mit MG132 infiltriert und auf GFP Fluoreszenz und einem Konfokalen Mikroskop analysiert. Da GFP aufgrund seiner chemischen Merkmale im sauren apoplastischen Milieu nicht fluoreszieren kann, ist das GFP-Signal nur nachweisbar, wenn das Protein durch eine Inhibition der Sekretion im Endomembransystem akkumuliert (Batoko et al., 2000). Als Positivkontrollen für die Blockierung der Sekretion wurde neben XopJ-myc die dominantnegative, zytosolische Mutante des Arabidopsis-Syntaxins 121 (AtSYP121ΔTM) verwendet. Ein Fehlen der Transmembrandomäne führt dazu, dass das SYP121ΔTM löslich ist und damit nicht mehr membrangebunden wie die Wildtyp-Form. Dadurch kommt es zu einer kompetitiven Wirkung mit dem endogenen SYP121-Homolog aus Tabak und der Inhibition der Vesikelfusion an der Plasmamembran. Wie in Abbildung 3.31B und C zu sehen ist, verursachten beide Positivkontrollen einen Anstieg der GFP-Fluoreszenz in einem ERähnlichen Netzwerk. Der Proteasom Inhibitor MG132 führte eine Stunde nach Infiltration zu einer ER-ähnlichen GFP Fluoreszenz (Abbildung 3.31E). Durch Erhöhung der Konzentration des Proteasom Inhibitors bildeten sich schnell bewegende, vesikelartige Strukturen aus (Abbildung 3.31D). Hiermit kann vermutet werden, dass die Manipulation des Proteasoms durch MG132 die Proteinsekretion beeinträchtigen kann. Neben der Sekretion spielt auch die Kallose-Ablagerung eine essentielle Rolle in der Immunantwort der Pflanze, weshalb diese nach Zugabe von MG132 untersucht wurde. Die Ablagerung der Kallose und Papillenbildung wurde nach flg22 PTI-Stimulierung in Arabidopsis, in An-und Abwesenheit von MG132 bestimmt. Sechs Stunden nach Flagellin-Behandlung, wiesen Pflanzen die mit MG132 ko- 73

81 ERGEBNISSE: XopJ infiltriert wurden, signifikant reduzierte Kalloseablagerung auf, verglichen mit den EtOH koinfiltrierten Arabidopsis Blättern (Abbildung 3.31F und G). Damit kann geschlussfolgert werden, dass das Proteasom einen wichtigen Beitrag zu Zellwand-assoziierten Abwehrprozessen in Arabidopsis leistet. Abbildung 3.31: Die Proteasom-Inhibition durch MG132 unterdrückt basale Abwehrantworten. Die MG132 Behandlung blockiert die Sekretion und führt zu einer Akkumulation des sekretierbaren GFPs in einem ERähnlichen Netzwerk. Die Bilder zeigen in A: die transiente Expression von secgfp mit 1%Ethanol in N. benthamiana, in B: die Ko-Expression von AtSYP121ΔTM mit secgfp, in C: die Ko-Expression von XopJ mit secgfp, in D: secgfp-exprimierende Blätter, die mit 300 µm MG132 oder in E: mit 100 µm MG132 infiltriert wurden. Die Bilder in D und E wurden zwei Stunden nach MG132 Behandlung mit dem Konfokalen Laserscanning Mikroskop aufgenommen. Die Länge der Standardbalken entspricht jeweils 20 µm. F und G: Arabidopsis thaliana- Blätter wurden mit 1 µm flg22+1% EtoH oder 100 µm MG132 ko-infiltriert. Die behandelten Blätter wurde nach 6 Stunden entfärbt und anschließend wurden die Kalloseablagerungen nach Anilin-Blau- Färbung am Fluoreszenzmikroskop detektiert (G). Die Quantifizierung der Anzahl der Kalloseablagerungen erfolgte durch Auszählung der Kallosepunkte pro Bildausschnitt. Die signifikanten Unterschiede wurden über einen student s t-test ermittelt und sind mit ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 4) an (F). 74

82 ERGEBNISSE: XopJ Modifikation von Rpt6 durch XopJ In der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria und Paprika Pflanzen, transloziert Xcv Typ III Effektorproteine in die pflanzliche Zelle um die Pflanzenabwehr zu unterdrücken. XopJ ist einer dieser Effektoren und interagiert mit der Proteasomuntereinheit RPT6, um die Proteasomaktivität zu reduzieren. Aber mit welchem Mechanismus kann XopJ die Proteasom Funktion beeinflussen? Wird RPT6 durch XopJ posttranslational modifiziert? Viele Mitglieder der YopJ-Familie besitzen Acetyltransferase Aktivität, die von einem Lysin-Rest abhängig ist (Mukherjee et al., 2006; Lee et al., 2012, Tasset et al., 2010; Mittal et al., 2010). Obwohl dieser Lysin-Rest auch in XopJ vorhanden ist, konnten bisherige Experimente keine Acetyltransferase-Aktivität des Effektorproteins zeigen (Bartetzko, 2012). Neben der Acetyltransferase-Funktion besitzen einige Effektoren der YopJ-Familie auch Cystein-Protease Aktivität (Ma et al., 2006; Szczesny et al., 2010). Im Folgenden soll analysiert werden ob XopJ durch eine ähnliche Aktivität RPT6 destabilisieren kann. Erste Hinweise für eine Instabilität von RPT6 lieferten Koexpressions-Studien. Hierzu wurden RPT6-GFP in Kombination mit XopJ-HA, XopJ C235A-HA oder XopJ G2A-HA in N. benthamiana transient ko-exprimiert und anschließend am Konfokalen Laserscanning Mikroskop (KLSM) analysiert. In Abbildung 3.32B ist zu erkennen, dass in Anwesenheit von XopJ die RPT6-GFP Fluoreszenz sehr schwach ist, verglichen mit der RPT6-GFP Fluoreszenz in Kombination mit dem Leervektor (Abbildung 3.32A). Wurde jedoch der Verstärkungsfaktor für den GFP-Kanal im Falle von schwacher Fluoreszenz erhöht konnte RPT6-GFP in der Nähe der Plasmamembran detektieren werden (Abbildung 3.32C). Dies ist auch im Einklang mit den BiFC und Kolokalisierungs-Studien (Üstün et al., 2013). Weiterhin wurde festgestellt, dass sowohl die Expression der katalytischen XopJ C235A als auch der nicht-myristoylierten Mutante XopJ G2A zu keiner verminderten GFP-Fluoreszenz von RPT6 führte (Abbildung 3.32D und E). Die XopJ G2A Variante besaß nicht mehr die Fähigkeit RPT6 an die Plasmamembran zu rekrutieren, da dieses Protein selber nicht mehr membrangebunden vorlag. Dahingegen wird RPT6 durch XopJ C235A an die Plasmamembran re-lokalisiert (Abbildung 3.32E). Bei näherer Betrachtung kann man erkennen, dass neben der Fluoreszenz der Plasmamembran auch Fluoreszenz an bestimmten punktartigen, unbeweglichen Mikrodomänen zu sehen war (Abbildung 3.32F). Weitere Analysen durch BiFC zeigten, dass die Interaktion von RPT6 mit XopJ oder XopJ C235A ebenfalls an der Plasmamembran und vor allem an diesen Mikrodomänen stattfindet (Abbildung 3.32G). Die Befunde deuten damit darauf hin, dass eine korrekte Lokalisierung für die Rekrutierung von RPT6 an die Plasmamembran notwendig ist und die katalytische Aktivität von XopJ benötigt wird um RPT6 in Mikrodomänen an der Membran zu destabilisieren. Die Quantifizierung der GFP-Fluoreszenz mit Hilfe der Leica Software konnte 75

83 ERGEBNISSE: XopJ das Resultat bekräftigen und verdeutlichen, dass XopJ die RPT6-GFP-Intensität signifikant reduziert (Abbildung 3.32H). Abbildung 3.32: XopJ Expression führt zu einer verminderten RPT6-GFP-Intensität. XopJ und Varianten wurden mittels Agroinfiltration in N. benthamiana zusammen mit RPT6-GFP transient exprimiert. A: KoExpression von RPT6-GFP mit dem Leervektor. B und C: Transiente Expression von XopJ-HA und RPT6-GFP. D: Ko-Expression von RPT6-GFP mit der XopJ G2A-HA Myristoylierungsmutante. E: RPT6-GFP wurde mit XopJ C235A-Ha ko-exprimiert. F: Nahaufnahme der Ko-Expression von RPT6-GFP und XopJ C235A-HA. G: Agrobakterien-vermittelte BiFC von XopJ C235A-nVenus mit RPT6-cVenus in N. benthamiana. Die Länge der Standardbalken entspricht jeweils 20 µm. H: Quantifizierung der GFP-Intensität nach Expression von RPT6-GFP mit XopJ und Mutanten. Die signifikanten Unterschiede wurden über einen student s t-test ermittelt und sind mit *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. In allen Experimenten wurde der gleiche Verstärkungsfaktor für die GFP-Fluoreszenz verwendet um eine vergleichbare Analyse zu schaffen (außer in C). Zur Verifizierung der am KLSM erzielten Resultate, wurden RPT6 und die XopJ Varianten in N. benthamiana transient ko-exprimiert und einem Western Blot unterzogen. Ein Westernblot gegen das GFP-markierte RPT6 bestätigte die KLSM Aufnahmen, da RPT6 in Abhängigkeit von der katalytischen Funktion und der Lokalisierung von XopJ destabilisiert wurde 76

84 ERGEBNISSE: XopJ (Abbildung 3.33). Bei einer Ko-Expression von XopJ mit RPT6 ist nur noch ein schwaches Signal mit dem anti-gfp Antikörper zu detektieren, das mit dem Fusionsprotein RPT6-GFP korrespondiert (Abbildung 3.33). Die XopJ C235A und G2A Varianten hingegen führten nicht zu einer Destabilisierung von RPT6-GFP, weil hier die Signale genauso stark sind wie wenn RPT6 mit einem Leervektor ko-infiltiert wurde (Abbildung 3.33). Abbildung 3.33: Destabilisierung von RPT6-GFP durch XopJ. RPT6-GFP wurde zusammen mit XopJ-HA oder XopJ G2A-HA bzw. C235A-HA in N. benthamiana transient exprimiert. 48 Stunden nach Agroinfiltration wurden die Proteinmengen mittels Western Blot mit anti-gfp- (für RPT6-GFP) und anti-ha-antikörpern untersucht. Die Amidoblack-Färbung der Rubisco dient als Ladekontrolle. Um nun zu ermitteln über welchen Mechanismus die XopJ-induzierte Destabilisierung von RPT6 vermittelt wird, wurde die Ko-Expression von RPT6 und XopJ oder XopJ C235A in Anwesenheit von verschiedenen Inhibitoren wiederholt. Dabei wurde der Proteasom Inhibitor MG132 oder eine Mischung aus verschiedenen Protease-Inhibitoren 40 Stunden nach transienter Expression infiltriert. Sechs Stunden nach Inhibitor Behandlung ist zu erkennen, dass die MG132 Applikationen keinen Einfluss auf die Instabilität von RPT6 in Gegenwart von XopJ hat, wohingegen die Behandlung mit einer Protease-Hemmer Mixtur zu einer partiellen Re-Stabilisierung von RPT6 führte (Abbildung 3.34). Zusammenfassend kann spekuliert werden, dass die Instabilität bzw. Degradierung von RPT6 durch Proteasen verursacht wird und nicht durch das Proteasom selber. Abbildung 3.34: Die XopJinduzierte Destabilisierung von RPT6-GFP ist Proteasomunabhängig und Proteaseabhängig. RPT6-GFP wurde zusammen mit XopJ-myc oder XopJ-C235A-myc in N. benthamiana transient exprimiert. 40 Stunden nach Agroinfiltration wurden die infiltrierten Blätter mit 100 µm MG132 oder einem 1-fach Protease-Inhibitor Mix behandelt, um nach 6 Stunden die Proteinmengen mittels Western Blot mit anti-gfp- und anti-myc-antikörpern zu analysieren. Die Amidoblack- Färbung der Rubisco diente als Ladekontrolle. 77

85 ERGEBNISSE: XopJ Ist die Degradierung bzw. Destabilisierung von RPT6 durch XopJ auch für die Verminderung der Proteasomaktivität verantwortlich? Bisherige Studien konnten die essentielle Funktion von RPT6 bei der Assemblierung des Proteasoms nachweisen, die wenn sie gestört ist zu einer reduzierten Aktivität des Proteasoms führt (Satoh et al., 2001; Ehlinger et al., 2013; Park et al., 2013). Ein Verlust von RPT6 könnte damit zu einer Störung in der Komplexbildung des Proteasoms resultieren und deshalb die Aktivität negativ beeinflussen. Um dies zu analysieren, wurde über Virus-indzuierte Genstilllegung (VIGS) die Genexpression von RPT6 in N. benthamiana herunterreguliert, um niedrige RPT6 Proteinlevel zu generieren. Da VIGS von RPT6 zu einem letalen Phänotyp führt, wurden 12 Tage nach VIGS Beginn Proben zur Messung der Proteasomaktivität entnommen, da zu diesem Zeitpunkt die Blätter nur chlorotisch und noch nicht abgestorben waren (Bartetzko, 2012). Die Messung verdeutlichte, dass eine verminderte RPT6 Proteinmenge, zu einer drastischen Reduzierung der Proteasomaktivität, im Vergleich zu den GFPsil- Kontrollpflanzen, führte (Abbildung 3.35). Damit konnte die Vermutung bestätigt werden, dass eine Destabilisierung von RPT6 eine Störung des Proteasoms verursacht. Abbildung 3.35: Die Verminderung der RPT6 Genexpression reduziert die Proteasomaktivität. Über Virus-induziertes gene silencing (VIGS) wurde die Transkriptmenge von RPT6 in N. benthamiana reduziert. 12 Tage nach VIGS wurde die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms in den RPT6- und GFPsil-VIGS Pflanzen gemessen, indem der Abbau des fluorogenen Peptids Suc-LLVY-NH-AMC bei 30 C in einem Fluoreszenz- Spektrophotometer beobachtet wurde. Die GFPsil-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Da die Interaktion von XopJ mit RPT6 zu einer Destabilisierung von RPT6 führt, die durch Protease Inhibitoren aufgehoben wird, stellte sich die Frage ob XopJ möglicherweise eine in vivo Cystein-Protease Funktion besitzt. Zu diesem Zweck, wurde XopJ in N. benthamiana transient exprimiert und anschließend wurde über ein fluorogenes Substrat Z-phe-arg-AMC die Cystein-Protease Aktivität in planta bestimmt. Dabei wurden Pflanzenextrakte auch mit dem Cystein-Protease Inhibitor E64 behandelt, um zu gewährleisten, dass die Messung spezifisch für Cystein-Protease Aktivität ist. Aus Abbildung 3.36 wird klar, dass eine Überexpression von XopJ, verglichen zur Leervektor-Kontrolle, nicht zu einer verstärkten 78

86 ERGEBNISSE: XopJ Cystein-Protease Aktivität führte (Abbildung 3.36). Die E64 Behandlung in beiden Fällen ergab, dass es sich bei der gemessenen proteolytischen Aktivität um die spezifische Cystein- Protease Aktivität handelte (Abb. 3.36). Hiermit konnte keine gesteigerte Cystein-Protease Aktivität in XopJ-exprimierenden Blättern festgestellt werden. Abbildung 3.36: Analyse der Cystein-Protease- Aktivität nach transienter Expression von XopJ. XopJ wurde über Agroinfiltration in N. benthamiana transient exprimiert. Nach 48 Stunden wurde in An- und Abwesenheit des Cystein-Protease Inhibitors E64 (50 µm) die Cystein-Protease-Aktivität gemessen. Das hierbei verwendete Substrat ist das fluorogene Peptid Z- phe-arg-amc. Die Leervektorkontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 79

