Phenolische Inhaltsstoffe in Eicheln (Früchte von Quercus spp.) sowie im Harn von Schweinen bei Nutzung von Eicheln als Futtermittel

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik - Chemische Analytik - Phenolische Inhaltsstoffe in Eicheln (Früchte von Quercus spp.) sowie im Harn von Schweinen bei Nutzung von Eicheln als Futtermittel INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Kristina Golling (Bremerhaven) Hannover 2008

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Waldemar Ternes 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Josef Kamphues Tag der mündlichen Prüfung: Diese Arbeit wurde gefördert durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover

3 Meiner Omi

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Zielsetzung Schrifttum Polyphenole Phenolische Verbindungen allgemein Polyphenole in Pflanzen Biosynthese der Polyphenole Reaktionen der Polyphenole Metabolismus der Polyphenole Physiologische Wirkungen der Polyphenole Malabsorption Functional Food Botanik der Eiche Vorkommen von Eichen und deren Nutzung Entwicklung des Samens Beschreibung und Nutzung der Eichel Nährwerte Veränderung in Früchten während des Wachstums Eicheln in der Humanernährung Eicheln in der Tierernährung Eichelmast in der Waldweide Stallmast Eichelfütterung bei Iberischen Schweinen Vergiftung durch Eicheln und andere Pflanzenteile der Eiche Heilwirkung und medizinische Anwendung Therapie der Eichelvergiftung bei Tieren Analyse der Polyphenole Dünnschichtchromatographie I

6 Inhaltsverzeichnis Analytische Methoden mittels HPLC Extraktion Festphasenextraktion (Probenaufreinigung) Trennung der Analyten Chromolith HPLC Säulen Analytische Methoden mittels GC-MS Analytische Methoden mittels MS/MS Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes Material und Methoden Chemikalien Untersuchungsmaterial Ganze Eicheln Futterproben der Fa. Büning Thermisch getrocknetes Eichelschrot Eichelsilage Weiteres Probenmaterial Harn von Schweinen, die mit Eicheln gefüttert wurden Harn von Schweinen, die mit Alleinfutter gefüttert wurden Polyphenolanalyse Probenaufbereitung Extraktion der Phenole Festphasenextraktion (SPE, engl.: Solid Phase Extraction) Vergleichssubstanzen Trennung und Analyse mittels Dünnschichtchromatographie Trennung und Analyse mittels HPLC Isokratische HPLC-Methode Gradienten-HPLC-Methode Analyse mittels HPLC-DAD Bestimmung der Wiederfindung Analyse mittels GC-MS II

7 Inhaltsverzeichnis Probenaufarbeitung für die GC-MS Methodenentwicklung für die GC-MS Gaschromatographie Massenspektrometrie Auswertung und Identifizierung Analyse mittels HPLC-MS/MS Bestimmung der Trockenmasse Gesamtpolyphenolgehalt nach Folin-Ciocalteu Statistische Auswertung Ergebnisse Trockenmasse und weitere physikalische Eigenschaften des Probenmaterials Gesamtphenolgehalt Ergebnisse aus der Dünnschichtchromatographie Ergebnisse aus der HPLC Wiederfindungsrate, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze Extraktion des Probenmaterials Identifizierung mittels HPLC-UV Identifizierung mittels HPLC-DAD Quantifizierung der Inhaltsstoffe Ergebnisse aus der GC-MS Ergebnisse aus der HPLC-MS/MS Identifikation der Eichelproben mittels HPLC-MS/MS Untersuchungen der Harnproben mittels HPLC-MS/MS Diskussion Untersuchungen zu Eichelpolyphenolen Dünnschichtchromatographie HPLC III

8 Inhaltsverzeichnis Einfluss des Reifezustandes Einfluss der Verarbeitungstechnik Thermische Trocknung Silierung Einfluss der Artunterschiede Aromaprofil der Eichelproben Strukturklärung der Eichelpolyphenole Ausscheidung der Eichelpolyphenole Schlussfolgerung für die Praxis Aspekte zu Functional Food Aspekte zur Fütterung von Eicheln Zusammenfassung Summary Anhang Liste der verwendeten Chemikalien Liste der verwendeten Vergleichssubstanzen Geräteliste Übersicht der Polyphenolanalysen aus den wichtigsten Literaturstellen Berechnungsgrundlagen für den Gesamtphenolgehalt Berechnung der Polarität Kalibration der Vergleichssubstanzen Berechnungsgrundlagen für die HPLC-UV Berechnungsgrundlagen für die HPLC-UV, Flächenanteile DAD-Spektren der einzelnen Eichelfutterproben HPLC-GC-MS: Identifizierte Verbindungen HPLC-MS/MS Daten der Eichelfutterproben Massenspektren ausgewählter Eichelinhaltsstoffe Massenspektren der Harnproben Strukturformeln IV

9 Inhaltsverzeichnis 9. Glossar Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Übersichtsverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung V

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11 Einleitung 1. Einleitung und Zielsetzung Ziel dieser Dissertationsarbeit war die qualitative und quantitative Identifikation der phenolischen Inhaltsstoffe der Eicheln (Früchte von Quercus ssp.) sowie der qualitative Nachweis von Polyphenolen im Harn von Schweinen, die zuvor mit Eicheln gefüttert wurden. Ergänzend wurden verschiedene Futtermittel aus behandelten bzw. verarbeiteten Eicheln qualitativ und quantitativ auf die enthaltenen Polyphenole untersucht. In der Fachliteratur sind bisher nur wenige Inhaltsstoffe der Eichel beschrieben. Bekannt ist, dass Eicheln reich an Polyphenolen sind. Die phenolischen Verbindungen zählen zu den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, da sie nicht im Primärstoffwechsel der Pflanze gebildet und verbraucht werden. Die Gehalte an Polyphenolen in Eicheln sind sowohl von der Art der Eiche als auch von der physiologischen Reife der Eichel abhängig. Mit dieser Arbeit wurden erstmals Eicheln verschiedener Reifegrade auf ihren Gesamtphenolgehalt und die einzelnen Polyphenole untersucht. Auch wenn bestimmten Polyphenolen viele Wirkungen zugeschrieben werden (u. a. antioxidativ, antiphlogistisch), ist nicht klar, ob, und wenn, welche Stoffe der Eichel für die Geschmacksentfaltung und Aromabildung des sog. Eichelrohschinkens verantwortlich sind. Die Eichelmast von Schweinen war bis vor ca. 150 Jahren eine weit verbreitete Tradition. In Hutewäldern wurden Schweine vorwiegend mit Eicheln gemästet. Damit nutzte man das reichhaltige Futterangebot im Herbst. Die Tiere wurden dann vor Wintereinbruch geschlachtet, wenn die Futterquellen knapp wurden. Auf diese Weise waren zu Weihnachten die ersten Rohwürste reif, die Schinken hingegen erreichten ihr typisches Aroma erst im folgenden Frühjahr zur Spargelzeit, wenn der Kuckuck ruft. Einerseits gibt es in Deutschland eine kleine Renaissance der Eichelmast in Hutewäldern. Andererseits ist in der Schweinemast im Stall eine zunehmende 1

12 Einleitung Zufütterung von Eicheln und Eichelverarbeitungen festzustellen. Um das Produktionsziel von qualitativ und geschmacklich hochwertigen Schinken und Rohwürsten zu erreichen, muss das Futter ausreichend Polyphenole enthalten. Ein geringer Polyphenolgehalt in Eicheln, die als Futtermittel genutzt werden sollen, oder eine zu starke Reduzierung des Polyphenolgehaltes durch verfahrenstechnische Maßnahmen wird daher nicht die gewünschte Wirkung erzielen. Bisher wurde noch keine umfassende Betrachtung des Gesamtgehaltes der Polyphenole und deren Metaboliten in Eicheln unter Berücksichtigung von Verarbeitungstechnik, Lagerung, Sorte und Reifezustand vorgenommen. In der vorliegenden Arbeit wurden neben unbehandelten Eicheln auch thermisch getrocknete Eicheln sowie Eichelsilage analysiert, um den Einfluss der Verarbeitungsmethoden festzustellen. Anhand der Ergebnisse wurde versucht, die optimale Zubereitung für eine polyphenolreiche Fütterung der Schweine zu finden. Die qualitative und quantitative Untersuchung der Polyphenole ist aufgrund ihrer hohen Reaktivität und großen strukturellen Vielfalt schwierig. Lange Zeit standen keine geeigneten Analysenmethoden zur Bestimmung und Trennung der Polyphenole zur Verfügung. Ältere halbquantitative Aussagen über die Gehalte an Polyphenolen, basierend auf kolorimetrischen Bestimmungen, besitzen aufgrund ihrer großen Reaktionsvielfalt als Summenparameter nur eine beschränkte Aussagekraft (SPANOS und WROLSTAD 1990, HERRMANN 1992). In den letzten beiden Jahrzehnten wurden auf dem Gebiet der analytischen Chemie, insbesondere in der Gerätetechnik der HPLC, sehr große Fortschritte erzielt (LEA 1979, SPANOS et al. 1990, SPANOS und WROLSTAD 1990). Daten zur Bioverfügbarkeit von Polyphenolen nach ihrer Aufnahme im menschlichen und tierischen Organismus fehlen weitgehend. In Anlehnung an Humanstudien (MEYERS et al 2006, MULLEN et al. 2004) soll diese Arbeit einen Ausblick auf die Bioverfügbarkeit und den Metabolismus der Polyphenole für die Schweinefütterung schaffen. Die Untersuchungen von Eichelextrakten und von Harnproben unterschiedlich gefütterter Schweine kann zumindest Hinweise dafür liefern, ob 2

13 Einleitung Polyphenole oder deren Metaboliten renal aus dem Körper ausgeschieden werden. Nach bisherigen Erkenntnissen werden die meisten Polyphenole bereits im Magen/Darm-Trakt vor der Aufnahme in den Körper gespalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch Verfütterung von Eicheln entstandenen Polyphenol- Metaboliten im Harn detektiert. Zur Verfügung standen dafür Harnproben von Schweinen, die mit verschiedenen Eichelmengen unterschiedlich lange gefüttert worden sind. Mit der Analyse der Polyphenole in Eicheln sowie der Gehalte in verarbeiteten Eicheln sollen weitere Möglichkeiten geschaffen werden, diese Futterart gezielt dafür einzusetzen, um vergleichbare Fleischprodukte wie den Pata Negra Schinken von Iberischen Schweinen zu produzieren. Mit den Ergebnissen kann ein Weg gefunden werden, auch innerhalb der Stallmast durch eine ausgewogene Tagesration und Optimierung der Polyphenolgehalte hochwertige Eichelfleischprodukte zu produzieren. 3

14 Schrifttum 2. Schrifttum 2.1. Polyphenole Phenolische Verbindungen allgemein Phenolische Verbindungen gehören zu den am häufigsten vorkommenden sekundären Inhaltsstoffen von Pflanzen. Sie liegen häufig als phenolische Säuren, Glycoside und Biopolymere vor; nur selten sind sie in freier Form zu finden. Ihre biologische Funktion als Abwehrstoffe beruht auf ihrer hohen potentiellen Toxizität gegenüber vielen Organismen. Die Pflanzen schützen sich selbst vor diesen Stoffen, in dem diese getrennt von aktiven Enzymen in metabolisch inaktiven Räumen (Zellen, Drüsen, Sekretbehälter, Vakuolen u. ä.) gespeichert werden. Wird das Zellgewebe mechanisch oder durch Infektion zerstört, werden die ungebundenen Phenole durch Hydrolasen freigesetzt (HARBORNE 1978) Polyphenole in Pflanzen Die phenolischen Verbindungen der Pflanzen werden auch Pflanzenphenole, Polyphenole oder kurz Phenole genannt, im Volksmund werden sie zum Teil einfach als Tannine bzw. Gerbstoffe zusammengefasst, auch wenn das strukturell nicht ganz korrekt ist. Sie können aus chemischer Sicht recht einfach oder aber auch sehr komplex aufgebaut sein. Die Bedeutung der Phenole in Eicheln sind - nach Stoffgruppen geordnet - in diesem Kapitel aufgeführt. In Kapitel 2.3. wird auf die bisher bekannten Inhaltsstoffe der Eichel eingegangen. Den Polyphenolen werden alle Verbindungen zugeordnet, die in ihrer chemischen Struktur auf das Phenol zurückzuführen sind. Phenol besteht aus einem Benzolring und einer Hydroxylgruppe (OH-Gruppe, alkoholische Gruppe). Wenn mehrere Hydroxylgruppen vorhanden sind, spricht man von Polyphenolen. 4

15 Schrifttum Sie bilden eine Gruppe der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe, da sie weder im Primärstoffwechsel der Pflanze gebildet noch verbraucht werden. Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe sind bioaktive Substanzen, die als Abwehrstoffe (Tannine) gegen Schädlinge und Krankheiten, als Wachstumsregulatoren sowie als Farbstoffe (Flavonoide, Anthocyane) von der Pflanze synthetisiert werden (BITSCH 1999). Noch sind nicht alle ihre Funktionen in der Pflanze erforscht. Die wichtigsten Polyphenole in Früchten lassen sich anhand ihres molekularen Aufbaus in drei große Gruppen einteilen: Phenolcarbonsäuren und ihre Derivate ( Nichtflavonoide ) Flavonoide Niedermolekulare Phenole (meist flüchtige Aromastoffe) Die Phenolcarbonsäuren werden weiter unterteilt in Hydroxybenzoesäure- Verbindungen mit einem C 1 -C 6 -Grundkörper und die Hydroxyzimtsäure- Verbindungen mit einem C 3 -C 6 -Grundkörper. Die Flavonoide dagegen besitzen einen C 6 -C 3 -C 6 -Grundkörper (BRAVO 1998). Hydroxybenzoesäure-Verbindungen kommen in Früchten im Gegensatz zu den Hydroxyzimtsäure-Verbindungen, wenn überhaupt, nur in geringen Konzentrationen vor (meist < 1 mg/kg), und liegen vor allem als freie Säuren vor (HÄKKINEN et al. 1997). In Abbildung 2.1. sind die Strukturen der wichtigsten Hydroxybenzoesäure- Verbindungen in Früchten darstellt. 2 1 Derivat Chemische Bezeichnung R 1 = OH R 2 = OH Gallussäure* 3,4,5-Trihydroxybenzoesäure R 1 = OH R 2 = H Protocatechusäure 3,4-Dihydroxybenzoesäure R 1 = H R 2 = OH Gentisinsäure 2,5-Dihydroxybenzoesäure R 1 = H R 2 = H p-hydroxybenzoesäure* 4-Hydroxybenzoesäure R 1 = OCH 3 R 2 = H Vanillinsäure 4-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure R 1 = OCH 3 R 2 = OCH 3 Syringasäure 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoesäure Abbildung 2.1. Struktur der Hydroxybenzoesäure-Verbindungen Tabelle 2.1. Hydroxybenzoesäure-Derivate mit ihren chemischen Bezeichnungen Mit * gekennzeichnet sind wichtige Hydroxybenzoesäuren in Eicheln 5

16 Schrifttum Die bekannteste der aromatischen Hydroxybenzoesäuren ist die Salicylsäure (2- Hydroxybenzoesäure). Sie ist in Abbildung 2.2. dargestellt. O OH OH Der Name leitet sich vom Salicin her, ein Glucosid, welches in den Weidenblättern (Salix) vorkommt, aber auch in der Rinde verschiedener Weiden. Durch Hydrolyse wird Salicin in Glucose und Saligenin gespalten, das wiederum zu Salicylsäure oxidieren kann. Abbildung 2.2. Struktur der Salicylsäure Salicylsäurederivate sind außer in Weidenbäumen auch im Kraut einiger Pflanzen zu finden, z. B. in der amerikanischen Teebeere und in Pappeln. Zu überprüfen war, ob Salicylsäure oder Salicylsäurederivate möglicherweise auch in Eicheln vorliegen. Die Gallussäure ist eine Trihydroxycarbonsäure. Beim Erhitzen geht Gallussäure unter CO 2 -Abspaltung in Pyrogallol über. Sie gibt mit Eisenchlorid einen blauschwarzen Niederschlag. Ebenso wie Pyrogallol färbt sie sich an der Luft durch Oxydation braun. Abbildung 2.3. Strukturformel der Gallussäure, Vertreter der Hydroxybenzoesäuren Gallussäure (Abb.2.3.) kommt hauptsächlich in holzigen Pflanzen oder Galläpfeln vor und zwar in löslicher Form gebunden an Glucose, als hydrolysierbares Gallotannin oder als Chinasäureester (HARBORNE 1980). Die wichtigsten Hydroxybenzoesäuren in Eicheln sind die Gallussäure (Abb. 2.3.), die Ellagsäure (Abb. 2.4.) sowie das Quercetin. Sie sind, wie auch in anderen Pflanzen, hauptsächlich an Zucker gebunden. Nachgewiesen werden konnten in Eicheln bereits verschiedene Galloylester der Glucose sowie Komplexe mit Rhamnose (MÄMMELÄ et al. 2000, CANTOS et al. 2003, RAKIC et al. 2005). 6

