Aus der Abteilung Rheumatologie und Klinische Immunologie der Medizinischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

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1 Aus der Abteilung Rheumatologie und Klinische Immunologie der Medizinischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Untersuchung der Wertigkeit neuer ELISA-basierter Komplementtests bei der Beurteilung der Krankheitsaktivität des Systemischen Lupus Erythematodes INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. vorgelegt 2013 von Lena Oelmann geboren in Siegburg

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3 Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. med. Peter Vaith 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Wolfgang Bessler Jahr der Promotion: 2013

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5 Inhaltsverzeichnis... Seite 1. Einleitung Das Komplementsystem Wege der Komplementaktivierung Komplementrezeptoren Regulation des Komplementsystems Dysregulation und Defekte des Komplementsystems und seine Folgen Das Komplementsystem und Infektionen Das Komplementsystem und die Beseitigung von entarteten und apoptotischen Zellen 1.2 Der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) Epidemiologie Ätiologie und Pathogenese Klinische Symptomatik Diagnostik 1.3 SLE und Komplementsystem Die Rolle des Komplementsystems bei der Pathogenese des SLE Die Bedeutung der Komplementdiagnostik bei SLE Die Problematik der klassischen Komplementtests bei SLE 2. Material und Methoden Material Patienten- und Kontrollseren Geräte Substanzen Statistik 2.2 Methoden Probengewinnung und -lagerung ELISA ic3b, Bb Plus und SC5b ELISA CH50 EQ Statistische Auswertung Aktivitätsscores ECLAM und SLICC 2.3 Bestimmung weiterer Laborparameter C3 und C CH C3d

6 3. Ergebnisse Übersicht der Ergebnisse Vergleich von Patienten und Normalpersonen (Wilcoxon-Mann-Whitney-Test) Vergleich der Ergebnisse der klassischen Komplementtests C3, C4, CH50 und C3d Vergleich der Ergebnisse der Komplement-ELISAs 3.3 Korrelationstest nach Spearman Korrelation der Komplement-ELISAs mit SLICC und ECLAM Korrelation der Komplement-ELISAs mit C3d bzw. C3d/C Korrelation der Komplement-ELISAs mit C3, C4 und CH Korrelation der Komplement-ELISAs untereinander 4. Diskussion Eignung von Komplementdiagnostik zum Monitoring der Krankheitsaktivität von SLE-Patienten Möglichkeiten zur Bestimmung der Krankheitsaktivität bei SLE Eignung von der Testform ELISA 4.2 Interpretation der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Ergebnisse Traditionelle Komplementtests Neue Komplement-ELISA 4.3 Interpretation der Spearman-Ergebnisse Zur Wahl der Referenzmethode im Allgemeinen, zu SLICC und ECLAM im Speziellen Korrelation der neuen Komplement-ELISA zu C3d bzw. C3d/C3 Zur Wertigkeit von C3d bzw. C3d/C3 als Aktivitätsparameter bei SLE Zur Wertigkeit von ic3b als Aktivitätsparameter bei SLE Zur Wertigkeit von SC5b-9 als Aktivitätsparameter bei SLE Zur Wertigkeit von CH50 EQ als Aktivitätsparameter bei SLE Zur Wertigkeit von Bb als Aktivitätsparameter bei SLE 4.4 Ausblick Zusammenfassung Verzeichnisse Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis... 97

7 6.3 Verzeichnis der Tabellen Literaturverzeichnis Lebenslauf Danksagung Anhang

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9 1. Einleitung Das Immunsystem des Menschen erfüllt die komplexe Aufgabe uns zum Einen mittels potenter Abwehmechanismen vor pathogenen Erregern zu schützen und zum Anderen Strukturen unseres Körpers als selbst zu erkennen. Auch müssen gewisse Fremdstoffe (z.b. Nahrungsmittel) als harmlos erkannt und toleriert werden. Beim Systemische Lupus Erythematodes (SLE) können diese Funktionen des Immunsystems eingeschränkt sein, so dass körpereigene Strukturen angegriffen werden. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Komplementsystem als Teil des angeborenen, azellulären Immunsystems und dem Wert der Komplementdiagnostik bei SLE. Die Bestimmung von verschiedenen Komplementfaktoren und spaltprodukten gehört seit Jahrzehnten in vielen Kliniken zur Routineuntersuchung (Mollnes et al., 2007). Bei der Überwachung von Patienten mit SLE gehört die Komplementdiagnostik für Mediziner mit zu den Parametern, die bestimmt werden um die derzeitige Krankheitsaktivität abschätzen zu können. In den im November 2009 herausgegebenen Empfehlungen der europäischen Liga gegen Rheumatismus (EULAR) zum Monitoring von SLE-Patienten im klinischen Alltag oder im Rahmen von Studien wird die Bestimmung der Komplementfaktoren C3 und C4 vorgeschlagen und ein möglicher Zusammenhang zwischen Komplement- Plasmaspiegeln und Krankheitsaktivität beschrieben (Mosca et al., 2009). Aufgrund von Problemen der gängigen Komplementtests bezüglich ihrer Durchführbarkeit, Handhabung und Interpretation sowie Zweifel an der Aussagekraft wurde in den letzten Jahren an der Entwicklung neuer Komplementtests gearbeitet, die einigen der bisher durchgeführten Tests bezüglich oben genannter Qualitäten voraus sein sollen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier der neuen Methoden zur Bestimmung von Komplementfaktoren mit Blutproben von SLE-Patienten und gesunden Probanden durchgeführt und mit vier an der Uniklinik Freiburg gängigen Komplementtests sowie verschiedenen Krankheitsaktivitätsparametern verglichen. Im Folgenden soll ein Überblick über die Funktionsweise des intakten Komplementssystems und die aus Komplementdefekten resultierenden Krankheitsbildern - im speziellen SLE - gegeben werden. Daraufhin folgt eine kurze 9

10 Beschreibung der Bedeutung der Komplementdiagnostik für dieses Krankheitsbild und der Problematik der zur Zeit gängigen Tests. Anschließend wird auf neuere bzw. alternative Methoden der Komplementbestimmung und die Fragestellung dieser Arbeit eingegangen. 1.1 Das Komplementsystem Das Komplementsystem verdankt seinen Namen Paul Ehrlich. Vor über 100 Jahren beschrieb er es erstmalig als Bestandteil des normalen Plasmas, das durch Opsonierung von Bakterienbestandteilen die Aktivität von Antikörpern komplementiert (Zipfel & Skerka, 2009; Ehrlich, 1899; Metschnikow, 1902). Komplementfaktoren werden größtenteils in der Leber, in geringen Anteilen auch in der Lunge gebildet. Es sind bisher über 60 Proteine bekannt, u.a. die zentralen Komplementkomponenten C1 bis C9 ( C von engl. complement ), zahlreiche während der Aktivierung entstehende Spaltprodukte wie z.b. C3a, C3b, ic3b, C3d und C3dg, mehrere Regulatoren, Komplementrezeptoren CR1-CR4 und verschiedenen Proteasen; die Anzahl der entdeckten Bestandteile steigt weiterhin stetig (Zipfel & Skerka, 2009; Köhl, 2006; Lambris, 1988). An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Nomenklatur der klassischen Komplementfaktoren einer historischen Ordnung folgt (Walport, 2001). Die Proteine sind in der Reihenfolge ihrer Entdeckung nicht jedoch der Reihenfolge der Reaktion - durchnummeriert. Weiterhin ist es hilfreich zu wissen, dass das größere der meist 2 Spaltprodukte ein b als Anhängsel, das Kleinere ein a erhält. Weitere Spaltprodukte sind ebenfalls durch kleine Buchstaben gekennzeichnet. Komplementfaktoren befinden sich in nahezu allen Körperflüssigkeiten und Geweben in Form von Vorstufenenzymen, den sog. Zymogenen (Walport, 2001a). Zum heutigen Zeitpunkt ist die Funktion des Komplementsystems sowie dessen Rolle bei der Pathogenese verschiedener Erkrankung schon recht detailliert erforscht. Durch verschiedene Auslöser kann eines der Zymogene aktiviert werden, wodurch es das nächste Substrat ebenfalls ein Vorstufenenzym proteolytisch spalten und damit aktivieren kann. So wird eine ganze Enzymkaskade in Gang gesetzt, durch die u.a. proinflammatorische Mediatoren, anaphylaktische Peptide, zytolytische und antimikrobielle Komponenten entstehen und außerdem verschiedene Effektorzellen rekrutiert werden, durch deren Zusammenspiel mit den andern Komponenten die Erkennung und Eliminierung von Pathogenen und 10

11 Zellschrott erfolgen kann (Köhl, 2006; Carroll, 2004; Zipfel, 2009). Das Komplementsystem ist somit ein zentraler Bestandteil des angeborenen Immunsystems, greift in den Ablauf der adaptierten Immunantwort ein und ist außerdem an der Gewebehomöostase beteiligt (Zipfel, 2009). Doch wie wird dieses schon in jedem Neugeborenen schlummernde Überwachungs-Programm aktiviert, wodurch erwacht die Komplementkaskade zum Leben? Wege der Komplementaktivierung Bis zum heutigen Tage sind drei verschiedene Mechanismen bekannt, durch die die Komplementkaskade ausgelöst werden kann (Walport, 2001). Nach der Entstehung verschiedener Effektormoleküle gehen die drei Wege schließlich alle in eine gemeinsame Endstrecke, den sog. terminalen Komplementweg über (siehe Abb. 1). Als erstes wurde der sog. Klassische Komplementweg entdeckt. Er wird entweder durch den an das Zielantigen gekoppelten Antikörper (AK), durch AK-unabhängig gebundenes C-reaktives Protein (CRP) oder durch Viren oder Gram-negative Bakterien direkt ausgelöst (Zipfel, 2009). Das Schlüsselprotein ist hierbei C1q, das sowohl direkt an die Oberfläche von Krankheitserregern als auch an gebundenes CRP oder Antigen-AK-Komplexe binden kann. Zusammen mit den Zymogenen C1r und C1s bildet C1q den C1-Komplex. Binden zwei der sechs globulären Köpfe an die Oberfläche eines Pathogens kommt es zu einer Konformationsänderung im (C1r:C1s) 2 -Komplex, die ihrerseits die autokatalytische Enzymaktivität von C1r stimuliert. Die aktive C1r-Form spaltet dann das assoziierte C1s-Protein und erzeugt so eine aktive Serinprotease, die die nächsten beiden Komponenten des klassischen Weges, C2 und C4, spaltet. Das bei der Spaltung von C4 entstandene C4b heftet sich an die Oberfläche von Krankheitserregern und kann daraufhin C2 spalten, welches dadurch C1s zugänglich wird. Das nun entstandene große C2b-Fragment verbleibt als aktive Serinprotease mit C4b an der Pathogenoberfläche und bildet die C3-Konvertase, ein zentrales Enzym der Komplementkaskade. Sie ist in der Lage, aus C3 große Mengen C3b zu bilden und auf der Pathogenoberfläche oder der Oberfläche apoptotischer Zellen abzuladen; diese wirken dort opsonierend und initiieren den alternativen Komplementweg (Zipfel, 2009). 11

12 Abbildung 1 (aus Walport, 2001): Die drei Wege der Komplementaktivierung Der klassische Komplementweg wird von der Bindung des C1q-Komplexes an die Bakterienwandantigen-gebundenen AK initiiert; die kaskadenartige Spaltung von C4 und C2 führt zur Bildung der C3-Konvertase. Lagert sich der MBL-Komplex mit den MBL- assoziierten Serin Proteasen (MASP) 1 und 2 an eine Mannose-Gruppe der Bakterienzellwand an, setzt dies den MB-Lektin-Weg in Gang, dessen nächster Schritt ebenfalls der Aufbau der C3-Konvertase ist. Beim alternativen Komplementweg führt die in geringem Umfang stetig vorhandene spontane Hydrolyse von C3 zur kovalenten Bindung von C3b an die Hydroxylgruppen von Kohlenhydraten und Proteinen auf der Zelloberfläche; daran lagert sich Faktor B, ein homologes Protein zu C2 an und wird durch Faktor D gespalten. Der Komplex aus C3b und Bb bildet ebenfalls eine C3-Konvertase, die von Properdin 12

13 stabilisiert wird. Ausgehend von der bei allen drei Aktiverungswegen entstehenden C3-Konvertase bildet sich durch Anlagerung eines C3b-Moleküls eine C5-Konvertase. Das durch Spaltung entstandene C5b bildet zusammen mit C6, C7 und C8 (sowie vielen porenbildenden, hier nicht benannten C9-Molekülen) in den terminalen Schritten der Komplementkaskade den membranangreifenden Komplex (MAC, membrane attack complex ), der zur Zerstörung der Zelle führt. Gleichzeitig löst das andere Spaltprodukt C3a, ein Peptid-Entzündungsmediator mittlerer Aktivität, eine Reihe von proinflammatorischen Effekten aus: Chemotaxis von Leukozyten, Degranulation von phagozytierenden Zellen, Mastzellen und basophilen Zellen, Kontraktion der glatten Muskulatur und Erhöhung der Gefäßpermeabilität (Kirschfink & Mollnes, 2003; Köhl, 2001; Nielsen & Graham, 2002; Walport, 2001). Damit hilft es bei der Rekrutierung und Aktivierung von Effektorzellen des angeborenen Immunsystems und hat außer der antimikrobiellen auch eine antimykotische Wirkung (Zipfel, 2009). C4a besitzt eine ähnliche Funktion, ist aber viel schwächer wirksam. Das später in der Komplementkaskade entstehende stark anaphylaktisch wirksame C5a (Zipfel, 2009) gehört ebenfalls zu dieser Gruppe von proinflammatorischen Enzymen und besitzt die höchste Aktivität. Es stimuliert u.a. Makrophagen über den C1-Rezeptor (CR1) (siehe Kapitel 1.1.2) gebundenen Bakterien zu phagozytieren. Der zweite, dem klassischen sehr ähnliche Komplementweg ist der sog. MB-Lektin- Weg. Hier aktiviert ein Protein, das C1q sehr ähnlich ist und als Mannan-bindendes Lektin (MBL) bezeichnet wird, die Komplementkaskade. Während der akuten Phase der angeborenen Immunantwort wird es in der Leber vermehrt gebildet und bindet dann spezifisch an Mannosereste und andere zugängliche Zuckermoleküle, die in einem bestimmten Muster angeordnet sind. Diese kommen vor allem an Oberflächen von Pathogenen vor (Fujita, 2002; Degn, Thiel & Jensenius, 2007). Diese Eigenschaft erlaubt dem MBL an die Oberfläche verschiedener Pathogene zu binden, nicht aber an die körpereigenen Zellen, da bei allen Vertebraten die Zielmoleküle durch andere Zuckergruppen, insbesondere durch Sialsäure bedeckt sind. Wie das C1q gehört das MBL zur Familie der Kollektine. Es besteht aus den zwei Zymogenen MASP-1 und MASP-2 (MBL-assoziierte Serinproteasen 1/2), die eine starke Homologie zu C1r und C1s aufweisen. Man nimmt an, dass alle vier Enzyme in der Evolution aus der Verdopplung eines gemeinsamen Vorfahrengens hervorgingen. Bindet MLP an ein Pathogen, spalten MASP-1 und MASP-2 C4 und C2, wodurch genau wie beim klassischen Weg nach der Bindung von C2b an C4b die C3-Konvertase entsteht. 13

14 Auch beim alternativen Komplementweg wird die zentrale C3-Konvertase gebildet, allerdings aus anderen Spaltprodukten: C3b und Bb. Der alternative Weg kann ablaufen, ohne dass ein spezifischer AK vorhanden sein muss. Die Aktivierung dieses dritten Weges unterscheidet sich maßgeblich von den anderen beiden: Sie erfolgt durch spontane Hydrolyse der Thioesterbindung des im Plasma und in den meisten anderen Körperflüssigkeiten in großen Mengen vorkommenden C3 (Lambris, 1988). Dieser Vorgang wird im englischen auch als tickover bezeichnet. Er ermöglicht dem Plasmaprotein Faktor B an C3 zu binden, wodurch Faktor D, eine Plasmaprotease, dieses in Ba und Bb spalten kann. Der in geringen Mengen entstandene C3(H 2 O)Bb-Komplex vermag dennoch viele C3 Moleküle zu spalten; das entstandene C3b wird zwar größtenteils durch Hydrolyse wieder inaktiviert, teilweise bindet es jedoch kovalent über die reaktive Thioestergruppe an die Oberfläche von Körperzellen oder Pathogenen. Auf diese Weise gebundenes C3b kann sich nun an Faktor B heften, sodass dieser durch Faktor D zu dem kleineren Fragment Ba und der aktiven Protease Bb gespalten werden kann. Dies führt dann zur Bildung der C3-Konvertase des alternativen Komplementweges: C3b,Bb. Verschiedene Mechanismen bewirken ein Fortschreiten des Aktivierungsweges auf der Oberfläche eines Krankheitserregers, andere verhindern das Voranschreiten im Falle der Bindung an eine Körperzelle (z.b. Faktor H, siehe Abb. 4). So gibt es eine Reihe von Proteinen im Plasma und auf den Membranen der Körperzellen, die mit C3b in Wechselwirkung treten und die Bildung der Konvertase verhindern oder deren schnelle Dissoziation initiieren (CR1, DAF, Faktor I, MCP, Faktor H), deren Wirkprinzip später detaillierter erklärt wird (siehe Kapitel 1.1.3). Es gilt zu beachten, dass die drei oben beschrieben Komplementwege zwar unterschiedlich ausgelöst werden und über verschiedene Proteine vermittelt werden, jedoch evolutionär in enger Verwandtschaft zueinander stehen. Des Weiteren können diese Wege durchaus gleichzeitig ablaufen. Die Verstärkerschleife, die beim alternativen Komplementweg entsteht, wenn das von der C3b-Bb-Konvertase gebildete C3b den Komplementweg erneut in Gang setzt, kann natürlich genauso von einem beim klassischen oder MB-Lektin-Weg gebildeten C3b aktiviert werden (Zipfel, 2009). Alternativer und klassischer bzw. MB-Lektin-Weg laufen dann also gleichzeitig ab. Bei der Bildung der C3-Konvertasen laufen alle drei Wege der Komplementaktivierung zusammen. Dies ist der zentrale Schritt der frühen 14