87 ERGEBNISSE: PopJ 3.2 Identifizierung von XopJ-ähnlichen Typ-III Effektoren Die YopJ-Superfamilie der Typ III Effektoren ist einer der größten und meist-verbreiteten bakteriellen Effektor-Familien. In Pflanzenpathogenen sind YopJ-ähnliche Proteine neben Xanthomonas (XopJ, AvrRxv, AvrXv4 und AvrBsT), auch in Pseudomonas (HopZ Familie) und anderen Bakterien repräsentiert (Ma et al., 2006). Diese Effektoren können unterschiedliche Ziel-Strukturen und -Prozesse, wie z.b. Mikrotubuli, Kinasen oder Biosynthese-Wege, in ihren Wirtspflanzen anvisieren, um die pflanzliche Abwehr zu unterdrücken (Lee et al., 2012; Szczesny et al., 2010; Zhou et al., 2011). Bisherige Befunde deuten an, dass Xanthomonas Effektor XopJ innerhalb der YopJ-Familie eine einzigartige Funktion zu besitzen scheint, indem es mit der Proteasomuntereinheit RPT6 in Pflanzenzellen interagiert und damit die Aktivität des Proteasoms negativ beeinflusst (Üstün et al., 2013). Jedoch ist die Unterdrückung der Proteasomaktivität kein Wirts-spezifischer Mechanismus, da Virulenzfaktoren anderer Pathogene, z.b. SylA aus Pseudomonas oder das virale Protein HcPro, die Proteasomaktivität beeinflussen können (Groll et al., 2008; (Ballut et al., 2005) Sahana et al., 2012). Diese Effektoren weisen allerdings keine Homologie zu XopJ oder anderen Mitgliedern der YopJ-Familie auf PopJ ist ein XopJ-Homolog mit hoher Sequenzidentität Gibt es nun auch andere YopJ-ähnliche Effektoren in Phytopathogenen, die mit der Proteasomuntereinheit RPT6 interagieren und damit eine XopJ-ähnliche Funktion besitzen? In einem Versuch dieser Frage auf den Grund zu gehen, wurde zunächst eine in silico Analyse mit der XopJ Proteinsequenz über blastp ( Altschul et al., 1997). Hierbei konnte ein Protein aus Pseudomonas syringae pv. lachrymans M (oder Pla107), pathogen auf Cucurbitaceae (Kürbisgewächse), identifiziert werden, das eine 86.21% Ähnlichkeit auf Aminosäure-Ebene zu XopJ aufweist und damit die größte Sequenzübereinstimmung aller YopJ-ähnlichen Effektoren von Pseudomonas zu XopJ besitzt. Das zu XopJ-ähnliche Protein wird im Folgenden PopJ (Pseudomonas outer protein J) benannt. Um die Homologie beider Proteine näher zu charakterisieren, wurde ein Sequenzvergleich auf Aminosäure-Ebene von XopJ und PopJ durchgeführt. Die Analyse zeigte, dass die für alle YopJ-ähnlichen Proteine katalytische Triade, aus einem Histidin, einer Glutaminsäure und eines Cysteins, auch in PopJ vorhanden ist (Abbildung 3.37). Beide Proteine besitzen an Position zwei der Aminosäuresequenz ein Glycin, das im Falle von XopJ möglicherweise durch eine Myristoylierung modifiziert wird und damit für die Plasmamembran Lokalisierung des Effektors verantwortlich ist (Thieme et al., 2007; Bartetzko et al., 2009). Über eine ähnliche Modifizierung und Lokalisierung von PopJ kann spekuliert werden. Außerdem geht aus dem Sequenzvergleich noch hervor, dass das 80

88 ERGEBNISSE: PopJ wahrscheinlich palmitoylierte Cystein, bei PopJ an Position drei ist und nicht wie bei XopJ an Position vier. Am auffälligsten in Abbildung 3.37 ist jedoch, dass der amino-terminale Bereich von PopJ um ca. 40 Aminosäuren verkürzt ist (in grün unterlegt). Beide Proteine könnten anhand des Sequenzvergleichs auch ähnliche Funktionen besitzen, da neben der für die Cystein-Protease Funktion wichtigen katalytischen Triade, auch das Lysin, das für die Auto- Acetylierung, von z.b. PopP2 oder HopZ1a notwendig ist (Tasset et al., 2010; Lee et al., 2012), auch in PopJ vorhanden ist (Position 259). Abbildung 3.37: Proteinsequenzvergleich von XopJ und PopJ. Beide Proteine sind Mitglieder der YopJ-Superfamilie, da sie die typische katalytische Triade besitzen, die aus einem Histidin (H), einer Glutaminsäure (E) und dem für die katalytische Aktivität essentiellen Cystein, besteht. Diese Aminosäuren sind hier mit Pink hervorgehoben. Weiterhin besitzen beide Proteine das Myristoylierungsmotiv, dem Glycin an Position 2 und das konservierte Lysin (in Rot markiert), das für die Auto-Acetylierung einiger YopJ-ähnlicher Effektoren erforderlich ist. In amino-terminalen Bereich von PopJ fehlen im Gegensatz zu XopJ etwa 20 Aminosäuren (in Grün hervorgehoben). Um die evolutionäre Verwandtschaft von PopJ zu den YopJ-ähnlichen Effektorproteinen zu verdeutlichen, wurde eine phylogenetische Analyse der kompletten YopJ-Familie durchgeführt. Hierbei zeigt sich, dass XopJ zusammen mit PopJ ein Cluster bilden und damit einen eigenen Stamm formen (Abbildung 3.38). Beide Effektorproteine sind auch eng verwandt mit Effektoren aus Symbionten (Y4IO und NopJ). Auch die HopZ1 Allele bilden 81

89 ERGEBNISSE: PopJ eine eigenständige Gruppe, während HopZ2 mit Effektoren von Xanthomonas und HopZ3 mit einem Effektor aus Erwinia ein Cluster erzeugt (Abbildung 3.38). Damit kann PopJ als neues Mitglied in der YopJ-Familie eingruppiert werden. Abbildung 3.38: Phylogenetischer Baum der Typ-III Effektoren der YopJ-Familie. Der phylogenetische Baum wurde mit dem Neighbor-Joining Algorithmus erstellt, um Datensätze zu vergleichen und hierarchisch anzuordnen. Bootstrap Werte über 50% sind angegeben. Sind hier die Werte über 95% so ist die Topologie des Baums als korrekt anzunehmen. Die Typ-III Effektorproteine XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria und PopJ aus P. syringae pv. lachrymans (Pla107) sind hervorgehoben. Aus dem phylogenetischen Baum wird ersichtlich, dass XopJ und PopJ sehr eng verwandt sind und einen eigenen Stamm bilden. 82

90 ERGEBNISSE: PopJ Abbildung 3.39: Direkte Interaktion von PopJ und RPT6 aus verschiedenen Pflanzen Spezies. PopJ wurde im pgbt9 Vektor an die GAL4 DNA Bindedomäne (BD) fusioniert und RPT6 im pad an die GAL4 Aktivierungsdomäne (AD). Beide Proteine wurden im Hefestamm Y190 ko-exprimiert. Die Zellen wurden auf ein geeignetes Selektionsmedium überstempelt. Zwei bis drei Tage später wurde ein LacZ-Filter-Test durchgeführt. SV40/p53 dienten als Positivkontrolle. Als Negativkontrolle fungierte die Ko- Transformation der potentiellen Interaktionspartner mit dem Leervektor. NtRPT6, N. tabacum RPT6; CaRPT6, C. annuum RPT6; AtRPT6a, A. thaliana RPT6 isoform a; AtRPT6b, A. thaliana RPT6 isoform b. LT Hefewachstum auf Medium ohne Leucin und Tryptophan. HTL, Hefe Wachstum auf Medium ohne Histidin, Leucin und Tryptophan, wobei HIS3 das Reportergen ist. LacZ: Aktivität des lacz Reportergens PopJ interagiert mit RPT6 in Hefe Die Ähnlichkeit von PopJ zu XopJ sowie die Konservierung wichtiger Aminosäuren gab Grund zur Annahme, dass dieser Effektor aus Pseudomonas möglicherweise das gleiche Zielprotein in Pflanzen anvisieren kann wie XopJ. Deshalb wurde über das Hefe-Zwei-Hybrid System ermittelt, ob PopJ mit RPT6 aus verschiedenen Pflanzenspezies interagieren kann. Hierzu wurde PopJ in den offenen Leserahmen mit der Gal4- Bindungsdomäne (BD) des Vektors pgbt9 kloniert. In einem direkten Interaktionsnachweis wurde PopJ mit RPT6a und b aus Arabidopsis thaliana, sowie RPT6 aus Tabak oder Paprika, in den Hefestamm Y190 ko-transformiert. Als Kontrollen dienten jeweilige Leervektoren mit den möglichen Interaktionspartnern bzw. PopJ mit pad-leervektor sowie SV40 zusammen mit p53 als Positivkontrolle. Abbildung 3.39 zeigt, dass PopJ in der Lage war mit allen RPT6 Proteinen zu interagieren, da ein Wachstum auf dem Histidin-Mangelmedium (-HLT) sowie eine Blaufärbung nach dem LacZ-Filtertest zu sehen war. Dieses Resultat eröffnet die Möglichkeit, dass PopJ eine ähnliche Funktion und Wirkweise wie XopJ besitzt. Obwohl, verglichen zu XopJ, PopJ ca. 40 Aminosäuren am amino-terminalen Bereich fehlen, ist dieser Effektor immer noch in der Lage mit RPT6 zu assoziieren. Deshalb wurde in die Interaktionsstudie eine Deletionsvariante von XopJ miteinbezogen, die um 57 Aminosäuren am N-Terminus verkürzt wurde. Eine direkte Interaktion von XopJ Δ1-57 und RPT6, war 83

91 ERGEBNISSE: PopJ genauso wie XopJ und RPT6 detektierbar (Abbildung 3.40). Folglich sind diese Aminosäuren nicht für die Wechselwirkung von RPT6 und XopJ essentiell. Abbildung 3.40: Aminoterminal-verkürztes XopJ interagiert mit RPT6. XopJ und XopJ Δ1-57aa wurden im pgbt9 Vektor an die GAL4 DNA Bindedomäne (BD) fusioniert und RPT6 im pad an die GAL4 Aktivierungsdomäne (AD). Alle Proteine wurden im Hefestamm Y190 ko-exprimiert. Die Zellen wurden auf ein geeignetes Selektionsmedium überstempelt. Zwei bis drei Tage später wurde ein LacZ-Filter-Test durchgeführt. LT steht für das Hefewachstum auf Medium ohne Leucin und Tryptophan. HTL, deutet das Hefewachstum auf Medium ohne Histidin, Leucin und Tryptophan an, wobei HIS3 das Reportergen ist. LacZ: Aktivität des lacz Reportergens Lokalisierung von PopJ in N. benthamiana Die Sequenzanalyse von PopJ und XopJ wies auf eine Konservierung des möglichen N- Myristoylierungsmotiv hin (Abb 3.37). An solchen eukaryotischen Motiven können Proteine von einer N-Myristoyltransferase (NMT) acyliert und dadurch an die Plasmamembran angeheftet werden (Farazi et al., 2001). Dabei dient ein amino-terminaler Glycinrest als Akzeptor für die Myristoylierung. Da PopJ diesen Glycinrest an Position zwei ebenso besitzt wie XopJ und damit auch an die Plasmamembran angeheftet werden könnte, wurde eine Lokalisierungsstudie am Konfokalen Laser Scanning Mikroskop (KLSM) mit PopJ und dessen Varianten (Katalytische Mutante PopJ C194A und Myristoylierungsmutante PopJ G2A) durchgeführt. Dazu wurde das grün-fluoreszierende Protein (GFP) an den C-Terminus von PopJ und das entstandene Fusionsprotein mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation transient in N. benthamiana exprimiert. Hierbei wurde neben PopJ-GFP auch das XopJ-mCherry Fusionsprotein ko-exprimiert, um eine mögliche Plasmamembran- Lokalisierung besser zu zuordnen (Üstün et al., 2013). Die transiente Expression von PopJ- GFP führte 48 Stunden nach Agroinfiltration zu einer GFP-Fluoreszenz, die in Zellwandnähe zu erkennen war, was auf eine Plasmamembran-Lokalisierung hindeutet (Abbildung 3.41A). Die Überlagerung mit dem Markerprotein für Plasmamembran (XopJ-mCherry) zeigte eine eindeutige Kolokalisierung beider Proteine in der Pflanzenzelle (Abbildung 3.41A). Die Mutation der katalytischen Triade von PopJ hat wie bei XopJ keinen Einfluss auf dessen subzelluläre Lokalisierung, da in der Überlagerung von PopJ C194A-GFP und XopJ-mCherry wiederum eine Plasmamembran-Assoziierung beider Proteine beobachtet wurde (Abbildung 84

92 ERGEBNISSE: PopJ 3.41B). Dahingegen führte die Punktmutation des Glycins an Position 2 der Aminosäuresequenz zu einer Umverteilung der Fluoreszenz von PopJ G2A-GFP, da aus Abbildung 3.41C ersichtlich wird, dass diese Variante nicht mehr mit XopJ kolokalisiert. Eine Nahaufnahme der Zelle verdeutlicht, dass PopJ G2A-GFP möglicherweise im Zytosol akkumuliert, da die GFP-Fluoreszenz, die Chloroplasten (in Blau dargestellt) umschloss (Abbildung 3.41C). Die Lokalisierungsstudien am KLSM bestätigen, dass PopJ über das Glycin an die Plasmamembran dirigiert wird und damit einen ähnlichen Wirk- und Funktionsort wie XopJ innehat. Abbildung 3.41: Subzelluläre Lokalisierung von PopJ ist abhängig von dessen Myristoylierunsmotiv. Transiente Expression von PopJ-GFP (A), PopJ C194A-GFP (B) und PopJ G2A-GFP (C) zusammen mit XopJmCherry als Plasmamembran-Markerprotein mittels Agroinfiltration in N. benthamiana. Für konfokale Laserscanning Mikroskopie (KLSM) wurden die Blätter 48 Stunden nach Infiltration beprobt und unter dem KLSM analysiert. Grün: GFP-Fluoreszenz, rot: mcherry-fluoreszenz, blau: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Die Länge der Standardbalkan beträgt 20 µm und in den Nahaufnahmen 5 µm. 85

93 ERGEBNISSE: PopJ In planta Interaktionsnachweis zwischen PopJ und RPT6 Die Wechselwirkung von PopJ und RPT6 in der Pflanze sollte mit Hilfe von in planta- Interaktionsstudien verifiziert werden. Um die Interaktion zweier Proteine zu visualisieren, wurde zunächst die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) verwendet (Walter et al., 2004). Dabei fusionierte man PopJ und dessen Varianten mit den ersten 155 Aminosäuren des gelb-fluoreszierenden YFP-Derivates, Venus, und RPT6 mit den restlichen carboxy-terminalen Aminosäuren von Venus. Dieses YFP-Derivat trägt eine Mutation, die für die Stabilität des Fluorophors sorgt (Nagai et al., 2002). Kommen beide Fusionsproteine durch eine direkte oder indirekte Interaktion in räumliche Nähe zueinander, wird das Venus re-konstituiert und kann bei einer Wellenlänge von 514 nm angeregt werden. Sowohl PopJnVenus als auch dessen Varianten wurden zusammen mit RPT6-cVenus in N. benthamiana über Agroinfiltration transient ko-exprimiert und 48 Stunden danach mit dem KLSM auf eine Interaktion hin untersucht. Dabei dienten die Kombinationen XopJ-nVenus (sowie dessen Varianten) und RPT6-cVenus als auch FBPase-nVenus und -cvenus als Positivkontrollen (Abbildung 3.42D und E). PopJ-nVenus oder RPT6-cVenus mit FBPase-cVenus oder FBPase-nVenus fungierten als Negativkontrollen (Abbildung 3.42F und G). Die Analysen deuteten darauf hin, dass PopJ, genauso wie XopJ, mit RPT6 an der Plasmamembran interagiert (Abbildung 3.42A und D). Weiterhin konnte festgestellt werden, dass sowohl die PopJ G2A und die C194A Mutante noch in der Lage waren mit RPT6 zu interagieren, wobei die PopJ-G2A Variante die Interaktion ins Zytoplasma verschob (Abbildung 3.42B und C). Eine Vergrößerung ergab nämlich, dass die Fluoreszenz den Chloroplast (rot) umschloss und zudem Hechtsche Filamente (mit einem Pfeil versehen) sichtbar waren, was weitere Indizien für eine Komplexbildung beider Proteine im Zytoplasma war (Abbildung 3.42C). Die Tatsache, dass die Mutation des Myristoylierungsmotivs und der katalytischen Triade keinen Einfluss auf die Interaktion mit RPT6 haben, war kein neuer Befund, da auch die Varianten von XopJ mit RPT6 interagieren (Bartetzko, 2012). 86