17 Schrifttum OH OH Die chemische Struktur der Ellagsäure entspricht als Dihydroxybenzoesäure zwei miteinander HO O HO OH O OH verbundenen Molekülen der Gallussäure unter Abspaltung von Wasser. Ellagsäure findet sich in Konzentrationen bis zu 1 % in Pflanzen und Gehölzen. Abbildung 2.4. Strukturformel der Ellagsäure In Abbildung 2.5. sind die Strukturen der wichtigsten Hydroxyzimtsäuren dargestellt. Als Hydroxyzimtsäure-Verbindungen kommen hauptsächlich die p-cumarsäure, die Kaffeesäure und Ferulasäure vor, die in Pflanzen normalerweise in gebundener Form vorliegen. Bei der Biosynthese wird die Carboxylgruppe der Phenole verestert oder mit Aminen zu Amiden umgesetzt. Die freien Säuren entstehen erst während der Verarbeitung der Früchte oder Pflanzen durch enzymatische oder nicht enzymatische Hydrolyse der Esterbindung. Derivat Chemische Bezeichnung R = OH Kaffeesäure 3,4-Dihydroxyzimtsäure R = H p-cumarsäure 4-Hydroxyzimtsäure R = OCH 3 Ferulasäure 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure R = OH Chlorogensäure* 5-Caffeoyl-Chinasäure R = CH 3 Sinapinsäure 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure R = H 5-p-Cumaroyl-L-(-)-Chinasäure R = OCH 3 5-p-Feruloyl-L-(-)-Chinasäure Abbildung 2.5. Struktur der Hydroxyzimtsäuren und derivate Tabelle 2.2. Hydroxyzimtsäurederivate mit ihren chemischen Bezeichnungen Mit * gekennzeichnet sind die wichtigsten Hydroxyzimtsäuren in Eicheln Die Ferulasäure ist die wichtigste Phenolsäure in Getreide und kommt vor allem in den äußeren Schichten des Korns vor. Analytische Bestimmungen zeigen, dass die höchste Konzentration an Phenolsäuren in der sog. Aleuronschicht besteht, die zwischen dem Mehlkörper und der Schale liegt. Über die Verteilung einzelner Polyphenole innerhalb der Eichel ist bisher nichts bekannt. In Kapitel 2.3. wird auf Unterschiede zwischen Kern und Schale eingegangen. 7

18 Schrifttum Die Chlorogensäure (Abb. 2.6.) ist ein Hydroxyzimtsäureester aus der Kaffeesäure und der L-Chinasäure (BITSCH 1999). Die Chlorogensäure und ihre beiden Stellungsisomere, die Neochlorogensäure und die Kryptochlorogensäure, sind die am weitesten verbreiteten Hydroxyzimtsäure- Verbindungen in Früchten. Dagegen sind Glycoside der Hydroxyzimtsäuren, bei denen eine glycosidische Bindung zwischen einem Zucker und einer der phenolischen Hydroxylgruppe vorliegt, selten (SCHUSTER und HERRMANN 1985). Abbildung 2.6. Strukturformel der Chlorogensäure, Vertreter der Hydroxyzimtsäuren Die Pflanzenpolyphenole mit der größten Bedeutung sind die Flavonoide. Die Grundstruktur der Flavonoide setzt sich aus einem Ringsystem zusammen, bei dem zwei aromatische Ringsysteme A und B (jeweils C 6 -Körper) über einen heterozyklischen Sauerstoffring verbunden sind (BRAVO 1998). Die große Vielfalt der Flavonoide entsteht durch Veränderungen an diesem Grundgerüst. Möglich ist die Substitution von Hydroxyl- und Methoxylgruppen in den Benzolringen A und B oder die Verknüpfung der Hydroxylgruppen mit einem Zucker bzw. Phosphat oder auch Variationen am Pyranring. Dadurch können die Flavanole, Flavone, Catechine, Flavanone, Anthocyanidine und Isoflavonoide gebildet werden (SCALBERT und WILLIAMSON 2000). In der Natur kommen die meisten Flavonoide nicht frei als Aglycon vor, sondern liegen als Flavonoidglycoside vor. Mehr als 80 verschiedene Zucker sind bisher nachgewiesen. Bei den Flavonolen ist der bevorzugte Bindungsort für die Sauerstoffbrücke das C 3 - Atom. Sie sind charakterisiert durch einen 4-Oxo-3-hydroxy-Ring, der den A- und B- Ring miteinander verbindet (BALENTINE et al. 1997). Die häufigsten Zuckerreste sind die Glucose und die Galaktose sowie das Disaccharid Rutinose (Rhamnosyl-(1-6)-glycosid), während Rhamnose, Arabinose, Xylose und die Zuckersäure Glucuronsäure weniger häufig sind. Die Bildung der hellgelben Flavonolglycoside ist 8

19 Schrifttum von der Lichtzufuhr abhängig (HERRMANN 1976), diese Substanzgruppe befindet sich daher vor allem in der Schale von Früchten. Das wichtigste Aglycon der Flavonole in Früchten und Pflanzen ist das Quercetin. Es liegt nur selten in freier Form vor, sondern ist in Position 3 glykosidisch gebunden. Durch saure Hydrolyse lassen sich die Zucker jedoch leicht abspalten (McMURROUGH et al. 1982). Der lichtabhängige Bildungsort könnte darauf hinweisen, dass Quercetin in Eicheln auch vor allem in der Schale vorhanden ist und für die Färbung im Herbst mitverantwortlich ist. Noch ist allerdings über die Verteilung innerhalb der Eicheln nichts bekannt. Die Flavanole kommen in allen heimischen Früchten vor. Das Diastereomerenpaar (+)-Catechin und (-)-Epicatechin sind die wichtigsten monomeren Flavan-3-ole, während (+)-Gallocatechin, (-)-Epigallocatechin und deren O-3-Gallate weniger häufig sind. Die Catechine sind durch Hydroxylgruppen am B-Ring und eine Hydroxylgruppe in meta-stellung am A-Ring charakterisiert (BALENTINE et al. 1997). Gallocatechine sind Verbindungen, bei denen der B-Ring mit drei Hydroxylgruppen substituiert ist. Verbindungen, deren Hydroxylgruppe des Pyranringes mit Gallussäure verestert ist, werden als Catechingallate bezeichnet (GRAHAM 1992). Anthocyane sind in der Natur sehr weit verbreitet und kommen als wasserlösliche Pigmente im Zellsaft der Vakuolen zahlreicher Pflanzen, überwiegend in den Außenbereichen wie Epidermis- und Subepidermiszellen der Früchte vor (HARBORNE 1988, MAZZA und MINIATI 1993). Die Anthocyanidine kommen in Pflanzen ausschließlich glycosidisch an verschiedene Zucker gebunden vor. Die häufigsten Zuckerreste sind die Glucose, die Galaktose, die Rhamnose und die Arabinose. Sie werden über eine Sauerstoffbrücke am C 3 - oder am C 3 - und C 5 -Atom gebunden. Ebenfalls werden auch häufig Di- und Trisaccharide gebildet, die aus Kombinationen dieser vier Zucker bestehen. Die Glycoside der Anthocyanidine, die Anthocyane, liegen bei ph-werten < 4 teilweise und bei einem ph-wert < 1 vollständig als Benzopyrylium- oder Flavyliumkationen vor, die eine rote, blaue oder violette Farbe aufweisen. Farbveränderungen bei 9

20 Schrifttum Anthocyanen kommen in Abhängigkeit vom ph-wert vor. Bei ph-werten über 6 kommt es zur Bildung der chinoiden Form bzw. ionischen Anhydrobase durch Abspaltung von Wasser, und damit zu einer Farbvertiefung. Bei ph-werten über 7 kann die ionische Anhydrobase durch Ringöffnung in das gelbe Chalkon übergehen (MAZZA und MINIATI 1993). Flavanon Anthocyanidin Abbildung 2.7. Grundstruktur von Flavanon und Anthocyanidin Die Proanthocyanidine sind Dimere, Oligomere und Polymere der Flavan-3-ole, die durch enzymatische oder chemische Kondensation der Flavan-3-ol-Grundeinheiten entstehen. Die chemischen Strukturen sind in Abbildung 2.7. dargestellt, die Biosynthese ist im Kapitel , Abbildung 2.9., beschrieben. Als kondensierte Gerbstoffe tragen sie zur adstringierenden Wirkung von Eicheln und anderen Früchten bei. Bei geringerem Polymerisationsgrad sind sie farblos und haben einen bitteren Geschmack, erst bei höherem Polymerisationsgrad entsteht eine bräunliche Farbe und die adstringierende Wirkung tritt auf (LEA und ARNOLD 1978). Reine Catechin-/Epicatechin-Kondensate werden als Procyanidine bezeichnet und sind die verbreitetste Gruppe der Proanthocyanidine, aber auch Prodelphinidine (Gallocatechin-/Epigallocatechin-Kondensate) kommen vor. Pflanzengewebe enthalten kleinere, lösliche Proanthocyanidine sowie unlösliche, höher polymere Formen von über 20 Flavan-3-ol-Einheiten, die vielfach sogar den überwiegenden Teil der pflanzlichen Proanthocyanidine darstellen und kovalent an die Polysaccharidmatrix der Zelle gebunden sein können (HEMINGWAY 1989). Der Name Proanthocyanidine bezeichnet die biosynthetischen Vorstufen der Anthocyane, die Flavan-3,4-diole (LEA 1979). 10

21 Schrifttum O O O OH O O O OHO Abbildung 2.8. Gallotannin Tannine (Abb. 2.8.) sind meist ungiftige Komponenten in Pflanzen und bestehen aus komplexen, stickstofffreien Polyphenolen. Sie werden auch als Gerbstoffe oder Gerbsäuren bezeichnet. Wenn sie Gallussäure-Reste enthalten, werden sie als Gallotannine oder Gallusgerbsäuren benannt. Tanninen wird eine wichtige Rolle in der chemischen Verteidigung von Pflanzen zugesprochen. Sie besitzen einen herben Geschmack (MEYERS et al. 2006). Anhand ihrer Struktur werden sie in zwei Gruppen unterteilt, die hydrolysierbaren und die kondensierten Tannine. Hydrolysierbare Tannine sind gekennzeichnet durch einen Kern aus Zucker (hauptsächlich D-Glucose), der mit Phenolsäuren verestert ist. Kondensierte Tannine sind homogene oder heterogene Polymere der Flavanoide, wie sie oben beschrieben sind. Übersicht 2.9. Vorkommen der natürlichen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe Übernommen von der DGE Was leisten sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe?, 2006 * - diese Stoffgruppen sind auch in Eicheln zu erwarten Klassen sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe Carotinoide Phytosterine Saponine * Polyphenole * (Phenolsäuren, Flavonoide) Monoterpene * Phytoöstrogene (Isoflavone und Lignane) Vorkommen Orange-gelb-rotes Obst und Gemüse, grünblättriges Gemüse Fettreiche Pflanzenteile, z. B. Sonnenblumenkerne, Sesamsaaten, Öle Hülsenfrüchte, Spargel, Hafer Viele Obst- bzw. Gemüsearten wie Äpfel, Trauben, Pflaumen, Beerenobst, Zwiebel, Soja, Vollkorn, Kaffee, Tee, Wein, Nüsse Öle aus Zitrusfrüchten, Fenchel, Kümmel und Pfefferminze Hülsenfrüchte wie Soja Der Gehalt und das Spektrum der phenolischen Verbindungen in einer Pflanze sind nicht nur sortenabhängig, sondern sie werden auch durch Anbau- und Vegetationsbedingungen sowie den Reifegrad beeinflusst. Innerhalb einer Frucht ist eine inhomogene Verteilung der phenolischen Verbindungen zu beobachten, wobei in den äußeren Schichten der Pflanzenteile höhere Konzentrationen vorliegen. Dort 11

22 Schrifttum schützen sie aufgrund ihrer Eigenschaften als Radikalfänger das darunter liegende Gewebe (BITSCH 1999, ROBARDS et al. 1999). Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe dienen der Pflanze außerdem zur Abwehr, die in der Botanik dann Fraßhemmer genannt werden. Für den Menschen als Verbraucher von Früchten spielen Abwehrstoffe nur im unreifen Zustand der Früchte eine Rolle. Ein fast überall festzustellendes Schutzprinzip ist oft der wesentlich höhere Säuregehalt, vor allem Citronensäure, Äpfelsäure, Oxalsäure oder Weinsäure in unreifem Obst Biosynthese der Polyphenole Die de novo-synthese der Flavonoide beschreibt die Umwandlung von Glucose in Phenylalanin (Shikimisäureweg) und die Bildung von Zimtsäure oder Cumarinsäure. Die 4-Cumarsäure reagiert mit 3 Molekülen Malonyl-CoA zum 4, 2', 4', 6' - Tetrahydroxychalkon, das bereits das C15-Grundgerüst der Flavonoide aufweist und mehrere OH-Gruppen trägt. Seine Zyklisierung führt zu den Flavonoiden (BÖHM et al. 1998). Die Biosynthese der aromatischen Verbindungen in der Pflanze besteht aus den drei folgenden Segmenten: - Das Shikimisäure-Segment, das die Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan produziert (benannt nach der aus den Früchten von Illicium religiosum (japanisch: shikimi-ki) isolierten Säure (LÜTTGE et al. 2002)) - Das Phenylpropanoid-Segment, das die Hydroxyzimtsäurederivate produziert, welche die Grundlage für Flavonoide und die Strukturkomponente Lignin sind - Das Flavonoid-Segment, das diverse Flavonoide produziert In Abbildung 2.9. ist die Biosynthese der Polyphenole schematisch dargestellt. Die aus dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel stammenden Vorstufen Phosphoenolpyruvat 12

23 Schrifttum und Erythrose-4-Phosphat werden durch enzymatische Synthese über die Zwischenstufen 3-Desoxyarabinoheptulosonat-Phosphat, Dehydrochinasäure und Dehydroshikimisäure zur Shikimisäure umgebaut. Über Shikimisäure-Phosphat führt der Syntheseweg zu den Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Phenylalanin wird durch PAL (Phenylalanin-Ammonium-Lyase) zur Zimtsäure umgewandelt, aus der nach enzymatischer Hydroxylierung die p-cumarsäure gebildet wird. Diese kann durch fortschreitende Hydroxylierung und Methylierung in Ferulasäure und Kaffeesäure umgewandelt werden. Aus der Kaffeesäure kann weiter Lignin synthetisiert werden (ein wichtiger Bestandteil von Holz). Bei Anwesenheit von Co-A-Ligase wird das Coenzym A an die p-cumarsäure gebunden. Die p-cumarsäure-coa kann durch eine von der Chalkon-Synthase katalysierten Reaktion mit 3 Molekülen Malonyl-CoA zum Naringeninchalkon weiterreagieren. Dies stellt nun das C 6 -C 3 -C 6 -Grundgerüst dar, von dem sich alle Flavanoide ableiten. Nach Ringschluss durch die Chalkon-Isomerase entsteht das Naringenin, von dem sich die Flavone, Isoflavone und das Dihydrokaempferol ableiten. Das Dihydrokaempferol kann durch Katalyse der Flavonol-Synthase, die eine Doppelbindung zwischen C 2 -Atom und C 3 -Atom ausbildet, in ein Flavonol, in diesem Fall das Kaempferol, umgewandelt werden oder durch katalytische Reduktion der Dihydroflavonol-Reduktase zu einem Flavan-3,4-diol (Leucoanthocyanidin) umgewandelt werden. Die Flavan-3,4-diole werden als kurzlebige Vorstufen der Anthocyane und Flavan-3-ole sowie deren Kondensationsprodukten, den Proanthocyanidinen, angesehen. Die Synthese ist bisher nicht vollständig geklärt. Ein Zusammenspiel verschiedener Enzyme ist wahrscheinlich (FORKMANN 1993). Bei den Flavan-3-olen wird die Bildung eines Carbokations durch Entfernung der Hydroxylgruppe am C 4 -Atom als Hydroxid-Anion angenommen, das dann zum Flavan-3-ol reduziert wird. Wenn das Reduktans, z. B. NADPH, limitiert ist, kann das Kation mit Flavan-3-olen zu Dimeren und höheren Oligo- und Polymeren, den Proanthocyanidinen, reagieren (BELITZ und GROSCH 1992). Die Einführung der Hydroxylgruppen am B-Ring der Flavonoide wird von Hydroxylasen katalysiert, wobei der Zeitpunkt noch nicht genau geklärt ist. Die Bildung von Glycosiden erfolgt in der Pflanze meist erst sekundär (HARBORNE 13