15 Komplementantwort und führt zu einem der Haupteffekte des Komplementsystems bei der Abwehr von Krankheitserregern. C3 ist im Plasma das Komplementprotein mit der höchsten Konzentration. In der Nähe einer C3-Konvertase können bis zu 1000 der daraus abgespaltenen C3b-Moleküle und seiner inaktiven Fragmente (z.b. ic3b) auf der Pathogenoberfläche binden, was für die Phagozyten das Signal zur Zerstörung des opsonierten Krankheitserregers gibt. C4b wirkt ebenfalls als Opsonin, spielt aber scheinbar nur eine relativ kleine Rolle, da es in viel geringeren Mengen als C3b entsteht. Doch die Komplementkaskade hat ihren Endpunkt, die Bildung des membranangreifenden Komplexes, noch nicht erreicht: Im nächsten Schritt, der den terminalen Komplementweg einleitet, bildet sich durch die Bindung eines C3b- Moleküls an die C3-Konvertase eine C5-Konvertase. Die C4b,2b,3b-Komplexe des klassischen oder MB-Lektin-Weges bzw. C3b 2 Bb-Komplexe des alternativen Weges haben die Aufgabe, C5-Moleküle zu fangen und an eine Akzeptorstelle von C3b zu binden. Anschließend ist C5 für die Serinproteasen C2b oder Bb zugänglich und wird in C5a und C5b gespalten. Letzteres leitet das Zusammenlagern der späteren Komplementkomponenten und ihren Einbau in die Zellmembran ein: Zuerst bindet ein C5b-Molekül an ein C6-Molekül. Der daraus hervorgehende Komplex lagert sich an ein Molekül C7 an, was zu einer Konformationsänderung führt, so dass ein hydrophober Bereich auf C7 zugänglich wird und sich in die Lipiddoppelschicht schieben kann. Hydrophobe Stellen werden auf ähnliche Weise bei den späteren Komponenten C8 und C9 exponiert, wenn sie sich an den Komplex binden; dies erlaubt ihnen, ebenfalls in die Lipiddoppelschicht einzudringen. C8 ist ein Komplex aus zwei Proteinen: C8β und C8α-γ. Die Bindung von C8β an den membranassoziierten C5b,6,7-Komplex ermöglicht der hydrophoben Domäne von C8α-γ das Eindringen in die Lipiddoppelschicht. Schließlich induziert C8α-γ die Polymerisierung von 10 bis 16 C9-Molekülen zu einer Porenbildenden Struktur, die man als den membranangreifenden Komplex (MAC, membran attack complex ) bzw. terminalen Komplement-Komplex (TCC, terminal complement complex ) bezeichnet (siehe Abb. 1). Durch den hydrophilen inneren Kanal, dessen Durchmesser etwa 100 Å beträgt, können gelöste Moleküle und Wasser frei durch die Lipiddoppelschicht gelangen, deren Durchbrechen zum Verlust der zellulären Homöostase führt. Dadurch wird der Protonengradient über die Membran zerstört, Enzyme wie Lysozym dringen in die Zellen ein und führen schließlich zur deren 15

16 Zerstörung; das Ziel der Kaskade ist erreicht (Zipfel, 2009). Zusätzlich stimuliert der MAC die T-Helfer-Zell-Polarisierung und verstärkt die Thrombozyten-Aktivität (Zipfel, 2009) Komplementrezeptoren Neben den bisher vorgestellten Komplementkomponenten gibt es noch viele andere Molekülgruppen, die für das komplette Zusammenspiel der verschiedenen Teile des Immunsystems (Regulation verschiedener B-Zellen inklusive Produktion spezifischer AK, Antigen-Aufnahme, Präsentation und Weiterverarbeitung sowie Entstehung eines B-Zell-Repertoires) unabdingbar sind. So ist eines der wichtigsten Ziele der Komplementkaskade, die Zerstörung des Pathogens durch Phagozytose, nur mithilfe einer bisher unerwähnte Molekülgruppe zu erreichen: der Komplementrezeptoren. Sie befinden sich u.a. auf Phagozyten und können Pathogen-opsonierende, gebundene Komplementkomponenten wie C3b spezifisch erkennen. Hierfür ist der C3b-Rezeptor CR1 verantwortlich, der auf Makrophagen und Monozyten sowie auf Erythrozyten, polymorphkernigen Leukozyten, B-Zellen und FDZ (follikuläre dendritische Zellen) zu finden ist. Weitere zentrale Komplementrezeptoren (siehe auch Abb. 3b) sind der auf FDZ und B-Zellen zu findende CR2 (entspricht CD21), der C3d, ic3b und C3dg bindet und einen Teil des B-Zell-Co-Rezeptors darstellt. CR3 und CR4 findet sich auf Makrophagen, Monozyten, Leukozyten und dendritischen Zellen, die ic3b binden, die Phagozytose stimulieren und außerdem die auf Endothelzellen, Mastzellen und Phagozyten sitzenden Rezeptoren für C3a und C5a aktivieren, die ihre Wirkung über die Aktivierung von G-Proteine entfalten. Da die Komplementrezeptoren nicht im Fokus dieser Arbeit stehen, muss dieser kurze Überblick genügen. Es sei jedoch ausdrücklich betont, dass sie ein essentielles Bindeglied zwischen humoralem und zellulären Immunsystem darstellen und für eine gesunde Abwehr von Bakterien unverzichtbar sind. Dies konnte experimentell bestätigen werden: Cr2-/- Mäuse (besitzen weder CR1 noch CR2) sind nicht in der Lage eine effektive AK-Produktion über längere Zeit aufrecht zu erhalten und zeigen zudem eine deutliche Hemmung der Produktion von AK, die durch AK- Klassenwechsel entstehen (z.b. IgG2a&b, IgG3). Als morphologisches Korrelat entstehen in den lymphatischen Organen weniger und kleinere Keimzentren (Nielsen & Graham, 2002). Mäuse mit reiner B-Zell-CD21-Defizienz verhalten sich ähnlich wie komplette Cr2-/- Mäuse, und selbst ein selektiver CD21-Mangel auf FDZ, der die 16

17 initiale Antwort zunächst nicht beeinträchtigt, führt zu einer gestörten Langzeit-IgG- AK-Antwort, was zu einem ineffizienten immunologischen (B-Zell-) Gedächtnis führt (Nielsen & Graham, 2002). Diese und viele andere Experimente haben immer wieder gezeigt, dass das Komplementsystem einschließlich seiner Interaktionen (u.a. über Komplementrezeptoren) mit anderen Komponenten des Immunsystems eine entscheidende und mächtige Rolle bei der Abwehr von Pathogenen und der Beseitigung von körpereigenem Zellschrott ist. Doch ein so wirksames und vielseitiges Abwehrsystem bedarf ebenso komplexer Regulationsmechanismen, um keine Gefahr für körpereigenes funktionelles Gewebe darzustellen und unkontrollierte Aktivierung zu verhindern; dazu mehr im nächsten Kapitel Regulation des Komplementsystems Unter physiologischen Bedingungen unterliegt das Komplementsystem mehreren Kontrollmechanismen, die dafür sorgen eine begonnene Kaskade an der richtigen Stelle, also an der Oberfläche von Pathogenen oder Zellschrott, zu fördern, vor allem aber die Reaktion an Körperzellen zu stoppen und diese vor der Zerstörung zu schützen (Walport, 2001). Für eine gesunde Gewebe-Homöostase ist ein empfindliches Gleichgewicht aus Hemmung und Aktivierung des Komplementsystems unerlässlich; funktioniert dies nicht, resultiert ein pathologischer Zustand (siehe hierzu auch Abb. 2). Bei einer lokalen Infektion beispielsweise wird das Komplementsystem zwar an Ort und Stelle stimuliert und attackiert die ursächlichen Erreger, dabei können jedoch auch immer benachbarte Wirtszellen geschädigt werden, die somit vor unkontrollierter Zerstörung geschützt werden müssen (Zipfel, 2009). Für die genannten Aufgaben existieren mehrere lösliche und membranständige Proteine (Morgan & Harris, 1999). Eine Übersicht darüber gibt Abbildung 3. Doch auch in der Funktionsweise der Komplementkaskade selbst steckt schon ein Kontrollmechanismus: Die Aktivierung der Zymogene läuft annähernd nur an Pathogenoberflächen ab; die aktivierten Komplementfragmente müssen dort in der Nähe binden, sonst werden sie rasch durch Hydrolyse abgebaut. 17

18 Abbildung 2 (aus Zipfel, 2009): Nutzen und Risiko des Komplementsystems a Intakte körpereigene Zellen müssen sich durch Komplementregulationsmechanismen gegen Angriffe schützen b Modifizierte oder beschädigte körpereigene Zellen sollten in geregelter Weise beseitigt werden. Dabei erfolgt die Komplementkaskade bis zur Ablagerung von C3b auf der Oberfläche, ein Fortschreiten bis hin zur C5-Konvertase und dem terminalen Komplex (TCC, terminal complement comlex ) wird jedoch blockiert, um eine nicht-entzündliche Beseitigung von apoptotischen und nekrotischen Zellen zu erzielen. c Komplementaktivierung an der Oberfläche von Mikroorganismen führt zu dessen Erkennung, Beschädigung sowie Beseitigung des entstandenen Zellschrotts d Inadäquate Aktivierung von Komplement kann zu Schäden von gesunden Körperzellen führen e Unzulängliche Erkennung bzw. Markierung von modifizierten und beschädigten Wirtszellen kann zu ungenügender Beseitigung und Akkumulation von apoptotischem Material führen und damit zur Entstehung von Nekrosen und Autoimmunerkrankungen beitragen f Einige pathogene Mirkoorganismen können ihre Erkennung durch das Immunsystem verhindern oder den Angriff des Komplementsystems blockieren. Dadurch fällt die erste Abwehrfront des Körpers weg, es kann eine Infektion resultieren 18

19 Abbildung 3 (aus Zipfel, 2009): Komplement Regulatoren und Rezeptoren a Dargestellt sind sowohl membranständige als auch lösliche Regulatoren, die verschiedene Schritte der Komplementkaskaden kontrollieren. Regulatoren des alternativen Weges sind Faktor H, FHL-1 ( factor H like protein 1 ) und das Aktivierungsprotein Properdin. Die Carbopeptidase N spielt bei der Regulation aller drei Aktivierungswege eine Rolle. Weitere lösliche Regulatoren des MB-Lektin-und des klassischen Komplementweges sind C1q, C1INH (C1 Inhibitor) und C4BP (C4b bindendes Protein). Die restlichen dargestellten löslichen Regulatoren greifen am terminalen Abschnitt der Komplementkaskade an. Membranständige Regulatoren sind CR1 (auch bekannt als CD35), CD46 (auch MCP, Membran-Co-Faktor der Proteolyse), CD55 (auch DAF), CD59 (auch Protektin) und der Komplementrezeptor der Immunglobulin Superfamilie CRIg (auch VSIG4). Die Funktionsweisen sind völlig verschieden; C1INH beispielsweise induziert die Dissoziation von C1; CR1, C55 und C4BP verdrängen eine Komponente der C3-Konvertase des klassischen Komplementweges. CD59 verhindert die endgültige Bildung des MACs. b Dargestellt sind verschiedene Komplementrezeptoren. Die Anzahl und Verteilung der Rezeptoren auf den verschiedenen Zellen variiert stark (siehe dazu auch Text Kapitel Komplementrezeptoren ). Der unlängst entdeckte Komplementrezeptor CRIg bzw. dessen kürzere Form CRIgs spielt eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung C3d- und ic3b-markierter Partikel inkl. Mikroorganismen und körpereigener Zellen. Wenn C4b z.b. nicht schnell genug an die Oberfläche eines Pathogens bindet, wird die Thioesterbindung durch eine Reaktion mit einem Wassermolekül gespalten und diese Hydrolysereaktion inaktiviert C4b irreversibel. Dadurch wird verhindert, dass C4b vom Mikroorganismus abdiffundiert und sich an Körperzellen anlagert; die Komplementaktivierung findet größtenteils nur da statt, wo sie initiiert wird: an der Oberfläche von Pathogenen. So wird C2 auch nur dann für C1q zur Spaltung 19

20 zugänglich, wenn es an das sich an der Pathogenoberfläche befindliche C4b gebunden ist; C3-Moleküle können ebenfalls nur an der Oberfläche des Pathogens aktiviert werden. Wie C4b wird zudem auch das C3b-Spaltprodukt schnell inaktiviert, wenn es nicht kovalent bindet. Die wenigen spontan im Plasma aktivierten Komponenten können allerdings auch an Proteine von Körperzellen binden. Hier ist das Komplementsystem nun durch manche Regulationsproteine in der Lage, körpereigen von körperfremd zu unterscheiden: Die Plasmaserinprotease Faktor I zum Beispiel zirkuliert in aktiver Form und kann C3b und C4b spalten allerdings nur dann, wenn diese z.b. an eines der Co-Faktor-Proteine CR1 oder MCP (Membran- Co-Faktor der Proteolyse) gebunden sind. Trifft dies zu, wird C3b erst zu ic3b und dann weiter zu C3dg gespalten; C4b wird entsprechend durch Spaltung zu 4c und 4d inaktiviert. In den Zellwänden von Mikroorganismen sind diese vor dem Fortschreiten der Komplementkaskade schützenden Co-Faktoren CR1 und MCP jedoch nicht enthalten; der Mechanismus greift nur bei körpereigenen Zellen. Die Bedeutung von Faktor I lässt sich daran erkennen, dass bei Personen mit einem genetisch bedingten Faktor-I-Mangel aufgrund der unkontrollierten Komplementaktivierung Komplementproteine schnell ausgedünnt werden und die Betroffenen an wiederholten Bakterieninfektionen leiden. Ein weiterer Co-Faktor für Faktor I, der sog. Faktor H, bedient sich noch eines anderen Mechanismus um regulatorische Aktivität auszuüben: Er bindet durch seine hohe Affinität zu endständigen Sialsäureresten an Glykoproteinen von Membranen, bevorzugt an C3b, das an Körperzellen gebunden ist (siehe dazu Abb. 4). Durch den unterschiedlichen Kohlenhydratgehalt in bakteriellen Zellwänden ist die Bindungsfreudigkeit des Faktors H an C3b, das sich auf Bakterien geheftet hat, jedoch sehr gering. Dadurch kann Faktor B, der mit Faktor H um die Bindungsstelle des C3bs konkurriert, vermehrt an Pathogene binden. Faktor B bewirkt eine gesteigerte Entstehung von der C3bBb-C3-Konvertase, was zu einer Amplifizierung der Komplementaktivierung führt. Gewinnt Faktor H den Konkurrenzkampf, was normalerweise an Vertebratenzelloberflächen der Fall ist, fungiert er als Co-Faktor für Faktor I, der das gebundene C3b wie oben beschrieben abbaut die Komplementaktivierung ist blockiert. 20

21 Dissertation von Lena Oelmann Abbildung 4 (aus Walport, 2001): Regulation der Spaltung von C3 durch Faktor H und I Die von der C3-Konvertase gespaltenen C3b-Moleküle binden sowohl an die Oberfläche von Bakterien als auch von körpereigenen Zellen. Durch die unterschiedliche Beschaffenheit der Membranen dieser zwei Zellen wird daraufhin jedoch die Bindung verschiedener Regulatoren des Komplementsystems begünstigt: Faktor H bindet durch seine hohe Affinität zu endständigen Sialsäureresten eher an Körperzellen, fungiert dort als Co-Faktor für Faktor I, der die C3b-Moleküle abbaut und so ein Fortschreiten der Komplementkaskade verhindert. Bindet durch die Zusammensetzung der Kohlenhydrate der Zellmembran Faktor B und nicht Faktor H an die C3bmarkierte Zelle, führt dies zum Fortschreiten der Komplementkaskade bis hin zur Zerstörung der Zielzelle. Ist ein Allel des für Faktor H kodierenden Gens defekt oder werden Antikörper gegen Faktor H gebildet, resultiert daraus das Krankheitsbild des atypischen hämolytisch urämischen Syndroms (ahus) (Zipfel, 2009). Defekte im Faktor B sind mit einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen mit Neisseria verbunden. Die genannten Regulationsproteine sind nur eine kleine Auswahl der großen Fülle an Molekülen (siehe Abb. 3), die für den geregelten Ablauf einer Abwehrreaktion mit Beteiligung des Komplementsystems beitragen. Sie greifen an verschiedenen Stellen der Komplement-Kaskade an, agieren an Membranen von Pathogenen oder 21

22 körpereigenen Zellen und können blockierende oder amplifizierende Wirkungen haben. Ist auch nur eines der zahlreichen Regulationsproteine defekt, kann diese Dysbalance verheerende Folgen haben Dysregulation und Defekte des Komplementsystems und seine Folgen Wegen seiner zentralen Rolle bei multiplen physiologischen Prozessen kann ein Ungleichgewicht oder eine Dysregulierung des Komplementsystems in Krankheiten resultieren, die sich in verschiedenen Organen manifestieren (Zipfel, 2009). Tabelle 1 zeigt die verschiedene Komplement-Mangelerkrankungen und Komplementvermittelte Erkrankungen, sowie den ihnen zugrunde liegenden Defekt und die betroffenen Genlokalisationen, sofern diese bekannt sind. Die verschiedenen Mechanismen, die zu einer im Komplementsystem begründeten Pathologie führen, werden anhand der Abbildung 2 deutlich: Steht das Komplementsystem eines gesunden Menschen im Gleichgewicht, werden eindringende Mikroorganismen angegriffen, körpereigenes Gewebe jedoch geschützt. Entartete und beschädigte Körperzellen werden möglichst entzündungsarm erkannt und abgebaut. Gerät das System aus dem Gleichgewicht können daraus pathologische Zustände resultieren, die sich verschieden äußern. Des Weiteren existieren zahlreiche pathologische Zustände des Körpers, die mit Komplementaktivierung assoziiert sind: Das systemic inflammatory response syndrom (SIRS), Multiorganversagen, das Ischämie-Reperfusions-Syndrom, Angioödeme, das capillary leak syndrome, hyperakute und akute Transplantat Abstoßung, Vaskulitis, Nephritis, Autoimmunerkrankungen (z.b. SLE, rheumatoide Arthritis, Myasthenia gravis), Biomaterialunverträglichkeit (z.b. nach Dialyse oder kardiopulmonalem Bypass), schwere Traumata, Verbrennungen oder Sepsis; außerdem scheint die Aktivierung des Komplementsystems eine Rolle bei einer Reihe neurologischer Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Multipler Sklerose sowie dem Guillain-Barré-Syndrom zu spielen (Kirschfink & Mollnes, 2003). 22