94 ERGEBNISSE: PopJ Abbildung 3.42: In planta Interaktionsanalyse von PopJ und RPT6 mittels bimolekularer Fluoreszenz Komplementation (BiFC). Transiente Ko-Expression von PopJ-nVenus, PopJ C194A-nVenus und PopJ G2AnVenus mit RPT6-cVenus in N. benthamiana mittels Agroinfiltration (A-C). Die gemeinsame Expression von XopJ-nVenus und RPT6-cVenus (D) sowie FBPase-cVenus mit FBPase-nVenus (E) dienten als Positivkontrollen. Als Negativkontrolle wurde PopJ mit der FBPase oder RPT6 mit der FBPase transient ko-exprimiert (F und G). Gelb: Interaktion der beiden YFP-Hälften und somit der Interaktionspartner, rot: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Längenstandard entspricht 20 µm. Bei den rechten Bildern in A, B und C handelt es sich um Nahaufnahmen und diese haben einen Längenstandard von 5 µm. 87

95 ERGEBNISSE: PopJ Die Koimmunopräzipitation (Ko-IP) stellt eine weitere Möglichkeit dar, die Interaktion beider Proteine zu untermauern. Hierzu wurde wiederum eine GFP-Ko-IP eingesetzt, bei der RPT6- GFP zusammen mit PopJ-HA transient in N. benthamiana exprimiert und anschließend über die GFP-Markierung aufgereinigt wurden. Anschließend wurden mit den Pflanzenextrakten und Eluaten Western Blots mit anti-gfp- und anti-myc-antikörpern durchgeführt. Die GFP- Ko-IP ergab, dass PopJ-HA, ebenso wie XopJ-HA, mit RPT6-GFP ko-präzipitierte, weshalb von einer Interaktion beider Proteine in planta ausgegangen werden kann (Abbildung 3.43). PopJ-HA schien keine Affinität zur GFP-Matrix aufzuweisen und spricht für eine spezifische Wechselwirkung beider Proteine. Abbildung 3.43: Ko-Immunopräzipitation von RPT6-GFP mit PopJ- HA, XopJ. RPT6-GFP wurde mit PopJ-HA und XopJ (Positivkontrolle) in N. benthamiana über Agrobakterien-vermittelte Transformation transient ko-exprimiert. 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde ein Rohextrakt gewonnen (Input) und RPT6-GFP wurde über dessen GFP-Markierung aufgereinigt (Eluat). Die Western Blot Analyse erfolgte mit anti-gfp- und anti-ha-antikörpern. Als Negativkontrolle wurde PopJ-HA in N. benthamiana exprimiert und anschließend über die GFP-Matrix aufgereinigt Analysen zum Einfluss von PopJ auf die Proteasomaktivität in N. benthamiana Die bisherigen Befunde stellen eindrucksvoll dar, dass das XopJ-Homolog PopJ, sowohl in Hefe als auch in planta mit der Proteasomuntereinheit RPT6 interagieren kann. Ist PopJ auch in der Lage die Proteasomaktivität zu beeinflussen? Eine konservierte Funktion zweier Effektor-Proteine aus unterschiedlichen Pathogenen, die ebenfalls verschiedene Wirtspflanzen befallen, ist in der Literatur noch nicht beschrieben. Um dies herauszufinden, wurde die Proteasomaktivität nach transienter Expression von PopJ-myc in N. benthamiana bestimmt. In Abbildung 3.44 ist eine deutliche und signifikante Verminderung der Chymotrypsin-ähnlichen Proteasomaktivität durch PopJ feststellbar. Die Reduzierung der Aktivität um ca. 40%, relativ zum Leervektor, war auch mit dem Effekt von XopJ vergleichbar (Abbildung 3.44A). Neben der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität des Proteasoms wurde auch 88

96 ERGEBNISSE: PopJ die Caspase-ähnliche Aktivität nach transienter Expression von PopJ beobachtet, da XopJ in der Lage ist diese auch zu hemmen. Wiederum konnte eine Inhibition der Caspaseähnlichen Proteasomaktivität über 40% bestätigt werden (Abbildung 3.44B). Folglich konnte neben der Konservierung der Interaktion auch eine konservierte Funktion beider Proteine nachgewiesen werde. Die Expression beider Proteine konnte 48 Stunden nach Agroinfiltration detektiert werden (Abbildung 3.44C). Abbildung 3.44: Messung der Proteasomaktivität nach transienter Expression von PopJ und XopJ in N. benthamiana. PopJ-myc und XopJ-myc wurden neben der Leevektor-Kontrolle (LV) in N. benthamiana transient exprimiert. A: 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms in den jeweiligen Blattextrakten bestimmt, in dem der Abbau des fluorogenen Peptids Suc-LLVY-NH-AMC bei 30 C in einem Fluoreszenz-Spektrophotometer beobachtet wurde. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. B: PopJ inhibiert Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms. PopJ wurde neben der Leevektor-Kontrolle mittels Agroinfiltration in N. benthamiana transient exprimiert. 48 Stunden nach Expression wurde die Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms über den Abbau des fluorogenen Substrats Z-LLE-AMC bestimmt. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. C: Zur Überprüfung der Expression von mycmarkierten Effektorproteinen wurde ein Western Blot mit anti-myc-antikörper durchgeführt. Da die Inhibition des Proteasoms durch XopJ abhängig von dessen katalytischer Triade und Myristoylierung war, sollte auch für PopJ untersucht werden, ob beide Eigenschaften für die Suppression der Proteasomaktivität von Bedeutung sind. 48 Stunden nach transienter Expression der Proteine, ergab die Messung der Proteasomaktivität, dass auch PopJ abhängig von dem katalytischen Cystein und Myristoylierungsmotiv, die Proteasomaktivität hemmt (Abbildung 3.45A). Die Western Blot Analyse zeigt, dass alle PopJ Varianten gleichermaßen exprimiert wurden (Abbildung 3.45B). 89

97 ERGEBNISSE: PopJ Abbildung 3.45: Messung der Proteasomaktivität nach transienter Expression von PopJ und XopJ in N. benthamiana. PopJ-myc, PopJ C194A-myc und PopJ G2A-myc wurden neben der Leevektor-Kontrolle (LV) in N. benthamiana transient exprimiert. A: 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms in den jeweiligen Blattextrakten bestimmt mit Hilfe des Substrates Suc-LLVY-NH-AMC bei 30 C in gemessen. Die Leervektor-Kontrolle wurde auf 100% gesetzt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. B: Zur Überprüfung der Expression von mycmarkierten Effektorproteinen wurde ein Western Blot mit anti-myc-antikörper durchgeführt. 90

98 ERGEBNISSE: SseF 3.3 Analyse der SseF-abhängigen HR in N. benthamiana Viele gram negative Bakterien, die pathogen in Säugetieren, Pflanzen oder Insekten sind, verwenden ein Typ III Sekretionssystem (T3SS) um bakterielle Effektorproteine ins Zytoplasma der jeweiligen Wirtszellen zu injizieren. Die translozierten Typ III Effektoren (T3E) agieren als Virulenz-Faktoren und ermöglichen dadurch das Überleben des Pathogens (Galan & Wolf-Watz, 2006). Welche Mechanismen hierbei verwendet werden sind teilweise noch nicht verstanden, da die Funktion vieler Effektormoleküle größtenteils noch nicht aufgeklärt ist. Jedoch kann von einer generellen Strategie bakterieller Pathogene gesprochen werden, da T3E die Aktivität endogener eukaryotischer Proteine nachahmen und somit Wirtszell-Zielstrukturen modifizieren (Galan, 2009). In pflanzlichen und tierischen Wirtszellen können ähnliche Proteine und Strukturen durch Effektoren manipuliert werden, wie z.b. das Zytoskelett, Abwehr-und hormonelle Signalwege, das Ubiquitin-Proteasom System, die Genexpression oder der Vesikeltransport (Grant et al., 2006; Galan, 2009; Spallek et al., 2009; Broberg & Orth, 2010). Die Funktionsweise von Effektoren ist auf den jeweiligen Wirt abgestimmt und spezialisiert. Dennoch ist es nicht ausgeschlossen das Effektoren funktionelle Motive als Ziel haben, die zwischen Pflanzen- und Tierwelt, konserviert sind, da Gemeinsamkeiten unter den Krankheits-Prozessen zwischen den unterschiedlichen Wirts-Systeme bestehen (Staskawicz et al., 2001; Guttman, 2004; Nürnberger et al., 2004). Tatsächlich gibt es auch einige Beispiele konservierter Effektorproteine zwischen Phyto- und Tierpathogenen, wie z.b. die Effektoren die der YopJ- Familie angehören (Hotson & Mudgett, 2004; Lewis et al., 2011). Auch Salmonella besitzt einige Effektoren die eine Homologie zu Effektoren aus Phytopathogenen aufweisen. Beispielsweise ist die Phosphothreonin-Lyase SpvC/OspF aus Salmonella ein Homolog des Effektors HopAI1 aus P. syringae und beide sind in der Lage MAP Kinasen zu dephosphorylieren (Mazurkiewicz et al., 2008; Zhang et al., 2007). Diese Beispiele sind ein Grund zur Spekulation, ob manche Effektoren mit konservierten Zielproteinen wechselwirken können Beeinflussung der SseF-induzierten HR in N. benthamiana Pflanzen mit verminderter endogenen NDR1 und EDS1 Tranksriptmengen Zur Identifizierung von Effektoren, die möglicherweise konservierte Funktionen zwischen Tier-und Pflanzenwelt aufweisen, wurde in früheren Studien eine systematische Analyse von Salmonella Effektoren durch Agrobakterien-vermittelter transiente Expression in der Modellpflanze N. benthamiana durchgeführt (Üstün, 2010; Üstün et al., 2012). Anhand 91

99 ERGEBNISSE: SseF phänotypischer Veränderungen wurde beurteilt, ob die jeweiligen Proteine sich mit einer Virulenz-oder Avirulenz-Funktion in Verbindung bringen lassen. Dabei konnte überraschenderweise beobachtet werden, dass die transiente Expression von Salmonella T3E SseF HR-ähnliche Antworten in N. benthamiana auslöst (Üstün et al., 2012). Dieser Effekt unterschied sich von nekrotischen Symptomen wie sie etwa durch Wirtsantworten oder Proteintoxizität ausgelöst werden, da diese Reaktion sehr schnell und stark auftrat. Zusätzlich war die SseF-induzierte HR-ähnliche Antwort abhängig von der endogenen SGT1-Menge, das für die Stabilität von R-Proteinen notwendig ist (Üstün et al., 2012). Die Daten deuteten darauf hin, dass die Erkennung von SseF über R-Proteine vermittelt wurde und dass der beobachtete SseF-abhängige Phänotyp kein Resultat der Toxizität des Effektors ist. Jedoch führt die Erkennung von bakteriellen Effektorproteinen neben der Ausbildung eines lokalisierten Zelltods (HR), zu verstärkten basalen Antworten, die eigentlich in Verbindung mit der PAMP-vermittelten Immunität (PTI) auftreten (Jones & Dangl, 2006). Deshalb wurde nach transienter Expression von SseF eine transkriptionelle Veränderung von bereits beschriebenen PTI-Markergenen untersucht (Nguyen et al., 2010). Verglichen zur 35S-GFP Kontrolle waren die Expressionsniveaus der PTI-Markergene Pti5, Gras2 und Acre31 durch die Überexpression von SseF signifikant induziert (Abbildung 3.46). Die Expression aller Markergene war zum Zeitpunkt 24 Stunden nach transienter Expression von SseF am stärksten und nahm, aufgrund der HR, 48 Stunden nach Expression wieder ab (Abbildung 3.46). Folglich leitet die Expression von SseF in Pflanzen Antworten ein, die sowohl mit der ETI als auch mit der PTI assoziiert sind. Abbildung 3.46: Die Expression von SseF führt zur Hochregulierung von PTI-Markergenen PTI5, Acre31 und Gras2. Die Expression der PTI-Markergenen PTI5, Acre31 und Gras2 wurde durch qrt-pcr analysiert. Hierzu wurde SseF in N. benthamiana transient exprimiert. Gesamt- RNA wurde 24 bzw. 48 Stunden nach Infiltration (hpi) extrahiert. Als Kalibrator wurden Pflanzen genommen die GFP exprimierten (35S-GFP). 3,32 auf der Y-Achse (log 2 (SseF / 35S-GFP)) entspricht einer 10-fachen Hochregulierung. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 und *** P < 0,001 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. Wie bereits erwähnt wurde, scheint die SseF-verursachte HR abhängig von R-Proteinen zu sein. Da in Pflanzen mit CC-NB-LRRs (NDR1-abhängig) und TIR-NB-LRRs (EDS1- abhängig) zwei Klassen von R-Proteinen vorkommen (Padmanabhan et al., 2009), wurde als nächstes untersucht welche Klasse von R-Proteinen für die SseF-induzierte Zelltod-Reaktion 92

100 ERGEBNISSE: SseF verantwortlich ist. Hierzu wurden NDR1 und EDS1 über Virus-induzierte Genstilllegung (VIGS) herunterreguliert. Eine effiziente Verminderung der Transkriptmenge beider Gene konnte zwei Wochen nach VIGS-Beginn über eine semi-quantitative RT-PCR nachgewiesen werden (Abbildung 3.47B). Transiente Expression von SseF-myc führte zu einem klaren und konsistenten Verlust der HR-ähnlichen Symptome in VIGS-NDR1 N. benthamiana Pflanzen, wohingegen die Reduzierung der EDS1 mrna-menge keinen Einfluss auf den SseFinduzierten nekrotischen Phänotyp hatte und damit mit den GFPsil-Kontrollpflanzen vergleichbar war (Abbildung 3.47A). Um die Expression des Effektors SseF in den VIGS- NDR1, -EDS1 und -GFPsil Pflanzen zu untersuchen, wurden 24 und 48 Stunden nach transienter Expression von SseF-myc Proben entnommen und anschließend über Western Blot mit anti-myc-antikörpern nachgewiesen. Der Western Blot ergab, dass SseF in allen Pflanzen exprimiert wurde, wobei die Expression in TRV:EDS1 Pflanzen 48 Stunden nach Agroinfiltration abnahm, was auf die auftretende HR zurückzuführen ist (Abbildung 3.47C). Abbildung 3.47: Verlust der SseF-induzierten HRähnlichen Symptome nach Verminderung der NDR1 Transkriptmenge. A: Mittels Virus-induziertem gene silencing (VIGS) wurde die Menge an endogenem NDR1 und EDS1 in N. benthamiana Pflanzen vermindert. Als Kontrolle fungierte ein ptrv2-gfpsil Konstrukt. 14 Tage nach der VIGS Behandlung der Pflanzen wurde über Agrobakterienvermittelte Transformation SseF transient in allen VIGS-Pflanzen exprimiert. 48 Stunden nach Agro- Infiltration wurde der Phänotyp der infiltrierten Blätter dokumentiert. B: Semiquantitative RT-PCR wurde für die Untersuchung der NDR1- und EDS1-Expression in den VIGS-Pflanzen angewandt. Hierfür wurde aus N. benthamiana Blättern RNA isoliert, cdna hergestellt und für RT-PCR eingesetzt. Gleiche Mengen an cdna wurden durch die Amplifikation von Ubiquitin überprüft. C: Nachweis der Expression von SseF in VIGS-GFPsil und VIGS-NDR1 und VIGS-EDS1 Pflanzen. Die Expression von SseF wurde, 1 bzw. 2 Tage nach Infiltration, mittels Western Blot analysiert. Zur Detektion wurde ein Anti-myc-Antikörper verwendet. Die makroskopisch sichtbaren Effekte wurden anschließend durch die Bestimmung der Leitfähigkeit, die durch einen gesteigerten Ionen-Ausstrom während Zelltod-Prozessen in Pflanzen charakterisiert ist, quantifiziert. Daher wurden SseF-myc in VIGS-NDR1, -EDS1 und GFPsil Pflanzen transient überexprimiert. Nicht-infiltrierte und GFP-exprimierende VIGS Pflanzen wurden als Kontrollen miteinbezogen, um einen Effekt der Virus-induzierten Genstilllegung oder der Agroinfiltration auf die Ionen Leckage auszuschließen. 93