24 Schrifttum 1988). Die Hydroxybenzoesäuren werden in Pflanzen aus den entsprechenden Hydroxyzimtsäuren gebildet (GROSS 1992). Phosphoropyruvat + Erythrose- Kohlenhydrat- Phosphat Stoffwechsel Shikimisäure Ferulasäure Gallussäure Phenylalanin PAL Tryptophan Tyrosin Zimtsäure Zimtsäure-Hydrase Shikimisäureweg Phenyl- propanoid- Segment Kaffeesäure p-cumarsäure CoA-Ligase 2-Acentyl-CoA 3-Malonyl-CoA p-cumaroyl-coa Naringeninchalcon Chalkonsynthase Chalkon- Isomerase Genitisin Naringenin Apigenin ISOFLAVONE FLAVANONE FLAVONE Synthase Flavonoid- Segment Dihydrokaempferol DIHYDROFLAVONOLE Kaempferol FLAVONOLE Flavonol- Dihydroflavonol- Reduktase Leukophargenidin LEUCOANTHOCYANIDINE Pelargonidin (+)-Catechin ANTHOCYANIDINE PROANTHOCYANIDINE FLAVAN-3-OLE Abbildung 2.9. Biosynthese der Pflanzenpolyphenole PAL= Phenylalanin-Ammonium-Lyase 14

25 Schrifttum Reaktionen der Polyphenole Die Polyphenole und ihre Oxidationsprodukte, die Chinone, zählen zu den reaktivsten Inhaltsstoffen in Früchten und deren Produkten. Sie sind in der Lage mit Proteinen, Kohlenhydraten und anderen Polyphenolen oder Chinonen komplexe Reaktionen einzugehen (MACHEIX et al. 1990, SPANOS und WROLSTAD 1990, SPANOS et al. 1990). Bei der Verarbeitung von Pflanzenteilen und der damit verbundenen Zerstörung der Zellen werden Polyphenole freigesetzt. Sie stellen potentielle Reaktionspartner für andere Inhaltsstoffe dar, was die Qualität des Produktes beeinflussen kann. Diese Veränderungen der Polyphenole beeinflussen z. B. in Fruchtsäften nicht nur die Qualität des Produktes, sondern auch ihre biologischen Eigenschaften, wie die Bioverfügbarkeit und die antioxidative Kapazität. Die ortho-chinone sind die wichtigsten Reaktionszwischenstufen der Polyphenole und können sowohl mit Polyphenolen als auch mit anderen organischen Inhaltsstoffen reagieren, wie in Abbildung dargestellt. Diese Reaktionen sind auch beim Verarbeiten von Eicheln zu verschiedenen Futterarten zu erwarten. Dadurch sind die ursprünglichen Eichelinhaltsstoffe stark beeinflusst und kommen im verarbeiteten Futter vermutlich nicht mehr vor. Enzyme, die Polyphenole zu oxidieren vermögen, werden als Polyphenoloxidasen (PPO) bezeichnet. Die Reaktionen der dargestellten primären Reaktionsprodukte sind aufgrund der Vielfalt sehr komplex, führen aber häufig zu höheren Polymeren mit brauner Farbe. Die wichtigsten Reaktionen der Polyphenole können wie folgt eingeteilt werden: - Enzymatische Oxidation (Mostoxidation) - Nichtenzymatische Reaktionen (Kondensation, Polymerisation) - Polyphenol-Protein Bindung - Polyphenol-Polysaccharid Bindung 15

26 Schrifttum Abbildung Reaktionen von o-chinonen mit Polyphenolen Polyphenole können entweder durch Wasserstoffbrückenbindungen oder durch Bindungen mit Proteinen und Enzymen antimikrobiell wirken. Bei Vorliegen einer o-hydroxy-gruppe können Chelate mit Metallionen gebildet werden. Durch einfache Oxidation erhöht sich die Toxizität von Phenolen. Phenoloxidasen und Peroxidasen lassen sie zu Chinonen reagieren. Die hohe antimikrobielle Aktivität von Chinonen beruht auf Reaktionen und Ausfällungen von Proteinen und Aminosäuren, Änderungen des Redoxpotentials, obengenannter Komplexbildung mit Metallionen sowie Hemmung von Enzymsystemen (SCHLESIER et al. 2001). Weitere Oxidation von Phenolen lässt ihre Toxizität herabsinken. Polymere Phenolkomplexe wie Lignine oder Melanine können als physikalische Barrieren dienen, welche die Ausbreitung der Erreger aufhalten (BELL 1981). Tannin enthaltendes, pflanzliches Gewebe (wie auch Eicheln) ist an seiner adstringierenden Wirkung zu erkennen. Wenn Polyphenole mit Speichel- und Glycoproteinen im Mund reagieren, kann der Mund trocken werden. Durch ungenügende Einspeichelung wird die Gleitfähigkeit der Nahrung verhindert. Tannine werden daher als Antinährstoffe bezeichnet. Ihre schädigende Wirkung für die Nahrungsaufnahme beruht auf Bindungen mit verschiedenen Eiweißverbindungen im Verdauungstrakt. Gerbstoffe können Verdauungsenzyme binden und damit deren Funktion hemmen. Die Bindung an Eiweiß der Nahrung führt zu einer unvollständigen Verdauung. Die Bindung an Proteine der Darmschleimhaut 16

27 Schrifttum beeinträchtigt deren Funktion, Nährstoffe zu resorbieren. Schwerlösliche Komplexe mit Eisen hemmen dessen Resorption aus pflanzlichen Nahrungsmitteln. Das kann bei Personen, die hohe Gehalte an Gerbstoffen zu sich nehmen, zu Eisenmangel führen (LINDNER 1990). Mit einem allgemeinen Ansteigen der Phenolgehalte reagieren viele Pflanzenarten auf biotischen oder abiotischen Stress. Nach Kälteeinwirkung (5 C) stiegen die Gesamtphenolgehalte in Kartoffelknollen von 210 mg/kg Frischgewicht auf 1720 mg/kg an (BEIER 1990). Nach Pilzinfektionen können sich Mono- und Diphenole, phenolische Glycoside, Flavonoide, Anthocyanidine, aromatische Aminsäuren und Cumarinderivate anreichern (HAHLBROCK und SCHEEL 1989). Wenn Pflanzen mit einer Hypersensitivitätsreaktion reagieren, werden viele phenolische Substanzen in den toten Zellen angereichert. Auch zahlreiche Phytoalexine (pflanzliche Abwehrstoffe) haben phenolischen Charakter und besitzen physiologische Wirkungen (zentrale Erregbarkeit, Steigerung der Sekretion von HCl im Magensaft). Diese Substanzen sind ursprünglich bereits in Eicheln enthalten, deren Gehalt kann möglicherweise durch biotischen oder abiotischen Stress gesteigert werden. Wie bereits BEIER (1990) die Auswirkung von Kälte (Zunahme der Gesamtphenolgehalte) auf pflanzliche Phenole gezeigt hat, so ist mit ähnlicher Reaktion in Eicheln zu rechnen. Unter Berücksichtigung des Anstiegs besonders der Chlorogensäure ist fraglich, ob diese Form der Lagerung von Eicheln für die Schweinemast ungewollte Wirkungen auf die Tiere hat oder nicht Metabolismus der Polyphenole Bei den vielfältigen Wirkungen von Flavonoiden taucht zwangsläufig die Frage nach der Bioverfügbarkeit auf, d. h. in welchem Umfang diese resorbiert und in welcher Form sie im Körper wirksam werden können. Resorption und Metabolismus von 17

28 Schrifttum Flavonoiden wurden vielfach untersucht, erste Untersuchungen dazu stammen aus den 50er Jahren (CLARK et al. 1950). In der Abbildung werden die von GEE et al. (2000) beschriebenen Transportmöglichkeiten von Quercetinglycosiden in die Epithelzelle veranschaulicht. Sowohl die Aufnahme als auch die Metabolisierung der polyphenolischen Verbindungen hängen stark von ihrer chemischen Struktur ab. Die frei vorliegenden Phenolcarbonsäuren können direkt im Intestinum aufgenommen werden (BRAVO 1998). Innerhalb der Gruppe der Flavonoide ist die Aufnahme und der Metabolismus von Quercetin am meisten untersucht. HOLLMAN et al. (1995) wiesen die Absorption von Quercetinglycosid und -rutinosid im Ileum bei Ileostomiepatienten nach. Es konnte gezeigt werden, dass Quercetinglycoside besser als das Aglycon Quercetin aufgenommen werden. Offenbar ist für die Absorptionsrate der Zuckerrest wichtig. Im Dünndarm weisen Quercetinglucoside, nicht jedoch nicht Quercetindisaccharide, eine hohe Bioverfügbarkeit auf. Für Quercetinglucosid konnte nachgewiesen werden, dass es aktiv über den intestinalen Na + /Glucose-Cotransporter aufgenommen wird. Vermutlich ist dies ebenfalls für andere Flavonoidglycoside möglich. Flavonglycoside werden im Darm (Kolon) von der Bakterienflora in Aglycon und Zucker gespalten. Flavonoidaglycone werden hauptsächlich durch die Darmbakterien in Bruchstücke gespalten werden. Der bakterielle Abbau von Flavonoiden erfolgt zum Großteil zu Phloroglucin und Phenolcarbonsäuren wie 4-Hydroxyphenylpropionsäure, 4-Hydroxyzimtsäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Hydroxyphenylessigsäure-Derivaten. Die Aglycone oder deren Abbauprodukte werden im Dünndarm durch passive Diffusion absorbiert. In der Leber glucuroniert, sulfatiert oder methyliert, werden sie mit dem Gallensaft ausgeschieden (SCALBERT et al. 2000). Vollständig resorbierte Flavonoide können im Humanplasma nachgewiesen werden und werden renal in sulfatierter bzw. glucuronidierter Form ausgeschieden. Insgesamt können für Flavonoide bei in vitro-tests und im Tierexperiment zahlreiche 18

29 Schrifttum Effekte belegt werden, allerdings sind die Metaboliten aber bisher nicht systematisch auf ihre Wirkung untersucht wurden (HEILMANN und MERFORT 1998). Die höchsten Flavonolkonzentrationen im Plasma werden <0,5 bis 9 h nach oraler Flavonolaufnahme gemessen. Die Halbwertszeiten für die Ausscheidung von Flavonolen aus Zwiebeln (Quercetin-Glucose-Konjugate) und Äpfeln (verschiedene Quercetin-Zucker-Konjugate) im Harn liegen bei 28 bzw. 23 h. Festgestellt werden konnten ausschließlich Quercetinmetaboliten, die an Glucuronsäure und Sulfate gebunden waren. Im Plasma liegt Quercetin zu 99 % an Albumin gebunden vor. Diese hohe Affinität erklärt möglicherweise die sehr langsame Elimination von Quercetin (SCALBERT et al. 2000, HOLLMAN et al. 2000). Darm Epithelzelle Natriumabhängiger Quercetin-3-glykosid Glucosetransporter Quercetin-3-glykosid Hydrolase Gluconidase A U S S C H E I D U N G Quercetin Quercetin Transferase Leber Quercetinglucuronid Abbildung Mögliche Absorptionswege von Quercetinglycosiden Der Metabolismus der Ellagitannine und Ellagsäuren führt im Jejunum unter Freisetzung der Ellagsäure zur Bildung von Urolithin A D. Diese können aufgrund 19

30 Schrifttum ihrer lipophilen Eigenschaften absorbiert werden. ESPIN et al. (2007) gelang es, die konjugierten Metaboliten in der Galle und im Plasma nachzuweisen. Nur Urolithin A und dessen Glucuronid konnten im Harn nachgewiesen werden. In Muskelgewebe, Fett, Lunge, Leber, Herz und Niere konnten auch nach Einsatz von Sulfatase und Glucuronidase keine Metaboliten bzw. deren Aglycone gefunden werden, was wiederum zeigt, dass diese Gewebearten keine Ellagitannine akkumulieren (vgl. Strukturformeln in Abb und Abb ). Quercetinglycoside werden mittels natriumabhängiger Glucosetransporter in die Epithelzelle transportiert und dort mit einer cytosolischen ß-Glucosidase in das Aglycon umgewandelt. Dieses Aglycon wird entweder weiter zur Leber transportiert oder mit Hilfe einer Transferase in Quercetinglucuronid überführt. Eine weitere Möglichkeit ist die passive Diffusion vom Aglycon in die Epithelzelle, nachdem Quercetinglycoside durch Lactase-Phlorizin-Hydrolase hydrolysiert werden. Daten zur Bioverfügbarkeit von Polyphenolen sind bis jetzt noch sehr begrenzt. WARDEN et al. (2001) untersuchten die Aufnahme von Catechinen beim Menschen nach Konsum von Tee. Die Autoren stellten eine signifikante Erhöhung der Plasmakonzentrationen von Epigallocatechin, Epicatechin und Epigallocatechingallat innerhalb eines Zeitraumes von 5-8 Stunden nach Beginn der Intervention im Vergleich zur Konzentration im Nüchternplasma fest. Epigallocatechin und Epicatechin wiesen eine signifikant höhere Ausscheidung im Urin im Vergleich zum Nüchternurin auf. HODGSON et al. (2002) nannten 4-O-Methylgallussäure als den Hauptmetabolit von Gallussäure nach Konsum von schwarzem Tee. Von PIETTA et al. (1998) wurden im Urin die Metaboliten 4-Hydroxybenzoesäure, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, 3-Methoxy- 4-hydroxyhippursäure und 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure) mittels elektrochemischer Detektion nachgewiesen. LI et al. (2001) beschrieben Ringspaltungen von Epicatechinen, bei denen Trihydroxyphenylvalerolactone und Dihydroxyvalerolactone entstanden. LEE et al. (2002) beschrieben ebenso diese Valerolactone nach Konsum von grünem Tee und sahen in diesen den möglichen Einsatz als Biomarker nach Teekonsum an. 20