23 Erkrankung Hauptdefekt Ursache Betroffenes Gen Atypisches hämolytisch urämisches Syndrom (ahus) Defekte C3-Konvertase Meist heterozygote Mutationen, gen. Defekte, Auto-AK CFHR1-Defizienz, CFHR3, Faktor B, Faktor I, Faktor H Membranoproliferative Glomerulonephritis Typ 2 (MPGN 2) Defekte C3-Konvertase Meist homozygote Mutationen, gen Defekte, Auto-AK und C3 nephritic factor Faktor H C3 Systemischer Lupus Erythematosus (SLE) Defekte Beseitigung apoptotischer Zellen Hereditäre homozygote Defizienz, gen. Defekte C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4 Pyogene Infektionen Unangemessene Komplementaktivität Infektionen mit Neisseria meningitidis und Streptokokkus pneumoniae C3, Faktor H, Faktor I, Properdin, MAC Properdin-Defizienz Infektionen mit Neisseria spp. Gen. Mutation Faktor I-Defizienz Infektionen mit N. menigitidis und S. pneumoniae oder andere Atemwegsinfektionen Faktor H-Defizienz Infektionen mit N. menigitidis Gen. Mutation Gen. Mutation, die die Proteinsekretion betrifft Hämolyse Thrombosen Erythrozyten Lyse Thrombenbildung unbekannt CD59, Faktor H, CFHR1-& CFHR3-Defizienz Partielle Lipodystrophie Verlust von Fettgewebe C3 nephritc factor unbekannt Hereditäres Angioödem Rezidivierende spontane nicht-allergische Ödeme des Subkutangewebes und der Schleimhäute Meist heterozygote Mutationen C1 Inhibitor Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) Ausfall der CD55- und CD59-Expression Gen. Defizienz von PIG-A, Ausfall der GPI-Anker- Formierung PIGA Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) Bildung von Drusen, chronische Entzündung unbekannt Faktor H, C3, C3, CFHR1- und/oder CFHR3-Defizienz, Faktor B, Faktor I Tumorzellen Überexpression von membranständigen und sezernierten Regulatoren, verstärkte Bindung von löslichen Regulatoren unbekannt unbekannt Tabelle 1 (modifiziert nach Zipfel, 2009): Komplementmangel und Komplement-vermittelte Erkrankungen Dargestellt sind verschiedene Erkrankungen, die mit Defekten des Komplementsystems assoziiert sind. Soweit bekannt, sind die zugrunde liegenden Gendefekte angegeben. Abkürzungen: C, complement component ; CFHR, complement factor H-related protein ; GPI, glycosylphosphatidylinositol ; PIGA, phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class A 23

24 1.1.5 Komplement und Infektionen Rezidivierende Infektionen können durch angeborene oder erworbene Mängel oder Defekte des Komplementsystems bedingt sein; je nachdem an welcher Stelle der Kaskade ein Faktor fehlt, prädisponiert dies für Infektionen mit verschiedenen Erregern: So erhöht ein Mangel an C3 und Komponenten des alternativen Weges das Risiko einer Infektion mit bekapselten Bakterien wie Pneumokokken, Streptokokken oder Hämophilus (Mollnes et al., 2007). Figueroa und Densen wiesen 1991 diese Erreger jedoch auch bei Patienten mit defekten Komplementkomponenten des klassischen Weges nach. Defizienzen des terminalen Komplementweges und Properdin-Defizienz sind mit rezidivierenden systemischen Infektionen mit Neisserien assoziiert (Mollnes et al., 2007). Mängel im MBL sind weit verbreitet, führen jedoch eher selten zu erhöhter Infektanfälligkeit; typischerweise sind dann am ehesten Kinder im Alter von 6-18 Monaten betroffen (Mollnes et al., 2007). Doch auch beim immunkompetenten Menschen ohne Komplementmangel-Syndrome können Infektionen durch geschicktes Ausspielen des Immunsystems vorkommen: Nach Millionen Jahren Evolution haben es einige pathogene Mikroorganismen geschafft, sich der Erkennung und des Angriffs durch das Komplementsystem durch verschiedene Strategien zu entziehen (Lachmann, 2002). Die meisten Pathogene exprimieren Oberflächenproteine, die Komplementregulatoren des Wirtes binden oder aber sie rekrutieren Komplementinhibitoren, die mit der Komplementaktivierungskaskade interferieren und sie damit verzögern bzw. sogar gänzlich blockieren (Zipfel, 2009). Manche Bakterien besitzen zum Beispiel Sialsäurereste in ihrer Membran, wodurch Faktor H das auf ihnen deponierte C3b inaktivieren kann Das Komplementsystem und die Beseitigung von entarteten und apoptotischen Zellen Etwas zögerlicher als der Zusammenhang zwischen Infektionen und dem Komplementsystem wurde dessen Rolle bei einer Reihe von nicht-infektiösen Erkrankungen akzeptiert (Mollnes et al., 2007). Es gibt Hinweise, dass die schützende Wirkung der Komplementregulationsproteine CR1, MCP, DAF und Glycodylphosphatidylinositol-Anker-Proteine bei malignen Zellen verstärkt ist, was zu 24

25 einer Refraktärität gegenüber Komplement führt (Jurianz et al., 2000). Hier würde die mangelhafte Entsorgung von entarteten Zellen durch das Komplementsystem also zu einer Tumorerkrankung führen. Doch die unzureichende Beseitigung von körpereigenem Material scheint auch bei der Entstehung einer anderen Krankheitsgruppe eine Rolle zu spielen: den Autoimmunerkrankungen. Zipfel beschreibt die ursächlichen Prozesse, die dahinter stecken, folgendermaßen: An der Oberfläche einer apoptotischen Zelle spielen sich dramatische morphologische Veränderungen ab, die in einem Zusammenbrechen der Membran resultieren. Dabei gehen die membranständigen Komplementregulationspoteine verloren, was zur Folge hat, dass zelleigene Strukturen als Komplement-aktivierende Oberflächen fungieren. Um einen komplementgesteuerten Angriff und eine Reaktion des adaptiven Immunsystems auf körpereigenes Gewebe zu verhindern benötigt der Körper an dieser Stelle das lösliche C1q in Kombination mit Faktor H. So werden die frühen Schritte des klassischen Komplementweges initiiert, die Bildung und Amplifizierung der C5-Konvertase jedoch blockiert (Gershov, Kim, Brot & Elkon, 2000; Schulze et al., 2008; Mihlan, Stippa, Jozsis & Zipfel, 2009). Der Zellschrott kann per C3bvermittelter nicht-inflammatorischer Einleitung der Phagozytose beseitigt werden (Mihlan et al., 2009; Cook & Botto, 2006). Bei inadäquater Beseitigung jedoch, z.b. bei einem Mangel an C1q oder C4, häuft er sich an. Dies kann zu einer Exposition der körpereigenen Antigene gegenüber Lymphozyten führen und in inadäquater Aktivierung von selbstreaktiven B- und T-Zellen resultieren. Letzteres wird als einer der entscheidenden Schritte für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen angesehen (Schulze et al., 2008). Außer einem Mangel an C1q und C4 existieren zahlreiche andere Störungen im Komplementsystem, die für eine Autoimmunerkrankung prädisponieren. Interessanterweise scheinen besonders den alternativen Komplementweg betreffende Defekte mit Autoimmunerkrankungen assoziiert zu sein (Zipfel, 2009). Der Zusammenhang zwischen Komplementsystem und Systemischem Lupus Erythematodes, einer potentiell schwer verlaufenden, zahlreiche Organe betreffenden Autoimmunerkrankung, hat schon viele Wissenschaftler beschäftigt. Siehe dazu Kapitel 1.3 SLE und Komplement. 25

26 1.2 Der Systemische Lupus Erythematodes Der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) gilt als typisches Modell einer Autoimmunkrankheit. Lupus sei, wie Nagy ihn beschreibt, der Prototyp der Immunkomplex-Erkrankungen, mit einer Krankheitsaktivität, die im Verlauf stark varriieren kann (Nagy et al., 2000). SLE gehört zu den sog. Kollagenosen, systemischen Bindegewebserkrankungen, bei denen die verschiedensten Immunphänomene und rheumatologischen Symptome auftreten Epidemiologie Die mittlere Gesamtprävalenz in Europa beträgt 25-27/ Einwohner, bei Asiaten 49/100000, bei Bewohnern Afrikas und der Karibik-Region über 200/ Einwohner. Die Inzidenz variiert je nach Herkunft und Geschlecht: Bei weißen Männern beträgt sie 0,4, bei Frauen 3,5, bei afrikanisch-amerikanischen Frauen sogar 9,2 Fälle/ Einwohner/Jahr. In den letzten 4 Jahrzehnten hat sich die Inzidenz verdreifacht. Neuerkrankungen sind häufig im Frühjahr und Sommer; Erstmanifestationen häufig nach intensiver Ultraviolettexposition (Sonnenbad) oder Infektion. Es erkranken zu 80-90% Frauen. Das Prädilektionsalter ist das 3. Lebensjahrzehnt. Das mittlere Alter bei Diagnose beträgt 30 Jahre Ätiologie und Pathogenese Auf die Frage, wodurch SLE entsteht, gibt es leider bisher keine einfache Antwort. Die Pathogenese ist sehr komplex und noch nicht hinreichend aufgeklärt. Es sind jedoch zahlreiche Mechanismen und Einflüsse identifiziert worden, die sicher zur Entstehung des SLE beitragen. Man geht davon aus, dass, wie Manson und Isenberg es in einer Arbeit von 2003 bezeichnen, diese heterogenetische Erkrankung durch eine komplexe Interaktion verschiedener Abnormalitäten, die für die Krankheit anfällig machen und/ oder diese auslösen würden, verursacht werde. Trifft ein Patient mit genetischer Belastung auf bestimmte Immuntrigger, die eine ausreichende Aktivierung des Immunsystems zur Folge haben, kann der Krankheitsprozess fortschreiten (Crow, 2009). Arbuckle et al. (2003) fanden in einer groß angelegten prospektiven Studie heraus, dass bei 88% der im Verlauf diagnostizierten SLE-Fälle schon im Vorfeld Antikörper gegen körpereigene Proteine nachweisbar waren, teilweise schon 5 Jahre vor Erstdiagnose (Arbuckle et al., 2003). 26

27 Das unterstützt die gängige Vorstellung der Krankheitsgenese: Die Patienten sind durch genetische Varianten bereits für die Erkrankung prädisponiert, sie schlummert sozusagen in ihnen. Fallen zufällig ein oder mehrere Trigger zusammen, kommt es zur Erstmanifestation. Mary K. Crow beschreibt in einer Arbeit von 2009 drei verschiedene Arten der genetischen Varianten: die single nucleotid variant, die seltenen genetic mutations (z.b. C2, C4, C1q, TREX1 betreffend) und eine dritte, in einem Mausmodell jüngst nachgewiesene copy number variation. Die betroffenen Gene kodieren für Proteine, die entweder in die Antigenpräsentation, Zytokin- und Komplement-Produktion, Apoptose, Fc-Rezeptor-Interaktionen oder aber B- und T- Zell-Funktionen involviert sind (Manson & Isenberg, 2003) (siehe Tabelle 2). Wie Abbildung 5 anschaulich verdeutlicht, führen die genetischen Varianten durch verschiedene Mechanismen zu einer Dysfunktion des Immunsystems: manche führen zu einer erleichterten, sozusagen vorschnellen Aktivierung des angeborenen Immunsystems, besonders über Typ 1 Interferon Produktion, andere haben eine erhöhte Verfügbarkeit von Autoantigenen zur Folge (hierzu siehe auch Kapitel SLE und Komplementsystem ). Von zentraler Bedeutung ist außerdem die veränderte Schwelle zur Aktivierung von Zellen der adaptiven Immunantwort. Überaktive B- Zellen, vermutlich verstärkt durch einen bei SLE erhöhten Spiegel vom B- Lymphozyten-Stimulator-Protein, sowie fehlender Suppression durch T-Zellen, produzieren übermäßig viele Antikörper (Manson & Isenberg, 2003). Zuvor werden die Fremd- oder Autoantigene von APZs aufgenommen oder aber binden an schon vorhandene Antikörper auf B-Zell-Oberflächen. APZs und B-Zellen verarbeiten die Antigene zu Peptiden und präsentieren diese über ihre HLA-Oberflächenmoleküle den T-Zellen, die dadurch aktiviert werden und die B-Zellen zur Produktion von Antikörpern anregen (Mok & Lau, 2003). Etwas detaillierter werden die hierbei auftretenden Unregelmäßigkeiten bei Patienten mit SLE in Tabelle 3 dargestellt. Das erhöhte Angebot von Autoantigenen spielt dabei natürlich auch eine wichtige Rolle (siehe auch Kapitel 1.3). Interessanterweise wurden in apoptotischen Zellbläschen genau solche Antigene gefunden, gegen die sich bei SLE viele Antikörper richten (Casciola-Rosen, Anhalt & Rosen, 1994). In in vitro Studien wurde nachgewiesen, dass autoreaktive T-Zellen von dendritischen Zellen stimuliert werden, die körpereigenes apoptotisches Material aufgearbeitet hatten (Chernyshev, Kirou & Crow, 2002). 27

28 Gentyp HLA genes Betroffenes Gen DR2, DR3 DR2, DR3, DR7, DQw1, DQw2, DQA1, DQB1, B8 (anti-ro) DR3, DR8, DRw12 (anti-la) DR3, DQw2, DQA1, DQB1, B8 (anti-ro and anti-la) DR2, DR3, DR7, DQB1 (anti-dann) DR2, DR4, DQw5, DQw8, DQA1, DQB1 (anti-u1 ribonuclear protein) DR2, DR4, DR7, DQw6, B61 (anti-sm) DR4, DR7, DQ6, DQ7, DQw7, DQw8, DQw9 (anticardiolipin or lupus anticoagulant) Complement genes (C2, C4, C1q) Non- HLA genes Mannose binding lectin polymorphisms Tumour necrosis factor a T cell receptor Interleukin 6 CR1 Immunoglobulin Gm and Km FcgRIIA (IgG Fc receptor) FcgRIIIA (IgG Fc receptor) PARP (poly-adp ribose polymerase) Heat shock protein 70 Humhr 3005 Tabelle 2 (aus Mok & Lau, 2003): In die Entstehung des SLE involvierte Gene Abkürzungen: HLA, human leucocyte antigen ; Sm, Smith antigen Weitere Einflussfaktoren an dieser Stelle der Pathogenese werden kontrovers diskutiert: Manson und Isenberg (2003) beschreiben in ihrem Review The pathogenesis of systemic lupus erythematosus Einflüsse von UV-Licht, Infektionen und Medikamenten, die zu einer erhöhten Apoptoserate führen können; des Weiteren spielen Sexualhormone eine immunmodulatorische Rolle bei 28

29 Autoimmunerkrankungen. In Mausmodellen konnte nachgewiesen werden, dass Oestrogen bei SLE-anfälligen Mäusen als potentieller Kranheitsstimulator agieren kann (Carlsten, Tarkowski, Holmdahl & Nilsson, 1990), was u.a. den Fakt erklären könnte, warum Frauen zwischen Menarche und Menopause am häufigsten von SLE betroffen sind (Manson & Isenberg, 2003). Ein weiteres Mausmodell lieferte Hinweise, dass Androgene bezüglich der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen protektiv wirken könnten (Lucas, Ahmed, Casey & MacDonald, 1985). Außerdem werden mögliche Zusammenhänge mit dem Epstein-Barr-Virus, Zytomegalievirus oder Parvovirus B19 in Studien untersucht. Abbildung 5 (aus Crow, 2009): Die Pathogenese des SLE Abgebildet sind die drei Phasen der Entstehung des SLE und die potentiell daran beteiligten defekten Gene (in orange). Die meisten mit SLE assoziierten Genvarianten sind recht verbreitet; manche jedoch sind seltene Mutationen (C2, C4, C1q und TREX1). Einige der Genvarianten begünstigen die Aktivierung des angeborenen Immunsystems, insbesondere die Produktion des Typ 1 Interferons. Aus anderen Genedefekten resultiert eine erhöhte Verfügbarkeit von Autoantigenen oder aber ein Senken der Schwelle zur Aktivierung des adaptiven Immunsystems bzw. Verändern von dessen Regulation, was zu erhöhter AK-Produktion führt. Zusätzlich können Genvarianten Entzündungen und resultierende Organschäden fördern bzw. Schutzmechanismen für das Gewebe vor proinflammatorischen Mediatoren aushebeln. Die gezeigten SLE-assoziierten Genvarianten machen das Immunsystem und betroffenen Organe für endo- und exogene Trigger anfällig. Wie in Abbildung 5 dargestellt führt eine Verbindung aus den genannten Defekten - evtl. kombiniert mit noch nicht bekannten Einflussfaktoren - in der dritten Phase zu einem Gewebeschaden; bedingt wird dies wahrscheinlich hauptsächlich durch die 29