101 ERGEBNISSE: SseF Übereinstimmend mit den zuvor beobachteten SseF-abhängigen Phänotypen, konnte eine signifikante Abschwächung des Ionen-Ausstroms in VIGS-NDR1 Pflanzen, verglichen mit den VIGS-EDS1- oder GFPsil Pflanzen, bestätigt werden (Abbildung 3.48). Weiterhin zeigte sich, dass weder die Virus-Behandlung noch die Agroinfiltration für einen Anstieg der Leitfähigkeit verantwortlich waren (Abbildung 3.48). Diese Befunde geben Grund zur Annahme, dass möglicherweise ein R-Protein des CC-NB-LRR Typs für die Erkennung von SseF notwendig ist. Abbildung 3.48: Die Herunterregulierung der NDR1-Genexpression führt zu einer reduzierten Leitfähigkeit nach transienter Expression von SseF in pyl-ndr1 Pflanzen. Zur Untersuchung der Ionen-Leckage wurde SseF transient in VIGS-NDR1, VIGS-GFPsil (Kontrollpflanze) und VIGS-EDS1 exprimiert. 48 Stunden nach transienter Expression wurde die elektrische Leitfähigkeit quantifiziert. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch *** P < 0,001 gekennzeichnet, wobei ein Vergleich zwischen pyl-ndr1 und ptrv2-gfpsil SseFexprimierenden Blättern gemacht wurde. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 94

102 ERGEBNISSE: SseF Translokation des Salmonella Effektorproteins SseF über das Xanthomonas T3SS Erstellung des chimären AvrRpt2-SseF Konstrukts und Test auf Funktionalität Bisherige Analysen zur Charakterisierung der SseF-Antwort in N. benthamiana wurden durch Agrobakterien-vermittelte transiente Expression durchgeführt. Hierbei werden Proteine unter einem konstitutiv aktiven 35S Promoter aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S) artifiziell überexprimiert. Natürlich könnte die durch SseF ausgelöste HR-ähnliche Reaktion eine Folge dieser Überexpression sein. Deshalb stellte sich die Frage, ob SseF ähnliche Antworten auslösen würde, wenn es unter einem weniger aktiven Promotor exprimiert und über ein T3SS in die Pflanzenzelle gelangt. Dazu wurde Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) herangezogen, da Xcv keinen lokalisierten Zelltod in N. benthamiana auslösen kann (Üstün et al., 2012). Zusätzlich war bekannt, dass Xcv Effektoren anderer Pathogene sekretieren kann (Rossier et al., 1999; Mudgett et al., 2000). In Salmonella enterica wird für die T3SS-abhängige Translokation von SseF dessen Chaperon, SscB, benötigt (Dai & Zhou, 2004), weshalb eine Erkennung des SseF Translokationssignals in Xcv eher unwahrscheinlich ist. Um dieses Problem zu umgehen, wurde das amino-terminale Translokationssignal von SseF (Aminosäuren 1-26) durch die Typ-III Sekretions- Signalsequenz (Aminosäuren 1-100) von AvrRpt2, einem Effektor aus dem Phytopathogen Pseudomonas syringae ersetzt (Guttman & Greenberg, 2001). Transiente Expression des Fusionsprotein AvrRpt SseF in N. benthamiana bestätigte, dass die Fusion keinen Einfluss auf die Ausbildung der SseF-abhängigen HR-ähnlichen Symptome hatte (Abbildung 3.49). Zudem konnte auch gezeigt werden, dass die ersten 100 Aminosäuren von AvrRpt2 nicht verantwortlich für die Zelltod-Reaktion sind (Abbildung 3.49). Dies deutet an, dass die T3S Signalsequenz von AvrRpt2 die Funktionalität von SseF nicht beeinflusst. Abbildung 3.49: Analyse der Funktionalität der AvrRpt SseF Fusion mittels transienter Expression. SseF-myc, AvrRpt SseF myc und AvrRpt myc wurden in N. benthamiana mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation transient exprimiert. 48 Stunden nach Agroinfiltration wurde der Phänotyp dokumentiert. Die Expression von AvrRpt myc wurde in einem Western Blot mit anti-myc- Antikörpern 24 und 48 Stunden nach Agroinfiltration untersucht. 95

103 ERGEBNISSE: SseF Die Translokation der AvrRpt2-SseF Fusion über das T3SS von Xcv löst HR-ähnliche Antworten in N. benthamiana aus Anschließend wurde das Konstrukt unter die Kontrolle des nativen AvrRpt2 Promotors gesetzt und über triparentale Konjugation in Xcv eingebracht. Die Infektion von N. benthamiana mit Xcv und zwei unabhängigen Xcv Stämmen, die das Fusionskonstrukt enthielten, offenbarte, dass beide Xcv (AvrRpt SseF ) Stämme 48 Stunden nach Infiltration eine starke und schnelle SseF-abhängige HR-ähnliche Reaktion auslösten. Im Gegensatz dazu war Xcv nicht in der Lage HR-ähnliche Antworten zu diesem Zeitpunkt zu induzieren (Abbildung 3.50A). Als eine Positivkontrolle wurde ein Xcv Stamm erstellt in dem HopZ1a aus Pseudomonas syringae eingebracht wurde. Dieser Effektor ist dafür bekannt eine HR in N. benthamiana auszulösen (Ma et al., 2006). Auch die Infiltration von N. benthamiana mit einem HopZ1a-exprimierenden Stamm resultierte 48 Stunden nach Infektion in einer HopZ1a-abhängigen HR, die eine zur SseF-vermittelten HR vergleichbare Kinetik aufwies. Um die Sekretion des AvrRpt2-SseF Fusionsproteins durch das Xcv T3SS nachzuweisen, wurde das Fusionskonstrukt in Xcv hrpb1 eingefügt. Hierbei handelt es sich um einen Xcv Stamm, das in HrpB1 deletiert ist und damit keine Effektoren mehr sekretieren kann (Rossier et al., 2000). Für in vivo Translokations-Studien, wurden N. benthamiana Pflanzen mit Xcv und zwei Xcv hrpb1 (AvrRpt SseF ) Stämmen infiltriert. Die Expression des Fusionsproteins AvrRpt2-SseF verursachte keine HR-ähnlichen Symptome mehr, was darauf hindeutet, dass in Abwesenheit von HrpB1 keine Sekretion stattgefunden hat (Abbildung 3.50B). Die Unterschiede in den beobachteten Phänotypen waren kein Ergebnis unterschiedlicher Proteinmengen, da ähnliche AvrRpt SseF Proteinlevel, sowohl in Xcv als auch in Xcv hrpb1, detektierbar waren (Abbildung 3.50C). Abbildung 3.50: SseF-abhängige HRähnliche Symptome in N. benthamiana nach Translokation durch das T3SS von Xcv. A: Xcv oder zwei Stämme die das Expressionskonstrukt AvrRpt SseF tragen wurden mit einer Bakteriendichte von 2 x 10 8 cfu/ml in N. benthamiana infiltriert. Als Positivkontrolle diente ein Xanthomonas- Stamm der HopZ1a translozieren kann. B: Das AvrRpt SseF Fusionsprotein wird durch den T3SS-defizienten Xcv ΔhrpB1-Stamm nicht transloziert. Xcv ΔhrpB1 und zwei unabhängige Xcv ΔhrpB1 (AvrRpt SseF ) Stämme wurden mit einer optischen Dichte von 2 x 10 8 cfu/ml in N. benthamiana infiltriert. A und B: Die Linien deuten den infiltrierten Bereich an. Die Phänotypen wurden 48 Stunden nach Infektion dokumentiert. 96

104 ERGEBNISSE: SseF C: Analyse der AvrRpt SseF Proteinmengen in den Xanthomonas Bakterien. Xcv 85-10, Xcv ΔhrpB1 und Xcv sowie Xcv ΔhrpB1, die das AvrRpt2- SseF Fusionskonstrukt enthalten wurden im Minimalmedium kultiviert. Für die Analyse der Proteinexpression wuren gleiche Mengen an Bakterienzellen verwendet und einem Western Blot mit einem anti-ha-antikörper unterzogen. Weiterhin wurde untersucht, ob die SseF-vermittelte HR-ähnliche Antwort auch in Translokations-Versuchen SGT1-abhängig ist. Zu diesem Zweck, wurden Pflanzen die in der SGT1 mrna-menge über VIGS herunterreguliert waren, mit einem hohen Bakterientiter (10 8 cfu/ml) an Xcv (AvrRpt SseF ) infiziert. Verminderung der SGT1 Genexpression führte zu einer kompletten Unterdrückung der makroskopisch sichtbaren HR-ähnlichen Symptome, verglichen mit VIGS-GFPsil Pflanzen (Abbildung 3.51). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass das T3S Signal von AvrRpt2 SseF über den Xcv T3S Apparat in N. benthamiana Zellen dirigieren kann und auch hier lokalisierten Zelltod verursacht. Außerdem erfordert die Auslösung SseF-induzierter HR-ähnlicher Antworten SGT1 und ist damit höchstwahrscheinlich eine durch Erkennung vermittelte, aktive Antwort der Pflanze auf den Effektor. Abbildung 3.51: Die SseF-vermittelte HR ist abhängig von SGT1. Phänotyp der N. benthamiana VIGS SGT1 Pflanzen, die mit Xcv oder Xcv (AvrRpt SseF ) infiziert wurden. Als Kontroll-Pflanzen dienten die ptrv2-gfpsil Pflanzen. Der Bakterientiter für die Infektion betrug 2 x 10 8 cfu/ml. Die Pflanzenreaktionen wurden 48 Stunden nach Infiltration der Xcv Stämme dokumentiert. Da die Translokation von AvrRpt2-SseF über das T3SS von Xanthomonas HR-ähnliche Symptome in N. benthamiana auslöste, sollte getestet werden, ob der beobachtete Phänotyp mit einem eingeschränkten Bakterienwachstum einherging. Deshalb wurden die Bakterientiter von Xcv (Vektor) und Xcv (AvrRpt SseF ) null und sechs Tagen nach Infektion von N. benthamiana ermittelt. An Tag 6 der Infektion konnte ein klarer und signifikanter Rückgang in der Bakterien Population von Xcv (AvrRpt SseF ) im Vergleich zu Xcv beobachtet werden (Abbildung 3.52A). Dies deutet wiederum auf eine Erkennung von SseF hin, die durch R-Proteine vermittelt wird und damit das bakterielle Wachstum eindämmt. In einem weiteren Experiment HR-ähnliche Symptome, die durch die 97

105 ERGEBNISSE: SseF Injektion von AvrRpt2-SseF ausgelöst werden, zu verifizieren, wurde die Ionen Leckage nach Infektion mit Xcv (AvrRpt SseF ) vermessen. Hierbei wurden PstDC3000 und Xcv (HopZ1a) in die Studie miteinbezogen, da beide Bakterien-Stämme eine spezifische HR in N. benthamiana auslösen und als Positivkontrollen fungieren (Wei et al., 2007; Ma et al., 2006). Die Messungen verdeutlichten, dass Xcv (AvrRpt SseF ) eine signifikante und schnelle Zunahme in der Leitfähigkeit bewirkte, wohingegen Xcv zu keiner verstärkten Ionen Leckage führte (Abbildung 3.52B). Genauer betrachtet ist zu bemerken, dass zum Zeitpunkt 24 Stunden nach Xcv (AvrRpt SseF ) Infektion, bereits ein signifikanter Anstieg des Ionen-Ausstroms zu verzeichnen ist, obwohl hier noch keine sichtbaren Anzeichen für eine HR zu erkennen waren. Wie zu erwarten stieg auch die Leitfähigkeit in Gegenwart von PstDC3000 und Xcv (HopZ1a) und war zur Xcv (AvrRpt SseF ) Infektion vergleichbar (Abbildung 3.52B). Abbildung 3.52: Die Translokation von AvrRpt2-SseF löst HR-typische zelluläre Antworten in N. benthamiana aus. A: Die Sekretion von AvrRpt2-SseF limitiert das Bakterienwachstum von Xcv in N. benthamiana. Xcv (Vektor) und Xcv (AvrRpt SseF ) wurden in Blättern von N. benthamiana mit einer Bakteriendichte von 1 x 10 6 cfu/ml infiltriert. Das Bakterienwachstun wurde ca. eine Stunde nach Infektion (an Tag 0) und 6 Tage nach Infektion (6 dpi) quantifiziert. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. B: Die Translokation von SseF führt zu einer gesteigerten Leitfähigkeit in N. benthamiana. Die Leitfähigkeit von Blättern, die mit den in der Abbildung angedeuteten Stämmen infiziert wurden, wurde zu den angegeben Zeitpunkten vermessen. Die Signifikanz wurde mittels student s t-test kalkuliert und ist durch * P < 0,05 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 98

106 ERGEBNISSE: SseF Einfluss der Sekretion des AvrRpt2-SseF Proteins während der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika Der für die AvrRpt2-SseF Translokations-Studien verwendete Xanthomonas Stamm ist virulent auf Paprika Pflanzen und löst in einer kompatiblen Interaktion die sogenannte bakterielle Fleckenkrankheit aus. Wie beeinflusst die Sekretion des AvrRpt2-SseF Fusionsprotein diese Interaktion? Ist auch hier SseF in der Lage einen HR-ähnlichen Phänotyp in Paprika auszulösen und damit eine kompatible Interaktion in eine inkompatible zu verwandeln? Um dies zu analysieren, wurde der Krankheitsverlauf und Bakterienwachstum in suszeptiblen Paprika ECW Pflanzen (C. annuum) nach Infektion von Xcv (AvrRpt SseF ) untersucht. In Abbildung 3.53A ist zu erkennen, dass die Translokation von AvrRpt2-SseF keine HR Symptome in Paprika Pflanzen verursachte. Hierbei handelte es sich um eine schnellere Symptomentwicklung, verglichen mit Xcvinfizierten Pflanzen. Während dieser, vier bis fünf Tage nach Infektion, wässrigen Läsionen, die nach und nach zu einem Absterben des Blattes führen, auslösen, führte die der Xcv (AvrRpt SseF ) Stamm bereits 3 Tage nach Infektion zu diesen Symptomen (Abbildung 3.53A). Die beschleunigte Symptomausbreitung korrelierte auch mit einem geringen, aber signifikanten Anstieg im Bakterienwachstum, drei und sechs Tage nach Xcv- Infektion (Abbildung 3.53B). Diese Erkenntnis legt nahe, dass SseF einen Beitrag zur Virulenz von Xanthomonas leistet. Außerdem wurde klar, dass SseF die kompatible Xcv- Paprika Interaktion nicht in eine inkompatible Wechselwirkung umprogrammieren kann, da SseF möglicherweise in Paprika nicht erkannt wird. Abbildung 3.53: Einfluss von SseF auf die kompatible Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika ECW. A: Krankheitssymptome von Paprika Pflanzen nach Infektion mit Xcv (Vektor) oder Xcv (AvrRpt SseF ). Die Paprika Pflanzen wurden mit einem Bakterientiter von 2 x 10 8 cfu/ml infiltriert und 3 Tage nach Infektion auf makroskopisch sichtbare Symptome analysiert. B: Bakterienpopulation in Blättern, die mit Xcv (Vektor) oder Xcv (AvrRpt SseF ) mit einer Bakteriendichte von 1 x 10 5 cfu/ml infiltriert wurden. Die Bakteriendichte wurde an Tag 0, 3 und 6 nach Infektion bestimmt. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch * P < 0,05 und ** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 99