31 Schrifttum Der Metabolismus der Polyphenole findet hauptsächlich im Dickdarm durch Bakterien und nach der Absorption in der Leber statt (HOLLMAN et al. 1995). Dabei werden die Polyphenole von der Mikroflora des Dickdarms in einfachere Substanzen umgewandelt, wie etwa Benzoesäure, Hydroxybenzoesäure und Hydroxyphenylessigsäuren, die dann absorbiert, metabolisiert und ausgeschieden werden (CLIFFORD 2000). Ob und welche Rolle andere Organe, wie Niere oder Darmwand, spielen, wurde bisher nicht untersucht. In der Leber werden aufgenommene Polyphenole oder ihre Metabolite aus der Dickdarmflora glucuronisiert und sulfatiert. Auch eine Methoxylierung von phenolischen Hydroxylgruppen wurde nachgewiesen. Nur geringe Mengen werden unverändert mit dem Harn ausgeschieden. Nicht aufgenommene Polyphenole werden im Dickdarm von Bakterien abgebaut und die Abbauprodukte ausgeschieden. Die wichtigsten Reaktionen der Bakterien sind die Hydrolyse von Konjugaten und Glycosiden sowie die Ringspaltung der Aglycone bei Flavonoiden. Zum Teil werden im Dickdarm entstandene Metabolite der Polyphenole absorbiert und ausgeschieden (RECHNER 2000). Glycosidisch gebundene Phenole können durch Glycosidasen, Glucuronidasen und Sulfatasen von Dickdarmbakterien zu Aglyconen abgebaut werden. Die Phenolsäuren werden im Kolon absorbiert und können im Harn nachgewiesen werden. Für Flavonole und Flavanole wurde gezeigt, dass nur 1-2 % der oral aufgenommenen Menge mit intakter Grundstruktur ausgeschieden werden. Das deutet auf eine extensive Metabolisierung hin. Weiter konnte gezeigt werden, dass gesunde Probanden % der oral aufgenommenen Menge an Quercetin absorbieren. Die intestinale Mikroflora war primär dafür verantwortlich, dass ein Großteil davon in der Atemluft nachzuweisen war. Dies würde erklären, weshalb bei Bilanzstudien nur eine geringe Menge der applizierten Dosis in Plasma, Urin und Stuhl nachgewiesen werden konnte (SCALBERT 2000). Zurzeit ist unklar, ob und wo Flavonoide in Körpergeweben gespeichert werden können. Zur intrazellulären Verteilung der Flavonoide gibt es wenige Informationen. Wegen ihrer Fettlöslichkeit könnten Flavonoidglycoside vorwiegend in der Zellmembran lokalisiert sein. 21

32 Schrifttum Physiologische Wirkungen der Polyphenole Phenolische Verbindungen dienen in Pflanzen als Pigmente, Attraktantien, Phytoalexine (z. B. zum Schutz vor Pilz- und Bakterieninfektionen) und zum Schutz vor UV-Strahlung und vor Insekten. Darüber hinaus sind sie an der Regulation des pflanzlichen Hormonhaushaltes und der Enzymaktivität beteiligt und tragen zum Geschmack und zum Aussehen bei (FLESCHHUT 2004). Im Körper werden sie mit einer Reihe von gesundheitsfördernden Wirkungen in Zusammenhang gebracht, die auf verschiedene Wirkmechanismen zurückgehen. Aufgrund der antioxidativen, antithrombotischen, antikanzerogenen und östrogenen Wirkungen sind phenolische Inhaltsstoffe besonders in Weinen und Trauben (CASTELLARI et al. 2002) gut untersucht und haben auch aus humanmedizinischer Sicht stark an Bedeutung gewonnen. Den Polyphenolen werden noch weitere physiologische Wirkungen zugeschrieben, u. a. antimikrobiell, immunmodulierend, entzündungshemmend, den Blutdruck und den Blutglucosegehalt beeinflussend (BUDDECKE 1980, CHHABRA et al. 1984, LANDAU und YANG 1997, GEE und JOHNSON 2001, YANG et al. 2001, MCKAY und BLUMBERG 2002). In verschiedenen epidemiologischen Studien wird der Zusammenhang zwischen dem Verzehr von ausreichend Obst und Gemüse und dem verringerten Auftreten degenerativer Erkrankungen (Herz-Kreislauferkrankungen und Krebs) den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen zugesprochen (TIJBURG et al. 1997). Gleichzeitig finden sich in der wissenschaftlichen Literatur sehr widersprüchliche Aussagen zu den gesundheitlichen Wirkungen von Polyphenolen. Zum Beispiel wird Quercetin einerseits als antikanzerogen und Antioxidans in Säften und Weinen eingestuft (HERTOG 1998) und andererseits wird auf seine mutagenen (MAC GREGOR 1984) und kanzerogenen Eigenschaften (DUNNICK und HAILEY 1992) hingewiesen. Diese Bewertungen erfolgten hauptsächlich aufgrund von in vitro Tests 22

33 Schrifttum oder Modellversuchen, doch für viele der beschriebenen Wirkungen fehlen in vivo Nachweise Malabsorbtion Polyphenole können die Absorption anderer Nahrungsmittelinhaltsstoffe stark beeinflussen. Dies kann sowohl positiv als auch negativ sein. Sie sind in der Lage, Proteine zu binden oder Enzyme zu hemmen und dadurch die weitere Verdauung anderer Stoffe (wie Polysaccharide) zu verringern (BUTLER und ROGLER 1992). HURRELL et al. (1997) haben in Korrelation zum Polyphenolgehalt eine Verringerung der Eisenverfügbarkeit nachweisen können. Bei der Verfütterung von Eicheln sind aufgrund des hohen Polyphenolgehalts ähnliche Wechselwirkungen möglich Functional Food Die Bedeutung der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe in der Lebensmittelindustrie ist laut dem Ernährungsbericht 2000 in den letzten Jahren aufgrund ihrer gesundheitsfördernden Eigenschaften gestiegen, wobei Daten zum Einfluss der Verarbeitung auf die Gehalte an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen nur begrenzt vorhanden sind (DEUTSCHE GESELLSCHAFT FÜR ERNÄHRUNG 2000). In den letzten Jahren stehen zunehmend die Funktionellen Lebensmittel im Interesse der Lebensmittelindustrie. Der Begriff Funktionelle Lebensmittel stammt ursprünglich aus Japan. Mitte der 80er Jahre des vergangenen Jh. wurde dort ein funktionelles Lebensmittel als ein Lebensmittel definiert, welches der Stärkung spezifischer Körperfunktionen dient und damit zur Verbesserung der Ernährungssituation und zur Prävention vor Erkrankungen beiträgt. Die Qualität des Lebensmittels besteht in mehr als nur dem bloßen Nährwert (PASCAL 1996, KUHNERT 2002). Hierbei kann es sich um ein verarbeitetes Lebensmittel handeln, 23

34 Schrifttum dem bei der Herstellung Zusatzstoffe zugesetzt werden. In den meisten Fällen handelt es sich aber um natürliche Lebensmittel, die bereits durch ihre eigenen Wirkstoffe zu einer vollwertigen Ernährung beitragen. Durch Auswahl, Selektion und Reinigung werden bestimmte Wirkstoffe konzentriert. Davon abzugrenzen sind die Nahrungsergänzungsmittel. Sie sind konzentrierte Quellen ausgewählter Nährstoffe, angeboten in dosierter Form und dazu bestimmt, die normale Ernährung um diese Nährstoffe zu ergänzen (SCHROETER 2001). Wissenschaftlich sind funktionelle Lebensmittel besonders aufgrund ihrer Wirkung im Gastrointestinaltrakt (Pro- und Präbiotika), des antioxidativen Wirkmechanismus und des Metabolismus von Hauptnährstoffen interessant (ROBERFROID 2000). Gesundheitlicher Nutzen ist aufgrund des hohen Polyphenolgehaltes auch bei genießbaren Eichelarten zu erwarten. Dies ist in einigen Studien (z. B. zu der Native Californian Diet, MEYERS et al. 2006) bereits nachgewiesen worden Botanik der Eiche Die Eiche gehört zur Familie der Buchengewächse (Fagaceae). Zu ihnen gehören auch die Buchen, Birken, Ulmen, Hanfgewächse und Brennnesselgewächse. Die Gattung Eiche umfasst etwa 500 Arten. Die größte Vielfalt an Eichenarten liegt in Asien und in Amerika vor. In Europa findet man lediglich 17 Arten, während in Afrika keine einheimischen und in Australien gar keine Eichen beheimatet sind (STRASBURGER 1998). Der Name Eiche kommt aus dem Germanischen. Die alte nordische Bezeichnung Eik galt grundsätzlich für alle Bäume. Der botanische Gattungsname Quercus war die römische Bezeichnung für die Eiche. Der Artname robur bedeutet Kraft und Stärke, womit auf die Festigkeit des Holzes hingewiesen wird. 24

35 Schrifttum Dem Typ der Deutschen Eiche entspricht am besten die Stieleiche aufgrund der Wuchsform mit einer breiten, kugeligen Krone und ihrer Blattart (gelappt, kurzgestielte und langgestielte Eicheln). Die Eiche gilt in Deutschland als König der Bäume. Eichen wachsen dank ihrer Anpassungsfähigkeit in einer Reihe unterschiedlicher Habitate. Sie blühen im Frühling noch bevor die Blattknospen aufbrechen. Manche Arten verlieren im Herbst ihre Blätter, andere sind immergrün (DENGLER 1980). Das Alter, das Eichen erreichen können, liegt an der Obergrenze der für einen Laubbaum möglichen Lebenspanne. Sie werden wesentlich älter als Buchen oder Linden und können ein Alter von tausend Jahren und mehr erreichen. Dabei kommen Samenjahre etwas häufiger vor als z. B. bei der Buche, ganz samenlose Jahre sind selten. Die Eicheln bleiben nur in dem Jahr nach der Reife keimfähig, keimen aber sehr leicht. In den ersten 4-6 Jahren wachsen die jungen Pflanzen ungerade und knickig, erst mit Jahren beginnt der Stamm sich zu strecken. Im mittleren Lebensalter hat die Eiche den stärksten Zuwachs, im hohen Alter setzt sie nur noch sehr dünne Jahresringe an. Dann tritt häufig Kernfäule ein, was sich negativ auf die Standfestigkeit auswirkt (STRASBURGER 1998). Die längliche Frucht wird von der schalenförmigen, aus zahlreichen verkümmerten Deckblättern (oder Schuppen) bestehenden Fruchthülle mehr oder weniger umgeben oder eingeschlossen. Die Eichel zählt zu den coenokarpen Nussfrüchten (EHRENDORFER 1998). 25

36 Schrifttum C D A B Abbildung Schematische Darstellung der Eichel, Q. robur A Blühender Spross, B Fruchtstand, C Reifer Samen, längs geteilt, D Reife Cupula, Fruchtbecher, napfförmig, mit Schuppen besetzt Kein Baum beherbergt so viele Insekten wie die Eiche. Besonders bemerkenswert sind die Gallwespen, die nahezu ausschließlich auf Eichen leben. Gallwespen erzeugen auf den Blättern Galläpfel, an den jungen Früchten Knoppern, die aber wenig wertvoll sind. Schädlinge der Eiche sind z. B. der Maikäfer, der Prozessionsspinner und der Eichenblattwickler. Außerdem kann die Eiche eine Reihe von Krankheiten bekommen (Sonnenbrand, Stock- und Kernfäule, Wipfeldürre, Krebs). Eichen haben ein haltbares, widerstandsfähiges Holz und sind daher wichtige Nutzholzbäume (MANTEL 1990). Das Holz ist unter allen klimatischen Verhältnissen sehr dauerhaft und dient u. a. als Schiffbauholz. Insbesondere wird es in der Möbelindustrie, als Dielenholz und für Wein- und andere Fässer verwendet. Aus der dicken, schwammigen Rinde der Korkeichen, die in mediterranen Gegenden vorkommen, wird Kork gewonnen. Manche Arten liefern Tannine, die bei der Ledergerbung Verwendung finden. 26

37 Schrifttum Die wichtigste Eiche Deutschlands ist wohl die Stieleiche (Sommereiche, Q. robur L., Q. pedunculata Ehrh.). Wenn dieser Baum nicht im Wald sondern als Solitär wächst, bekommt die Stieleiche eine schön kugelig gewölbte, breite und hohe Krone. Diese Art wird bis über 50 m hoch, der Stamm bleibt in den ersten 50 Jahren glatt, entwickelt dann aber im höheren Alter die charakteristische, tiefrissige Borke. Die Krone ist nie dicht und wird von vielfach gekrümmten und geknickten Ästen und Zweigen gebildet. Die Blätter sind ca. 14 cm lang und bis 8 cm breit, derb, buchtig gelappt und kurzgestielt. Die Oberseite des Blattes ist dunkelgrün, die Unterseite dagegen hellgrün. Am Rand ist das Blatt meist etwas gewellt. Die Stieleiche blüht nahezu zeitgleich mit der Entfaltung der Blätter und trägt 1-3 sitzende Früchte an einem etwa 5 cm langen Stiel. Die Eichel an sich ist eiförmig mit einer Länge von 1,5-2 cm (STRASBURGER 1998). Am besten gedeiht diese Eichenart auf fruchtbarem, lockeren Aueboden der Ebene, wächst aber auch noch in lehmigem, frischem Sandboden. Außerdem ist sie sehr anpassungsfähig und verträgt starke klimatische Veränderungen, die manch anderer Baum nicht überleben würde. Die Wintereiche (Steineiche, Q. petraea Liebl., Q. sessiliflora Salisb., Q. robur Mill.) hat im Gegensatz zur Stieleiche deutlich gestielte Blätter ohne ohrähnliche Anhängsel an der Basis und trägt gedrängt stehende, mehr eiförmige Eicheln auf einem sehr kurzen Fruchtstiel (daher auch Traubeneiche genannt). Auch sie blüht mit Entfaltung der Blätter, schlägt aber etwa 14 Tage später aus als die vorige Art. Die Blätter haben 6-8 regelmäßigere Einschnitte und sind zierlicher. Der Baum bleibt meist niedriger, erscheint gedrungener, erreicht kein so hohes Alter und verbreitet sich nicht so weit wie die Sommereiche (STRASBURGER 1998). Neben den in Mitteleuropa und nördlichen Gefilden vorkommenden Arten werden zunehmend mehr Eichen aus fremden Ländern hier kultiviert. Alle Eichenarten aufzuführen, sprengt den Rahmen, trotzdem sollen noch stellvertretend die Arten genannt werden, die für diese Arbeit relevant sind: 27

38 Schrifttum Die Roteiche (Q. rubra L.) hat langgestielte, gefiederte, nur in der Jugend behaarte, cm lange Blätter und große, eirunde Früchte. Diese sticht vor allem im Herbst durch ihre tief scharlachrote Blattfärbung hervor. Die Roteiche bildet in Nordamerika ausgedehnte Wälder und liefert so viel Gerbrinde. Diese Art bildet erst im zweiten Jahr reifende Früchte (STRASBURGER 1998). In südeuropäischen Ländern dominieren Quercus cerris L. (Zerreiche) und Quercus ilex L. (Grüneiche) nach LÜTTGE et al auch Steineiche genannt. Die Zirn- oder Zerreiche (österreichische, burgundische Eiche, Q. cerris L.) hat gestielte, längliche, buchtig fiederspaltige oder oberflächlich gelappte Blätter und steife, lange, abstehende Schuppen auf der Fruchthülle. Ihre Früchte sind essbar. Die Zerreiche wächst in Südeuropa auch diesseits der Alpen in Ungarn, Serbien sowie in Kleinasien und Syrien. Die immergrüne Eiche (Q. ilex L.) wächst als 2,5-3,8 m hoher Strauch in den Mittelmeerländern und auf den Inseln im Mittelmeer. Die Blätter sind relativ klein, gestielt, rundlich oder länglich und buchtig gezahnt. Die langen Früchte der immergrünen Eichen werden in Spanien, Südfrankreich und Nordafrika gegessen und heißen Ballota (daher Q. ballota Desf.). Übersicht 2.2. Charakteristika der Eichen, deren Eicheln für diese Arbeit genutzt wurden Q. robur L. Q. petraea Liebl. Q. rubra L. Baumhöhe über 50 m ca. 50 m ca. 50 m Blatt 14 cm x 8 cm 12 cm x 6 cm cm buchtig gelappt kurze Einschnitte gelappt bis gezackt kurzgestielt langgestielt mittel Frucht langer Stiel kurzer Stiel kurzer Stiel 1,5 2 cm 1,5 2 cm 2 cm eiförmig eiförmig rundlich 28