30 Ablagerung von Immunkomplexen, was eine Vaskulits und prinzipiell eine Entzündungsreaktion des betroffenen Gewebes zur Folge hat. Diese Inflammation kann beim SLE fast überall im Körper auftreten, was zu einer Fülle von möglichen Symptomen führt. Einige Manifestationsarten sind dabei jedoch scheinbar mit einzelnen Autoantikörpern assoziiert, z.b. AK gegen das ribosomale P-Protein mit Psychosen, subakuter kutaner Lupus mit Anti-Ro-AK (Mok & Lau, 2003). Unregelmäßigkeiten im Immunsystem von SLE-Patienten Überaktivierte B-Zellen Erhöhte Anzahl von aktivierten, Ig-produzierenden B-Zellen im peripheren Blut Vorhandensein von B-Zell Unregelmäßigkeiten, die der Entwicklung des SLE voraus gehen können (bei nichtbetroffenen Familienmitgliedern) B-Zellen von SLE Patienten sind anfälliger für polyklonale Aktivierung durch spezifische Antigene Erhöhte IL-6- und IL-10- Konzentrationen, die B-Zell-Hyperaktivität begünstigen Gestörte/ abnormale B-Zell-Antwort auf aktivierende Signale Überaktivierte T-Zellen Erhöhte Anzahl von aktivierten T-Zellen im peripheren Blut Ungewöhnlich frühe T-Zell-Aktivierung B-Zellen empfänglicher für T-Zell-Hilfe, daraus resultierend gesteigerte Ig-Produktion T-Zellen von SLE Patienten produzieren nach Stimulation nur wenig IL-2 Abnormal Funktion der Phagozyten Phagozyten können Immunkomplexe nicht effizient binden bzw. verarbeiten Phagozytose von apoptotischen Zellen gestört Abnormale Immunregulation Gestörte Beseitigung von Immunkomplexen und apoptotischem Material auf Grund von qualitativen oder quantitativen Mängeln der frühen Komplementkomponenten C2, C4, C1q oder von Fcγ, CR1 und C1q-Rez. auf Zelloberflächen Inadäquat niedrige Aktivität von T-Suppressor-Zellen und NK-Zellen Dysregulierte idiotypische Kontrolle der AK-Produktion Tabelle 3 (aus Mok & Lau, 2003): Zusammenfassung der Unregelmäßigkeiten im Immunsystem von SLE-Patienten Abkürzungen: Ig, Immunglobulin; IL, Interleukin; NK, Natürliche Killerzellen Klinische Symptomatik Die Beschwerden der Patienten mit SLE sind sehr vielfältig, der Weg zur Erstdiagnose manchmal lang und beschwerlich. Nicht umsonst wird Lupus als ein Chamäleon bezeichnet. Neben Allgemeinsymptomen wie Müdigkeit, Schwäche, Fieber und Gewichtsverlust kann es zu folgenden Hauterscheinungen kommen: dem klassischen Schmetterlingserythem, einem morbilliformen Exanthem (ähnelt einem 30

31 Arzneimittelexanthem, tritt besonders nach UV-Exposition auf), ausgedehnten, nicht vernarbenden erythematosquamösen Plaques (durch Licht provozierbar, oft symmetrisch, besonders an Armstreckseiten und am Stamm, häufig konfluierend), diskoidem Lupus, oralen und nasopharyngealen Schleimhautulzera, Vaskulitis der Haut (geht einher mit Ulzera, Purpura, Livedo reticularis, Gangrän, subkutanen Knoten und dermalen Infarkten), Urtikaria, Raynaud-Syndrom, Fotosensibilität, Nagelfalzveränderungen, Blasenbildung (auch hämorrhagisch, bullöser LE), selten subkutanen Verkalkungen und Pannikulitis. Fast alle Organe können von der Autoimmunerkrankung betroffen sein: In ca. 50% der Fälle kommt es zu einer Lupusnephritis, die klinisch meist stumm verläuft. Von allen Organmanifestationen ist die Lupusnephritis am besten erforscht: Mesangiale Zellproliferation, Entzündung sowie Immunkomplexablagerungen einschließlich Immunglobulinen und Komplementkomponenten wurden nachgewiesen (Mok & Lau, 2003). Es kommt zu einer persistierende Proteinurie > 0,5 g/ 24 h oder Zylindrurie mit Nachweis von Erythrozyten, Hämoglobin, granulären oder gemischten Zylindern im Urin. Die Lupusnephritis kann auch in transplantierten Nieren auftreten, klinische und serologische Aktivitätszeichen können fehlen. Eine Lungenbeteiligung äußert sich bei ca. 10% der Patienten in einer Lupuspneumonitis mit Infiltrationen, Zwerchfellhochstand und Plattenatelektasen. Pleuraergüsse und pulmonale Hypertonie treten je nach Krankheitsdauer sogar in bis zu 40% der Fälle auf. Liegt eine Herzbeteiligung vor, kann man häufig echokardiographische Veränderungen (in ca. 60%) und Klappenveränderungen (in ca. 40%) feststellen. Diese befinden sich meist an der Mitralklappe (Regurgitationsstörungen). Die Endokarditis Libmann-Sacks war früher häufig, ist heute jedoch klinisch weniger bedeutsam. Eine Perikarditis mit Perikarderguss kommt bei ca. 25% der Patienten vor und ist häufig mit einer Myokarditis vergesellschaftet. Die bei ca. einem Fünftel der an SLE Erkrankten vorkommenden myokardialen Veränderungen bleiben oft ohne klinisches Korrelat. Auch das Nervensystem kann vom SLE betroffen sein. Die Prozentangaben für eine ZNS-Beteiligung schwanken zwischen 20% und 50% und äußern sich meist in diffusen Veränderungen wie akuten Verwirrtheitszuständen, Desorientierung, Psychosen, Depressionen, affektiven Veränderungen, Krampfanfällen und kognitiven Dysfunktionen. Schwere Kopfschmerzen (in 10%) gelten als ZNS-Beteiligung, wenn sie rezidivierend sind. Es kann jedoch auch zu fokalen Ereignissen in Form von zerebrovaskulären Ereignissen, Krampfanfällen, 31

32 kranialen Neuropathien und Myelitis transversa oder zu Bewegungsstörungen (mit Chorea, Athetose, zerebellarer Ataxie und Parkinson-ähnlichen Symptomen) kommen. Bei einer in ca. 15% der Fälle vorkommenden Beteiligung des peripheren Nervensystems leiden die Lupus-Patienten an Neuropathien (Polyneuropathie, Mononeuritis multiplex, autonome Neuropathie); auch das Guillain-Barré-Syndrom kann auftreten. Weitere mögliche Manifestationen sind: gastrointestinale Beschwerden (Bauchschmerzen, Durchfälle, Nausea, Dickdarmulzera durch Arteriitis mesenterialis), Lymphknotenvergrößerungen, Konjunktivitis und Episkleritis, Hepatomegalie, Splenomegalie, Parotisvergrößerungen, Herzinfarkt durch Vaskulitis der Herzkranzgefäße, Thrombophlebitis, Thrombosen (bes. bei sekundärem Antiphospholipid-Antikörpersyndrom), Pankreatitis, Menstruationsanomalien, diverse Allergien und Osteonekrosen. Weitaus häufiger als die gerade genannten Beschwerden sind jedoch Manifestationen am Bewegungsapparat: Bei ca. 90% der SLE-Patienten treten sie in Form von Arthritis und/oder Arthralgien auf. Es kommt zu einem meist symmetrischer Befall der proximalen Interphalangealgelenke (in 80%), Kniegelenke (70%), Handgelenke, MCP-Gelenke, Sprunggelenke, Ellbogengelenke oder Schultergelenke (50%). Oligoarthritis und Monarthritis kommen ebenfalls vor. Zwischen massiver Synovitis mit Erguss und Arthralgie sind alle Übergänge möglich. Morgensteifigkeit tritt bei ungefähr der Hälfte der Bertoffenen auf. Eine begleitende Tenosynovitis gilt häufig als Frühsymptom. Bei den Jaccoud-Arthropathien der Fingergelenke entwickelt sich durch Sehnen- und Muskelbeteiligung eine Schwanenhalsdeformität oder eine Ulnardeviation, die bis hin zur Laxation führen kann. Ungefähr ein Drittel der Patienten leidet an Myalgien, bei denen sich histologisch eine Art Myositis mit lymphozytärer Vaskulitis und Typ II-Faseratrophie zeigt; Fibromyalgien werden in den letzten Jahren zunehmend beobachtet, korrelieren aber nicht mit der Aktivität des SLE; nichtsdestotrotz können sie den Patienten stärker beeinträchtigen als die Grundkrankheit Diagnostik Die Diagnostik des SLE ist beinahe ebenso vielfältig wie das klinische Bild. Die Erstdiagnose erfolgt klinisch mithilfe der revidierten Klassifikationskriterien des American College of Rheumatology von 1997 (siehe Tab. 4). 32

33 Kriterium Schmetterlingsexanthem Diskoide Hautläsionen Fotosensitivität Ulzerationen Arthritis Serositis Nierenerkrankung Neurologische Erkrankung Hämatologische Erkrankung Immunologische Befunde Antinukleäre Antikörper Definition flaches oder erhabenes Exanthem beider Wangen, die Nasolabialfalten aussparend erythematöse erhabene Flecken mit keratotischer Schuppung und atrophischen Narben Hautrötung infolge einer ungewöhnlichen Reaktion auf Sonnenlicht orale oder nasopharyngeale Ulzerationen nicht erosive Arthritis von zwei oder mehr Gelenken (Druckschmerz, Schwellung oder Erguss) Pleuritis Perikarditis persistierende Proteinurie (0,5 g/ d oder 3 + und darüber, falls nicht quantifiziert) Zylindrurie (Erythrozyten, Hämoglobin) Krampfanfälle nicht medikamentöse oder metabolisch bedingte Psychose hämolytische Anämie (mit Retikulozytose) Leukozytopenie (4000/ ml) Lymphozytopenie (1500/ ml) Thrombozytopenie (100000/ ml) Anti-dsDNA-Antikörper Anti-Sm-Antikörper Anti-Phospholipid-Antikörper erhöhte Titer nicht medikamentöser Genese Tabelle 4: ACR-Klassifikationskriterien zur Diagnose des SLE von 1982, modifiziert 1997 Liegen mindestens vier der elf Kriterien beim Patienten (gleichzeitig oder hintereinander) vor, ist die Diagnose SLE sehr wahrscheinlich. Laborchemisch ist neben den Entzündungsparametern, dem Differentialblutbild, den Gerinnungsparametern und dem Urinstatus die Bestimmung der Autoantikörper besonderes wichtig. Zwar ist nur jeder 4. Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) auf einen SLE zurückzuführen, doch bei über 95% der Lupuspatienten können ANAs nachgewiesen werden (Mok & Lau, 2003). Sie sind also sehr sensitiv, jedoch nicht sehr spezifisch für SLE. Weitgehend krankheitsspezifisch ist der Nachweis von dsdna-antikörpern (am Anfang allerdings nur bei jedem 2. Patienten) und von Sm- Antikörpern (30-40%). Auch die vielen bei SLE häufig auftretenden, jedoch nicht krankheitsspezifische Autoantikörper gegen z.b. La, Ro, Histone, U1-RNP und Antiphospholipide sollten untersucht werden, da sie mit Symptomkomplexen wie z.b. erhöhter Thromboemboliegefahr bei einem Antiphospholipid-Antikörpersyndrom einhergehen, woraus sich therapeutische Konsequenzen ableiten. Die Bestimmung 33

34 der Komplementfaktoren C3 und C4 sowie deren Spaltprodukten wird ebenfalls empfohlen. Außerdem sollte laut der deutschen Gesellschaft für Rheumatologie am Anfang eines neu diagnostizierten Lupus eine EKG, Echokardiographie, Röntgen- Thorax und eine Lungenfunktionsanalyse inkl. Diffusionskapazität durchgeführt werden. Auch nach der Erstdiagnose hat die Labordiagnostik bei SLE-Patienten eine große Bedeutung. Neben den Beschwerden des Patienten ist sie wichtig, um die aktuelle Krankheitsaktivität zu ermitteln und so über weitere therapeutische Maßnahmen zu entscheiden. Dabei korrelieren Klinik und Entzündungsparameter häufig nicht; teilweise kann ein Schub laborchemisch vorausgesagt werden, oder aber eine Infektion als Ursache einer akuten Zustandsverschlechterung identifiziert werden. Zu diesem Zweck ist besonders die Bestimmung des CRP maßgeblich: es korreliert praktisch nicht mit der Krankheitsaktivität des SLE, steigt jedoch besonders bei bakteriellen Infektionen an. Die Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) hingegen korreliert meist sehr gut mit der Krankheitsaktivität von Autoimmunerkrankungen. Speziell bei SLE-Patienten kann man außerdem den dsdna-ak-titer bestimmen; nach den EULAR Empfehlungen für das SLE-Monitoring kann ein Anstieg des Titers Hinweis auf einen bevorstehenden Schub sein. Schließlich spielt die Bestimmung von einigen Komplementfaktoren und deren Spaltprodukten noch eine wesentliche Rolle bei der Verlaufskontrolle von SLE-Patienten. Doch die Interpretation der bestimmten Werte stellt die Ärzte oft vor große Herausforderungen (siehe Kapitel 1.3). Ein weiteres Instrument zur Beurteilung der Krankheitsaktivität stellt der Aktivitätsscore dar. Durch Vergabe von Punkten für klinischen Symptome oder auffällige Befunde ist es möglich, diese standardisiert zu quantifizieren und zu gewichten. Für den SLE stehen folgende Aktivitätsscores zur Verfügung: ECLAM ( European Consensus Lupus Activity Measurement ) und SLICC ( Systemic Lupus International Collaborating Clinics ), die später im Kapitel Material und Methoden genauer beschrieben werden; SLEDAI ( SLE disease activity score ), ein Score der 24 Parameter, 9 Organsysteme und Gewichtungsfaktoren enthält; SLAM ( Systemic Lupus activity measure ), ein Punktsystem mit maximal 82 Punkten, das 24 klinische Parameter, 8 Laborparameter und 3 Schweregrade erfasst; SELENA ( Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus National Assessment ), der zur Abschätzung eines Schubes mit erhöhter Krankheitsaktivität entwickelt wurde und schließlich der 34

35 britische BILAG ( British Isles Lupus assessment group ) zur Beurteilung der Aktivität u.a. nach therapeutischer Interventionsnotwendigkeit, mit 86 klinischen und Laborparametern für 8 Organsysteme und einer Skala mit 4 Kategorien. 1.3 SLE und Komplementsystem Wie im vorherigen Kapitel bereits angesprochen spielt die Bestimmung von Komplementfaktoren eine wichtige Rolle bei der Beurteilung der Krankheitsaktivität bei Verlaufskontrollen von SLE-Patienten. Doch auch bei pathogenetischen Überlegungen zum SLE sollte man das Komplementsystem nicht außer Acht lassen Die Rolle des Komplementsystems bei der Pathogenese des SLE Die Komplexität sowohl des Komplementsystems als auch der Pathogenese des SLE lassen schon erahnen, dass auch deren Zusammenhang nicht ganz einfach zu erschließen ist. Sicher ist, dass ein Mangel von frühen Komponenten des klassischen Komplementweges oder aber das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen Komplementfaktoren (z.b. gegen C1q, C3, CR1, C3 nephritic factor, C4b2a oder C1INH) mit Autoimmunerkrankung assoziiert ist (Zipfel, 2009). Die stärksten Auswirkungen wurden bei C1q-Mangel beobachtet: Über 90% der Betroffenen entwickeln eine rheumatische Erkrankung (Zipfel, 2009). Beim SLE zeigt der Mangel bestimmter Komponenten, insbesondere von C1q, eine starke Assoziation mit der Beteiligung der Niere (Walport, 2001). Die Präsenz von Auto-AK gegen C1q korreliert bei SLE-Patienten klar mit der Entwicklung einer Glomerulonephritis, sowie mit Hypokomplementämie und dem Titer der dsdna-ak (Siegert, Daha, Westedt, van der Voort & Breedvelt, 1991). Im oben zitierten Review der Zeitschrift Immunology von 2009 beschreiben Zipfel und Skerka außerdem, dass ein homozygoter Defekt in den Genen für C1q, C1r, C1s, C2, C3 und C4 für die Entstehung von SLE prädisponiere; Sjöberg, Trow und Blom betonen in ihrem Artikel Complement activation and inhibition: a delicate balance von 2009 jedoch, SLE sei bei Menschen mit C2- Mangel selten, C3-Mangel und SLE ständen in keinerlei Verbindung. Mok und Lau (2003) berichten von Ergebnissen, nach denen die HLA Klasse III Gene, insbesondere jene, die für C2 und C4 kodieren, bei bestimmten ethnischen Gruppen einen zentralen Punkt bei der Pathogenese des SLE darstellen. So sollen Patienten mit homozygoten C4A-Null-Allelen ungeachtet ihrer ethnischen Herkunft höchst gefährdet sein, an SLE zu erkranken. Auch bei einem Mangel an C1q, s und r sowie 35

36 C2 soll dies zutreffen. Mok und Lau berufen sich hierbei auf eine Arbeit von Atkinson mit dem Titel Complement activation and complement receptors in systemic lupus erythematosus (1986). Des Weiteren soll schadhaftes oder fehlendes C5, C8 oder MBL laut Zipfel uns Skerka (2009) mit Lupus oder Lupus-ähnlichen Syndromen in Verbindung stehen. Ungeachtet den verschiedenen Meinungen über die betroffenen Komplementkomponenten sind sich alle Autoren aber einig, dass die jeweilig aufgeführten Defekte dazu führen, dass die Beseitigung von C3d-opsoniertem Zellschrott bzw. apoptotische Zellen nicht ordnungsgemäß ablaufen kann. Die Folgen sind Nekrose, Entzündung und Akkumulation von potentiellen Autoantigenen, die bei Überlastung der Reinigungskapazität des Immunsystems die Entstehung von Autoimmunerkrankungen begünstigen bzw. verursachen können. Etwaige Mechanismen, die bei einer solchen Überlastung mit apoptotischem Material zur Autoimmunität führen können, werden in Abb. 6 gezeigt. Die beschriebenen Defekte und Mangelerscheinungen, durch die der normale Ablauf des Komplementsystems gestört ist, tragen also erheblich zur Pathogenese des SLE bei. Ein funktionierendes Komplementsystem ist so gesehen ein protektiver Faktor; Mängel bedingen pathologische Zustände. Doch stellt dies nicht einen Widerspruch zur allgemein anerkannten Tatsache dar, dass die Aktivierung des Komplementsystems bei zahlreichen oben beschriebenen Erkrankungen maßgeblich zur Entstehung von Gewebsschäden beiträgt? Walport schreibt im zweiten Teil seines Reviews über das Komplementsystem, es sei allgemein akzeptiert, dass die Aktivierung des Komplementsystems durch Immunkomplexe ein wichtiger Mitverursacher von Gewebeverletzungen bei Patienten mit SLE sei (Walport, 2001). Entstehende Immunkomplexe aktivieren das Komplementsystem über den klassischen Weg (Bevers, Zweel & Willems, 2004; Ramos-Casals et al., 2004). Falls die Immunkomplexe aus irgendeinem Grund nicht eliminiert werden können, wird das Komplementsystem chronisch aktiviert und kann Entzündungen anstacheln (Walport, 2001). Es kommt zur Einlagerung der Komplement-aktivierenden Immunkomplexe in Glomeruli und kleinen Gefäßen und damit zur akuten Entzündungsreaktion sowie zum Angriff körpereigenen Gewebes durch Autoantikörper (Nielsen & Graham, 2002). 36