107 ERGEBNISSE: SseF Mutationsanalyse von SseF SseF besitzt zwei hydrophobe Transmembran (TM)-Regionen: TM1 (Aminosäuren ) und TM2 (Aminosäuren 128 bis 211), die am amino- und carboxyterminalen Bereichen lokalisiert sind (Abbildung 3.54A). Abrahams et al. (2006) konnten funktionelle Domänen von SseF identifizieren. Demnach wird TM1 für die Sekretion und Translokation des Proteins gebraucht, während die zweite hydrophobe Region TM2 für die Virulenz-Funktion des Effektors in tierischen Zellen nötig ist (Abrahams et al., 2006). Aufgrund dieser Erkenntnisse, sollten die Rollen der beiden TM-Regionen in der SseF-vermittelten HR-ähnlichen Symptomentwicklung analysiert werden. Basierend auf den bereits bekannten SseF- Deletionsmutanten (Abrahams et al., 2006), wurden zwei Deletionsvarianten erstellt. Dabei wurden eine C-terminale (SseFΔC4) und eine interne Deletion in der TM2-Region (SseFΔ7) generiert, die zur Detektion eine myc-markierung enthielten (Abbildung 3.54A). Beide Varianten wurden mit dem Volllängen-Protein in N. benthamiana transient exprimiert und auf die Entwicklung von HR-ähnlichen Symptomen untersucht. In Abbildung 3.53B ist zu erkennen, dass eine C-terminale Deletion keinen Einfluss auf die HR-Ausbildung hat, wohingegen eine Deletion in der funktional wichtige TM2 Domäne zu einem Verlust der HRähnlichen Antwort führt. Alle Varianten wurden in planta exprimiert, wie Westernblot Analysen gegen das myc-epitop der Proteine zeigten (Abbildung 3.54C). Hierbei wird deutlich, dass 48 Stunden nach transienter Expression das Volllängen-Protein und die SseFΔC4-Variante kaum oder nicht mehr zu detektieren waren, da die HR-ähnlichen Symptome sehr fortgeschritten waren (Abbildung 3.54C). Im Einklang mit den phänotypischen Beobachtungen konnte auch die Ionen Leckage bestätigen, dass die Leitfähigkeit der SseFΔC4-exprimierende Blätter vergleichbar zu SseF-exprimierenden Blättern war (Abbildung 3.54D). Dahingegen löste die transiente Expression der SseFΔ7- Variante keinen gesteigerten Ionen-Ausstrom aus (Abbildung 3.54D) und ist ein weiteres Indiz dafür dass die TM2 eine wichtige Funktion in der HR-Auslösung besitzt. Ein erstaunlicher Befund, denn die gleiche Domäne scheint wichtig für die Funktion von SseF in Säugetier-Zellen zu sein (Abrahams et al., 2006). 100

108 ERGEBNISSE: SseF Abbildung 3.54: Strukturelle Analyse von SseF in N. benthamiana. A: Eine schematische Darstellung der Deletionsvarianten die in dieser Arbeit verwendet wurden. Beide Deletionskonstrukte tragen am C-Terminus eine myc-markierung. Interne Deletionen in SseF (Δ7) oder carboxy-terminale Verkürzungen (ΔC4) sind durch Pfeile und gestrichelte Linien dargestellt. B: SseF und die beiden Deletionsmutanten wurden mittels Agroinfiltration in N. benthamiana transient exprimiert und 48 Stunden nach Transformation wurde der Phänotyp dokumentiert. C: Die Expression der myc-markierten Proteine wurde mittels Western Blot verifiziert. Hierfür wurde ein anti-myc- Antikörper verwendet. Die Amidoblackfärbung der Rubisco diente als Ladekontrolle. D: Quantifizierung der Ionen- Leckage 48 Stunden nach transienter Expression von SseF-, SseFΔ7- und SseFΔC4-myc in N. benthamiana. Die Leckage wird als prozentualer Anteil von der maximal möglichen Leckage nach Aufkochen ausgewertet. Die signifikanten Unterschiede wurden mittels student s t-test kalkuliert und sind durch *** P < 0,01 gekennzeichnet. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung SD (n = 3) an. 101

109 ERGEBNISSE: SseF Die Interaktion von Salmonella mit N. benthamiana In den vergangenen Jahren wurde es offensichtlich, dass S. enterica Serotypen nicht nur die Fähigkeit besitzen sich an die Oberfläche des Pflanzengewebes anzuheften um epiphytisch zu proliferieren, sondern auch Pflanzengewebe kolonisieren um endophytisch zu wachsen (Dong et al., 2003; Iniguez et al., 2005; Klerks et al., 2007a; Klerks et al., 2007b; Kroupitski et al., 2009). Des Weiteren belegen vorangegangene Studien, dass S. enteria serovar Thyphimurium Stamm eine Reihe von basalen Abwehrantworten in Arabidopsis auslösen kann (Iniguez et al., 2005). Schikora et al. (2008) zeigten, dass S. enterica die Pflanzenabwehr überkommen kann, sich innerhalb verschiedener Gewebetypen in A. thaliana vermehrt und dadurch Chlorosen verursacht. Ein funktionales T3SS scheint für die Infektion von A. thaliana durch Salmonella notwendig zu sein (Schikora et al., 2011). Daher wird davon ausgegangen, dass möglicherweise Typ-III Effektoren in die Suppression der Pflanzenabwehr involviert sein könnten. Diese Spekulation ist ein Anreiz, die Interaktion von Salmonella mit N. benthamiana zu studieren und die Frage zu klären, ob diese Nicht-Wirts- Interaktion eine HR-ähnliche Antwort in Tabakpflanzen auslösen kann. Diese Hypothese wurde geklärt, indem N. benthamiana Blätter mit Salmonella Typhimurium infiziert wurden. Neben normalem Vollmedium für wurde ein Minimal Medium (ph 5.0) für die Bakterien-Kultivierung verwendet, um die Assemblierung des T3SS zu fördern (Yu et al., 2004). Zudem wurden die Bakterien einem ph Wechsel von 5.0 zu 7.2 unterzogen, um die Sekretion von Effektormolekülen zu fördern (Yu et al., 2010), da bisher nicht bekannt ist ob Salmonella in der Lage das T3SS in Pflanzen auszubilden und T3E zu injizieren. Die unterschiedlichen Behandlungen resultierten zwei Tage nach Infektion nicht zu sichtbaren HR-ähnlichen Symptomen oder anderen Krankheits-Phänotypen in N. benthamiana (Abbildung 3.56). Deshalb scheint Salmonella, obwohl SseF vorhanden ist, keine HRähnlichen Antworten in N. benthamiana auszulösen. Abbildung 3.56: Salmonella verursacht keine makroskopisch sichtbaren Symptome auf N. benthamiana. S. typhimurium wurde unter verschiedenen Bedingungen angezogen (in der Abbildung zu sehen) und anschließend mit einer OD 600 = 0.2 in N. benthamiana infiltriert. Zwei Tage nach Infektion wurde der Phänotyp der infizierten Blätter fotografiert. 102

110 DISKUSSION: XopJ 4 Diskussion 4.1 Xcv Typ-III Effektorprotein XopJ Eine Reihe Gram-negativer phyto- und zoopathogene Bakterien besitzen die Fähigkeit Typ- III Effektorproteine in das Cytosol ihrer Wirtszellen zu translozieren, wodurch zahlreiche zelluläre Prozesse moduliert werden können. Letztendlich wird dadurch die Virulenz gefördert, was mit der Ausbreitung der bakteriellen Erreger mit einhergeht, und schließlich zur Krankheit des Wirtssystems führt (Galan, 2009). Um Wirts-Zielproteine zu modifizieren ahmen viele Effektorproteine die Funktionen eukaryotischer Proteine nach. Diese Modifikationen tragen zur Virulenz bei und sind essentiell für die anschließende Interaktion mit dem Wirt (Abramovitch et al., 2006). Jedoch konnten bisherige Studien nur einige Zielproteine für einige wenige Typ-III Effektoren identifizieren. Dabei zeichnete sich ab, dass diese größtenteils mit zellulären Abwehrmechanismen interferieren (Feng & Zhou, 2012; Deslandes & Rivas, 2012; Lee et al., 2013). Vorangegangen Arbeiten deuteten darauf hin, dass der T3E des Bakteriums Xanthomonas campestris pv. vesicatoria XopJ Zellwandbasierte Abwehrantworten, wie die Proteinsekretion oder Einlagerung von Callose beeinflusst und damit möglicherweise eine Rolle in der Unterdrückung der PTI einnimmt (Bartetzko et al., 2009). Auf der Suche nach potentiellen pflanzlichen Zielproteinen ergab eine Hefe-2-Hybrid Durchmusterung eine mögliche Wechselwirkung von XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6. Diese Verbindung führte zu einer Reduzierung der Proteasomaktivität und Akkumulierung von ubiquitinierten Proteinen, in Abhängigkeit der katalytischen Aktivität sowie Lokalisierung des Effektors (Üstün et al., 2013). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht welchen Beitrag die Wechselwirkung von XopJ und RPT6 und die daraus resultierende Inhibition des Proteasoms auf die Virulenz von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in einer kompatiblen Interaktion mit Paprikapflanzen hat XopJ interagiert mit der Proteasomuntereinheit RPT6 in vivo und in vitro zur Beeinträchtigung der Proteasomaktivität Das 26S Proteasom ist ein ATP-abhängiger proteolytischer Proteinkomplex, der Ubiquitin (Ub)-konjugierte Proteine degradiert. Dabei wird das Ubiquitin in einer dreistufigen Enzym- Kaskade, die aus einem aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und ligierenden (E3) Enyzm besteht, an Zielproteine konjugiert (Trujillo & Shirasu, 2010). Das Ubiquitin- Proteasom-System (UPS) nimmt eine zentrale Stellung im Abbau von regulatorischen 103

111 DISKUSSION: XopJ Proteinen ein und ist daher für eine Vielzahl zellulärer Prozesse von großer Bedeutung (Vierstra, 2009; Sadanandom et al., 2012). Das 26S Proteasom besteht aus 31 Untereinheiten, das in zwei großen Unter-Komplexen arrangiert ist: die 20S Kern-Protease Untereinheit (core protease; CP) und die 19S regulatorische Untereinheit (regulatory particle; RP) (Abbildung 4.1). Dabei ist die 20S Untereinheit eine unspezifische ATP-und Ubiquitinunabhängige Protease und bildet eine zylindrische Struktur aus vier Ringen mit je 7 Untereinheiten mit der Anordnung α 1-7 /β 1-7 /β 1-7 /α 1-7. Die β 1, β 2 und β 5 Untereinheiten bilden das aktive Zentrum der Protease und generieren peptidylglutamyl peptid hydrolysierende, trypsin-ähnliche und chymotrypsin-ähnliche Aktivitäten, um nahezu alle Peptidbindungen spalten zu können (Smalle & Vierstra, 2004). Die 19S regulatorische Untereinheit assoziiert mit der 20S CP und ist für die ATP-Hydrolyse und Erkennung von Poly-Ubiquitin-Ketten erforderlich. Sie besteht aus 17 Untereinheiten und kann wiederum in Deckel- und Basis- Subkomplexe unterteilt werden (Abbildung 4.1B). Die Basis ist mit dem α-ringkanal verbunden und beinhaltet einen Ring aus 6 AAA-ATPasen (RPT1-6) und drei nicht-atpase Untereinheiten (RPN1, 2, und 10). Der Deckel besteht aus RPN3, 5-9 und 11-12, die auch keine ATPase Aktivität besitzen. Die Hauptfunktion der RP ist es, geeignete Substrate zu erkennen und zu entfalten. Hierzu werden Ubiquitin-Ketten gespalten, und der α-ringkanal geöffnet, um dann die Polypeptide in das Lumen der 20S CP zur Degradierung zu dirigieren. Zurzeit sind nur ein Teil der Funktionen der RP Untereinheiten bekannt. Dabei sind die RPTs möglicherweise an der ATP-abhängigen Öffnung des α-ringkanals und an der Protein- Entfaltung beteiligt, wohingegen die RPNs eher als Ubiquitin-Rezeptoren und für die Erkennung oder Rekrutierung von Substraten zum Proteasom dienen (Smalle & Vierstra, 2004). Abbildung 4.1: Aufbau des 26S Proteasoms. A: Aufbau der 20S Kern-Protease aus den α- und β- Untereinheiten, wobei die β-untereinheiten, das aktive Zentrum bilden. B: Die 19S regulatorische Untereinheit (RP) besteht aus einem Deckel- und aus einem Basis-Komplex. Die Basis besteht hauptsächlich aus den RPT1-6 Untereinheiten. C: Das 26S Proteasom ist aus dem 20S und 19S Komplex zusammengesetzt. Abbildung modifiziert nach Smalle und Vierstra (2004). 104

112 DISKUSSION: XopJ In den letzten Jahren wurde deutlich, dass das UPS nicht nur an lebenswichtigen zellulären Mechanismen beteiligt ist, sondern auch während der PTI oder ETI eine essentielle Funktion einnimmt (Marino et al., 2012; Trujillo und Shirasu, 2010). Beispielsweise, sind RING-Finger E3 Ubiquitin Ligasen an der RPM1- und RPS2-vermittelten HR Antwort involviert (Kawasaki et al., 2005). In Paprika wurden zwei RING-E3 Ubiquitin Ligasen, CaRING1 und CaRFP1 nach einer Infektion mit einem avirulenten Xanthomonas Stamm induziert, wobei es sich bei CaRING1 um eine aktive E3 Ligase handelt, die für die HR und Resistenz-Antworten gegen virulente und avirulente Xanthomonas-Stämme in Paprika gebraucht wird (Hong et al., 2007; Lee et al., 2011). Außerdem konnte kürzlich gezeigt werden, dass Mitglieder der U-box E3 Ligasen die PTI negativ regulieren können, indem sie mit verschiedenen Komponenten der basalen Abwehr interagieren und diese ubiquitinieren und zum Abbau über das 26S Proteasom bereitstellen (Trujillo et al., 2008; Lu et al., 2011; Stegmann et al., 2012). Dahingegen können einige bakterielle Effektorproteine das UPS der Wirtszelle zum eigenen Nutzen ausbeuten, indem sie als E3 Ligasen agieren, wie z.b. AvrPto (Janjusevic et al., 2006; Göhre et al., 2008), oder wie im Falle von HopM1 die Ubiquitinierung von Zielproteinen fördern um die Pflanzenabwehr zu supprimieren (Nomura et al., 2006). Weiterhin konnte in früheren Studien die essentielle Rolle einzelner Proteasom-Untereinheiten für die Regulation von Abwehrantworten gegen Mikroben dokumentiert werden. Die α3, α6 und β1 Untereinheiten der 20S CP sind nach Cryptogein-Behandlung induziert und die β1 scheint eine Caspase-3-ähnliche Funktion auszuüben um Zelltodreaktionen zu regulieren (Dahan et al., 2001; Suty et al., 2003; Hatsugai et al., 2009). Interessanterweise, scheint der Proteasom-abhängige Proteinabbau für Zelltod-Antworten benötigt zu werden, jedoch nicht für die Signalweiterleitung während der basalen Abwehr (Hatsugai et al., 2009). Die Analyse von Arabidopsis Mutanten, in denen bestimmte Proteasomuntereinheiten ausgeschaltet sind veranschaulicht, dass einige Untereinheiten an der basalen Abwehr mitwirken (Yao et al., 2012). Außerdem interagiert die 19S Untereinheit RPT2a mit einem Resistenzprotein und ist am SA-abhängigen Signalweg beteiligt (Chung & Tasaka, 2011). Alles in Allem scheinen die einzelnen Proteasomuntereinheiten neben ihrer Rolle im 26S Proteasomkomplex auch andere Funktionen einzunehmen, v.a. um Abwehrmechanismen zu kontrollieren, weshalb sie auch ein attraktives Ziel für Phytopathogene darstellen. Dennoch konnten bis jetzt keine Proteasom-Untereinheiten als direkte Zielproteine von bakteriellen Typ-III Effektoren in Pflanzen identifiziert werden. Jedoch können andere bakterielle oder virale Proteine mit dem Proteasom interagieren und dessen Aktivität beeinflussen (Groll et al., 2008; Ballut et al., 2005; Sahana et al., 2012). P. syringae pv. syringae Stamm B728a sekretiert z.b. ein kleines nicht-ribosomales Peptid, Syringolin A (SylA), das die Proteasomaktivität durch die kovalente Bindung an die katalytischen Untereinheiten irreversible hemmt und dadurch basale Abwehrantworten unterdrückt (Schellenberg et al., 2010; Groll et al., 2008). 105