39 Schrifttum Vorkommen von Eichen und deren Nutzung Der Flächenanteil der Eichenarten Stieleiche (Quercus robur L.) und Traubeneiche (Quercus petraea MATT. LIEBL.) beträgt in der Bundesrepublik Deutschland laut BML (1998) 9 % der Waldfläche. Die Ergebnisse der Bundeswaldinventur Oktober 2002 zeigen, dass rund 11,1 Mio. Hektar mit Wald bedeckt sind (knapp ein Drittel der Gesamtfläche). Der deutsche Wald wird von Fichte (Flächenanteil 28,2 %), Kiefer (23,3 %), Buche (14,8 %) und Eiche geprägt (Abb. 2.6.). Übersicht 2.3. Waldfläche bezogen auf Gesamtbaumbestand nach Baumartengruppen Alle Laubbäume: 4,2 Mio. Hektar, davon 1,6 Mio. Hektar Buchen als Vergleich zu 1,0 Mio. Hektar Eichen; Alle Nadelbäume: 6,1 Mio. Hektar (Quelle: BWI, 2003) Eiche Buche alle Nadelbäume alle Laubbäume Die Eiche nimmt somit ungefähr 1 Mio. Hektar der deutschen Waldfläche ein. Würde man die komplette Fläche für die Ernährung von Schweinen im Herbst nutzen, könnten pro Jahr in Deutschland zwischen und Schweine auf diese Art gemästet werden (HUSS 1999). Vorausgesetzt sind gute Erntejahre und entweder die Möglichkeit, Schweine in Herden in die Wälder zu treiben oder Erntegeräte, mit denen möglichst alle Eicheln für die Stallmast gewonnen werden können. 29

40 Schrifttum Den wirtschaftlich wichtigsten Nutzen liefern Eichen mit ihrem Holz, das in vielfältiger Weise für den Möbelbau, Hausbau und verschiedene weitere Möglichkeiten genutzt wird. Sehr große Bedeutung hat der Eichenschälwaldbetrieb. Er ist ein Nutzwald mit meist 20jährigem Umtrieb; in dieser Zeit hat die Eiche den größten Zuwachs, der Stamm hat sich gestreckt und kann optimal genutzt werden. Die Traubeneiche ist die für diesen Betrieb geeignetste Eichenart. Sie beherrscht in Deutschland ein weitaus größeres Gebiet als die Stieleiche. Das Saatgutaufkommen von Quercus robur und Quercus petraea unterliegt starken Schwankungen, in sogenannten Vollmastjahren ist nach SCHRÖDER (1999) mit einem Saatgutaufkommen von bis zu t zu rechnen. SEEGER (1930) schreibt, dass Eichelmastjahre alle 7-8 Jahre eintreten. In der Zeit von 1983 bis 1995 betrug die mittlere Inlandernte bei Quercus robur ca. 300 t und bei Quercus petraea ca. 420 t (BEF 1993 und BLE 1997, cit. ex. SCHRÖDER 1999). Der hohe Wassergehalt und die metabolische Aktivität der Eicheln stellen ein großes Problem für die Lagerung dar. Eicheln lassen sich aufgrund ihres hohen Wassergehaltes und der damit verbundenen Gefahr der intrazellulären Eisbildung nicht durch tiefere Frosttemperaturen (um 5 C und darunter) in eine Zwangsruhe versetzen. Bei Temperaturen um 0 C und höher sowie rekalzitranzkonformer Luftfeuchtigkeit im Lager sind Eicheln jedoch physiologisch aktiv, keimen und/oder verlieren durch physiologische Alterung ihre Vitalität (PAMMENTER et al. 1994). Phytosanitäre Probleme (Pilzkrankheiten) verschärfen die Lagerproblematik unter rekalzitranzkonformen Klimabedingungen. SCHRÖDER (1999) gelangt zu dem Ergebnis, dass eine Lagerung bei 1 C bis 3 C nach vorher erfolgtem Abschwemmen und Thermotherapie bei Aufrechterhaltung der Feuchte im Saatgut von über 40 % das derzeit optimale Verfahren darstellt. Das Abschwemmen wurde bereits 1874 von MANTEUFEL (cit. ex. SCHRÖDER) beschrieben und später verschiedentlich als notwendig bestätigt. 30

41 Schrifttum Bei der von DELATOUR (1978) eingeführten Thermotherapie wird das Saatgut bei 41 C bis 42 C für zwei Stunden im Wasserbad therapiert, um den Schwärzepilz Ciboria batschiana (Zopf) Buchwald zu bekämpfen. Damit wurde erreicht, dass Eicheln für mehrere Jahre bei Erhalt einer hohen Keimfähigkeit bevorratet werden konnten. Seit langem ist bekannt, dass Eicheln die Fähigkeit besitzen, eine gewisse Frosthärte aufzubauen; diese veranlasste GUTHKE (1993) zu weiteren systematischen ökophysiologischen Beobachtungen und Versuchen, die Eicheln im Kühlraum kontrolliert abhärten zu lassen Entwicklung des Samens Nach der Befruchtung der Samenanlagen entwickelt sich aus der Blüte die Frucht. Die nur bei den Samenpflanzen vorkommende Einheit aus Samenschale (Testa), Perisperm (Nucellus, Makrosporangium), Endosperm (Makroprothallium) und Embryo wird Same genannt. Der Anteil der einzelnen Teile wird dabei vor allem dadurch bestimmt, wo die Reservestoffe für den Keimling gelagert sind. Ein aus dem Nucellus hervorgehendes Speichergewebe wird Perisperm genannt. Das aus dem Makroprothallium hervorgehende Speichergewebe heißt Endosperm (SITTE 1998). Die Frucht der Eiche wird aufgrund ihres Aufbaus zu den Nüssen gezählt. Der Samenmantel (Abb ) der Nuss ist hart. Die Frucht öffnet sich nicht, sie enthält immer nur einen Samen. Die Nussfrucht Eichel wird an ihrer Basis von einem napfbis becherförmigen, beschuppten oder filzig behaarten Fruchtbecher (Cupula, vgl. Abb )) umschlossen, aus dem sie nach der Reife herausfällt (EHRENDORFER 1998). Die schematische Darstellung vom Blütenstand der Eiche und der reifen Eichel (inkl. Querschnitt) ist in Abbildung 2.12., Kapitel 2.2., zu finden. In Abbildung ist der Aufbau der Eichel gezeigt. 31

42 Schrifttum Embryo Nährgewebe (Endosperm) Samenschale (Testa) Samenmantel (Arillus) Abbildung Aufbau der Eichel Im Keimling werden Nährstoffe hauptsächlich in den beiden Keimblättern deponiert. Hierfür sind die Samen der Fabaceae (z. B. Bohnen, Erbsen) und die Eichel ein gutes Beispiel. Die nächste entscheidende Phase nach der Ausbreitung der Samen ist die Keimung und die Etablierung der Jungpflanze. Die Keimpflanze hat es umso leichter, je mehr Reservestoffe sie von der Mutterpflanze im Samen mitgebracht hat. Für die hypogäische Keimung (wie bei der Eichel) wird zunächst das Epicotyl gestreckt, die Keimblätter verbleiben im Boden und die ersten Laubblätter (Primärblätter) entfalten sich oberhalb der Erdoberfläche. Abbildung Grundtypen der Keimung (Quelle: EHRENDORFER 1998) 32

43 Schrifttum Man unterscheidet epigäische Keimung von der hypogäischen. Bei der hypogäischen Keimung dienen die Keimblätter ausschließlich der Nährstoffresorption aus dem Nährgewebe oder als Nährstoffspeicher innerhalb der Samenschale. Sie verbleiben daher im Samen und die ersten photosynthetisch aktiven Blätter sind nicht die Keimblätter, sondern Primär- oder Niederblätter. Für die Definition von hypogäischer und epigäischer Keimung (Abbildung 2.14.) ist nicht die relative Lage des Samens zum Substrat wichtig, sondern nur, ob die Keimblätter entfaltet werden und der Photosynthese dienen oder ob sie nicht entfaltet im Samen verbleiben. Gerade besonders große Samen oder Früchte (wie die Eichel) gehören dem hypogäischen Typ an, keimen in der Regel aber auf der Bodenoberfläche (EHRENDORFER 1998). Die gekeimte Eichel spielt in der Tierernährung bisher keine bedeutende Rolle, soll hier aber angeführt werden, da sie in der Freilandhaltung von Tieren durchaus aufgenommen werden kann. Außerdem wird sie in der Literatur für die Stallmast empfohlen, da durch die Keimung der Nährwert steigt und die Tiere sie bevorzugt aufnehmen (NEHRING 1972). Aufgrund des hohen Aufwands bei gezielter Keimung und der höheren Gefahr von Schimmelbildung spielt die gekeimte Eichel heute eine eher nebensächliche Rolle. Die in der Tierernährung eingesetzten Eicheln werden in Kapitel weiter beschrieben. Die erstmals hergestellte Eichelsilage, die für diese Arbeit zur Untersuchung zur Verfügung stand, ist im Kapitel im Zusammenhang mit dem anderen Untersuchungsmaterial aufgeführt, da in der Literatur keine Angaben zur Eichelsilage zu finden waren. 33

44 Schrifttum 2.3. Beschreibung und Nutzung der Eichel Nährwerte Eichenrinde, Cortex Quercus, und Eicheln, Semen Quercus, werden in der Literatur als potenzielle Drogen genannt. Früchte, Blätter und Rinde sind als wirkstoffhaltige Pflanzenteile beschrieben, wobei als Hauptwirkstoffe die Gerbstoffe zählen. Deren Gehalt beträgt in der Rinde bis zu 20 % und in Blättern und grünen Früchten 15 %. Bei allen genannten Arten ist der Gerbstoffgehalt hoch und dadurch ist eine ähnliche Wirkung zu erwarten. Im HUNNIUS (2004) wird der Gerbstoffgehalt von Semen Quercus (Eicheln) mit 6 bis 9 % angegeben, v. a. bestehend aus Quercit C 6 H 12 O 5, dem Eichelzucker. Eicheln, die Früchte der Eichen, bestehen aus dem dünnen, schalenartigen, zerbrechlichen Fruchtgehäuse, einer braunen Samenhaut und den aus zwei großen, gewölbten, fleischigen Keimblättern gebildeten Samen, welche unter ihrer Spitze die kleinen, aufwärts gerichteten Wurzeln samt der Knospe bergen. Die Eicheln der deutschen Eichen (Q. petraea Liebl. und Q. robur L.) schmecken sehr schwach süßlich, und mal mehr, mal weniger stark bitter mit adstringierender Wirkung, während die Eicheln mancher südlicher Arten wohlschmeckend sind. Eicheln zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an Kohlenhydraten (hauptsächlich Stärke, glycosidartige Verbindungen) sowie einen niedrigen Protein- und mäßigen Rohfasergehalt aus. Da die Verfütterung von entschälten Eicheln als günstiger empfunden wurde, hat bereits ENGELS (1913) ganze Eicheln, aber auch Schalen und Kerne separat auf ihre Zusammensetzung untersucht. Der Rohfasergehalt ist in den Schalen erwartungsgemäß hoch und erreicht nahezu 50 %. Die Kohlenhydrate in geschälten Eicheln bestehen hauptsächlich aus Stärke. Neben Zucker liegen als andere lösliche Bestandteile u. a. Gerbsäure und Zitronensäure vor. Der Gerbstoffgehalt von entschälten Eicheln wird von ENGELS (1913) mit etwa 7 % angegeben. 34

45 Schrifttum Tabelle 2.3. Zusammensetzung der Eicheln us = ursprüngliche Substanz, TS = Trockensubstanz, OS = Organische Substanz, bezogen auf TS, Rp = Rohprotein, Rf = Rohfett, Rfa = Rohfaser, NFE = N-freie Extraktstoffe, Asche gleichzusetzen mit Rohasche; ( * diese Angaben weisen Diskrepanzen in der Trockenmasse im Vergleich zu frischen Eicheln auf) Literaturstelle Eicheln TS OS Rp Rf Rfa NFE Asche % us % TS Engels (1913) ganz 62,9 97,2 6,1 3,1 9,9 78,1 2,8 Kerne 97,2 6,6 3,4 4,0 83,2 2,8 Schalen 97,7 3,4 1,0 49,3 43,4 2,3 DLG-Werte frisch 60,3 98,4 3,5 2,0 6,4 46,8 1,6 (ca.1960) getrocknet 86,9 97,4 6,2 3,7 12,6 61,8 2,6 Nehring (1972) frisch, unentsch. 88,0 97,6 6,5 4,9 14,1 72,1 2,4 getrocknet, unentsch.* 88,0 97,0 7,1 4,3 14,5 71,1 3,0 getrocknet, entschält * 88,0 97,0 7,9 5,4 6,7 77,0 3,0 Furr et al. (1979) Kerne Rakic et al. (2005) getrocknet 92,1 97,9 4,2 2,1 Institut für Tierernährung, Tierärztliche Hochschule (2005) ganz 33,4 97,9 5,7 8,3 14,5 69,4 2,1 Bereits 1883 hat HORNBERGER den Gehalt an Mineralstoffen in Eicheln bestimmt. Auch ENGELS (1913) hat ähnliche Werte gefunden. Er gibt für Kerne 0,9 g/kg Calcium und 1,5 g/kg Phosphor an, die Werte für Schalen liegen bei 2,6 g/kg Calcium und 0,6 g/kg Phosphor. Tabelle 2.4. Mengen- und Spurenelemente in Eicheln; Gehalte in g/kg TS Ca P Mg Na K S Cl Si Fe Cu Zn Mn Hornberger (1883) 1,1 1,4 0,7 0,1 11,6 0,4 0,4 0,1 Engels (1913) 0,9 1,5 Furr et al. (1979) 0,9 0,5 0,01 8,5 1,2 0,05 0,02 0,08 0,007 0,02 0,004 Rakic et al. (2005) 1,0 1,0 0,4 8,3 0,04 0,006 0,01 0,003 Institut für Tierernährung, Tierärztliche Hochschule (2005) 1,7 1,4 0,5 0,4 9,0 0,2 0,03 0,004 0,01 0,02 Die Futteranalysen der einzelnen Autoren bestätigen sich gegenseitig, die Ergebnisse sind nahezu identisch, vereinzelte Diskrepanzen können sich durch bessere Analysentechnik, aber auch durch mögliche Unterschiede in der Lagerung oder im Reifezustand der Eicheln erklären. 35

46 Schrifttum FURR et al. (1979) haben in ihrer umfassenden Arbeit über Nussbäume und deren Früchte zu den in Tabelle 2.4. aufgeführten Mengen- und Spurenelementen noch weitere in Eicheln nachweisen können. Sie fanden im Vergleich zu anderen Nüssen in Eicheln einen hohen Gehalt an Bor (1,8 mg/kg TS), zusätzlich konnten sie Spuren von Brom, Fluor und Titan nachweisen. Die Untersuchungen des Instituts für Tierernährung, Tierärztliche Hochschule Hannover (2005), ergaben einen Stärkegehalt von 134,5 g/kg ursprüngliche Substanz. In einem Kilogramm frischer Eicheln sind 21,6 g Zucker nachweisbar. Außerdem wurde Selen mit 0,03 mg/kg Trockensubstanz gefunden. Auch FURR et al. (1979) konnten in den von ihnen analysierten Eicheln 0,03 mg Selen/kg Trockensubstanz ermitteln. Tabelle 2.5. Fettsäurezusammensetzung in Eicheln us = ursprüngliche Substanz, Rf = Rohfett Literaturstelle Rohfett (% us) Ölsäure (% Rf) Linolsäure (% Rf) Palmitinsäure (% Rf) Linolensäure (% Rf) Stearinsäure (% Rf) León-Camacho et al. 5, (2004) Cantos et al. (2003) 2, ,8 2 Nur wenige Autoren bestimmten die Zusammensetzung der Fettsäuren in Eicheln näher. Der Rohfettgehalt (Rf; gesamter Fettgehalt) der anderen Autoren ist in Tabelle 2.3. aufgeführt. LEÓN-CAMACHO et al. (2004) untersuchten die ganzen Eicheln der Arten Q. ilex, Q. suber und Q. faginea einschließlich der sie noch umschließenden Schalen. Der Rohfettgehalt der drei Eichelarten variiert von 6,9 % bis 4,1 %, was mit den Angaben der anderen Autoren übereinstimmt. CANTOS et al. (2003) standen Eicheln von Q. ilex, Q. rotundifolia und Q. suber für die Untersuchungen des Fettsäuremusters zur Verfügung. Der Hauptanteil der Fettsäuren besteht in Übereinstimmung aller Autoren aus Ölsäure sowie Linolensäure. 36