37 Dissertation von Lena Oelmann Abbildung 6 (aus Walport, 2001): Die Waste-Disposal-Hypothese bei SLE Bild A zeigt einen Makrophagen, der eine apoptotische Zelle verschlingt. Eine Reihe von Liganden auf der abgestorbenen Zelle sowie Rezeptoren auf dem Makrophagen machen diesen Vorgang so extrem effizient. Die Bindung von C1q, CRP und IgM begünstigen die Aktivierung des Komplementsystems, was zur Beseitigung der Zelle durch Bindung an Komplementrezeptoren führt. Die Bindung von Serum Amyloid P maskiert Autoantigene auf der Zelloberfläche und sorgt für eine sichere Entsorgung. Hat der Makrophage die Zelle einmal verschlungen, sondert er antiinflammatorische Zytokine, den transforming growth factor β (TGF-β) ab. Besteht ein Übermaß an apoptotischen Zellen sowie ein Ausfall einer oder mehrerer der normalen Rezeptor-Ligand-Systeme, die für die Aufnahme der Zelle zuständig sind, können wie in Bild B dargestellt unreife dendritische Zellen die apoptotische Zelle aufnehmen. Passiert dies in Anwesenheit von inflammatorischen Zytokinen wie dem granulocytemakrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), dem Tumor Nekrose Faktor α (TNFα) oder IL-1, kann die dendritische Zelle zu einer antigenpräsentierenden Zelle heran reifen und Autoantigene an TZellen präsentieren. Teil C der Abbildung zeigt eine autoreaktive B-Zelle, die über ihre AK-Rez. Autoantigene apoptotischer Zellen aufgenommen hat. Dabei erlangt sie Hilfe von einer aktivierten TZelle, die co-stimulierende Moleküle und Zytokine exprimiert, die zur Reifung der B-Zelle beiträgt (BLyS = B-Lymphozyten Stimulator). Die B-Zelle verwandelt sich in eine AK-sezernierende Plasmazelle. Ein Großteil der SLE-Patienten entwickelt die Krankheit wahrscheinlich nur, wenn in einem der gezeigten Schritte Unregelmäßigkeiten vorhanden sind. 37

38 Der Mechanismus der schädlichen Wirkung der Komplementfaktoren wurde u.a. von N.R. Rose und seinen Kollegen erforscht, die nachgewiesen haben, dass die durch eine Beimpfung mit Viren oder Herz-Myosin hervorgerufene Autoimmunmyositis bei Mäusen mit C3-Depletion aufgehoben bzw. durch eine Blockade von CD21 (entspricht CR2) und CD35 (entspricht CR1) deutlich reduziert wird (Kaya et al., 2001). Wie im Kapitel Komplementrezeptoren angedeutet erfüllen CR1 und CR2 regulatorische Funktionen bei der Modulation der B-Zellfunktion; das dort erwähnte Mausexperiment hatte erwiesen, dass Mäuse ohne CR1 und CR2 keine Antikörperproduktion über längere Zeit aufrecht erhalten können (Nielsen & Graham, 2002). Folgende Beobachtungen ergänzen das Bild des Zusammenhangs zwischen B-Zellen und Komplementsystem: Trifft eine B-Zelle in Anwesenheit von Komplementfaktoren auf ein Antigen, ist die Schwelle zur Aktivierung der B-Zelle erniedrigt (Walport, 2001). Dempsey und Kollegen beschrieben 1996 bereits, dass bis zu mal weniger Antigen zur Aktivierung einer B-Zelle nötig ist, damit diese eine definierte Menge AK produziert, wenn das Antigen an C3dg-Moleküle gekoppelt ist (C3dg ist das größte Fragment des kovalent gebundenen Faktors C3, der Ligand für den Komplementrezeptor CR2 ist) (Dempsey, Allison, Akkaraju, Goodnow & Fearon, 1996). Dies ließ schon die Idee aufkommen man könne Komplementfaktoren als Adjuvantien einsetzen (Walport, 2001). Zusammenfassend kann man sagen, dass es außer Frage steht, dass Komplementaktivierung bei verschiedenen Erkrankungen inkl. SLE einen schädlichen Faktor darstellt; ebenso ist andererseits unangefochten, dass Komplementmangel zur Pathogenese des SLE beiträgt, d.h. ein intaktes Komplementsystem kann auch eine protektiven Rolle bzgl. Autoimmunerkrankungen einnehmen. Sheerin, Springall, Abe und Sacks schreiben hierzu in einer Arbeit von 2001: Es ist möglich, dass Komplementaktivierung eine schädliche und protektive Rolle spielt, zeitgleich oder in verschiedenen Phasen der Entwicklung einer Krankheit. Beim SLE zum Beispiel vermittelt Komplementaktivierung entzündliche Schäden, obwohl Komplementdefizienz für die Erkrankung prädisponiert.. Die zitierte Arbeitsgruppe hat ein interessantes Experiment zur Erforschung dieser vermeintlichen Widersprüchlichkeit der Komplementaktivierung bei einigen Erkrankungen durchgeführt: Bei gesunden und bei C3-defizienten Mäusen wurde durch Injektion von gegen die glomeruläre Basalmembran gerichteten AK eine Glomerulonephritis induziert. Dann wurde der damit produzierte entzündliche Schaden anhand von Proteinurie, Urämie etc. zu verschiedenen Zeitpunkten 38

39 gemessen. Wie erwartet war der Schaden in der akuten Phase der Entzündung, die durch die Bindung der heterologen AK an der glomerulären Basalmembran initiiert wird, komplementabhängig, bei den C3-/- Mäusen also schwächer ausgeprägt. 14 Tage nach Krankheitsinduktion, in der sog. autologen Phase der eigene Immunantwort auf die fixierten AK jedoch zeigte sich eine signifikant höhere Proteinurie und Urämie bei den komplementdefizienten Mäusen. Außerdem konnte eine stärkere Akkumulation elektronendichter Ablagerungen nachgewiesen werden ein Hinweis darauf, dass die C3-/- Mäuse eine Schwäche bezüglich der Beseitigung von Immunkomplexen aufweisen (Sheerin et al., 2001). Ähnlich läuft es wahrscheinlich bei der Pathogenese des SLE ab: anfangs bereitet das defiziente Komplementsystem Probleme, da die Beseitigung von Zellschrott die Entstehung von Autoantikörpern begünstigt. Die im Verlauf entstehenden Immunkomplexe aktivieren das Komplementsystem, sofern die Kaskade trotz bestehenden Defekten noch funktioniert, richtet auch dieser intakte Teil des Komplementsystems Schäden an: Die Entzündung wird weiter angestachelt und kann überschießend sein. Dass die aktivierenden Immunkomplexe durch Komplementdefekte weniger effektiv beseitigt werden können ist ebenfalls unvorteilhaft. Soweit ist also verständlich, dass Komplement sowohl schädliche als auch protektive Aufgaben erfüllen kann. Doch vollständig aufgeklärt ist die komplexe Rolle des Komplementsystems bei SLE trotz allem noch nicht; zum Beispiel bestehen noch Unklarheiten bezüglich des Einflusses auf B-Zellen. Wie oben erwähnt führt die Blockade von CR1 und CR2 in einigen Experimenten zu einem geringeren Schaden, Komplementaktivierung ist dabei also ein schädlicher Faktor. Andererseits verbessert das angeborene Immunsystem inkl. Komplement u.a. die negative Selektion von autoreaktiven B-Zellen (Nielsen & Graham, 2002). Eine Störung der Komplement-vermittelten Modulation der B-Zell- Aktivität kann also auch auf diesem Wege zur Pathogenese des SLE beitragen. Tatsächlich ist die Zahl der Komplementrezeptoren CR1 und CR2 auf B-Zellen von SLE-Patienten erniedrigt (Marquart et al., 1995). Letztendlich bleibt nur zu sagen, dass die Rolle des Komplementsystem bei SLE äußerst komplex und vom Krankheitsstadium abhängig ist; Komplement kann, wie Walport schreibt, Freund oder Feind sein (Walport, 2001). Dies ist sowohl bei der Diagnostik als auch bei möglichen Therapie-Ansätzen im Bereich von Komplementfaktoren zu berücksichtigen. 39

40 1.3.2 Die Bedeutung der Komplementdiagnostik bei SLE Die klinischen Indikationen für Komplementanalysen können in zwei Hauptkategorien geteilt werden: Autoimmunkomplex-Erkrankungen und Komplement-Mangel- Erkrankungen (Mollnes et al., 2007). Es wurde beobachtet, dass Komplementumsatz mit fallenden Serumkonzentrationen bei SLE-Patienten häufig die Krankheitsaktivität widerspiegelt (Manson & Isenberg, 2003); erhöhter Komplementumsatz kann somit auf einen neuen Krankheitsschub hindeuten (Mollnes et al., 2007). Auch Mok und Lau (2003) erwähnen in ihrer Arbeit Pathogenesis of SLE die häufige Assoziation von Hypokomplementämie und Zeichen von Vaskulitis bei aktivem SLE. Besonders sinnvoll seien die Komplementanalysen vor allem bei renaler Beteiligung (Ekdahl et al., 2007). Natürlich ist die Bestimmung verschiedener Komplementfaktoren auch zu Beginn der Krankheitsgeschichte bzw. bei differentialdiagnostischen Überlegungen äußerst sinnvoll: Mollnes et al. (2007) schreiben in ihrem Review Complement Analysis in the 21th Century, um den Komplementstatus eines erstmalig hospitalisierten Patientens zu bestimmen, sei eine sorgfältige und gründliche Untersuchung nötig. Funktionelle Assays (ELISA-basiert oder aber hämolytische Tests wie CH50) kombiniert mit Messungen der Konzentration von C1q, C3, C4, sowie einer oder mehrerer Produkte der Komplementaktivierung, z.b. C3dg oder SC5b-9, seien empfohlen (Mollnes et al., 2007). Bei schwer erkrankten Patienten z.b. mit Lupusnephritis werden häufig AK gegen C1q gefunden, die prognostischen Wert haben können (Coremans et al., 1995). Doch auch bei seit Jahren bekanntem SLE hat die Komplementdiagnostik noch ihre Berechtigung: Die regelmäßig Bestimmung der Krankheitsaktivität ist bei SLE-Patienten unerlässlich, da im aktiven Stadium meist Immunsuppression nötig ist, während im inaktiven Stadium die Therapie reduziert oder ganz gestoppt werden sollte (Nagy et al., 2000). Es wurden viele Versuche unternommen, sensitive und spezifische Labormarker zu finden, um die Krankheitsaktivität darzustellen (Nagy et al., 2000). Kirschfink und Mollnes et al. empfehlen beim Langzeitmonitoring entweder einen funktionellen Test oder die Bestimmung von C1q, C4 und C3dg, sowie den C3-Serumspiegel um den C3dg/C3- Quotienten zu bestimmen (Mollnes et al., 2007; Nürnberger & Bhakdi, 1984). Die gleichzeitige Identifizierung von Cryoglobulinen sei dabei jedoch ggf. zur korrekten Interpretation der Werte notwendig; siehe dazu und zu weiteren Problemen der Komplementanalysen Kapitel Nagy et al. (2000) schreiben in ihrer Arbeit mit dem Titel Usefulness of detection of complement activation products in evaluating 40

41 SLE activity C3, C4 und CH50 seien Routinetests bei SLE, deren Sensitivität und Spezifität jedoch niedrig sei. Mögliche Gründe hierfür werden ebenfalls im nächsten Kapitel erläutert. Schließlich sei an dieser Stelle noch eine Arbeit von H.H. Peter und Kollegen erwähnt, die die Überlegenheit von C3d bzw. des Quotients C3d/C3 gegenüber C3, C4 und CH50 bezüglich der Krankheitsaktivitätsbestimmung bei SLE- Patienten in einer Studie mit 79 Patienten nachgewiesen haben (Röther, Lang, Coldewey, Hartung & Peter, 1993). Für sie sei C3d damit der beste serologische Marker für die Krankheitsaktivität. Die Überlegenheit sei darin begründet, dass C3d ein Komplement-Spalt-Produkt sei, das damit den Komplementumsatz am besten widerspiegele; niedrige C4-Spiegel beispielsweise könnten auch auf Grund eines genetischen Defektes, der zu einer geringeren Synthese führt, vermindert sein. Der Vorteil gegenüber der Messung von C3dg sei die bessere Stabilität (Charlesworth et al., 1974). Die erwähnten sowie zahlreiche andere Forschungsergebnisse haben dazu geführt, dass an der Uniklinik Freiburg und vermutlich auch an vielen anderen Kliniken Deutschlands und weltweit die Komplementprodukte C3, C4, C3d und der CH50-Test zur Beurteilung der aktuellen Krankheitsaktivität bei der Verlaufsuntersuchung von SLE-Patienten bestimmt werden. Das nächste Kapitel soll nun Aufschluss darüber geben, warum viele Kliniker mit den genannten klassischen Tests unzufrieden sind und die Suche nach den besten Komplementtests zur Bestimmung der Krankheitsaktivität beim SLE deshalb noch nicht beendet ist Die Problematik der klassischen Komplementtests bei SLE Kao et al. nennen in ihrer Arbeit aus dem Jahr 2010 drei Schwächen der C3- oder C4-Bestimmung, die trotz bekannter Unzuverlässigkeit seit Jahren Goldstandard beim Monitoring von SLE-Patienten sei: Erstens würden die Serumspiegel von C3 und C4 schon bei gesunden Menschen erheblich schwanken; diese Beobachtung decke sich mit Beobachtungen bei SLE-Patienten. Zweitens seien C3 und C4 eigentlich eher Vorläufer als End- bzw. Spaltprodukte der Komplementaktivierung, und drittens sei ein niedriger C4-Spiegel häufig auf hereditären Komplementmangel anstatt auf Komplementverbrauch zurückzuführen. Eine verminderte Synthese von Komplementfaktoren kann somit einen erhöhten Komplementumsatz vortäuschen (Nagy et al., 2000). Sensitivität und Spezifität von C3 und C4 sowie ebenfalls von CH50 könnten laut Nagy et al. (2000) auch niedrig sein, da sich der Plasmaspiegel der drei Parameter durch mögliche gesteigerte Produktion von Komplementfaktoren 41

42 trotz stattgefundener Komplementaktivierung bzw. erhöhtem Umsatz im Normalbereich befinden kann. Die Bestimmung von CH50 ist ein funktioneller Test und bietet damit durchaus Vorteile gegenüber der alleinigen Bestimmung von Einzelkomponenten: Diese können sich quantitativ im Normbereich befinden, jedoch funktionell inaktiv sein; letzteres würde sich nur in einem funktionellen Assay zeigen (Kirschfink & Mollnes, 2003). Die Funktionsweise des CH50-Tests wird im Teil Material und Methoden beschrieben. Die Durchführung eines funktionellen Tests der Komplementkaskade ist bei SLE sicher sinnvoll und wird deshalb auch von einigen Autoren weiterhin empfohlen (Mollnes et al., 2007; Ekdahl et al., 2007). Man sollte sich jedoch auch hier über die begrenzte Aussagekraft bewusst sein, da hämolytischen Tests viele Störfaktoren unterliegen können: Die Seren sind empfindlich bezüglich der in vitro Komplementaktivierung; falls das Serum Hitzeinaktiviert ist, lange bei Raumtemperatur gelagert wurde oder Komplementaktivierende Agentien wie z.b. Immunkomplexe oder Kälteagglutinine enthält, kann die hämolytische Aktivität reduziert sein oder ganz ausbleiben (Kirschfink & Mollnes, 2003). Deshalb sollten die Serumproben bei Messung unter 4h alt sein oder bis zur Testung bei -70 C gelagert werden (Kirschfink & Mollnes, 2003). Die Bestimmung von CH50 ist außerdem von der Verfügbarkeit von AK-sensibilisierten Schafs- Erythrozyten abhängig und weist Schwächen bezüglich Handhabung, Arbeitsaufwand, Logistik und Reproduzierbarkeit auf (Kirschfink & Mollnes, 2003). Berücksichtigt man zusätzlich, dass eine diagnostizierte reduzierte oder nicht vorhandene hämolytische Aktivität weitere Komplementdiagnostik nach sich zieht (Kirschfink & Mollnes, 2003), ist klar, dass auch dieser Test keine ausreichenden Werte zur Verlaufsdiagnostik von SLE-Patienten bieten kann. Auch die Bestimmung von C3d ist nicht ganz unproblematisch: Die einzige Methode für dessen Quantifizierung, die double-decker rocket immunoelectrophoretic assays, sind arbeitsaufwendig und teuer (Lund, Sørensen & Brandslund, 1990). Deshalb arbeiteten die zitierten dänischen Autoren 1990 auch an der Entwicklung einer ELISA-basierten Bestimmung von C3d; die damals getesteten Antikörper zeigten sich leider als zu unspezifisch: Sie wiesen eine Kreuzreaktivität zu C3 und/oder C3b und C3bi auf (Lund et al., 1990). Auch bei der vorliegenden Arbeit konnte der eingeplante ELISA für C3d nicht berücksichtigt werden, da er bereits in der Vortest-Phase vermutlich ebenfalls bedingt durch Kreuzreaktivität Mängel bezüglich der Linearität zeigte. 42