113 DISKUSSION: XopJ Mit dem bakteriellen Typ-III Effektorprotein XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria konnte erstmals ein T3E identifiziert werden, der mit einer Proteasomuntereinheit interagiert. Dabei interagiert das Wildtyp-Protein XopJ mit RPT6 in Hefe und in planta. Der in vitro Ko-IP Interaktionsnachweis demonstrierte nochmals die direkte Interaktion von XopJ und RPT6 (Abbildung 3.3). Demnach ist es nicht wahrscheinlich, dass ein drittes Protein oder ein anderer eukaryotische Faktor für die Interaktion beider Proteine gebraucht wird. Hefe-zwei-Hybrid Analysen konnten zudem zeigen, dass XopJ in Abhängigkeit von dessen katalytischer Aktivität mit RPT6 interagiert (Üstün et al., 2013). Jedoch deuteten in planta BiFC Analysen darauf hin, dass die katalytische Mutanten dennoch in der Lage war mit RPT6 zu assoziieren (Bartetzko, 2012; Abbildung 3.32). Weitere Interaktionsstudien mittels einer GFP-Ko-IP bestätigten die Annahme, dass die Mutation der katalytischen Triade nicht zu einem Verlust der Interaktion beider Protein führt (Abbildung 3.1). Dies steht im Wiederspruch zu den Daten aus dem Hefesystem ist aber nicht ungewöhnlich. Sowohl das Wildtyp-Protein XopJ als auch die katalytische Mutanten sind beide an der Plasmamembran lokalisiert und damit in der Lage mit RPT6 zu interagieren, oder RPT6 an die Plasmamembran zu rekrutieren (Bartetzko et al., 2009; Bartetzko, 2012). Des Weiteren war die Interaktion von einem XopJ-verwandten Effektor, HopZ1a, mit der 2-Hydroxyisoflavon Dehydratase (HID1) aus der Sojabohne auch nicht von dessen katalytischen Triade abhängig (Zhou et al., 2011). Es ist möglich dass andere Bereiche oder Domänen für eine Wechselwirkung beider Proteine erforderlich sind. Natürlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass das Expressionsniveau der katalytischen Mutante von XopJ in Hefe zu niedrig ist, weshalb keine Interaktion nachweisbar ist oder auch das XopJ C235A mit RPT6 in planta interagiert, weil beide Proteine nach Ko-Expression in unmittelbarer Nähe zu einander an der Plasmamembran lokalisiert sind. Die Diskrepanz zwischen der Bindung von XopJ C235A mit RPT6 in beiden experimentellen Systemen ist derzeit nicht aufklärbar, aber könnte Unterschiede in der Sensitivität beider Systeme reflektieren. Da die Inhibition der Proteasomaktivität von der katalytischen Triade und der korrekten Lokalisierung von XopJ abhängig ist (Üstün et al., 2013), kann spekuliert werden, dass XopJ C235A zwar in der Lage ist mit RPT6 an der Plasmamembran zu assoziieren, aber dieses nicht zu modifizieren, so dass die Proteasomaktivität unbeeinflusst bleibt. Bei näherer Betrachtung der Interaktion von XopJ C235A mit RPT6 konnte auch beobachtet werden, dass diese Interaktion möglicherweise an spezifischen Domänen, sogenannten Lipid rafts, also an Cholesterinreichen Mikrodomänen in der Zellmembran, stattfand. Diese Lipid Rafts und die damit assoziierten Proteine können wichtige Funktionen nach Pathogenbefall einnehmen (Jarsch & Ott, 2011). Wie stabil oder transient die Wechselwirkung von RPT6 mit der katalytischen XopJ-Mutante ist, könnte mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) weiter analysiert werden 106

114 DISKUSSION: XopJ (Hink et al., 2002). Hierbei werden die potentiellen Interaktionspartner an zwei unterschiedlich fluoreszierende Proteine gekoppelt, von denen das Emissionsspektrum des einen mit dem Extinktionsspektrum des anderen überlappt (CFP und YFP). Befindet sich ein Interaktionspartner in räumlicher Nähe des anderen, wird nach Anregung des ersten Fluoreszenzmoleküls dessen Emissionsenergie auf das zweite Molekül übertragen, woraufhin die Emission des zweiten Moleküls nachweisbar wird. Ist eine Wechselwirkung nicht stabil genug, kann nur die Fluoreszenz des ersten angeregten Moleküls detektiert werden. Die in planta Interaktion scheint dennoch spezifisch und auch nicht von einer myc- Markierung abhängig zu sein, da diese Markierung die Bindung an die Matrix nicht vermittelt. Andere Typ-III Effektoren aus Xanthomonas (XopD und XopB) wurden in der Ko-IP nicht mit RPT6 zusammen eluiert (Abbildung 3.1C), und zeigen, dass es keine generelle Eigenschaft von Xanthomonas Effektorproteinen ist mit Proteasomuntereinheiten zu assoziieren. Beispielsweise wurde für AvrBsT eine Interaktion mit der Proteasomuntereinheint RPN8 dokumentiert und vermutet, dass diese Interaktion zustande kommt, weil AvrBsT möglicherweise durch das 19S Proteasom für die Degradierung über das 26S Proteasom bereitgestellt wird (Szczesny et al., 2010). Die Interaktion und mögliche posttranslationale Modifikation von RPT6 durch XopJ führte in vorangegangenen Arbeiten zu einer um etwa 40% verminderten Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms nach transienter Expression in N. benthamiana. Im Rahmen dieser Arbeit konnte verdeutlicht werden, dass die Inhibition des Proteasoms durch XopJ ein spezifischer Effekt ist. Typ-III Effektoren werden in der Regel in die Wirtszelle transloziert um basale Abwehrantworten zu unterdrücken und somit das bakterielle Wachstum zu gewährleisten (Boller & He, 2009). Eine Überexpression dieser Effektoren führt oft zu unspezifischen Aktivitäten bzw. zum Absterben der Zellen, da zum Teil lebenswichtige zelluläre Mechanismen durch die Effektoren umgesteuert werden (Göhre & Robatzek, 2008). Weiterhin kann die Überexpression von Effektoren zu einer konstitutiven Abwehrantwort führen, weil die Pflanzenzelle das Effektorprotein detektieren kann. Folglich könnten andere zelluläre Prozesse, wie der proteolytische Abbau von Ubiquitin-markierten Proteinen, gestört sein oder vernachlässigt werden. Um die Spezifizität der XopJ-abhängigen Verminderung der Proteasomaktivität zu verifizieren, wurde XopB, ein weiteres Effektorprotein aus Xanthomonas, in N. benthamiana überexprimiert. Dieser Effektor kann basale Abwehrantworten in Pflanzen unterdrücken und löst wie XopJ nach transienter Überexpression zu späten Zeitpunkten eine Zelltodreaktion in Solanaceen aus (Schulze et al., 2012; Thieme et al., 2007). Diese Zelltodreaktion resultiert wahrscheinlich aus der Tatsache, dass beide Proteine durch die konstitutive Unterdrückung und Manipulierung der pflanzlichen Abwehr, die Wirtszellen schwächen und schließlich zum Absterben dieser 107

115 DISKUSSION: XopJ führen. Die transiente Expression von XopB hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität (Abbildung 3.4), weshalb folglich ausgeschlossen werden kann, dass die Unterdrückung der basalen Abwehrantworten oder auch die Schwächung der Pflanzenzelle zu einer verminderten Proteasomaktivität führt. Die Expression des viralen Faktors HcPro verdeutlicht, dass sowohl XopJ als auch HcPro durch die Interaktion mit verschiedenen Komponenten des Proteasoms, die Funktion und Aktivität ähnlich beeinflussen können. Dabei bindet HcPro an das 20S Proteasom und interagiert hier mit der α1 Untereinheit. Neben der proteolytischen Funktion, besitzt die 20S CP auch eine RNAse Aktivität, die vor allem gegen virale RNAs wirkt (Ballut et al., 2003; Gautier-Bert et al., 2003; Camborde et al., 2010). Es wird angenommen, dass HcPro mit der α1 Untereinheit des 20S Partikels assoziiert, um die Proteasomaktivität bzw. die RNAse Aktivität zu vermindern, um damit die Virus-Vermehrung zu unterstützen (Sahana et al., 2012). Die transiente Expression von HcPro in N. benthamiana führt genauso wie die Expression von XopJ zu einer etwa 40%- igen Suppression der Proteasomaktivität und unterstreicht, dass verschiedene Pathogene ähnliche Strategien nutzen, um die Virulenz im Wirtsorganismus zu steigern. Somit kann das Proteasom als ein neuer Knotenpunkt (hub) in der pflanzlichen Immunantwort gezählt werden, das als gemeinsames Ziel für unterschiedlich evolvierte Effektoren dient. Dies ist auch im Einklang mit der Hypothese, dass Effektoren aus verschiedenen Phytopathogenen auf gemeinsame Zielstrukturen konvergieren, um ihre unterschiedlichen Lebensweisen zu ermöglichen (Mukhtar et al., 2011). Da das für die in vitro Proteasommessungen verwendete fluorogene Substrat Suc-LLVY- AMC auch durch Cystein-Proteasen wie Calpain gespalten werden kann und auch Proteasom Inhibitoren wie MG132 und MG115 Cystein-Proteasen inhibieren können (Debiasi et al., 1999; Gu et al., 2010), sollte weiterhin untersucht werden ob XopJ eine ähnliche Funktion einnimmt und nur unspezifisch die Aktivität des Proteasoms beeinflusst. Jedoch ist die Inhibierung der Proteasomaktivität durch XopJ nicht auf eine mögliche Funktion als ein Cystein-Protease Inhibitor zurückzuführen, da in Anwesenheit eines potenten Cystein-Protease Inhibitors (E64) keine Veränderung in der XopJ-abhängigen Reduzierung der Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms wahrgenommen werden konnte (Abbildung 3.5). Damit konnte untermauert werden, dass XopJ durch die Interaktion und mögliche Modifikation von RPT6 zu einer Verminderung der Proteasom-Funktion führt und nicht durch andere, indirekte Mechanismen. Außerdem wurde die Funktion von XopJ das Proteasom zu inhibieren nicht beeinträchtigt und lässt die Vermutung zu, dass XopJ möglicherweise nicht als eine Cystein-Protease funktioniert. Für SylA, einem Proteasom-Inhibitor, der durch Pseudomonas sekretiert wird, war bereits bekannt, dass neben der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität auch die Trypsin- und Caspaseähnliche Aktivität des Proteasoms irreversibel supprimiert wurde (Groll et al., 2008). 108

116 DISKUSSION: XopJ Messungen der Caspase-ähnlichen Aktivität nach transienter Expression von XopJ in N. benthamiana deuteten darauf hin, dass auch XopJ einen negativen Effekt auf die Caspaseähnliche Proteasomaktivität besitzt (Abbildung 3.6). Eine Inhibition dieser Aktivität würde ein weiteres interessantes Ziel für Phytopathogene darstellen, da Hatsugai et al. (2009) demonstrieren konnten, dass die Caspase-ähnliche Funktion der β1 Untereinheit der 20S CP den programmierten Zelltod reguliert. Hierbei steuert die β1 Untereinheit die Membranfusion der Vakuolen- mit der Plasmamembran, um Vakuolenproteine in den Apoplasten zu entlassen und somit bakterielle Eindringlinge erfolgreich abzuwehren. Die Unterdrückung dieser Aktivität würde diese Form der Abwehr verhindern und damit einen Vorteil für die Bakterien bringen. Ob XopJ die Membranfusion und die damit verbundene Resistenz gegen avirulente Bakterien spezifisch unterbinden kann, müssen Infektionen von avirulenten Stämmen und paralleler transienter Expression von XopJ klären. Zudem kann durch das activity-based protein profiling (ABPP) die Aktivität der einzelnen Proteasomuntereinheiten β1, 2 und 5, die für die Caspase-, Trypsin und Chymotrypsin-Aktivität erforderlich sind, näher untersucht werden. Dabei werden fluoreszente oder biotinylierte Sonden genutzt, die mit dem katalytisch aktiven Rest der Enzyme kovalent und irreversibel reagieren und damit die Visualisierung der Enzym-Aktivität ermöglichen. Gu und Kollegen (2010) entwickelten eine Sonde, die alle drei Proteasomuntereinheiten erkennt. Eine Anwendung dieser Methode, könnte zu einer näheren Charakterisierung der Proteasominhibition durch XopJ führen. Sowohl für SylA als auch für HcPro wurde gezeigt, dass die Inkubation mit einem isolierten Peptid oder in E.coli produziertes rekombinantes Protein eine Inhibition des Proteasoms zur Folge hat (Groll et al., 2008; Sahana et al., 2012). Proteasom-Inhibitoren bilden daher auch eine neue Klasse therapeutischer Mittel gegen Krebs und andere Krankheiten (Borissenko & Groll, 2007). Tatsächlich konnte für in vitro eingesetztes SylA die Reduzierung der Proliferation und Induktion der Apoptose in Neuroblastom- und Ovarialkarzinomzellen beobachtet werden und stelle daher eine neue therapeutische Möglichkeit dar (Coleman et al., 2006). Auch in E. coli synthetisiertes und rekombinantes XopJ war in der Lage die Proteasomaktivität in Pflanzenextrakten in vitro zu vermindern (Abbildung 3.7), und das abhängig von der katalytischen Triade (Abbildung 3.8), was die Schlussfolgerung zulässt, dass XopJ auch in vitro die Proteasomaktivität beeinflussen kann. Ob es sich dabei um einen Dosis-abhängigen Effekt handelt müssen weitere Messungen mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen klären. Studien mit anderen Zellextrakten (z.b. HeLa Zellen) könnten Aufschluss darüber geben, ob XopJ die Proteasomaktivität über einen konservierten Mechanismus inhibieren kann. Weiterhin demonstrieren die in vitro Analysen, dass das aufgereinigte XopJ enzymatisch aktiv ist, da möglicherweise ein nötiger eukaryotischer Ko- Faktor im Pflanzenextrakt vorhanden ist. Dies eröffnet die Möglichkeit die enzymatische Aktivität von XopJ näher zu ergründen, in dem das rekombinante Protein mit 109

117 DISKUSSION: XopJ Pflanzenextrakten inkubiert wird und nach einer anschließenden Affinitätsreinigung für Enzymtests verwendet werden kann Verzögerung der Nekrose-Bildung durch die XopJ-abhängige Inhibition des Proteasoms in der kompatiblen Interaktion von Xcv mit Paprika Im Gegensatz zu einer früheren Studie (Noël et al., 2003), zeigte die in planta Analyse der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika ECW Pflanzen, dass eine Deletion von XopJ zu einem signifikant verminderten Bakterienwachstum führte (Abbildung 3.9). Jedoch war die Reduktion des Bakterienwachstums im Verhältnis zu der bei Deletion von anderen Effektoren wie XopN oder XopD beobachteten Reduktion geringer (Kim et al., 2008; Kim et al., 2009). Folglich muss es andere Effektoren mit einer redundanten Funktion in Xcv geben, die eine ähnliche Virulenz-Funktion wie XopJ besitzen, beispielsweise Mitglieder der YopJ-Familie wie AvrBsT oder AvrRxv (Lewis et al., 2011). Die Begünstigung der bakteriellen Multiplikation scheint nicht die Hauptfunktion von XopJ zu sein. Deshalb stellt sich die Frage, wie ist Interaktion von XopJ mit dem Proteasom in der Lage die Virulenz von Xanthomonas zu fördern. Die Proteasomaktivität in Paprikapflanzen die mit verschiedenen Xanthomonas Stämmen infiziert wurden, war signifikant gegenüber der Kontrolle induziert, wobei die stärkste Zunahme nach Infektion mit einem ΔxopJ Stamm beobachtet werden konnte. Einerseits deutet dieser Befund darauf hin, dass XopJ die Proteasomaktivität während einer Infektion unterdrücken kann, während andererseits die Infektion mit dem Xanthomonas Wildtyp-Stamm an sich eine immense Erhöhung der Aktivität des Proteasoms zur Folge hat (Abbildung 3.10). Außerdem kann auch hier festgestellt werden, dass die katalytische Aktivität sowie die korrekte Lokalisierung von XopJ von essentieller Bedeutung für die Minderung der Proteasomaktivität sind, da die beiden Komplementationsmutanten sich wie der ΔxopJ Stamm verhalten. Das bedeutet, dass nur ein funktionales XopJ die Proteasomaktivität beeinflussen kann. Die Rolle des Proteasoms während der basalen Abwehr wird weiterhin dadurch bestätigt, dass eine Infektion mit Xcv ΔhrpF, einem T3SS-defizienten Stamm, der keine Effektoren mehr in die Wirtszelle einschleusen kann (Büttner et al., 2002), zu einer verstärkten Proteasomaktivität führt, die vergleichbar zur Xcv ΔxopJ induzierten Aktivität ist (Abbildung 3.11). Xcv ΔhrpF ist überhaupt nicht mehr in der Lage die basale Abwehr zu unterdrücken und führt zu einer verstärkten Abwehrantwort. Deshalb kann angenommen werden, dass das Proteasom auch ein wichtiger Teil der basalen Abwehr darstellt. Bisherige Arbeiten deuteten eine Beteiligung einzelner Proteasom-Komponenten an der ETI, der zweiten Ebene des pflanzlichen Immunsystems, an (Hatsugai et al., 2009; Elmore et al., 2012; Chung & Tasaka, 2011). Weitere Hinweise auf eine Beteiligung des Proteasoms an der basalen Abwehr sollten 110