47 Schrifttum LEÓN-CAMACHO et al. (2004) ermittelten außerdem die Gehalte der Tocopherole in den drei von ihnen untersuchten Eichelarten. Auffällig ist der hohe -Tocopherolgehalt (281,0 mg/kg ursprüngliche Substanz). Der Anteil an -Tocopherol ist mit 21,7 mg/kg ursprüngliche Substanz deutlich niedriger. Auch CANTOS et al. (2003) analysierten diese Gehalte. Sie wiesen 29,3 mg/kg - -Tocopherol nach. Die Verdaulichkeit der ungeschälten Eicheln wird von WEISKE (1879) und Mitarbeitern als durchaus günstig angegeben. Für ungeschälte Früchte wird bei Schweinen eine Gesamtverdaulichkeit von etwa 65 % genannt. Bei geschälten Früchten erreicht die Verdaulichkeit der organischen Substanz sogar über 80 %, wobei sich hier das Rohprotein als unverdaulich erweist. In der Schweinefütterung sind Eicheln daher als reine Kohlenhydratquelle anzusehen, eine entsprechende Eiweißzufuhr muss zusätzlich erfolgen. HUMPHREYS (1988) wies den hohen Gehalt an Catechin-Gerbstoffen in allen Teilen der Eiche nach. Den höchsten Gerbstoffgehalt hat die durchsaftete Eichenrinde (bis 20 %), gefolgt von Knospen und jungen bzw. grünen Blättern. Dann folgen grüne, unreife und noch weiche Eicheln mit einem Gehalt von bis zu 15 %. Nur geringe Mengen an Gerbstoffen liegen in trockenem Laub, braunen Früchten und im Holz vor. Entgegen landläufiger Meinung enthalten Eicheln oder vielmehr ihre Schalen keine Blausäure. Durch Rösten der Eicheln (möglichst zuvor von der Samenschale befreite Eicheln) wird der Gerbstoffgehalt reduziert und der Zucker wird in Dextrine umgewandelt (HUNNIUS 2004). Durch Auslaugen oder Dämpfen entbitterte, getrocknete und gemahlene Eicheln können als Mehlersatz genutzt werden. Geschälte und geröstete Eicheln dienen als Kaffeesurrogat. Eicheln sollen auch einen sehr reinen, dem Kornbranntwein ähnlichen Spiritus geben, wenn die Kohlenhydrate zu Alkohol vergoren werden. 37

48 Schrifttum Veränderungen in Früchten während des Wachstums Früchte mit den sich darin oder darauf entwickelnden Samen dienen der Erhaltung und Verbreitung der Art. Die im Verlauf der Phylogenese selektiv erworbenen Methoden zum Schutz der unreifen, d. h. noch nicht keimfähigen Samen sind unterschiedlich, aber in jedem Fall wirksam. Im einfachsten Fall sind die Früchte vor der Reife, d. h. vor der Keimfähigkeit der Samen, grün, was einen gewissen Schutz gegen das Gesehenwerden im grünen Blattwerk aus größerer Entfernung bedeutet. Auffällig anders gefärbt werden sie erst relativ spät. Zu diesem Zeitpunkt der Entwicklung steigt die Attraktivität für Nahrungssuchende durch Abnahme der Festigkeit, der titrierbaren Säuren, des Gesamt-Pektingehaltes und des Chlorophylls; dagegen nehmen gleichzeitig lösliches Pektin, Zucker, Carotinoide und Anthocyane zu (FRANK 2004). U N R E I F Pektin Säuregehalt Chlorophyll Lösliches Pektin Carotinoide Anthocyane Zucker R E I F Abbildung Veränderungen während der Reife von Früchten Die chemische Zusammensetzung von Frucht und Samen verändert sich während der Entwicklung. Daher ist auch während der Reifung der Eichel zu erwarten, dass sich die Gehalte der einzelnen Inhaltsstoffe von der jungen, grünen Eichel zur reifen, kräftig braunen Eichel, die aus ihrem Kelch auf den Boden fällt, deutlich verändern. Die in Kapitel erwähnten Schutzstoffe sind vor allem in grünen Eicheln zu erwarten. Bei reifen Eicheln dient dagegen in erster Linie die Schale zum Schutz, außerdem wirkt der hohe Gehalt an Polyphenolen als Fraßhemmer. Tritt die Keimung des reifen Samens ein, so erhöht sich auch in Eicheln der Stärkeanteil und damit die Nährkraft (vgl. Kap ). Aufgrund der Zunahme des ölhaltigen Keims ist bei gekeimten Eicheln außerdem mit einem höheren Ölanteil zu 38

49 Schrifttum rechnen, dazu sind allerdings in der Literatur in Bezug auf Eicheln keine Angaben zu finden, und dieser Aspekt ist auch in dieser Arbeit nicht weiter untersucht worden Eicheln in der Humanernährung Wer sich reichlich mit Obst und Gemüse ernährt, versorgt seinen Körper nicht nur mit essentiellen Vitaminen, Mengen- und Spurenelementen sowie Ballaststoffen, sondern auch mit bioaktiven Substanzen. In der Humanernährung spielen Eicheln als Quelle bioaktiver Nahrungsmittel allerdings nur eine unbedeutende oder vielmehr unbeachtete Rolle. Eicheln werden besonders im mediterranen Raum von ärmeren Bevölkerungsschichten noch immer als Nahrungsmittel genutzt, gleichzeitig fällt eine niedrigere Erkrankungsrate in diesen Schichten auf (RAKIC et al. 2007, 2005). Zusammenhänge lassen sich durch die gesundheitsfördernde Wirkung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen erklären. Der Schutz vor degenerativen Erkrankungen durch hydrolysierbare Tannine veranlasste auch MEYERS et al. (2006) dazu, verschiedene Eichelarten zu untersuchen. Amerikanische Ureinwohner haben über Generationen Zubereitungen der Eicheln entwickelt, so dass diese noch heute auf dem Speiseplan stehen ( Native Californian Diet ). Auch Spanier, Italiener, Koreaner, Chinesen und Japaner schätzen die Eichel als Nahrungsmittel. Häufig werden dafür sogenannte Tanoak (Lithocarpus densiflorus) oder Ballota (Quercus ballota Desf.) verwendet. Die positiven und protektiven Wirkungen von Pflanzeninhaltsstoffen können abhängig von der Art und den Umweltbedingungen stark schwanken. Ein Anhaltspunkt dafür ist der Geschmack verschiedener Eichelarten. Einige Arten sind roh bekömmlich, manche schmecken leicht bitter, andere hingegen sind nur nach vorheriger Zubereitung genießbar, wieder andere sind ungenießbar. Des Weiteren beeinflussen Lagerung und Verarbeitung bzw. Zubereitung den Gehalt der Inhaltsstoffe. Carotinoide und Monoterpene vertragen z. B. kein Licht und keinen Sauerstoff, Glucosinolate sind empfindlich gegenüber hohen Temperaturen und 39

50 Schrifttum laugen durch Garen in Wasser aus. Solche Veränderungen sind auch bei Eichelinhaltsstoffen denkbar, bisher aber noch nicht belegt. Durch die Verarbeitung von Eicheln werden sie zwar schmackhafter, allerdings könnten auch die gesundheitsfördernden Substanzen beeinflusst werden. Weiter nimmt jeder Körper die im verzehrten Lebensmittel enthaltene Menge an sekundären Pflanzeninhaltsstoffe unterschiedlich auf und setzt sie auch unterschiedlich um. Wie gut die einzelne Substanz genutzt werden kann, hängt von der chemischen Struktur, der Bakterienflora im Darm und der Matrix, in der die Substanz vorliegt, ab. Allerdings ist aufgrund des mangelnden Kenntnisstandes bisher keine konkrete Zufuhrempfehlung möglich. Vor allem scheint das Zusammenspiel der verschiedenen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe sowie die Kombination mit weiteren Inhaltsstoffen pflanzlicher Lebensmittel wichtig zu sein. Isolierte Verbindungen wirken häufig nicht bzw. negativ Eicheln in der Tierernährung Eicheln dienten ursprünglich nur als Futter, d. h. als Energie- und Nährstoffquelle für freilebende Wildtiere. Im Südwesten Mitteleuropas werden Eicheln hauptsächlich für domestizierte Tiere in Freilandhaltung genutzt. So ernähren sich Iberische Schweine hauptsächlich von den Arten Q. ilex, Q. rotundifolia und Q. suber. Das Hauptziel dieser Haltungs- und Fütterungsart ist die Herstellung des daraus resultierenden hochwertigen Schweinefleisches mit Eichelaroma. Die Fleischprodukte von Schweinen, die sich während der Mast ausschließlich von Eicheln und frischem Grün ernähren, sollen eine deutlich bessere Qualität haben als solche von Schweinen, die mit normalen Mastfutter gefüttert wurden (LOPEZ-BOTE 1998). In Zusammenarbeit mit dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule wurden in Fütterungsstudien Schweine gezielt mit Eicheln gefüttert. CAPPAI et al. (2008) untersuchten dabei den Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Eicheln durch Schweine und der Hypersekretion der Glandula parotis (Ohrspeicheldrüse). 40

51 Schrifttum Der Gehalt an Prolin im Speichel ist nach Eichelverfütterung erhöht, was auf Adaption des tierischen Körpers an den hohen Tanningehalt in Eicheln schließen lässt Eichelmast in der Waldweide Seit Beginn der Haustierhaltung bis zur ganzjährigen Stallhaltung im 19. Jh. hatte der Wald eine hohe Bedeutung als Viehweide. Ziegen, Schafe, Rinder, Pferde und Esel führten zum Verbiss bei Jungwüchsen. Die natürliche Erneuerung der Baumbestände wurde zusätzlich durch Trittschäden und Holznutzung erschwert (MANTEL 1990), dies führte zur Auflichtung der Wälder. Dadurch wurden die Wälder ärmer an Baumarten, weil sich nur verbisstolerante Baumarten erfolgreich durchsetzen konnten. Eichen wurden dabei besonders gefördert, da die Eicheln, aber auch Bucheckern (zusammen früher als Eckern bezeichnet), für die Schweinemast eine wichtige Futterquelle waren. Der geregelte Schweineeintrieb in den Wald hatte zusätzliche Vorteile (MANTEL 1990) durch den Bodenumbruch und das Einbringen von Eicheln und Bucheckern in den Boden. Für die Eichelmast wurden Hausschweine in die Eichen- und Buchenwälder (vorwiegend Mischwälder) getrieben, damit sie sich dort an den Eicheln und Bucheckern satt fressen konnten. Damit wurde ein schmackhaftes, kerniges Fleisch erzeugt, das besonders gut für die Haltbarmachung durch Räuchern geeignet war. Noch heute bezeichnet man daher Jahre mit reicher Eichelbildung als Mastjahre. Nach Vorgabe der Mast (Vollmast, Teilmast, Sprengmast) bestimmte man im 18. Jh. die Anzahl der Schweine, die in den Wald eingetrieben werden durften. Eine reine Buchenmast bewirkte weiches Schweinefett (mit tranigem Geschmack aufgrund der Fettsäurenzusammensetzung), wogegen die Eichelmast derbes Fett ergab (vgl. Kap ). Die Schmalzweide (so wurde die Eckernmast auch genannt) schätzte man am meisten, wenn Buchen und Eichen gleichermaßen vorhanden waren. Dies gab den besten Schinken (HUSS 1999). 41

52 Schrifttum Laut BUB (2003) waren hauptsächlich das Verbot des Eintriebes von Schweinen durch die Waldeigentümer sowie der Rückgang der Tierbestände (durch Viehseuchen, herrschaftliche Pfändungen und drohende Futternot) ausschlaggebend dafür, dass in Deutschland die Waldmast abnahm. Heute noch wird die Eichelmast in Südspanien und Portugal mit den halbwild gehaltenen Iberischen Schweinen praktiziert. Diese Haltungsform liefert den bekannten iberischen Eichelschinken (Jamón Ibérico de Bellota; LÓPEZ-BOTE 1998) Stallmast Zur Stallmast der Schweine verwendet man die Eicheln gedörrt (getrocknet/geröstet), gemahlen oder auch gemalzt (gekeimt). Diese Behandlungen sind erforderlich, um die bitter schmeckenden Gerbstoffe zu entfernen (NEHRING 1972). So kann man die befeuchteten Eicheln keimen lassen, um ihre Nährkraft und Zuträglichkeit zu erhöhen. Mastochsen gibt man Eicheln zerstoßen unter den Häcksel gemischt. Schafe vertragen Eicheln nicht, Vögel dagegen mit Ausnahme der Gänse schon. Die hier aufgeführten Verarbeitungsmethoden von Eicheln werden in der Diskussion noch einmal angeführt, um diese mit den untersuchten Proben aus unbehandelten, thermisch getrockneten Eicheln und Eichelsilage zu vergleichen. Seit alters her wurden die Früchte der Stieleiche und der Steineiche verfüttert. Im frischen Zustand enthalten die Eicheln etwa 30 bis 50 % Wasser (vgl. Tab. 2.3.). Um eine optimale Lagerung zu gewährleisten, werden die Eicheln im Herbst bei trockenem Wetter gesammelt und an einem luftigen Platz getrocknet und regelmäßig gewendet, da leicht Schimmel oder Fäulnis auftreten. BECKER et al. empfehlen bereits 1965 die Eicheln in einer Trockenapparatur oder auf einer Darre zu trocknen. Für die Verfütterung ist es vorteilhaft, die Eicheln zu schälen. Im gut getrockneten Zustand platzen die Schalen leicht ab, was das Entschälen einfach gestaltet. 42

53 Schrifttum Außerdem ist die Aufnahme wesentlich besser, da geschälte Eicheln nicht so bitter schmecken. Zusätzlich sind sie auch besser haltbar und werden nicht schimmelig oder faulen. Probleme durch Eichelverfütterung ergaben sich vielfach nur dann, wenn diese verdorben waren. Bei einwandfreier Beschaffenheit sind keine Störungen im Befinden der Tiere zu erwarten, wenn man von der stopfenden Wirkung durch Bitterstoffe absieht. Daher scheint es vorteilhaft zu sein, bei größeren Futtermengen die Eicheln zu entbittern. Dies geschieht am einfachsten durch Einweichen in kaltem Wasser über zwei bis drei Tage, in denen das Wasser mehrfach erneuert wird. Für Schweine sind Eicheln sehr schmackhaft und sie können davon, im Gegensatz zu vielen anderen Tierarten, sehr große Mengen am Tag fressen (7-10 kg; REY et al. 1998). Zusätzlich wurde bei Beobachtungen festgestellt, dass das Iberische Schwein gleichzeitig viel Gras zu sich nimmt (REY et al. 1997), welches die Konzentrationen - -Tocopherol im Muskel und Mikrosomen anhebt. Die mit Mischfutter gefütterten Schweine erhielten im Vergleich dazu eine Mixtur aus Getreide und ausbalancierten Nährstoffen inklusive -Tocopheryl-Acetat (REY et al. 1997, 1998). Es wurde gezeigt, dass während der Mastperiode aufgenommenes Tocopherol für die Fettoxidation während des Reifungsprozesses eine Rolle spielen kann (LÓPEZ- BOTE 2000). Trotz des umfangreichen Wissens ist dennoch nichts bekannt über die phenolischen Komponenten der Eicheln, welche auch an dem Fettoxidationsphänomen teilhaben könnten. Schweine können ohne besondere Schwierigkeiten Eicheln im unentbitterten Zustand aufnehmen; auch von Schafen und Ziegen werden sie recht gut vertragen. SOMMER und SCHELPER (1942) haben die beiden Formen der Eichelmast - Waldweide und Stallmast - miteinander verglichen. Sie schreiben nur Buchen- oder Eichenwäldern im Herbst wirklichen Erfolg bei der Eichelmast zu. Bei der Stallmast fütterten sie pro Schwein täglich 1 bis 2 kg frische Eicheln oder die Hälfte an getrockneten Eicheln. ZORN und RICHTER (1927) gaben versuchsweise sogar bis zu 6,5 kg frische Eicheln ohne Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens. Die Ration 43