43 Die seit vielen Jahren bestehende, offensichtliche Notwendigkeit, eine reliable, valide und einfach durchzuführende Testmethode für Komplementspaltprodukte als sinnvollen Aktivitätsparameter bei Immunkomplexerkrankungen zu finden, hat zur Entwicklung einiger alternativer ELISAs geführt. Vier dieser ELISAs, gerichtet gegen die Komplementprodukte Bb, ic3b, SC5b-9, sowie ein alternativer CH50-Test wurden im Rahmen dieser Arbeit getestet und mit den klassischen Komplementtests C3, C4, CH50 und C3d verglichen. Ziel der Studie ist, der Antwort auf die Frage, ob diese alternativen den gängigen Komplementtests überlegen sind und sie damit ersetzen könnten, einen Schritt näher zu kommen. (Gesamtes Kapitel: Nach Murphy K. et al. 2007, sofern nicht anders bezeichnet) 43

44 44

45 2. Material und Methoden 2.1 Material Patienten- und Kontrollseren Es wurden die Seren von 51 Patienten mit bekanntem SLE sowie von 29 gesunden Spendern (HD healthy donors ) verwendet. Einschlusskriterien für die Patienten war lediglich die klare, nach den ACR-Kriterien gestellte Diagnose SLE (Patienten mit rein kutanem Lupus oder Mischkollagenosen wurden nicht berücksichtigt), die Einwilligung zur Teilnahme an der Studie und die Bereitschaft, Informationen für die erforderlichen Aktivitätsscores SLICC und ECLAM zur Verfügung zu stellen. Die Patienten wurden zur Errechnung der Scores nach Aufklärung und Einwilligung in die Rheumadatenbank der Uniklinik Freiburg aufgenommen (Informationsblatt inkl. Einverständniserklärung siehe Anhang). Die Ausschlusskriterien waren akute Infektionen und Schwangerschaft. Zum Zeitpunkt der Probengewinnung waren die Patienten zwischen 20 und 76 Jahren alt (mittleres Alter 48,18 Jahre); 6 von ihnen waren männlich (entspricht 11,8%), 45 weiblich (88,2%). Die 29 normalen Humanseren stammen von Labor- und Klinikpersonal als auch von Kommilitonen, Freunden und Verwandten. Die Personen mussten folgende Bedingungen erfüllen: keine rheumatische Grunderkrankung keine chronische Erkrankung keine Schwangerschaft keine akute Infektion oder Erkältung aktuell oder innerhalb der letzten 2 Wochen keine regelmäßige Medikamenteneinnahme (außer Kontrazeptiva) Unter den Spendern befanden sich Personen im Alter von 19 bis 68 Jahren (mittleres Alter 45,7 Jahre); 5 (17,2%) Männer, 24 (82,8%) Frauen. Bei der Auswahl der gesunden Spender wurde darauf geachtet, dass diese bezüglich der Verteilung von Alter und Geschlecht eine gute Vergleichsgruppe zum Kollektiv der SLE-Patienten bilden (nachweisende Statistik: Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Geschlecht: p = 0,688, Wilcoxon-Mann-Whitney-Test Alter: p = 0,095) 45

46 2.1.2 Geräte ELISA Photometer Multiscan EX mit Ascent Software Version 2.6. Den Standardkurven, die für Auswertung der Bb-, ic3b- und SC5b-9-Tests benutzt wurden, lag eine sigmoide Logistik zugrunde; bei der Standardkurve des CH50EQ- Tests handelte es sich um eine kubisch polynomische Logistik. Pipetten: variable Hubpipetten, achtkanalige Mehrkanalpipette Substanzen Alle verwendeten Substanzen wurden den Test-Kits für die jeweiligen ELISA entnommen. Eine Auflistung der Substanzen findet sich in der Beschreibung der Kits (siehe Anhang) Statistik Für die statistische Auswertung wurde das Statistik-Programm SigmaStat for Windows Version 3.10 verwendet. 2.2 Methoden Probengewinnung und lagerung Der Großteil der Patientenseren (PS) wurde im Rahmen von Kontrollterminen der Patienten in der Rheuma-Ambulanz bzw. Studien-Ambulanz der Universitätsklinik Freiburg entnommen. Bei einigen Patienten erfolgte die Blutentnahme während eines stationären Aufenthalts im Universitätsklinikum Freiburg (Station Ehrlich). Für die geplanten ELISA-Tests wurde jeweils ein 5 ml EDTA-Röhrchen sowie ein Serum- Röhrchen venöses Blut abgenommen. Es wurde in den ersten 4 Stunden nach Entnahme bei 4000 Umdrehungen pro Minute für 5 Minuten zentrifugiert. Serum bzw. Plasma wurden abpipettiert und in mehreren Portionen (zur Verwendung in verschiedenen Tests) bei 80 C tiefgefroren. Mit dem in der Uniklinik Freiburg entnommenen venösen Blut der gesunden Spender wurde entsprechend verfahren. Die Gefrierdauer der Proben bis zur Testung lag zwischen einer Woche und einem Jahr. Sie wurden unmittelbar vor Beginn des jeweiligen ELISA bei Raumtemperatur aufgetaut. 46

47 2.2.2 ELISA ic3b, Bb Plus, SC5b-9 Der Nachweis der drei Spaltprodukte der Komplementkaskade ic3b, Bb und SC5b-9 erfolgte mittels enzymgekoppelter Immunadsorptionstests, englisch enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Bei dieser heute vielfach verwendeten Methode können biologisch aktive Substanzen durch eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden. Die Bestimmung erfolgte mit gebrauchsfertigen Kits, die uns freundlicherweise von der Firma Quidel zur Verfügung gestellt wurden; die Original- Arbeitsanleitungen mit detaillierten Angaben zur Durchführung befinden sich im Anhang. An dieser Stelle soll lediglich das Funktionsprinzip kurz erläutert werden (siehe auch Abb. 7): Eine unmarkierte Komponente in unserem Fall ein Antikörper (AK), prinzipiell kann es aber auch ein Antigen sein wird an einen festen Träger gebunden, z.b. in den Wells einer Mikrotiterplatte. Im ersten Schritt werden die Proben, die das nachzuweisende Antigen bzw. die nachzuweisenden AK enthalten, hinzugegeben. Die in langjähriger Arbeit entwickelten AK (bei den hier vorgestellten Tests die feste Komponente) erkennen nun Epitope der Antigene (z.b. den C9-Ring beim SC5b-9-ELISA) und binden an diese. Durch Waschen mit Pufferlösung werden ungebundene Komponenten daraufhin entfernt. Als nächstes bindet ein weiterer AK, der an ein Enzym (meist Meerrettichperoxidase, horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt ist, an die im vorherigen Schritt gebundene Komponente (in diesem Falle ic3b, SC5b-9 oder Bb). Die HRP kann nun die Umwandlung eines farblosen Substrates in ein farbiges Produkt katalysieren; dieser Farbumschlag ist für das bloße Auge sichtbar und wird nach Zugabe der Stopp-Lösung im ELISA-Reader photometrisch quantifiziert. Durch Auswertung der parallel durchgeführten Messungen der im Kit enthaltenen Standards (vorbekannte Antigenkonzentrationen) wird eine Kalibrierungskurve für das gemessene Signal (optische Extinktion) erstellt, mit deren Hilfe das Gerät die Werte für die jeweilige zu messende Komponente (im vorgestellten Fall Komplementproteine) in den Proben errechnet. 47

48 Abbildung 7: Komplement-ELISA Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte der ELISA für ic3b, SC5b-9 und Bb; Zwischenschritte wie das Auswaschen von nicht gebundenem Konjugat, Zugeben der Stopp-Lösung etc. sind nicht dargestellt. A Mikroassay-Platte, beschichtet mit monoklonalen Maus-Antikörpern, die, je nach Testkit, Spezifität für ic3b, SC5b-9 oder Bb aufweisen. B Nach Zugabe der Standardlösungen, Kontrollen und Proben binden die Zielmoleküle ic3b, SC5b-9 oder Bb an die AK. C Die zugefügten, an Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase ) gekoppelten Detektions- AK binden ebenfalls an das Antigen. D Wird nun das passende (farblose) Substrat zugegeben, bildet sich mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion ein farbiges Produkt, das zum Farbumschlag der gesamten Flüssigkeit in den Mikrowells führt. Nun kann mittels Photometer die Extinktion bestimmt werden, was Rückschlüsse auf die Menge der in den Standardlösungen, Kontrollen und Proben befindlichen zu detektierenden Komplementspaltprodukte zulässt ELISA CH50 EQ Der CH50 EQ ELISA basiert ebenfalls auf dem Nachweis des terminalen Komplementkomplexes (TCC, SC5b-9), erfasst aber neben in vivo präformiertem SC5b-9 vor allem durch in vitro Komplementaktivierung gebildete TCC. Die vor dem eigentlichen ELISA erforderliche Aktivierung der Seren erfolgt durch Immunkomplexe als Aktivatoren, bestehend aus humanen Gammaglobulinen und murinen monoklonalen AK. Diese induzieren den Start der klassischen Komplementkaskade und die Bildung der TCC. Nach der einstündigen Inkubationszeit mit dem Aktivator verfährt man wieder nach dem oben beschriebenen Prinzip des ELISA. 48

49 Nachgewiesen wird die Menge der gebildeten TCC in den verschiedenen Proben. Die mit Hilfe einer Standardkurve ermittelten CH50 Eq-Werte sind proportional zu den im klassischen CH50-Hämolysetest gewonnenen Werten. Die Bestimmung des CH50 EQ-Werte wurde ebenfalls mit einem gebrauchsfertigen Kit der Firma Quidel durchgeführt. Die Arbeitsanleitung befindet sich im Anhang Statistische Auswertung Um die erlangten Daten auszuwerten stehen verschiedene statistische Tests zur Verfügung. In dieser Arbeit wurden der Wilcoxon-Rangsummentest (auch Wilcoxon- Mann-Whitney-Test genannt) und der Korrelationstest nach Spearman angewandt. Der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test kann bei nicht normalverteilten Differenzen und auch bei Rangdaten eingesetzt werden. Er dient zur Überprüfung der Signifikanz der Übereinstimmung zweier Verteilungen; man prüft, ob zwei unabhängige Verteilungen A und B zu derselben Grundgesamtheit gehören. Man geht hierbei von der Nullhypothese (hier: kein Unterschied zwischen verglichenen Werten) und einer Alternativhypothese (hier: Unterschied zwischen verglichenen Werten) aus und errechnet die Irrtumswahrscheinlichkeit in Höhe eines bestimmten Signifikanzniveaus, das hier wie in den meisten Fällen α = 0,05 = 5% beträgt. Der errechnete p-wert gibt folglich die Wahrscheinlichkeit an, die vorliegende Beobachtung zu machen, unter der Voraussetzung, dass die Nullhypothese gilt. Ist der p-wert kleiner als das vorgegebene Signifikanzniveau α = 0,05, so liegt ein signifikantes Testresultat vor und die Testentscheidung fällt für die Alternativhypothese aus (mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von max. 5%). In unserem beschrieben Fall konnte also mit dem Wilcoxon-Test errechnet werden, ob es zwischen den Ergebnissen der einzelnen Tests der SLE-Patienten verglichen mit denen der gesunden Spender einen signifikanten Unterschied gab; bei einem p-wert unter 0,05 wurde dies angenommen. Der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman (r s ) ist ein Maß für die Stärke eines Zusammenhangs zwischen zwei mindestens ordinal skalierten, voneinander unabhängigen Größen. Anders als Pearsons Korrelationskoeffizient benötigt er nicht die Annahme, dass die Beziehung zwischen den Variablen linear ist. Ist der Korrelationskoeffizient r s > 0, so liegt ein positiver Zusammenhang vor, ist r s < 0 so besteht ein negativer Zusammenhang; kein Zusammenhang liegt vor, wenn r s = 0 ist. Der Korrelationskoeffizient nimmt Werte zwischen +1 und -1 an; je dichter r s bei 0 49

50 liegt, desto schwächer ist der Zusammenhang, je näher er bei -1 oder +1 liegt, desto stärker ist der Zusammenhang. Einheitliche Richtlinien zur Bewertung der Korrelationskoeffizienten gibt es in der Literatur nicht. In dieser Arbeit wurde r s > 0,5 als relevanter positiver, r s < -0,5 als relevanter negativer Zusammenhang gewertet; zusätzlich musste der Zusammenhang statistisch signifikant, d.h. der p-wert < 0,05 sein Aktivitätsscores ECLAM und SLICC Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität bedienen sich viele Ärzte diverser SLE- Aktivitätsscores (siehe auch Kapitel 1.2.4). In der vorliegenden Arbeit wurden zwei dieser Scores bei allen Patienten zu folgendem Zweck bestimmt: Sie sollten möglichst objektiv die Krankheitsaktivität abschätzen, um diese dann mit den Ergebnissen der neuen und alten Komplementtests vergleichen zu können. Der ECLAM ( European Consensus Lupus Activity Measurement ) wurde durch eine Konsensfindung der European Consensus Study Group 1992 als Maßstab für die Krankheitsaktivität beim SLE erstellt. Beteiligt waren 29 Zentren aus 14 verschiedenen Nationen, und es wurden 704 Patientenfälle in die Analyse miteinbezogen (Vitali et al., 1992). Im Anhang ist der gesamte Score zu finden. Er bezieht verschiedene Organsysteme mit ein und beinhaltet sowohl klinische Elemente als auch Laborwerte; diese beziehen sich immer auf die Gegenwart bzw. jüngste Vergangenheit. Im Gegensatz dazu gehen beim SLICC ( Systemic Lupus International Collaborating Clinics ) -Score (siehe Anhang) auch schon länger zurückliegende Befunde mit ein, die auf den SLE zurückzuführen sind, sowie Befunde, die während eines Schubs aufgetreten sind (auch wenn sie aktuell keine Beschwerden bereiten). Es ist somit ein Maß des Schadens, den die Krankheit seit Ausbrechen verursacht hat. 2.3 Bestimmung weiterer Laborparameter Alle in diesem Kapitel aufgeführten Laborparameter wurden im Rahmen der klinischen Routinediagnostik im immunologischen Labor der Universitätsklinik Freiburg durchgeführt. 50

51 2.3.1 C3 und C4 Die Bestimmung erfolgte nephelometrisch mit einem BN ProSpec System der Firma Siemens Health Care Diagnostics (Immunpräzipitationsreaktion mit Antiseren gegen C3 und C4) CH50 Die Funktion des klassischen Komplementweges kann in vitro durch die Bestimmung des gesamthämolytischen Komplements (CH50) getestet werden. Hier wird die Bestimmung nach der Mainzer Methode, modifiziert für Mikrotiterplatten, beschrieben. Schafserythrozyten werden mit Kaninchenantiserum ( Ambozeptor ) beladen und anschließend als Immunkomplexe mit Verdünnungsreihen von Patientenseren bei 37 C für 90 Min. in Gegenwart von Mg- und Ca-Ionen inkubiert. In Abhängigkeit vom Gehalt der verschiedenen Komplementfaktoren im Serum kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Lyse der Erythrozyten. Diese Hämolyse wird photometrisch erfasst (Hämoglobin im Überstand) und gegen die Serumverdünnung aufgetragen. Aus dem Kurvenverlauf wird mit Hilfe von Umrechnungsfaktoren der CH50-Wert für 50%ige Hämolyse berechnet. Das Ergebnis zeigt dabei auch die vorhandene Menge an TCC, da diese für die gemessene Hämolyseaktivität direkt verantwortlich sind. Die Verminderung eines oder mehrerer Komplementfaktoren im Serum führt zu einem verminderten CH50-Wert. Für weitere Informationen zur Durchführung des CH50-Tests darf auf die Standardarbeitsanleitung im Anhang verwiesen werden C3d Zur Durchführung des C3d-Tests siehe Standardarbeitsanleitung im Anhang. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die C3d-Werte auch gruppiert berechnet. Alle Werte <6 wurden Gruppe 1 zugeordnet, Werte zwischen 6 und <7,5 Gruppe 2, Werte zwischen 7,5 und <9 Gruppe 3 etc.. Grund hierfür ist die Messmethode des C3d: Werte unter 6 können nicht quantifiziert werden, da sie unter dem untersten Standardwert liegen, weshalb als Messergebnis lediglich <6 angegeben werden kann. All jene Werte sind als Wert 5 in die Berechnungen eingegangen. Da ein solches Vorgehen jedoch statistisch nicht korrekt ist, weil ein Teil der Werte gruppiert, der andere Teil in stetiger Form vorliegt, wurden alle relevanten Berechnungen zusätzlich mit dem gänzlich gruppierte C3d durchgeführt. 51

52 52

53 3. Ergebnisse 3.1 Übersicht der Ergebnisse Die Untersuchung von Komplementaktivität und Komplementumsatz ist relevant in Zusammenhang mit Immundefizienz und Autoimmunität (Mollnes et al., 2007; Mok & Lau, 2003). Etablierte Tests wie CH50 und C3d-Bestimmung sind kompliziert und benötigen viel Erfahrung bei der Durchführung. In der vorliegenden Arbeit sollte am Beispiel des SLE untersucht werden, ob moderne ELISA-basierte Tests eine brauchbare Alternative darstellen. Tabelle 5 zeigt die statistische Zusammenfassung der mit den Proben von SLE- Patienten und Normalpersonen ( healthy donors, HD) durchgeführten klassischen Komplementtests C3, C4, CH50 und C3d. Zusätzlich stellt Spalte 5 der Tabelle die deskriptive Statistik für den Quotienten aus C3d und C3 dar (Begründung siehe Kapitel 3.3.2). Weiterhin wurden die C3d-Werte im Rahmen dieser Arbeit auch gruppiert berechnet (Begründung siehe Kapitel 2.3.3). CH50 C3 C4 C3d (C3d C3d gru. [E/l] [g/l] [g/l] [mg/l] /C3)x10 3 Pat. Anzahl 51,00 51,00 51,00 51,00 51,00 51,00 Median 27,00 0,97 0,17 8,20 8,26 3,00 5.Perz. 14,00 0,64 0,07 5,00 4,40 1,00 95.Perz. 37,50 1,44 0,31 11,71 15,79 5,00 HD Anzahl 29,00 29,00 29,00 29,00 29,00 29,00 Median 31,00 1,04 0,22 5,00 4,86 1,00 5.Perz. 21,40 0,80 0,13 5,00 3,68 1,00 95.Perz. 48,60 1,41 0,28 7,40 8,62 2,60 Tabelle 5: Übersicht über die Ergebnisse der klassischen Komplementtests Aufgeführt sind für jeden Test die Median-Werte, 5. und 95. Perzentile sowie die Anzahl der in die Berechnung eingegangen Proben, oben für die Patienten, unten für die Normalpersonen (HD). Die Tabelle wurde durch das gruppierte C3d und den Quotient aus C3d zu C3 ergänzt. Tabelle 6 zeigt eine Auflistung derselben Übersichtsparameter (Median, Perzentile, Anzahl der in die Berechnung eingegangenen Proben). Für die Tests, die Komplementspaltprodukte messen (SC5b-9, Bb, ic3b), wurde zusätzlich der Quotient zu C3 berechnet. 53