118 DISKUSSION: XopJ VIGS Experimente der Proteasomuntereinheit RPT6 und anschließende Analyse der PTI Antworten ergeben. Die Analyse von Arabidopsis Mutanten, denen bestimmte Untereinheiten fehlen, legen nahe, dass einige Untereinheiten auch an der basalen Abwehr beteiligt sind. Eine Arabidopsis rpn1a Mutante wies eine starke Suszeptibilität gegenüber virulente und avirulente Pseudomonas Stämme, aber auch gegen biotrophe Pilze auf (Yao et al., 2012). Andere getestete Proteasomuntereinheiten wie RPT2a und RPN8a supprimierten die edr2- vermittelte Resistenz gegenüber Mehltau, was darauf hindeutet, dass verschiedene Untereinheiten möglicherweise bestimmte Rollen in der basalen Abwehr einnehmen können (Yao et al., 2012). Eine RPT6 Verlustmutante in Arabidopsis wurde bis jetzt nicht charakterisiert, jedoch veranschaulicht die Virus-induzierte Genstilllegung von RPT6 in Paprika, dass eine Herunterregulierung der RPT6 Expression zu einer Wachstumsretardation und Letalität der Pflanze (Abbildung 3.18). Genetische Analysen sind deshalb schwierig, aber diese Tatsache untermauert die essentielle Rolle von RPT6 als Proteasomuntereinheit, weshalb diese Untereinheit auch ein interessantes Ziel für T3E darstellt, um die Proteasomaktivität und Funktion zu beeinflussen. In Bartetzko (2012) wurde die Expression von RPT6 nach Infektion mit Xcv, Xcv ΔxopJ und dem T3SS-defizientem Xcv ΔhrpB1 induziert. Irrtümlich wurde wird hier jedoch RPT6 als ein PAMP-induzierbares Gen beschrieben, obwohl der Xcv ΔhrpB1-Stamm, der die basale Abwehr nicht unterdrücken kann und damit PAMP-induzierbare Gene auch aktiviert, nahezu keine Induktion des Gens fördert (Bartetzko, 2012). Wäre die Aktivierung der Genexpression nach Infektion mit dem T3SS-defizientem Stammes deutlich höher gewesen als die nach Infektion mit dem Wildtyp- Stamm, wäre RPT6 durch PAMPs-induzierbar. Sowohl nach Infektion mit Xcv als auch mit Xcv ΔxopJ ist die basale Abwehr unterdrückt, womit keine Aussage über die PAMP- Induzierbarkeit von RPT6 getroffen werden kann. Eine direkte Rolle an der basalen Abwehr kann möglicherweise ausgeschlossen werden, da RPT6 nicht während der PTI hochreguliert wird (Abbildung 3.19). Eine Beteiligung an der pflanzlichen Abwehr wurde vermutet, da andere Zielproteine von T3E bedeutende Rollen in der PTI einnehmen und auch durch PAMPs induzierbar sind (Taylor et al., 2012). Jedoch stellte sich heraus, dass die RPT6 Genexpression durch die Xcv Infektion induziert war und die Hochregulierung in Xcv ΔxopJ infizierten Blätter noch stärker ausgeprägt war (Abbildung 3.26) Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen könnte mit der gesteigerten Proteasomaktivität in beiden Fällen zusammenhängen. Da frühere Studien bereits zeigen konnten, dass XopJ Zellwandassoziierte Abwehrprozesse wie die Callose-Einlagerung und Sekretion inhibiert (Bartetzko et al., 2009), wurden diese Prozesse nach Zugabe von dem Proteasom-Inhibitor MG132 untersucht. Der inhibitorische Effekt von XopJ auf den Vesikeltransport in der basalen Abwehr konnte durch MG132 imitiert werden (Abbildung 3.31). Eine mögliche direkte Rolle des Proteasoms in der Sekretion wurde bereits für das Pollenschlauchwachstum diskutiert 111

119 DISKUSSION: XopJ (Sheng et al., 2006). Außerdem ist in Säugetieren bereits bekannt, dass die Proteasomaktivität für die Vesikelfusion und die Wiederverwertung der Komponenten erforderlich ist (Willeumier et al., 2006). Weitere Studien in Säugern zeigen, dass das SNARE Protein SNAP-25 nach synaptischer Aktivität über das 26S Proteasom degradiert wird. Der Abbau von SNAP-25 wird durch einen Chaperon-Komplex an der synaptischen Membran verhindert und fördert damit die SNARE-Komplex Bildung (Sharma et al., 2011). Ein weiteres Indiz für eine Beteiligung des Proteasoms am Vesikeltransport in Pflanzen, stellt die Proteasom-abhängige Endozytose des aktivierten FLS2 Rezeptors dar (Robatzek et al., 2006). Eine verhinderte Endozytose von FLS2 würde zu einem Block in der Signalweiterleitung nach flg22 Behandlung führen und spätere Abwehrmechanismen wie die Sekretion oder auch die Callose-Ablagerung negativ beeinflussen. Das Proteasom scheint auch eine wichtige Rolle in der Exozytose einzunehmen, da die Vesikel-assoziierten Membranporteine VAMP721/722 durch einen konstitutiven Abbau über das 26S Proteasom in einem unifizierten Zustand reguliert werden, wohingegen die Behandlung mit flg22 die Proteinstabilität fördert und damit eine korrekte Exozytose fördert (Yun et al., 2013). Natürlich kann auch eine indirekte Wirkung der Proteasomaktivität auf die Sekretion nicht außer Acht gelassen werden, beispielsweise durch die Beeinträchtigung des SA Signalweges, welches die Expression von Genen des sekretorischen Weges, kontrolliert (Wang et al., 2005). Die Behandlung von Arabidopsis Blättern mit dem Proteasominhibitor MG132 führten zu einer Verminderung der Callose-Deposition, was darauf hindeutet, dass die Proteasom-Funktion für diese Art von Abwehrantworten gebraucht wird. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, dass die beobachteten Effekte auf die Sekretion und Callose-Einlagerung über die Inhibition der Proteasomaktivität durch XopJ vermittelt wurden. Xcv kann als ein hemibiotrophes Pathogen angesehen werden, das in seinem Infektionszyklus charakteristische Eigenschaften von biotrophen sowie nekrotrophen Mikroorganismen besitzt (Büttner & Bonas, 2010). In frühen Infektionsstadien braucht Xanthomonas das lebende Gewebe seines Wirtes, um sich eine Ernährungsgrundlage zu schaffen, die essentiell für die Multiplikation des Bakteriums ist. Zu späteren Zeitpunkten in der Infektion kommt es schlussendlich zum Absterben des Gewebes, was möglicherweise eine Folge der Ausbeutung der Nahrungs- und Energiequellen der Wirtspflanze oder auch als eine Form von später Abwehrantwort ist. Der programmierte Wirts-Zelltod stellt daher einen effektiven Weg dar, erfolgreiche Abwehrantworten gegen Pathogene in der biotrophen Phase zu initiieren, weshalb hemibiotrophe Bakterien diese Art von Abwehrreaktion reprimieren müssen. Ein Verlust von XopJ führte 3 Tage nach Infektion zu nekrotischen Läsionen in den Paprikapflanzen, die zu diesem Zeitpunkt nicht in Xcv-infizierten Blättern auftraten (Abbildung 3.12). Dies war der erste Hinweis, dass XopJ wahrscheinlich den Wirts- Zelltod während der biotrophen Phase der Infektion verhindert. Eine nähere 112

120 DISKUSSION: XopJ Charakterisierung der Suppression des Zelltodes durch XopJ zeigte, dass XopJ nicht eine Art vom programmierten Zelltod inhibiert, sondern die Ausbildung von Nekrosen während einer kompatiblen Interaktion verzögert. Grundsätzlich erfolgte die Ausbildung von Nekrosen 5 Tage nach Infektion mit dem Xanthomonas-Wildtyp Stamm und 3 Tage nach Infektion mit dem Xcv ΔxopJ, weshalb im Umkehrschluss von einer verlangsamten Symptomentwicklung oder Nekrose-Ausbildung gesprochen werden kann. Diese Tatsache galt sowohl für hohe bakterielle Titer als auch für niedrige Titer (Abbildung 3.16). Angesichts der Tatsache, dass eine Deletion von XopJ zu einem reduzierten Bakterienwachstum während der Infektion von suszeptiblen Paprikapflanzen führt scheint es das XopJ als eine Art Toleranzfaktor die Entwicklung der nekrotischen Läsionen verzögert und damit für die volle Pathogenität von Xanthomonas auf Paprika gebraucht wird. Eine ähnliche Rolle wurde für XopD in der kompatiblen Interaktion von Xcv mit Tomaten Pflanzen postuliert (Kim et al., 2008). XopD beeinträchtigt die Kinetik der Chlorosen und Nekrosen auf den infizierten Blättern und agiert ebenfalls als ein Toleranzfaktor. Dabei ist XopD in der Lage die Transkription der Wirtszelle zu beeinflussen, bakterielles Wachstum zu fördern und die Symptomentwicklung zu verzögern. Interessanterweise, scheint XopD die Virulenz von Xcv auf Paprika nicht vollständig zu fördern, weshalb angenommen wird, dass ein anderer T3E eine redundante Rolle einnehmen könnte und damit die XopD Funktion maskieren würde (Kim et al., 2008). Eine Xanthomonas ΔxopJ/xopD Doppelmutante wird weiteren Aufschluss über eine möglich redundante Funktion beider Effektoren in Paprika geben. Kann die verminderte Proteasomaktivität mit der Verzörgerung der Symptomentwicklung in Verbindung gebracht werden? Wie bereits erwähnt zeigen frühere Veröffentlichungen, dass die Inhibition des Proteasoms zu einer De-Regulation der Zelltodreaktion führt (Hatsugai et al., 2008). Eine ähnliche Rolle könnte auch XopJ besitzen, da es neben der Chymotrypsin- Aktivität auch die Caspase-ähnliche Aktivität des Proteasoms beeinflusst. Die Behandlung von Xcv ΔxopJ infizierten Paprika Blätter mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 führte zu einer Verminderung der nekrotischen Läsionen und demonstrierte, dass XopJ die Proteasomaktivität schwächt, um die Ausbildung von Nekrosen zu inhibieren (Abbildung 3.17). Damit ermöglicht XopJ eine Verlängerung der biotrophen Phase Beeinträchtigung der SA- und Seneszenz-abhängigen Antworten durch XopJ Tomatenpflanzen sind durch zwei Stadien der Symptom Entwicklung während der Infektion durch Xanthomonas campestris pv. vesicatoria charakterisiert (O'Donnell et al., 2001; O'Donnell et al., 2003). Die primäre Antwort zeichnet sich durch lokal begrenzte Läsionen aus, die von einer zweiten Phase gefolgt wird, in der Chlorosen und Nekrosen sich von der ursprünglichen Infektionsstelle ausbreiten. Es konnte bereits demonstriert werden, dass die 113

121 DISKUSSION: XopJ Infektion von Tomaten Pflanzen mit einem virulenten Xcv Stamm mit einem Anstieg in den SA-Gehalten korrelierte. In die Untersuchung wurden transgene NahG-Tomaten Pflanzen miteinbezogen. Diese Pflanzen sind SA-defizient und können keine Salizylsäure mehr akkumulieren, da NahG als eine Hydroxylase SA abbaut (Lund et al., 1998). Eine Infektion dieser Pflanzen mit Xcv verhinderte die Ausbildung der zweiten Phase und damit die Entwicklung von nekrotischen Läsionen (O Donnell et al., 2001). Die Infektionsexperimente mit einem XopJ-defizienten Xcv Stamm zeigten, dass XopJ die Akkumulation der SA- Gehalte während einer kompatiblen Interaktion signifikant vermindern kann und damit die Ausbildung von Nekrosen unterdrückt (Abbildung 3.20). Die Suppression oder Verzögerung der Nekrose-Bildung ist auch eine Konsequenz der reduzierten SA Signalweiterleitung, da XopJ die Transkriptmengen von SA Markergenen sowie von Seneszenz-assoziierten Genen beeinträchtigt (Abbildungen 3.22 und 3.24). Passend dazu war die Expression von JA- Markergenen reprimiert, was auch im Einklang mit der antagonistischen Funktion beider Phytohormone steht (Robert-Seilaniantz et al., 2011). Dies liefert einen weiteren Beweis für eine zentrale Rolle von XopJ an der Beteiligung der Unterdrückung SA-abhängiger Abwehrantworten. Aufgrund seiner Fähigkeit programmierte Zelltod-Reaktionen im Wirt auszulösen, wird SA als ein zentraler Regulator der Abwehr von biotrophen und hemibiotrophen Pathogenen betrachtet (Vlot et al., 2009). Jedoch sind auch basale Abwehrmechanismen wie die bakteriell-induzierte Schließung der Stomata und die Callose- Einlagerung an der Zellwand teilweise von SA abhängig (DebRoy et al., 2004; Melotto et al., 2006). Folglich sind einige T3E in der Lage den SA Signalweg zu manipulieren, indem sie damit direkt oder indirekt wechselwirken. Beispielsweise ist der P. syringae Effektor HopI1 in Chloroplasten lokalisiert, wo er die SA Akkumulation negativ beeinflusst (Jelenska et al., 2007). Dabei ist die Abwehr-supprimierende Aktivität dieses Effektors von der Interaktion mit dem pflanzlichen Chaperon HSP70 abhängig (Jelenska et al., 2010). Zusätzlich konnten HopPtoM und AvrE als Effektoren von Pseudomonas identifiziert werden, die mit SAabhängige basalen Abwehrantworten wie der Callose-Deposition interferieren (DebRoy et al., 2004). Kim et al. (2008) charakterisierten Xanthomonas Effektor XopD als einen transkriptionellen Repressor, der SA- und Seneszenz-induzierte Abwehrgene reprimiert und damit das bakterielle Wachstum fördert. Jedoch konnte eine neuere Studie nachweisen, dass XopD eigentlich die Ethylen-Signalweiterleitung stört und damit nur einen indirekten Effekt auf den SA-abhängigen Signalweg besitzt (Kim et al., 2013). Im Falle von XopJ kann eine Beeinträchtigung anderer Hormonwege aber ausgeschlossen werden, da die Analyse von ET-responsiven Genen keine Veränderung aufzeigte (Abbildung 3.23B). Wären die Ethylen-Mengen in Xcv ΔxopJ infizierten Geweben erhöht gewesen, hätte man eine verstärkte Expression dieser Markergene, analog zu den SA-Markergenen, erwarten können. Um diese Schlussfolgerung zu untermauern muss die Ethylen Akkumulation nach Xcv ΔxopJ 114