54 Schrifttum wurde mit 2 kg Futterrüben und 0,2 kg Fischmehl ergänzt. Trotz dieser hohen Menge wurde die Beschaffenheit des Fleisches und des Speckes nicht wesentlich beeinflusst; jedoch verfärbten die Gerbstoffe den Darm schwärzlich-blau. BÜNGER (1927) weist darauf hin, dass nicht nur bei der Stallmast, sondern auch bei der Waldmast auf eine ausreichende Eiweißzufuhr geachtet werden muss Eichelfütterung bei Iberischen Schweinen FLORES et al. (1988) unterscheiden drei Arten der Fütterung in der Mast von Iberischen Schweinen. Mit Montanera wird die Mastart bezeichnet, bei der die Schweine von Oktober bis Dezember in Freilandhaltung Eicheln und Gras aufnehmen. Das Schlachtgewicht der Schweine kann bis zu 160 kg betragen. Wird die Eichelmast durch die Fütterung von Getreide und Mischfutter ergänzt, nennt man sie Recebo. Im Gegensatz dazu werden die Schweine bei Cebo ausschließlich mit Getreide und Mischfutter gemästet. Der Unterschied in der Mastart hat sowohl einen Einfluss auf die sensorischen Merkmale (Aussehen, Beschaffenheit, Geschmack und Geruch), als auch auf die Fettsäurenzusammensetzung und das Aroma der Schinken (CARRAPISO et al. 2003). In den Schinken mit Eicheln gemästeter Schweine ist der Gehalt an Ölsäure wesentlich höher, was CAVA et al. (1999) mit dem hohen Ölsäuregehalt in Eicheln erklären. Die entstehenden Fleischprodukte, vor allem der Schinken, von mit Eicheln gefütterten Iberischen Schweinen sind traditionelle Produkte aus der spanischen mediterranen Ernährung. LEÓN-CAMACHO et al. (2004) stellen eine detaillierte und umfassende Übersicht der Lipide dreier Eichelarten auf, um den Zusammenhang zwischen der Fütterung dieser Tiere und dem Schinken ermitteln zu können. Mit der Zusammensetzung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren wird es möglich, zu unterscheiden, ob die 44

55 Schrifttum Schweine mit Eicheln als Rohmaterial gefüttert worden sind oder ob ihnen chemische oder pharmazeutische Futtermittelzusätze verabreicht worden sind. Zur Bestimmung der Fettsäuren wurden die ganzen Eicheln der Arten Q. ilex, Q. suber und Q. faginea gesammelt und einschließlich der sie noch umschließenden Schalen untersucht (LEÓN-CAMACHO et al. 2004). Der Rohfettgehalt der drei Eichelarten variiert von 6,9 % bis 4,1 %. Der Hauptgehalt der Fettsäuren besteht aus Ölsäure (60 %) und Linolensäure (27 %), auch Palmitinsäure (14 %). Nach LOPEZ et al. (1992) werden aufgrund quantitativer und nicht qualitativer Unterschiede im Aromaprofil der flüchtigen Substanzen die Schinken von Iberischen Schweinen aus der Eichelmast bevorzugt. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Fütterungsarten zeigen sich eher in der Konzentration der flüchtigen Verbindungen als in der Art der Substanzen Vergiftung durch Eicheln oder durch andere Pflanzenteile der Eiche Die Eiche ist per se keine Giftpflanze. Trotzdem sind die Früchte der meisten Arten ungenießbar. Intoxikationen beim Menschen sind nicht oder nur kaum zu erwarten, höchstens bei hochdosierter Anwendung. Außerdem kann zu hoch dosierter Tee aus der Rinde bei empfindlichen Menschen unter Umständen zu Magenbeschwerden führen (WEILEMANN 1992). Erst WAGNIN weist 1960 auf verschiedene Schadensfälle bei der Verfütterung hin. Die Zufütterung anderer Futtermittel konnten diese Erscheinungen mindern. ACHTAROW (1959) berichtete über Vergiftungsfälle nach der Aufnahme von frischen, keimenden Eicheln bei Rindern, Schafen und auch bei Schweinen. Die Fütterung von gerösteten oder getrockneten Eicheln scheint keine Probleme zu verursachen. Daher werden in der Literatur getrocknete Eicheln den unbehandelten vorgezogen (HUNNIUS 2004). 45

56 Schrifttum Grüne Eicheln sind laut BECKER und NEHRING (1965) für Schweine nicht giftig, wirken aber stark stopfend. Dagegen stuft HUMPHREYS (1988) grüne Eicheln als deutlich giftiger ein als reife Eicheln. Pflanzliche Tannine können mit Proteinen (Nahrungsproteine, Verdauungsenzyme sowie an Proteinen der Darmschleimhaut, Oberfläche von Mikroben) Verbindungen eingehen (Eiweißfällung, adstringierende Wirkung). Die Zusammensetzungen, proteinbindende und enzymaktivierende Eigenschaften variieren je nach Quelle (DESHPANDE 1984). Unterschiedliche Konzentrationen saisonal oder auch von Jahr zu Jahr schwankend - beeinflussen natürlich das Risiko einer Schadwirkung. Wenn durch Tannine die Darmschleimhaut mittels Koagulationsdeckschicht verfestigt und damit die Resorptionskapazität der Darmzotten herabgesetzt wird, hat man durch diesen Schleimhautschutz früher leicht Durchfälle lindern können, da keine toxischen Stoffe mehr aufgenommen werden. So kommt es aber gleichzeitig zu einer antinutritiven Wirkung, da sich die Tannine nicht nur an Proteine der Darmschleimhaut binden, sondern auch an Nahrungsproteine und Enzyme. Pflanzenfresser, die nicht an den Verzehr von Tannin adaptiert sind, können in der Nahrungsverwertung bzw. Verdauung und damit in Wachstum und Gesundheit beeinträchtigt werden. Aufgrund der akuten Toxizität können Tannine bei Überdosierung zentrilobuläre Lebernekrosen hervorrufen (UNGEMACH 1999). Außerdem bildet Tannin mit Eisen Komplexe und verhindert dadurch dessen Aufnahme aus dem Darm, was zu einer mineralischen Fehlversorgung führen kann. Tannin scheint selbst nicht resorbiert zu werden, kann aber im Verdauungstrakt vorwiegend bakteriell zersetzt werden. Daraus entstehen resorbierbare Derivate wie die giftige Gallussäure oder Pyrogallol, was die Toxizität für Rinder erklärt. Pyrogallol wirkt hämolysierend. Außerdem werden Niere und Leber geschädigt (Abb ). Die LD 50 von Pyrogallol (0,7 g/kg p. o. beim Kaninchen) ist um ein vierfaches geringer als die von Gallussäure (HUMPHREYS 1988). Gallussäure ist eine Polyhydroxyphenolverbindung, die Proteine präzipitieren kann. Das genaue Wirkungsprinzip ist noch nicht bekannt. Es wird aber angenommen, dass es im Pansen zu einer Bindung von Gallussäure und Pyrogallol mit Nahrungsproteinen, 46

57 Schrifttum Enzymen oder gastrointestinalem Epithel kommt. Die proteingebundenen Phenolverbindungen, die den Labmagen erreichen, werden dort durch die ph- Veränderungen wieder gespalten. Die freien Phenolverbindungen werden absorbiert und führen zu Zerstörung der Plasmaproteine, der endothelialen Zellen und der renalen Tubuli. Durch diese Schädigung kommt es zum Flüssigkeitsaustritt aus den Gefäßen. Die Schädigungen an den renalen Tubuli führen zu interstitiellem Ödem, verminderter glomerulärer Filtration und ausgeprägtem Ödem. OH HO HO OH HO OH O OH Pyrogallol Gallussäure Abbildung Struktur des Pyrogallols im Vergleich zur Gallussäure (Abspaltung von COOH) In allen Teilen der Eiche sind Gallotannine vorhanden. Sie werden zu nephrotoxischen Polyhydroxyphenolsäuren, wie z. B. Gerbsäure, Gallussäure und Pyrogallol, metabolisiert. Mit zunehmendem Alter der Pflanze nimmt deren Konzentration ab (vgl. Kap , Abb. 2.8.; Abb ). Bereits 1983 gibt WINDHOLZ die LD 100 von Gerbsäure für die Maus mit 6 g/kg p. o. an. HUMPHREYS (1988) nennt dagegen die LD 50 für Kaninchen bei täglicher Aufnahme über 5 Tage mit 6,9 g/kg p. o.. Für Maus, Ratte und Kaninchen liegt die LD 50 bei 2,25 6,0 g/kg p. o. (DESHPANDE 1984). Allerdings gibt DESHPANDE (1984) gleichzeitig eine LD 50 bei mg/kg s. c. oder i. p. bei Maus, Ratte und Kaninchen für kondensiertes Tannin von verschiedenen pflanzlichen Quellen an. Die meisten Eichenarten enthalten für Rinder toxische Gerbstoffmengen (BENTZ 1969, WOLF 1996), jüngere und schlecht genährte Tiere sind empfindlicher. Die Erkrankungsrate (Morbidität) bei Eichenvergiftungsfällen in Herden ist unterschiedlich; die Sterblichkeit (Mortalität) kann jedoch bei Tieren mit Symptomen 47

58 Schrifttum bis zu 80 % betragen. Die Vergiftung verläuft über 3-5 bis hin zu 14 Tagen als sogenannte Eichelkrankheit (HAPKE 1975, LIEBENOW und LIEBENOW 1981). Ein reduziertes Allgemeinbefinden kann laut CLAY et al. (1993) sogar über mehrere Wochen anhalten. Akute Krankheitsanzeichen sind Fressunlust, apathisches Verhalten, starker Durst, Verstopfung, Blähungen, blutiger Durchfall, Mattheit und Taumeln. Außerdem treten häufig Nierenschädigungen (erhöhter Harnabsatz) bis hin zum Nierenversagen auf. Rinder sind deshalb besonders anfällig, weil die Pansenflora die Gallotannine zu nephrotoxischen Polyhydroxyphenolsäuren, wie z. B. Gallussäure und Pyrogallol, umwandelt. Es wird angenommen, dass diese im Pansen an Nahrungsproteine, Enzyme oder gastrointestinales Epithel gebundenen Verbindungen im Labmagen durch die ph-veränderungen wieder frei und dann resorbiert werden. Ins Blut gelangt, führen sie zur Zerstörung der Plasmaproteine, der Blutgefäßwandzellen und des Epithels der Nierenkanälchen. Durch diese Schädigungen kommt es zum Flüssigkeitsaustritt aus den Gefäßen, Blutkörperchenzerfall und Ödem. Die Schädigungen der Nieren führen zu Wassereinlagerungen, verminderter glomerulärer Filtration und ausgeprägtem Ödem im Nierenlager. Interessanterweise vertragen Rehe und andere Gehölz fressende Wiederkäuer wie auch Ziegen Eichenteile und Eicheln deutlich besser. Sie sind resistenter gegenüber Tanninintoxikation, da ihr Speichel einen hohen Prolingehalt (35 %) hat. An Prolin (cyclische Aminosäure) gebundenes Tannin gelangt durch den Gastrointestinaltrakt, ohne in Phenolverbindungen hydrolysiert zu werden (BLODGETT 1993). Vergiftungserscheinungen bei Pferden sind selten lebensbedrohlich. Die Stoffwechselprozesse der Zellulosevergärung, die im Vormagen des Rindes so verheerend wirken können, finden beim Pferd erst im Blinddarm statt. Dadurch kommt es nur selten zu Nierenschäden und Hämaturie. Eine toxische Dosis an Laub oder Eicheln ist aber nicht festzulegen, da die Tanningehalte jahreszeitlichen und offenbar auch witterungsbedingten Schwankungen unterliegen. Von größeren Mengen, vor allem unreifen Eicheln oder Blättern sollten Pferde jedoch ferngehalten werden. Sind z. B. infolge eines Unwetters viele Eicheln abgefallen und das Rauh- 48

59 Schrifttum und Mineralfutter ansonsten unzureichend (wie z. B. auf abgegrasten Herbstweiden), ist das Risiko für Vergiftungen durch Eicheln besonders hoch. HUMPHREYS (1988) hat in Versuchsreihen Pferden 50 bis 300 g Tannin per Nasenschlundsonde verabreicht. Dies führt zu Koliken, Apathie, Futterverweigerung, erschwerter Atmung und Körperschwäche. Auch bei Wirtschaftsgeflügel hat HUMPHREYS (1988) ähnliche Versuchsreihen durchgeführt. Durch die Zugabe von Gerbsäure (Tannine) zur Nahrung von Küken wird die Erythrozyten- und Leukozytenzahl im Blut vermindert, das zirkulierende Hämoglobin sowie der Zucker- und Proteinspiegel herabgesetzt und die Cholesterolplasmakonzentration erhöht. Bei Legehennen kommt es zu verminderter Nahrungsaufnahme und herabgesetzter Eiproduktion. Die Eier werden gefleckt und haben einen grünen Eidotter (HUMPHREYS 1988) Heilwirkung und medizinische Anwendung Eichen zählen zu den stärksten Gerbstoffdrogen. Die Rinde wird daher bei Durchfällen und zur Kräftigung des Darms eingesetzt. Eicheln werden bei Entzündungen eingesetzt. Der Gerbstoff (Tannin) festigt die Schleimhäute im Mund und auch im Darm, somit können sich Bakterien nicht mehr oder zumindest nur eingeschränkt anlagern. Das Zusammenziehen von Magen und Schleimhaut (adstringierende Wirkung) durch pflanzliche Gerbstoffe kommt durch die Denaturierung von oberflächlich gelegenen Proteinen (Eiweißausfällung/-gerinnung) zustande (UNGEMACH 1999, FORTH 1998). Dieser Effekt kann in Maßen durchaus heilsam sein, denn das verfestigte Gewebe wird vom Körper abgestoßen, um neues Gewebe zu bilden. 49

60 Schrifttum Therapie der Eichelvergiftung bei Tieren Selbstverständlich muss der Zugang zu Eicheln besonders bei gefährdeten Beständen (abgefressene Weiden) eingeschränkt oder noch besser verhindert werden. Prophylaktisch kann die Zufütterung von Kalziumhydroxid erfolgen. Dieses bindet die verschiedenen Phenolsäuren im Magen-Darm-Trakt, behindert so deren Aufnahme und Metabolisierung und verhilft zu einer schnellen Ausscheidung. Die Therapie einer Eichelvergiftung beinhaltet das Entfernen des Toxins und eine Expositionsprophylaxe sowie eine Linderung der Symptome, die infolge der Niereninsuffizienz entstehen. HAPKE (1975) empfiehlt bei Rindern zunächst natürlich präventiv das Unterbinden der Aufnahme von Eichenzweigen und Eicheln. Im Notfall erfolgt die Behandlung mit Medizinalkohle 100 g, evtl. Pansensaftübertragung. Bei wertvollen Rindern wird zur Rumentomie mit Ausräumen des Vormageninhaltes geraten; anschließend erfolgt Heudiät und reichlich schleimig-einhüllende Mittel sowie g Natriumbikarbonat oder Calciumkarbonat. Milde Laxantien sind nur im anfänglichen Stadium der Verstopfung angezeigt. Außerdem erscheinen zusätzlich wiederholte parenterale Flüssigkeitszufuhr, Stimulantien und eine Leberschutztherapie sinnvoll. Die initiale anurische Phase führt zu einem tieferen Blut-pH und einer Hyperkaliämie; infolge der Anorexie kann es allerdings auch zu einer Hypokaliämie kommen. Diese Veränderungen sollten überwacht und, falls nötig, zusammen mit der Rehydratation therapiert werden (CLAY 1993). Bei schwerwiegender Intoxikation sollten bei Rind und Pferd der Vormagen bzw. der Magen entleert werden und zusätzlich Abführmittel gegeben werden. Außerdem kann symptomatisch eine Schmerzbehandlung erfolgen und Flüssigkeitsersatz sowie Elektrolyte zugeführt werden (CLAY 1993). 50