54 SC5b-9 (SC5b-9 Bb (Bb/C3) ic3b (ic3b/c3) CH50 [ng/ml] /C3)x10 6 [µg/ml] x10 3 [µg/ml] x10 3 [U Eq/mL] Pat. Anzahl 51,00 51,00 49,00 49,00 47,00 47,00 50,00 Median 124,34 117,30 1,18 1,33 2,86 3,09 104,07 5.Perz. 22,01 19,82 0,69 0,60 1,99 2,03 56,45 95.Perz. 329,22 355,05 2,01 2,39 4,39 4,60 188,55 HD Anzahl 24,00 24,00 29,00 29,00 21,00 21,00 28,00 Median 91,37 90,95 0,96 0,94 2,33 2,10 120,32 5.Perz. 3,30 3,18 0,68 0,59 1,47 1,41 73,80 95.Perz. 147,53 168,87 1,44 1,56 3,34 3,13 173,50 Tabelle 6: Übersicht über die Ergebnisse der neuen ELISA-basierten Komplementtests Aufgeführt sind für jeden ELISA-Test die Median-Werte, 5. und 95. Perzentile sowie die Anzahl der in die Berechnung eingegangen Proben, oben für die Patienten, unten für die Normalpersonen (HD). Für die Spaltprodukte SC5b-9, Bb und ic3b erfolgte außerdem die Berechnung des Quotients zu C3. Für die Komplementtests C3d, CH50 und CH50EQ existieren in der Praxis verwendete Referenzbereiche. Von Bedeutung ist, ob die Streubreite des hier ermittelten Normalspender-Kollektivs zu diesen vorhandenen Referenzbereichen kompatibel ist. Erfreulicherweise ist dies annähernd der Fall: Für C3d wird im Labor ein Normbereich von <9 µg/ml angegeben, die gesunden Kontrollen dieser Arbeit lagen mit der 5. bis 95 Perzentile zwischen 5 und 7,4 µg/ml. Bei CH50 liegt der Referenzbereich bei 20 bis 50 U/ml, die Kontrollen weisen einen Perzentilenbereich von 21,4 bis 48,6 U/ml auf. Von der Firma Quidel werden gesamthämolytische Komplementwerte über 70 U Eq/ml als normal angegeben, in dieser Arbeit lagen die 5. und 95. Perzentile der CH50 Eq-Werte für die Kontrollen bei 73,8 und 173,5 U Eq/ml. Eine Tabelle mit den gesamten Einzelergebnisse der klassischen Komplementtests C3, C4, CH50 und C3d sowie der getesteten ELISA findet sich im Anhang. 3.2 Vergleich von Patienten und Normalpersonen (Wilcoxon-Mann-Whitney- Test) Vergleich der Ergebnisse der klassischen Komplementtests C3, C4, CH50 und C3d Der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test für die Werte der Patienten im Vergleich zu denen der Normalpersonen (Tab. 7) ergab signifikante Unterschiede für C3d und CH50, nicht jedoch für C3 und C4. 54

55 Patienten Median HD Median P-Wert C3 0,97 1,04 0,129 C4 0,17 0,22 0,057 CH ,013 C3d 8,2 5 <0,001 (C3d/C3)x10 3 8,26 4,86 <0,001 C3d gru 3 1 <0,001 Tabelle 7: Ergebnisse des Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests für die klassischen Komplementtests Aufgeführt sind die Medianwerte der Patienten-/ HD-Proben für den jeweiligen Komplementtest sowie das Ergebnis der Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests in Form des P-Werts. Ergänzend zu den vier Tests wurde auch der P-Wert des gruppierten C3ds und des C3d/C3-Quotients berechnet Vergleich der Ergebnisse der Komplement-ELISA Bei drei der getesteten ELISAs, ic3b, SC5b-9 und Bb bzw. deren Quotienten zu C3 konnten signifikante Unterschiede zwischen den Werten der Normalpersonen und denen der Patienten nachgewiesen werden (Tab. 8). Für CH50 EQ hingegen bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Kollektiven. Patienten Median HD Median P-Wert CH50 EQ 104,07 120,32 0,193 ic3b 2,86 2,33 <0,001 (ic3b/c3)x10 3 3,09 2,10 <0,001 SC5b-9 124,34 91,37 0,014 (SC5b-9/C3)x ,30 90,95 0,012 Bb 1,18 0,96 0,004 (Bb/C3) x10 3 1,33 0,94 <0,001 Tabelle 8: Ergebnisse des Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests für die ELISA-basierten Komplementtests Aufgeführt sind die Medianwerte der Patienten-/ HD-Proben sowie das Ergebnis der Wilcoxon-Mann- Whitney-Tests in Form des P-Werts für den jeweiligen Komplementtest bzw. dessen Quotient zu C Korrelationstest nach Spearman Im folgenden Kapitel werden die Ergebnisse des Spearman-Tests gezeigt, der als statistisches Mittel zum Nachweis von positiven oder negativen Korrelationen zwischen zwei Parametern verwendet wurde. 55

56 3.3.1 Korrelation der Komplement-ELISA mit SLICC und ECLAM Wie in Tabelle 9 zu sehen wies keiner der Tests eine eindeutige, starke (Korrelationskoeffizient >0,5) Korrelation zu einem der SLE-Scores ECLAM und SLICC auf. Erwähnenswert ist lediglich die Korrelation zwischen SC5b-9 und den beiden Scores, die als einzige das erforderliche Signifikanzniveau (P<0,05) erreicht hat. Betrachtet man den Median-Wert der zwei Aktivitätsscores, fällt auf, dass im Durchschnitt nur 1 bzw. 2 Punkte (Maximum: 10 Punkte) erreicht wurden, was die durchschnittlich recht geringe Krankheitsaktivität der Patienten widerspiegelt. Pat. ECLAM SLICC Median Perzentile 0, Perzentile 7 5,5 CH50 EQ Korrelationskoeffizient -0,093-0,032 N=50 P-Wert 0,521 0,826 ic3b Korrelationskoeffizient 0,050-0,009 N=47 P-Wert 0,736 0,950 SC5b-9 Korrelationskoeffizient 0,285 0,333 N=51 P-Wert 0,043 0,017 Bb Korrelationskoeffizient -0,064 0,044 N=49 P-Wert 0,661 0,764 C3d Korrelationskoeffizient 0,122 0,214 N=51 P-Wert 0,392 0,131 C3 Korrelationskoeffizient 0,100-0,075 N=51 P-Wert 0,485 0,601 C4 Korrelationskoeffizient 0,144-0,108 N=51 P-Wert 0,311 0,448 CH50 Korrelationskoeffizient -0,120-0,165 N=51 P-Wert 0,401 0,245 C3d/C3 Korrelationskoeffizient -0,011 0,183 N=51 P-Wert 0,939 0,198 C3d grupp. Korrelationskoeffizient 0,094 0,196 N=51 P-Wert 0,513 0,167 Tabelle 9: Ergebnisse des Korrelationstests nach Spearman der Komplement-ELISA zu den Aktivitätsscores Korrelation der Komplement-ELISA mit C3d bzw. C3d/C3 Nach den Aktivitätsscores ist C3d als Komplementspaltprodukt von den klassischen Komplementtests wohl der geeignetste Vergleichsparameter zu den neuen Tests, insbesondere zu ic3b, Bb und SC5b-9, weshalb in diesem Kapitel die Korrelation zu 56

57 C3d dargestellt wird. Zusätzlich wurde die Korrelation zum Quotienten C3d/C3 berechnet. Dieser Quotient kann einen evtl. stattgefundenen Komplementumsatz möglicherweise etwas deutlicher zeigen als C3d allein, da neben der erhöhten Konzentration von C3d auch das häufig verminderte C3 mit eingeht und im Quotient wertsteigernd wirkt. In einer Arbeit aus dem Jahre 1993 hatten Röther et al. ebenfalls den C3d/C3-Quotienten als Vergleichsparameter genutzt, da dieser laut Ihnen den Korrelationskoeffizienten verbesserte, das Signifikanzlevel hob und so besser zwischen verschieden schwer erkrankten Patienten unterschied, als C3d allein. Dieselbe Beobachtung haben wir beispielsweise bei der Messung der Korrelation zu SC5b-9 oder zu CH50 EQ (siehe Tabelle 10) ebenfalls gemacht. Um die Wertigkeit des C3d/C3-Quotienten im Rahmen dieser Arbeit besser einschätzen zu können, wurde dieser für die SLE-Patienten graphisch dem C3d gegenüber gestellt (Abb. 8). Zusätzlich sind die 5. und 95. Perzentile sowie der Median der HD-Werte in Form von verschiedenen gestrichelten Linien eingetragen. Die Werte zwischen der 5. und 95. Perzentile der gesunden Spender wurden als Normalwerte gewertet. Je nach Test ist bei Über- oder Unterschreiten dieser Grenzen von pathologischen Werten auszugehen. Es zeigte sich eine gute Korrelation der zwei Parameter; 22 Patienten zeigten für beide Parameter pathologische Werte, in 16 Fällen war beides normwertig. Patient 36 hat als einziger ein normwertiges C3d (6,2 mg/l), während der Quotient im pathologischen Bereich lag. Das C3 dieses Patienten war mit einem Wert von 0,56 g/l deutlich erniedrigt. Bezüglich der Genese dieses Mangels muss zwischen hereditärem C3-Mangel und Mangel durch erhöhten Umsatz und verzögerte Nachbildung von Komplement in der Leber unterschieden werden. Der normale C3d-Wert von 6,2 mg/l lässt eher einen hereditären Mangel vermuten, doch der C3d/C3-Quotient ist hoch pathologisch. Auch der pathologische Wert für SC5b-9 und insbesondere SC5b-9/C3 sprechen dafür, dass bei diesem Patienten Komplementaktivierung und -umsatz stattgefunden hat. Offen bleibt, warum der klassische CH50-Test bei diesem Patienten normal ausgefallen ist, da man bei hohem Komplementverbrauch und C3-Mangel einen niedrigen Wert erwarten würde. In eine weitere interessante Gruppe von 12 Patienten reihen sich Patient 22 und 35 ein. Hier waren die C3d-Werte pathologisch, während C3d/C3 im Normbereich lag. Dies entsteht durch meist nur mäßig erhöhtes C3d bei normalen bis auffällig hohen C3-Werten (bei Patient 22 z.b. 1,43 g/l, 95. Perzentile der HD bei 1,41 g/l). Ein Großteil dieser Gruppe zeigte dabei keine oder nur wenige Auffälligkeiten in den 57

58 anderen Tests, so auch Patient 22, bei dem lediglich Bb und ic3b leicht erhöht waren. Bei zwei anderen Patienten dieser Gruppe könnte man jedoch eine überschießende Nachbildung von C3 nach stattgehabtem Komplementumsatz vermuten. Dafür spricht, dass hier auch andere Werte pathologisch waren, bei Patient 35 beispielsweise waren SC5b-9, ic3b, Bb und CH50 EQ stark erhöht, in den Aktivitätsscores SLICC und ECLAM zeigte er mit 6 und 9 Punkten den höchsten Score von allen Patienten. Allerdings war bei Patient 35 auch das CRP stark erhöht, was differentialdiagnostisch immer an eine Infektion denken lassen muss; hohe Komplementwerte könnten dann auch als Akut-Phase-Reaktion verstanden werden. Klinisch wurde bei dem Patienten kein Fokus außer einem Ulcus cruris gefunden, der als alleinige Ursache für ein CRP von 69 mg/l eher unwahrscheinlich erscheint, so dass klinisch nicht ausgeschlossen werden konnte, dass ein SLE-Schub vorlag. In den klassischen Komplementtests zeigten sich jedoch nahezu keine Auffälligkeiten, CH50 war normal, C3 und C4 hochnormal bis hoch und C3d mit 8,9 nach dem Grenzwert des Immunologischen Labors gerade noch normal. Entweder hatte der Patient also eine Infektion und keine SLE-spezifische Krankheitsaktivität, dann wären die klassischen Tests ausreichend und der C3d/C3-Quotient bei einem C3d- Grenzwert von 7,4 mg/l hilfreich, um den Patienten als nicht-aktiven Lupus- Erkrankten mit Infektion zu erkennen. Falls der SLE für die pathologischen Werte verantwortlich war, muss festgehalten werden, dass weder die klassischen Komplementtests noch der Quotient diesen Patienten detektiert hätten, die neuen Tests hätten die mutmaßliche Krankheitsaktivität erkannt. Hieraus ergeben sich zwei interessante Folgerungen: 1. Der Quotient C3d/C3 scheint nicht in allen Fällen ein besserer Aktivitätsparameter zu sein als C3d, sondern vor allem dann, wenn C3 erniedrigt oder niedrig-normal ist. Der Nutzen bei hohen C3-Werten ist im Rahmen dieser Arbeit nicht klar beurteilbar. 2. Die klassischen Komplementtests scheinen manche Patienten mit eindeutiger Krankheitsaktivität nicht zu detektieren, insbesondere ist möglicherweise der Grenzwert für C3d zu hoch angesetzt. Gestützt wird diese These durch 13 andere Patienten neben Patient 35, deren C3d-Wert über dem in dieser Arbeit verwendeten, aus der 95. Perzentile der Normalpersonen berechneten Grenzwert von 7,4 mg/l lagen, jedoch unter der vom Immunologischen Labor der Universitätsklinik verwendeten Grenzwert von 9 mg/l. Dieser cut-off von 9 mg/l repräsentiert allerdings die Aufrundung des Wertes der 95. Perzentile von 8,1 mg/l, der von 31 58

59 Normalpersonen ermittelt wurde. Es bleibt allerdings festzuhalten, dass bei Patienten mit nur leicht erhöhtem C3d der Quotient zu C3 häufig nicht pathologisch ausfällt, wie es auch für 10 dieser 14 Patienten der Fall ist. Dies kann bedeuten, dass der C3d/C3-Quotient bei einem C3d-Grenzwert von 9 mg/l vermeintlich weniger Schwächen aufweist als bei einem Grenzwert von 7,4 mg/l, da 10 von 12 Patienten mit unauffälligem C3d/C3-Quotienten C3d-Werte zwischen 7,4 und 9 mg/l zeigten (vergleiche Abbildung 8 fein gestrichelte Linie = cut-off von 7,4 mg/l, durchgezogene Linie = cut-off von 9 mg/l). Abbildung 8: C3d versus C3d/C3 Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD; durchgezogene Linie (vertikal): Grenzwert des Immunologischen Labors der Universitätsklinik Freiburg für C3d von 9 mg/l Bei dem Vergleich der getesteten Komplement-ELISA zum Komplement- Spaltprodukt C3d zeigten sich für die Patientenproben (Tab. 10) eindeutige, positive Korrelationen zu SC5b-9 und Bb (Korrelationskoeffizient >0,5); hierbei fiel die 59

60 Korrelation der reinen C3d-Werte zu Bb deutlicher aus als die Korrelation des Quotienten aus C3d und C3 zu Bb. CH50 EQ hingegen zeigte insbesondere zum Quotient aus C3d und C3 eine negative Korrelation, die nur knapp unter einem Korrelationskoeffizienten von -0,5 blieb. Der Unterschied zur Korrelation zum reinen C3d ist auf die positive Korrelation zwischen C3 und CH50 EQ zurück zu führen (bei Mangel an C3 wenig Bildung des TCCs), die sich auf Grund des im Nenner stehenden C3 als negative Korrelation niederschlägt. ic3b wies keine signifikante Korrelation zu C3d oder C3d/C3 auf. Pat. C3d C3d gru. C3d/C3 CH50 EQ Korrelationskoeffizient -0,251-0,285-0,476 N=50 P-Wert 0,079 0,045 0 ic3b Korrelationskoeffizient 0,233 0,264-0,104 N=47 P-Wert 0,114 0,073 0,487 SC5b-9 Korrelationskoeffizient 0,545 0,544 0,631 N=51 P-Wert Bb Korrelationskoeffizient 0,555 0,56 0,441 N=49 P-Wert 0 0 0,002 Tabelle 10: Ergebnisse des Korrelationstests nach Spearman der Komplement-ELISAs zum Spaltprodukt C3d, dem gruppierten C3d oder dem Quotienten aus C3d (SLE-Patienten) Bei Berechnung der Korrelation nach Spearman für die Werte der Normalpersonen (Tab. 11) erhält man für CH50 EQ ebenfalls eine negative Korrelation zu C3d, die insbesondere zu C3d/C3 sehr deutlich ausfällt. Letzteres erklärt sich durch die starke Korrelation zwischen CH50 EQ und C3 (vgl. Tab. 14). HD C3d C3d gru. C3d/C3 CH50 EQ Korrelationskoeffizient -0,47-0,539-0,735 N=28 P-Wert 0,012 0,003 0 ic3b Korrelationskoeffizient 0,222 0,319-0,092 N=21 P-Wert 0,328 0,157 0,686 SC5b-9 Korrelationskoeffizient 0,168 0,172 0,032 N=24 P-Wert 0,426 0,417 0,879 Bb Korrelationskoeffizient 0,345 0,302 0,099 N=29 P-Wert 0,067 0,11 0,606 Tabelle 11: Ergebnisse des Korrelationstests nach Spearman der Komplement-ELISAs zum Spaltprodukt C3d, dem gruppierten C3d oder dem Quotienten aus C3d und C3 (Normalpersonen) 60