122 DISKUSSION: XopJ Infektion analysiert werden. Nichtsdestotrotz, konnte keiner der T3E, die den SA-Signalweg unterdrücken, mit dem Proteasom assoziiert werden und birgt die Möglichkeit, dass die Inhibition der SA-Antworten durch XopJ lediglich ein indirekter Effekt durch die Beeinträchtigung von anderen Prozessen ist. Erstaunlicherweise, kann das durch P. syringae pv. syringae sekretierte Peptid SylA der Stomata-vermittelten basalen Abwehr entgegenwirken, indem es das Proteasom inhibiert, und das in Abhängigkeit eines intakten SA Signalweges (Schellenberg et al., 2010). Dabei ist zu beachten, dass SylA kein Typ-III Effektorprotein ist, sondern ein kleines nicht-ribosomales Peptid, das möglicherweise durch einen Exporter sekretiert wird (Amrein et al., 2004). Eine kürzlich erschienene Studie demonstriert, dass SylA die SAR supprimiert, indem es die SA-Signalweiterleitung blockiert und lokale Immunantworten hemmt. Daher kann SylA eine SA-insensitive Zone schaffen um eine anschließende Ausbreitung der Kolonisierung von Pseudomonas zu ermöglichen (Misas-Villamil et al., 2013). Deshalb erscheint es wahrscheinlich, dass auch XopJ den SA- Signalweg und die Entwicklung von Nekrosen inhibiert, in dem es mit RPT6 interagiert und damit die Proteasomaktivität supprimiert. Zusätzliche Hinweise für eine wichtige Rolle des Proteasoms in SA-vermittelten Abwehrantworten lieferte eine Studie, in der die Arabidopsis Proteasomuntereinheiten-Mutanten rpn1a, rpt2a und rpn8a wesentlich geringere SA-Mengen nach Infektion mit einem virulenten Pst DC3000 Stamm akkumulierten (Yao et al., 2012). Eine Deletion in RPT5a hingegen führte zu einer Erhöhung der Proteinmenge des JA- Rezeptors COI, was die Spekulation zulässt, dass eine gesteigerte JA-Antwort in dieser Pflanze womöglich die SA Akkumulation negativ beeinflussen kann (Yan et al., 2013). Momentan ist es jedoch nicht ganz offensichtlich wie die Inhibition des Proteasoms durch XopJ die SA-Mengen in infizierten Pflanzen beeinträchtigen kann. Eine mögliche Erklärung liefert die Analyse der NPR1 Proteinlevels (nonexpresser of pathogenesis-related (PR) genes) nach transienter Expression von XopJ. NPR1 agiert hierbei als ein transkriptioneller Ko-Aktivator, und muss in seiner phosphorylierten Form ständig durch das Proteasom abgebaut werden um SA-responsive Gene zu aktivieren (Spoel et al., 2009). Wahrscheinlich kann nur neu-synthetisiertes NPR1 eine Re-Initiation des Transkriptionszyklus erlauben und ist deshalb auch für die Etablierung der SAR von wichtiger Bedeutung. Die transiente Ko- Expression von NPR1 und XopJ führt zu einer starken Akkumulierung von NPR1 und deutet darauf hin, dass die Reduzierung der Aktivität des Proteasoms, womöglich den Auf- und Abbau von NPR1 stört (Abbildung 3.28). Da NPR1 auch als negativer Regulator der SA Biosynthese und des SA-Biosynthese-Gens ICS1 in Arabidopsis thaliana agiert (Zhang et al., 2010), kann angenommen werden, dass die Akkumulation von NPR1 im Zellkern zu einer Repression der ICS1 Expression führen kann. Die Analyse der Genexpression des ICS Orthologs in Paprika nach Infektion mit Xcv ΔxopJ wird nähere Erkenntnisse über diesen Mechanismus ergeben. Interessanterweise, führt die Expression von YopJ aus Yersinia 115

123 DISKUSSION: XopJ pestis, zu einer Akkumulation des Ko-Faktors IκB, das strukturelle Eigenschaften mit NPR1 teilt (Cao et al., 1997; Ryals et al., 1997). Dieser Ko-Faktor wird nach Pathogenbefall phosphoryliert, über das 26S Proteasom der Säugertierzellen abgebaut und führt zu einer Freisetzung des Transkriptionsfaktors NF-κB, der im Zellkern die Transkription von Abwehrgenen aktiviert (Hayden & Ghosh, 2008). Die YopJ-vermittelte Deubiquitinierung und Akkumulierung von IκB resultiert in einem inaktivierten NF-κB-Signalweg (Zhou et al., 2005). Für XopJ konnte bisher zwar keine Deubiquitinase-Aktivität gezeigt werden, jedoch ist XopJ über die Inhibition des Proteasoms in der Lage die Akkumulation von NPR1 zu fördern, um SA-abhängige Abwehrantworten in Pflanzen auszuschalten. Dieser Fall zeigt, dass Effektoren einer Familie anscheinend konservierte Funktionen aufweisen können, wenn gleich durch unterschiedliche Mechanismen (illustriert in einem Modell in Abbildung 4.2). In weiterführenden Studien kann z.b. analysiert werden ob vor allem ubiquitiniertes NPR1 in Gegenwart von XopJ akkumuliert und ob dieser Effekt abhängig von der katalytischen Funktion von XopJ ist. Abbildung 4.2: Einfluss von XopJ und YopJ auf die NPR1 Signalweiterleitung bzw. auf den NF-κB- Signalweg. Die XopJ-abhängige Inhibition des Proteasoms in Pflanzen beeinflusst den NPR1-Signalweg während der SA-vermittelten Abwehr, indem es zu einer Akkumulation von NPR1 in Gegenwart von XopJ kommt. In Säugetieren verhindert XopJ-Homolog YopJ den Abbau des zu NPR1 strukturell ähnlichen IκB und schaltet damit den NF- κb-weg aus. Beide Effektoren scheinen damit wichtige Signalwege der Immunantwort in verschiedenen Systemen auf ähnlichen Wegen zu beeinflussen. Abbildung wurde modifiziert nach Hayden und Ghosh (2008). Doch wie kann XopJ den proteasomalen Abbau von NPR1 im Zellkern beeinflussen (Spoel et al., 2009), wenn die Interaktion mit RPT6 an der Plasmamembran stattfindet? Zurzeit ist 116

124 DISKUSSION: XopJ noch nicht bekannt ob XopJ nur eine Subpopulation des Proteasoms an der Plasmamembran inhibiert oder Proteasom-Komplexe in anderen zellulären Kompartimenten beeinträchtigen kann. Eine mögliche Theorie ist, dass XopJ RPT6 an die Plasmamembran rekrutiert und damit den Aufbau des Proteasoms stören kann. In Säugetieren konnte bereits gezeigt werden, dass RPT6 für die Assemblierung des Proteasoms essentiell ist (Satoh et al., 2001). Neuere Arbeiten verdeutlichen, dass RPT6 Konformationsänderungen eingeht um die Assemblierung des Proteasoms zu ermöglichen und dass der C-terminale Bereich von RPT6 essentiell für die Bindung an die α-untereinheiten des 20S Proteasoms ist (Ehlinger et al., 2013; Park et al., 2013). Vielleicht ist XopJ in der Lage diese Konformationsveränderung von RPT6 durch einen bisher unbekannten Mechanismus zu unterbinden. Die gestörte Komplexbildung könnte dann auch Einfluss auf die Proteasomaktivität im Zellkern haben. Wie und vor allem wo das Proteasom schlussendlich assembliert wird ist unklar, jedoch kann stark davon ausgegangen werden, dass die Assemblierung direkt am Ort des Proteinabbaus stattfinden muss. In einer alternativen Theorie, könnten auch andere Komponenten des SA- Signalweges abhängig von einem proteasomalen Auf-und Abbau an der Plasmamembran sein. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Plasmamembran-lokalisierte RING E3 Ubiquitin Ligase CaRING1 für die SA Akkumulation und Aktivierung von SA-responsiven Genen in Paprika nötig ist (Lee et al., 2011). Die Beobachtung, dass der Verlust von XopJ durch exogene Applikation von SA auf Xcv Wildtyp-infizierten Pflanzen imitiert werden kann, spricht jedoch für ein intaktes SA- Signalweg (Abbildung 3.21.). Damit würde XopJ nicht mit dem SA-Signalweg per se interferieren, sondern die Biosynthese von SA negativ beeinflussen. Die Herunterregulierung der Genexpression des SA-Synthese Gens ICS durch VIGS in Paprika führte zu einem Verlust des XopJ-abhängigen Phänotyps, was demnach verdeutlicht, dass eine intakte SA Synthese für die Ausbildung der Nekrosen verantwortlich war (Abbildung 3.29). Allerdings, resultierte auch die Genstilllegung von NPR1 zu einem Verlust der Wirts-Zelltod-Reaktion nach Infektion mit Xcv ΔxopJ (Abbildung 3.29). Dies verdeutlicht die Relevanz eines funktionalen SA Signalweges für diese Art der Zelltod-Antwort. In weiteren Ansätzen einen Zusammenhang zwischen der SA-Signaltransduktion und der Proteasomaktivität zu erstellen, führten SA Behandlungen zu einer induzierten RPT6 Transkription als auch zu einer Induktion der Proteasomaktivität (Abbildung 3.27). Auch die Genexpression von RPT6 nach Infektion mit Xcv oder Xcv ΔxopJ korrelierte mit den SA- Gehalten in den jeweiligen infizierten Pflanzen (Abbildung 3.25). Das bedeutet, dass eine Art positive Rückkopplung existiert, um die Proteasom-abhängige SA-Biosynthese oder Signalweiterleitung zu amplifizieren. In Arabidopsis, resultierte die SA Behandlung zur Aktivierung der Genexpression von RPN1a, einer weiteren Proteasomuntereinheit des 19S Partikels (Yao et al., 2012). Weiterhin induzierte die Besprühung mit dem nicht- 117

125 DISKUSSION: XopJ metabolisierbaren SA-Analogon Benzothidiazol (BTH) die Proteasomaktivität in Arabidopsis Pflanzen (Gu et al., 2010), und verhielt sich damit ähnlich zur Aktivierung des Proteasoms durch die Besprühung mit SA von Paprika und N. benthamiana Pflanzen (Abbildung 3.27). Paprika Pflanzen die eine drastisch reduzierte NPR1 Expression aufzeigten, waren nicht mehr in der Lage die Proteasomaktivität nach Infektion mit Xcv oder Xcv ΔxopJ zu fördern (Abbildung 3.30). Diese Beobachtung enthüllt, dass die Regulation der Proteasomaktivität während der basalen Abwehr teilweise durch NPR1 vermittelt sein muss. Vorherige Studien hatten bereits schon angedeutet, dass ein Verlust von NPR1 in Arabidopsis zu einem Verlust der Proteasomaktivierung nach BTH Behandlung führt (Gu et al., 2010). Momentan ist es nicht klar ob die SA-induzierte Aktivierung des Proteasoms durch eine Steigerung der Genexpression oder posttranslationalen Mechanismen vermittelt wird. Was jedoch bedacht werden muss ist, dass NPR1 als ein transkriptioneller Ko-Aktivator, auch die Fähigkeit besitzt Gene der Sekretion zu aktivieren, weshalb eine Aktivierung von Genen welche die Proteasom-Funktion positiv beeinflussen können, nicht ausgeschlossen werden kann (Wang et al., 2005). Für diese Hypothese spricht die Tatsache, dass die Verminderung der ICS Genexpression zu keiner veränderten Proteasomaktivierung während der Infektion von Paprika mit Xanthomonas führt (Abbildung 3.30). Hiermit kann festgestellt werden, dass nicht eine gesteigerte SA-Biosynthese für die Proteasomaktivität verantwortlich ist, sondern die SA-Signalweiterleitung ein essentieller Prozess in der Induktion der Proteasom-Funktion ist. XopJ scheint durch die Inhibition des Proteasoms die SA-Signalweiterleitung zu stören und könnte dadurch eine essentielle Rolle in der Unterdrückung der SAR einnehmen. Wie SylA könnte XopJ für die Ausbreitung von Xanthomonas von der Infektionstelle weg, verantwortlich sein, indem es an der Infektionsstelle die SA-vermittelte Abwehrantwort lokal unterdrückt (Misas-Villamil et al., 2013) Destabilisierung von RPT6 durch XopJ Die zentrale Frage die sich nach allen Beobachtungen stellt ist, wie XopJ mechanistisch agiert um die Proteasomaktivität zu inhibieren. Zahlreiche Mitglieder der YopJ-Familie besitzen Acetyltransferase Akitivät (Mukherjee et al., 2006; Lee et al., 2012; Tasset et al., 2010). Obwohl das Substrat und damit das Zielprotein, nicht für alle Effektoren identifiziert wurde, konnte in vielen Fällen eine Auto-Acetylierung an einem konservierten Lysin-Rest gezeigt werden (Lee et al., 2012; Tasset et al., 2010). Dieser essentielle Lysin-Rest ist auch in XopJ konserviert, jedoch konnte in bisherigen Analysen keine Auto- oder Trans- Acetylierung von XopJ bzw. RPT6 beobachtet werden (Bartetzko, 2012; Üstün & Börnke unveröffentlicht). Da einige Effektoren der YopJ-Familie (HopZ1a, AvrBsT) auch Cystein- Protease-Funktionen besitzen, wurde untersucht ob XopJ zu einer Destabilisierung von RPT6 in planta führt. GFP-Aufnahmen von RPT6 nach transienter Ko-Expression mit XopJ 118

126 DISKUSSION: XopJ verdeutlichen, dass XopJ, abhängig von der katalytischen Aktivität sowie Myristoylierung, zu einer schwächeren Fluoreszenz von RPT6-GFP führt (Abbildung 3.32). Die Proteinlevels von RPT6 waren stark vermindert und gaben Grund zur Annahme, dass XopJ über einen unbekannten Mechanismus zur Instabilität von RPT6 führt. Ähnliche Phänomene konnten auch bei der Interaktion von HopZ1a mit der 2-Hydroxyisoflavon Dehydratase (HID1) oder bei der Wechselwirkung der Sumo-Protease XopD mit SlERF4 festgestellt werden (Zhou et al., 2011; Kim et al., 2013). Die mögliche Destabilisierung von RPT6 war nicht Proteasomabhängig, und dies ist essentiell, da XopJ selber auch als ein Proteasom-Inhibitor wirkt und eigentlich zu einer Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen führt. Deshalb wird angenommen, dass die Interaktion von XopJ mit RPT6 zu einer Instabilität von RPT6 führt und dieses durch andere Mechanismen abgebaut wird. Die anschließende Behandlung mit einem Protease-Inhibitormix resultierte in einer Re-Stabilisierung der RPT6 Proteinlevel, was darauf hindeutet, dass XopJ vielleicht als eine Cystein-Protease an der Destabilisierung von RPT6 mitwirken könnte (Abbildung 3.34). Jedoch konnte ein in vivo Cystein-Protease Aktivitätstest diese Vermutung nicht bestätigen (Abbildung 3.36). Über den Mechanismus der Destabilisierung von RPT6 kann nur spekuliert werden. Eine kürzlich erschienene Proteomanalyse brachte ein Ubiquitinierungs-Netzwerk zu Tage, in der RPT6 nach Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 als ein ubiquitiniertes Protein vorliegt (Kim et al., 2013). Viele Ubiquitin-konjugierte Proteine werden gezielt über das 26S Proteasom abgebaut, wohingegen einige andere Poly-ubiquitinierte Proteine, v.a. große Aggregate oder ungebrauchte Multiprotein-Komplexe in einer Art Qualitätskontrolle durch Autophagieabhängige Prozesse abgebaut werden (Johansen & Lamark, 2011; Li & Vierstra, 2012). Ob ubiquitiniertes RPT6 durch Autophagie-Mechanismen schlussendlich beseitigt wird, müssen weitere Analysen klären. Eine Ubiquitinierung kann jedoch auch ein Signal für die Stabilisierung eines Proteins sein, weshalb XopJ, ähnlich wie YopJ oder SseL aus Salmonella, als eine Deubiquitinase wirken könnte, um RPT6 wiederum zu destabilisieren (Zhou et al., 2005; Mesquita et al., 2012). Eine partielle Destabilisierung von RPT6 kann auch zu einer reduzierten Aktivität des Proteasoms führen, da die Herunterregulierung von RPT6 in N. benthamiana zu einer stark verminderten Proteasomaktivität führt (Abbildung 3.35). Auch für den Verlust von RPT2, einer anderen Proteasomuntereinheit des 19S Partikels, konnte ein ähnlicher Effekt beobachtet werden, da rpt2a Arabidopsis Mutanten das 26S Proteasom destabilisierten. In diesen Mutanten zeigte sich eine signifikante Reduktion der Peptidase-Aktivität des Proteasoms (Lee et al., 2011). Zusammenfassend kann spekuliert werden, dass XopJ sowie XopJ C235A in der Lage sind RPT6 an die Plasmamembran zu rekrutieren, wobei nur das katalytisch aktive XopJ zu einer Destabilisierung von RPT6 führt. Die Instabilität von RPT6 stört möglicherweise den Aufbau des 26S Proteasoms und führt damit zu einer reduzierten 119

127 DISKUSSION: XopJ Aktivität (Abbildung 4.3). Die gestörte Assemblierung des Proteasoms kann auch einen negativen Einfluss auf die Proteasomaktivität im Zellkern haben und damit den Abbau von NPR1 verhindern. Abbildung 4.3: Modell der möglichen Funktion von XopJ in planta. XopJ interagiert mit RPT6 an der Plasmamembran und fördert durch einen bisher unbekannten Mechanismus dessen Instabilität. Die Interaktion von XopJ und RPT6 führt zu einer verminderten Proteasomaktivität, die aus einer gestörten Assemblierung des Proteasoms resultieren kann. Die Beeinträchtigung der Assemblierung des Proteasoms könnte auch die Aktivität des Proteasoms im Zellkern vermindern, weshalb es möglicherweise zu einer Akkumulation von NPR1 kommt. 120