61 Schrifttum 2.4. Analyse der Polyphenole Polyphenole wurden bis in die 1970er Jahre mittels Papierchromatographie analysiert. Ende der 1970er Jahre wurde die HPLC für die quantitative Bestimmung von Flavonoiden eingesetzt (SCHLESIER 2001). Die weitaus meisten Untersuchungen zum Vorkommen der Pflanzenphenole sind mit Weintrauben, anderen Beeren, Äpfeln, Wein und Tee gemacht worden, da der Phenolgehalt besonders bei der Herstellung von Wein sowohl als Qualitäts- (Farbe und Geschmack), als auch als Produktionsfaktor (Gerbstoffe) bei der Fermentation und der Lagerung eine wichtige Rolle spielt Dünnschichtchromatographie Bei der Dünnschichtchromatographie werden Probenlösungen auf speziell beschichtete Platten (vornehmlich mit Kieselgel) aufgetragen und mit entsprechenden Fließmitteln entwickelt. Das Chromatogramm einer Probe stellt sich bei optimaler Auftrennung in mehreren Banden dar. Eine genaue Bestimmung ist aber nur dann möglich, wenn die entsprechenden Vergleichssubstanzen mitgelaufen sind (STAHL 1981). CHEBAN et al. versuchten bereits 1976 mittels Dünnschichtchromatographie phenolische Inhaltsstoffe in Weinrebenblättern zu untersuchen. Bevor sie die Weinblätter extrahierten, trockneten sie diese zunächst vor. Sie stellten Extrakte aus Hexan, Chloroform, Diethylether, Ethylacetat und Methanol her. Dadurch konnten sie auf Silofol-Platten mit einem Butanol-Ethanol-Wasser-Chloroform (2:2:1:2)-Fließmittel bis zu 20 Komponenten nachweisen, die sich im UV-Licht als hauptsächlich phenolische Inhaltsstoffe darstellten. Mit Hilfe des UV-Spektrums konnten sie vier Einzelsubstanzen identifizieren: Hirsutrin, Rutin, Quercitrin und dessen Aglykon Quercetin (CHEBAN et al. 1976). 51

62 Schrifttum Analytische Methoden mittels HPLC Die heutzutage gängige Methode zur Analyse von Polyphenolen ist die Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC). In der Polyphenolanalytik sind schon etliche Methoden für die HPLC etabliert. Viele der Studien sind über Rotwein entwickelt worden, bei denen das Probenmaterial direkt, also ohne vorherige weitere Bearbeitung bzw. Extraktion, eingespritzt wird. Manche Autoren empfehlen die vorherige Extraktion, nur wenige nutzen die anschließende Rotationsverdampfung, um das Probenmaterial zu konzentrieren. Nahezu einheitlich werden für die HPLC mit Polyphenolen RP C-18 Säulen empfohlen. Eine Übersicht der für diese Arbeit wichtigsten Literaturstellen über Polyphenolanalysen findet sich im Anhang Die Methoden dieser Autoren haben sich prägend auf die Entwicklung der hier verwendeten Methode ausgewirkt. Die Wahl der mobilen Phase hängt von der Wasserlöslichkeit der zu analysierenden Substanzen ab. Zur Verfügung stehen das isokratische System und alternativ das Gradientensystem. Bei dem isokratischen System wird nur ein Laufmittel verwendet, welches während des gesamten Probenlaufs seine Zusammensetzung nicht verändert. Im Gegensatz dazu werden beim Gradientensystem zwei oder mehr Eluenten verwendet. Dadurch kann während des Probendurchlaufs die Eluentenzusammensetzung durch HPLC-Pumpen so variiert werden, dass Substanzen verschiedener Polarität leichter getrennt werden können. Für Analysen von Polyphenolen benutzen der Großteil der Autoren ein Gradientensystem zur Auftrennung der komplexen Polyphenolextrakte. Aus der großen Diversität an Gradienten für die HPLC, die in der Literatur beschrieben werden, sind die zumeist verwendeten Eluenten Methanol und Wasser oder Acetonitril und Wasser (FERNÁNDEZ de SIMON et al. 1990, BAUMGARTNER et al. 1998, RAKIC et al. 2005, CONDE et al. 1995, CHINNICI et al. 2004, CASTELLARI et al. 2002, CANTOS et al. 2003). Sie können mit organischen oder anorganischen Säuren gemischt 52

63 Schrifttum werden, um die Separation noch weiter zu optimieren. BARAN und SCHWEDT beobachteten 2003 jedoch eine Verschlechterung der chromatographischen Trennung von Polyphenolen bei Methanolgehalten ab 15 Vol.-%. Für eine optimale Auftrennung kann das Fließmittel auf einen niedrigeren ph herabgesetzt werden. BARAN und SCHWEDT (2003) bevorzugen einen ph von 2,85, nach CASTELLARI et al. (2002) genügt es, das Fließmittel auf ph 3 abzusenken. In der Analyse von Polyphenolen werden vor allem der UV-Detektor und der Diodenarray-Detektor (DAD) eingesetzt (CONDE et al. 1995). Sowohl der UV- Detektor als auch der DAD besitzen variabel zu messende Wellenlängenbereiche, die je nach der zu untersuchenden Substanz einstellbar sind. Während der UV- Detektor nur eine bestimmte Wellenlänge pro Probenlauf messen kann, ist es möglich, mit dem DAD mehrere Wellenlängen gleichzeitig aufzunehmen. CONDE et al. (1995) empfehlen, Polyphenole in drei verschiedenen Wellenlängen zu messen: 325 nm (alle Komponenten), 280 nm (Catechine, Proanthocyanidine und Flavanone), 360 nm (Flavone und Flavonole). Die optimalen Wellenlängen werden von Autor zu Autor unterschiedlich angegeben. Offensichtlich ist dies abhängig von den zu untersuchenden Proben und ihrer Zubereitung, den genutzten Trennsäulen und des gesamten HPLC-Systems zu sehen. Auch CHINNICI et al. (2004) nutzen für die Identifikation der phenolischen Inhaltsstoffe in Äpfeln am DAD verschiedene Wellenlängenbereiche, die im wesentlichen mit denen von CONDE et al. übereinstimmen. Die UV-Spektren der getrennten Verbindungen werden mit den DAD UV- Absorptionsspektren der Referenzsubstanzen verglichen. Durch eine anschließende Gegenüberstellung der chromatographischen und spektroskopischen Daten ist eine entsprechende Peak-Zuordnung möglich. 53

64 Schrifttum Sind UV-detektierte Substanzen in geringer Konzentration in der Probe enthalten, liefert in solchen Fällen ein Spektren-Vergleich keine eindeutigen Ergebnisse. Spektren, die von sehr kleinen Peaks aufgenommen werden, können aufgrund ihrer zackigen Form nicht zur Identifikation herangezogen werden. Darüber hinaus wird oft eine eindeutige Peak-Zuordnung durch die große Ähnlichkeit der Absorptionspektren erschwert. Neben dem UV-Detektor und dem DAD kommen vereinzelt auch die Fluoreszenzdetektion und elektrochemische Detektoren zum Einsatz. Der Informationsgehalt, den eine HPLC-Trennung bringt, kann durch den Einsatz einer Multidetektionsmethodik erheblich erweitert werden. Eine simultane Detektion, durch serielle Schaltung von verschiedenen Detektoren, die nach unterschiedlichen Messprinzipien arbeiten, kann darüber hinaus wichtige Hinweise für die qualitative Analyse liefern. Der Einsatz einer Mehrfachdetektion zeigt besonders dann sehr deutliche Vorteile, wenn die getrennten Probenkomponenten eine Ähnlichkeit der UV-Spektren aufweisen. In solchen Fällen ist laut BARAN und SCHWEDT (2003) eine eindeutige Peak-Zuordnung mit nur einem Detektor nicht durchführbar. Die Kombination der Identifikationsmöglichkeiten durch UV-Detektion, DAD, Elektrochemische Detektion u. a. kann dagegen eine entsprechende Zuordnung erleichtern Extraktion Bei der Analyse von Polyphenolen in Wein (BARAN und SCHWEDT 2003, CASTELLARI et al. 2002) oder auch in Fruchtsäften (RECHNER 2000), bei denen die Polyphenole in gelöster Form vorliegen, ist nicht zwingend eine Extraktion notwendig, da auch eine Direkteinspritzung der Getränkeflüssigkeiten in das System erfolgen kann. Die vorherige Probenzerkleinerung entfällt bei diesen Probenmatrices. FERNÁNDEZ de SIMON et al. (1990) erläutern wichtige Unterschiede in den Extraktionsmethoden. Nach ihrer Meinung ist das Hauptproblem die Extraktion einer 54

65 Schrifttum ausreichenden Menge von Polyphenolen aus dem Probenmaterial. Es hängt nicht allein davon ab, ob das Probenmaterial zerstoßen, geschrotet oder zermahlen ist, sondern auch von den Extraktionsmitteln (z. B. Wasser, Alkohol oder Wasser- Alkohol-Gemisch), die mitentscheidend sind für die optimale Extraktion. Sie wirken damit direkt auf das Ergebnis der Analysen. BAUMGARTNER et al. (1998) entwickelten eine Extraktions- und Analysenmethode der löslichen phenolischen Komponenten. Zur Gewinnung der in den Zellen gelösten Phenole wurden Rebenblätter zu feinem Pulver zermahlen. Das Material wurde dann mit siedendem Alkohol extrahiert und unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der Rohextrakt wurde unter reduziertem Druck am Rotationsverdampfer eingeengt. Die Extraktion der Polyphenole ist am erfolgreichsten, je polarer das Lösungsmittel ist, daher finden bei vielen Autoren vor allem Methanol oder Methanol-Wasser- Gemische Anwendung (CANTOS et al. 2003). Ein weiteres Problem stellt die Aufkonzentration des alkoholischen Probenextrakts dar. Zu hohe Temperaturen beim Einengen und zu lange Zeiten bei der Aufbereitung der Proben führen später zu Störpeaks im Chromatogramm, die als ghost peaks bezeichnet werden. RAKIC et al. (2006) empfehlen außerdem, alle Extraktionen und Probenzubereitungen unter Lichtschutz durchzuführen, um die Polyphenole vor Veränderungen durch Lichteinwirkung zu schützen und damit den ursprünglichen Polyphenolgehalt möglichst genau im Extrakt wiederspiegeln zu können Festphasenextraktion (SPE, engl. Solid Phase Extraktion ) Nach erfolgter Extraktion können noch unerwünschte und die Analytik störende Begleitsubstanzen vorhanden sein, die eine weitere Probenaufreinigung nötig machen. Je nach Art und Stärke der Verunreinigung können Papierfilter und Spritzenvorsatzfilter sowie Festphasenextraktionen Anwendung finden. 55

66 Schrifttum Letztere kommen besonders bei komplexen Probenextrakten zum Einsatz. Die Extrakte können mit Hilfe von C18 Festphasen von stark unpolaren Verbindungen befreit werden (BAUMGARTNER et al. 1998). Eine anschließend erneute Aufkonzentrierung des gereinigten Probenextraktes kann in Abhängigkeit der Menge der Lösungsmittel sinnvoll sein Trennung der Analyten Bei der Analytik mittels HPLC finden unterschiedliche stationäre und mobile Phasen Verwendung. Als stationäre Phasen in der Polyphenolchromatographie können sowohl Normalphasen (straight phase) Silica SiO 2 oder Silanol SiOH, als auch Umkehrphasen (reversed phase) z.b. C18 (Si-(CH 2 ) 17 -CH 3 ) eingesetzt werden. Das Trägermaterial ist in beiden Fällen sphärisches Kieselgel (Silicagel) mit einem durch die Oktadecyl-Kohlenwasserstoffkette repräsentiert. CONDE et al. (1995) verweisen darauf, dass die meist verwendeten Säulen für diese Art der Separation die Phasenumkehr-Trennsäulen mit kleiner Korngröße sind, dabei werden mehr C18 als C8 Säulen verwendet (CONDE et al. 1995, CANTOS et al. 2003, RAKIC et al. 2007, BARAN und SCHWEDT 2003). Die straight phase besteht aus einer polaren stationären Phase (z. B. unmodifiziertes Silicagel). Die Polarität der mobilen Phase bedingt daher direkt die Stärke der Elutionskraft. Die verschiedenen Lösungsmittel sind nach ihrer ansteigenden Polarität in der eluotropen Reihe angeordnet. Eine Substanz wird um so schneller eluiert, je polarer die mobile Phase ist. Je polarer die zu untersuchende Substanz ist, desto länger retardiert sie auf der Säule und verlässt deshalb später als unpolare Moleküle die Säule. Die gängigsten Säulen der Polyphenolanalytik sind vom Typ der reversed phase (RP). Für die Herstellung der stationären Phase lässt man Silane (chemische Verbindungen aus einem Silicium-Grundgerüst und Wasserstoff), welche mit 56

67 Schrifttum langkettigen Kohlenwasserstoffatomen substituiert werden, mit Silicagel reagieren. Dabei wird die polare Oberfläche der Silicapartikel mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also die Polarität umgekehrt (reversed phase). Die RP besitzt somit eine unpolare stationäre Phase, bei der die Elutionskraft der Lösungsmittel mit steigender Polarität sinkt. Diese Umkehrphasen werden häufig für die Analyse komplexer Polyphenolgemische eingesetzt. Für die Polyphenolanalytik werden üblicherweise herkömmliche RP-Säulen genutzt, die mit Partikeln aus Silicagel mit Octadecyl-Ketten bepackt sind. Bei den üblichen Silica-basierten RP-Säulen findet unterhalb eines ph-wertes von 3 eine saure Hydrolyse statt, oberhalb von ph 8 erfolgt eine Auflösung der Silicapartikel. Das ph- Optimum liegt somit zwischen ph 3 und ph 8. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Fließmittel mit ph 3 gewählt (Kap ), welches für herkömmliche Trennsäulen und für die verwendete Chromolith Performance Säule (Kap ) einsetzbar ist. Mit dieser monolithischen Säule gelingt in Bezug auf verschiedene Aspekte die Optimierung des Analysenlaufes. Allerdings ist sie bisher nur vereinzelt für die Polyphenolanalytik eingesetzt (CASTELLARI et al. 2002, CANTOS et al. 2003) Chromolith HPLC Säulen Chromolith HPLC Säulen liefern exzellente Trennungen in nur Bruchteilen der Zeit, die herkömmliche Säulen brauchen. Der Grund dafür ist das hochporöse Monolith- Säulenmaterial aus Silica, welches eine bimodale Porenstruktur aufweist. Auf chemischer Basis ist die Herstellung der Chromolith RP-18 end-capped Säulen vom Startmaterial bis hin zu der Oberflächenbildung das gleiche wie bei high-end konventionell gepackten Säulen. Allerdings ist diese Säule nicht mehr mit kleinsten Kieselgelpartikeln bepackt, sondern besteht aus einem einzigen Stück des hochreinem monolithischen Silicagels. 57

68 Schrifttum Chromolith Kieselgel hat eine Porosität von über 80 % (gegenüber der normalen von 65 %) und eine einzigartige bimodale Porenstruktur, die in Bezug auf Trennleistung und Säulenrückdruck eine verbesserte chromatographische Leistung liefert. Das Skelett des Silicamaterials besteht aus einer einzigartigen Kombination aus Makroporen und Mesoporen. Dadurch erhält diese Säule, verglichen mit herkömmlichen Säulen, eine höhere Porosität. Die Makroporen (Abb ) ermöglichen eine hohe Flussrate, da sie den Säulenrückdruck verringern und damit wiederum die Analyse-zeit wesentlich verkürzen. Ihre durchschnittliche Größe liegt Mesoporen (Abb ) bilden die feine poröse Struktur (durchschnittliche Porengröße 13 nm) und schaffen damit eine große aktive Oberfläche, auf welcher die Absorption stattfindet. Abbildung Darstellung der Porenstruktur von Chromolith Kieselgel (Quelle: Firma Merck, 2006) Klassische korpuskuläre HPLC-Säulen, welche mit 3 oder 5 - Partikeln bepackt sind, schränken aufgrund der Partikelgröße die Analysegeschwindigkeit und auch die Säulenlänge ein. Sie ergeben häufig solch einen hohen Druck, dass nicht nur die Säule, sondern auch die gesamte HPLC-Anlage gefährdet ist. Mit dem Versuch, die Oberfläche durch Verkleinern der Partikelgröße zu vergrößern, erreichte man nur einen unakzeptablen hohen Druck und Einschränkungen in der Trennung. Verglichen mit partikulären Säulen ist der Säulenrückdruck bei Chromolith HPLC- Säulen in der Regel acht Mal geringer, dabei bleibt jedoch die Trennleistung gleich 58