61 Darüber, dass auch C3d allein schon eine (beim gruppierten C3d sogar recht eindeutige) negative Korrelation zu CH50 EQ zeigt, kann man nur spekulieren. Evtl. weist ein niedriger bzw. normaler C3d-Spiegel, wie bei fast allen gesunden Spendern der Fall, auf ein wenig aktiviertes, gut aufgestelltes Komplementsystem hin, weshalb die in-vitro Aktivierung beim CH50 EQ- Test eine normale bis hohe TCC-Bildung nach sich zieht. Im Gegensatz zu den Patienten konnte bei den Kontrollen keine Korrelation zwischen C3d und SC5b-9 oder Bb festgestellt werden. Die folgenden drei Graphen zeigen die beschriebenen Korrelationen in Form von Punktdiagrammen, nach gleichem Prinzip wie bei der ersten Abbildung beschrieben, nur dass neben den SLE-Patienten auch die gesunden Spender mit einem anderen Symbol dargestellt sind. Abbildung 9: CH50 Eq versus C3d/C3 Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD 61

62 In Abb. 9 wird der ELISA-basierte CH50 EQ-Test dem Quotienten C3d/C3 gegenübergestellt (negative Korrelation). Ca. ein Drittel der Patientenwerte bewegen sich für beide Parameter im Normbereich. Für die fünf Patienten oben links wurden erhöhte C3d/C3-Werte und erniedrigte CH50 EQ-Werte festgestellt. Hier könnte ein Komplementmangel vorliegen, was für den tiefen CH50 EQ-Wert sorgt. Dazu würden auch die niedrigen C3 und teilweise auch C4-Werte passen, die bei allen Patienten dieser Gruppe vorlagen. Die verhältnismäßig hohen C3d-Werte sprechen allerdings auch für Komplementumsatz; die dadurch in vivo entstandenen TCC sollten allerdings vom CH50 EQ erfasst werden, weshalb der niedrige Wert in diesem Test schwer erklärbar ist. Interessant sind bei diesen Patienten die SC5b-9-Werte als 2. Messparameter für die TCC. Bei drei der fünf Patienten waren auffällig hohe lösliche terminale Komplexe im SC5b-9-ELISA nachweisbar, bei einem Patienten war der alleinige SC5b-9-Wert nicht, der Quotient zu C3 jedoch schon pathologisch. Warum der CH50 EQ-ELISA die wahrscheinlich vorhandenen TCC nicht erfasst bleibt unklar. Hier stellt sich wieder die Frage, ob C3d vielleicht eine längere HWZ als die TCC haben, was diese Konstellation erklären würde. Nahe der 5. Perzentilen-Grenze der CH50 EQ-Werte (grob gestrichelte schwarze vertikale Linie), jedoch im Normbereich für CH50 EQ, fanden sich mehrere erhöhte C3d/C3-Quotienten, insgesamt fanden sich in 14 Patienten-Proben pathologisch erhöhte C3d/C3- bei normalen CH50 EQ- Werten. Bei Patient 14 (umkreister Wert P14) war der Unterschied besonders groß: Der C3d/C3-Wert war mit 0,0262 deutlich erhöht, der höchste überhaupt, während CH50 EQ mit 90,57 U Eq/mL klar im Normbereich lag. Bei dieser großen Gruppe Patienten zeigte sich die Schwäche des CH50 EQ-Tests: bei Komplementumsatz und nachfolgendem Mangel werden die zahlreichen in vivo entstandenen TCC erfasst, in vitro entstehen evtl. jedoch nicht mehr viele TCC zusätzlich, da Komplementmangel herrscht. So ist das Ergebnis weder pathologisch hoch, noch pathologisch niedrig. Natürlich könnte der normale CH50 EQ-Wert theoretisch auch Ausdruck eines gesunden Gleichgewichts sein, wie bei den Normalpersonen der Fall. Schaut man sich jedoch beispielsweise die anderen Komplementwerte des Patienten 14 an wird deutlich: Alle Werte außer CH50 EQ sind stark pathologisch (Hinweis: ic3b-wert war nicht auswertbar). Keiner der 14 Patienten dieser Gruppe hatte völlig unauffällig Werte, meist fielen mehrere Tests pathologisch aus, lediglich ic3b und CH50 waren auffällig häufig normal. Auch der traditionelle CH50-Test scheint also bei Komplementumsatz nicht immer pathologisch auszufallen (mehr zum 62

63 Vergleich CH50 und CH50 EQ in Kapitel 3.3.3). In 2 Fällen waren C3d/C3 und CH50 EQ beide erhöht. Hierfür könnte eine hohe in vivo-tcc-bildung verantwortlich sein. Bei einem dieser Patienten bestätigte sich der Verdacht bei Betrachtung des SC5b- 9-Wertes, der hoch pathologisch war. C3 und CH50 waren hierbei normal, so dass wahrscheinlich im CH50 EQ-Test zu der großen Menge in vivo gebildeten terminalen Komplex zusätzlich TCC in vitro gebildet wurde, was den hohen CH50 EQ-Wert erklären könnte. Beim 2. Patienten dieser Gruppe war der SC5b-9-Wert normal, C3 und CH50 ebenfalls; hier bleibt die Genese des hohen CH50 EQ unklar. Abbildung 10: SC5b-9 versus C3d Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD Die graphische Darstellung der Korrelation von SC5b-9 mit C3d (Abb. 10) zeigte eine Reihe von Patientendaten, bei denen beide Werte pathologisch erhöht waren, wenn auch bei großer Streuung. Bei 19 der Patienten- und zwei HD-Proben befanden sich die C3d-Werte jenseits der 95. Perzentile, wurden also als pathologisch gewertet, 63

64 während die zugehörigen SC5b-9-Werte im Normbereich lagen. Bei der Gegenüberstellung von SC5b-9 zum Quotienten aus C3d und C3, die eine noch größere Korrelation zeigte, verringerte sich diese Gruppe um 11 Patienten (Abb. 11). Diese Patientengruppe entspricht größtenteils der bei Abb. 8 besprochene Patientengruppe, die pathologische C3d-Werte bei normalen C3d/C3-Werten zeigte. Ein nur moderater Komplementumsatz (sprich: leicht erhöhtes C3d) bei ausreichendem Gesamt-Komplement (sprich: normales C3) und funktionierendem Komplementsystem (sprich: normales CH50) scheint nicht zu erhöhten SC5b-9- Werten zu führen. Abbildung 11: SC5b-9 versus C3d/C3 Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD Des Weiteren fallen in Abbildung 10 und 11 die drei bzw. vier Patienten auf, die ein erhöhtes SC5b-9 bei normalem C3d bzw. C3d/C3 haben. Drei dieser Patienten haben erhöhte Bb-Werte, hier könnte man also eine Aktivierung des alternativen 64

65 Komplementweges vermuten. Warum sich das C3d hier nicht erhöht zeigte bleibt unklar. Eine Erklärung wäre eine Fehlregulation bei der Abzweigung zur C3d- Bildung, beispielsweise durch einen fehlenden Faktor o.ä. Vertraut man den Ergebnissen des ic3b-tests, müßten jedoch verschiedene Schritte dieser Abzweigung betroffen sein, denn nur zwei dieser drei Patienten hatten erhöhte ic3b- Werte, d.h. bis zu diesem Punkt könnte die Kaskade regelrecht abgelaufen sein. Abbildung 12: Bb versus C3d Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD Stellt man die Werte des Bb-ELISA und des C3d-Tests in einem Punktdiagramm gegenüber (Abb. 12) sieht man bei den Patientenwerten bis auf wenige Ausreißer eine gute Korrelation, was sich in einem Korrelationskoeffizienten von 0,55 quantifizieren ließ. Bei Patient 14 (gekennzeichnet in Abb. 9, 11 und 12) wurde sowohl der höchste C3d-Wert als auch der höchste Bb-Wert gemessen. Im gleichen Bereich, jenseits beider 95. Perzentilen, lagen 14 weitere Patienten. Ungefähr 65

66 genausoviele Werte waren bezüglich C3d erhöht, die zugehörigen Bb-Werte lagen jedoch im Normbereich. Zu ihnen gehören auch die Werte von Patient 1 (P1, umkreist, Abb. 12), der bis auf Bb und ic3b in allen Tests pathologische Werte aufwies. Bei dieser Patientengruppe könnte vermutet werden, dass lediglich der klassische Komplementweg aktiviert wird, wodurch die hohen C3d-Werte entstehen, bei nur begrenzter Aktivierung des alternativen Komplementweges, dessen Spaltprodukt u.a. Bb ist. Im Umkehrschluss hieße dies auch, dass bei den Patienten im rechten oberen Quadranten (siehe Abb. 12) sowohl der klassische als auch der alternative Komplementweg ablaufen; wahrscheinlich wird der alternative Komplementweg nach Aktivierung des klassischen Weges durch Immunkomplexe im Sinne einer Verstärkerschleife angekurbelt. Andersherum bewegen sich in drei Proben die C3d-Werte bei pathologisch erhöhtem Bb im Normbereich. Eine dieser Proben stammt von einem gesunden Spender (HD3, eingekreist) und wies mit 1,99 µg/ml den vierthöchsten Bb-Wert auf. Hier wird wohl hauptsächlich der durch C3- Tickover initiierte alternative Komplementweg angelaufen sein. Auch der SC5b-9- Wert dieser Normalperson war auffällig hoch, was für eine Fortsetzung der Komplementkaskade bis zum terminalen Komplex spricht. Als Ursache des mangelnden C3d-Anstiegs könnte wiederum eine Dysregulation auf dem Wege zur C3d-Spaltung vermutet werden. Alternativ könnte man auch über die Funktion von Faktor B diskutieren: Wird er evtl. an anderer Stelle eingesetzt, wodurch das Spaltprodukt Bb entsteht? Korrelation der Komplement-ELISAs mit C3, C4 und CH50 Vergleicht man die Ergebnisse der Komplement-ELISAs mit den Werten für C3, C4 und CH50 zeigt sich egal ob für Patienten oder Normalpersonen (Tab ) dasselbe Bild: Eindeutig positive signifikante Korrelationen zwischen CH50 EQ und C3 sowie CH50 EQ und CH50. Die bei den Normalpersonen festgestellte Korrelation zwischen C3 und CH50 EQ ist die stärkste im Rahmen dieser Arbeit gemessene Korrelation (Korrelationskoeffizient 0,787). Sie spiegelt am ehesten die zentrale Rolle von C3 in der Komplementkaskade wider. Dies erklärt auch warum die Korrelation bei den Normalpersonen stärker ist als bei den Patienten: Die gesunden Spender haben normalerweise keine TCC-Bildung in vivo, die den Zusammenhang zwischen C3 und CH50 EQ stört, weil sie durch C3-Verbrauch und CH50 EQ-Erhöhung in die andere Richtung steuert. Des Weiteren besteht eine signifikante positive Korrelation 66

67 von C3 und C4 zu ic3b. Das bedeutet also vereinfacht ausgedrückt: je mehr C3 bzw. C4, desto mehr ic3b. Damit scheint ic3b als Umsatzparameter nicht geeignet. Dies erklärt auch die oftmals verwirrende und widersprüchliche Rolle von ic3b in den oben beschriebenen Ergebnissen. Pat. C3 C4 CH50 CH50 EQ Korrelationskoeffizient 0,579 0,342 0,605 N=50 P-Wert 0 0,015 0 ic3b Korrelationskoeffizient 0,405 0,304 0,195 N=47 P-Wert 0,005 0,038 0,189 SC5b-9 Korrelationskoeffizient -0,384-0,189-0,208 N=51 P-Wert 0,006 0,184 0,142 Bb Korrelationskoeffizient -0,131-0,016 0,049 N=49 P-Wert 0,366 0,911 0,739 Tabelle 12: Ergebnisse des Korrelationstests nach Spearman der Komplement-ELISAs zu C3, C4 und CH50 (SLE-Patienten) HD C3 C4 CH50 CH50 EQ Korrelationskoeffizient 0,787 0,304 0,584 N=28 P-Wert 0 0,114 0,001 ic3b Korrelationskoeffizient 0,275 0,22 0,085 N=21 P-Wert 0,225 0,334 0,707 SC5b-9 Korrelationskoeffizient 0,019 0,279 0,023 N=24 P-Wert 0,927 0,184 0,914 Bb Korrelationskoeffizient 0,096 0,291-0,071 N=29 P-Wert 0,619 0,125 0,712 Tabelle 13: Ergebnisse des Korrelationstests nach Spearman der Komplement-ELISAs zu C3, C4 und CH50 (Normalpersonen) Graphisch zeigte sich beim Vergleich CH50 EQ C3 eine eindeutige Korrelation für Patienten und Normalpersonen (Abb. 13). Die Streuung nahm im oberen Bereich etwas zu. Die meisten Proben bewegten sich für beide Werte im Normbereich. Zehn Patienten zeigten C3-Werte unter 0,8 g/l, also unter der 5. Perzentile. Vier dieser Proben wiesen ebenfalls erniedrigte CH50 EQ- Werte auf, bei den anderen sechs Proben lag der CH50 EQ-Wert jedoch im Normbereich. Bei Patient 36 beispielsweise (P36, umkreist, Abb. 13) wurde der niedrigste C3-Wert (0,56 g/l) gemessen, der Wert für CH50 EQ bewegte sich bei P36 mit 140,78 U Eq/mL jedoch nur leicht oberhalb des Medians. Bei diesem Patienten befand sich weder eines der Spaltprodukte C3d, 67

68 ic3b oder Bb, noch der SC5b-9- oder CH50-Wert im pathologischen Bereich. Auch das C4 war normal hoch. Diese Konstellation der Laborparameter könnte für einen selektiven C3 Mangel ohne stattgefundenen Komplementumsatz sprechen. Setz man die Spaltprodukte jedoch in Verhältnis zum C3-Wert, ergeben sich pathologische Werte. Es kann also ebenso möglich sein, dass dieser Patient an einem C3-Mangel leidet und im Rahmen des SLE Komplementumsatz stattfindet, der jedoch aufgrund der - absolut gesehen - geringen Werte der Spaltprodukte nicht erkannt wird. Eine CH50 EQ-Erhöhung wurde nur in sechs Proben gemessen, wobei eine Probe von einem gesunden Spender stammte. Das C3 bewegte sich bei allen sechs Proben im Normbereich. Abbildung 13: CH50 Eq versus C3 Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert; feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert; fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD Die zweite in diesem Kapitel beschriebene Korrelation besteht zwischen dem alten und neuen CH50-Test (Abb. 14). Für den neuen CH50 EQ-Test ist aufgrund der 68

69 Messung der in vivo- und in vitro-bildung von terminalen Komplexen sowohl der Bereich unter der 5. Perzentile der HD als auch über der 95. Perzentile der HD interessant. Der Großteil der Werte lag für beide Parameter im Normbereich (siehe Abb. 14). In keinem Patientenserum wurden für beiden Tests pathologisch erhöhte Werte gemessen; lediglich ein gesunder Spender zeigte diese Konstellation (HD20, eingekreist, Abb. 14). Sechs Patientenseren zeigten in beiden Tests erniedrigte Werte (Kreis unten links, Abb. 14); drei davon wiesen hohe SC5b-9-Werte auf. Für fünf andere SLE-Erkrankten fiel der klassische CH50-Test pathologisch aus (Werte < 20 E/l), während die Ergebnisse des ELISA-basierten CH50-Tests im Normbereich lagen (Kreis unten Mitte, Abbildung 14); hiervon wiesen ebenfalls drei Proben erhöhte SC5b-9-Werte auf. Hier zeigte sich die erwartete Schwäche des neuen CH50-Tests: Sind in vivo und in vitro- Bildung von terminalen Komplexen vorhanden, kann das Endergebnis des Tests im Normbereich liegen, obwohl vermehrter Komplementumsatz vorliegt, was auch der pathologisch erniedrigte klassische CH50-Test anzeigt. Interessant ist, dass nur drei der fünf bzgl. CH50 auffälligen Proben erhöhte SC5b-9-Werte zeigten. Man könnte spekulieren, dass bei diesen drei Patienten tatsächlich Komplementumsatz stattgefunden hat, während bei den anderen beiden evtl. einfach Komplementmangel herrscht, was ebenfalls zu einem erniedrigten klassichen CH50 und einem normalen CH50 EQ führen kann. Vier weitere Patienten zeigten bei normalen Werten im klassichen CH50-Test erniedrigte CH50 EQ-Werte (Kreis links Mitte, Abb. 14), wobei bei zwei Patienten auch erhöhte SC5b-9-Werte gemessen wurden. Für diese Ergebnisse lassen sich nur schwer Erklärungen finden, daher muss hier auf den Diskussionsteil verwiesen werden. Fünf andere Patienten zeigten erhöhte Werte für CH50-EQ bei normalem CH50. Der überhaupt höchste gemessene Wert für CH50 EQ gehört zu einem Patienten (P37, eingekreist, Abb. 14), dessen CH50 im klassischen Test mitten im Normalbereich lag. Auch der SC5b-9- Wert dieses Patienten lag nahe des Medians, alle anderen Werte waren ebenfalls unauffällig. Es scheint also nicht wie aufgrund des hohen CH50 EQ vermutbar ein hoher Komplementumsatz mit hoher Bildung von terminalen Komplexen abgelaufen zu sein; das hohe CH50 EQ muss eher durch in vitro-bildung von TCC zustande gekommen sein, sonst zeigten die anderen Komplementtests nicht durchweg unauffällige Werte. Bei diesem Patienten gab der hohe CH50 EQ-Wert allein also wiederum Anlass für potentielle Fehlinterpretationen. 69

70 Abbildung 14: CH50 Eq versus CH50 Grob gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 5. Perzentile HD = unterer Normwert Feiner gestrichelte schwarze Linie (vertikal und horizontal): 95. Perzentile HD = oberer Normwert Fein gepunktete graue Linie (vertikal und horizontal): Median HD Korrelation der Komplement-ELISAs untereinander Die Auswertung der Ergebnisse der neuen Komplement-ELISAs der Patientenproben mithilfe des Spearman-Tests ergaben signifikante Korrelationen von Bb zu ic3b bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,48 und von Bb zu SC5b-9 bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,46 (Tab. 14). Bei dem Vergleich der Ergebnisse der ELISA, die mit den Serumproben der Normalpersonen durchgeführt wurden (Tab. 15), konnten signifikante positive Korrelationen von SC5b-9 zu Bb, SC5b-9 zu ic3b sowie ic3b zu Bb festgestellt werden. CH50 EQ zeigte keine signifikante Korrelation zu den übrigen drei ELISA. 70